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Biology

Vorbereitung und Beobachtung von Dick biologischen Proben durch Scanning Transmission Electron Tomography

Published: March 12, 2017 doi: 10.3791/55215
Automatic Translation
1, 2, 1
1Institut Curie, INSERM U1196, Campus Universitaire d'Orsay, 2Institut Pasteur, Trypanosome Cell Biology Unit, Department of Parasites & Insect Vectors, INSERM U1201

Introduction

Seit den frühen 1970er Jahren, Ansätze Tomographie in der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wurden weitgehend für die strukturelle Charakterisierung von biologischen Proben 1, 2, 3 verwendet. Die Anziehungskraft des Transmissionselektronentomographie war, dass es verwendet werden könnte, ein breites Spektrum von biologischen Strukturen im Nanometerbereich zu studieren, von der Architektur der Zellen und die Ultrastruktur von Organellen zu der Struktur von makromolekularen Komplexen und Proteinen. Dennoch könnte Transmissions-Elektronen-Tomographie nicht zu studieren, sehr dicke Proben verwendet werden (mehr als 0,5 & mgr; m). Tatsächlich produzieren dicke Proben zu viele gestreute Elektronen zu erzeugen niedrigen Signal-zu-Rausch-Verhältnis (SNR) Bilder. Darüber hinaus beinhaltet die Tomographie Sammlung von Bildern von gekippten Proben, mit der scheinbaren Dicke der Probe mit der Neigungswinkel erhöht wird. Obwohl kann die unelastische Streuung gefiltert werdenEnergiefilter geführt, wobei die kritische Menge an Elektronen für hohe SNR Bilder benötigt wird, kaum in TEM erreicht. Daher haben dicke biologische Proben nur untersucht worden sectioning 4 verwendet wird .

Einige Proben können nicht geschnitten werden: einige verschlechtern könnten, wenn sie geschnitten werden, und andere müssen in ihrer Gesamtheit untersucht, um zu ihrer Komplexität zu verstehen. Ein alternativer Ansatz ist die Verwendung TEM in Abtastmodus 5, 6, 7, 8. In Rastertransmissions-Elektronenmikroskopie (STEM), die optische Weglänge der Elektronen unterscheidet sich von dem in konventionellen TEM. Elektronen durch die Probe ohne Streuung hindurchtritt, mit einem Hellfeld- (BF) Detektor 9, während die gestreute elastisch in einem bestimmten Winkel von der optischen Achse mit einem Dunkelfeld (DF) -Detektor gesammelt auf der optischen Achse gesammelt werden kann.Der andere Vorteil der STEM ist, daß der fokussierte Elektronenstrahl an der Oberfläche der Probe abgetastet wird, wodurch die Pixel-für-Pixel-Sammlung der Bilder. Auch wenn der Elektronenstrahl während verbreitert 10 durch die Probe vorbei, diese besondere Sammelsystem ist weniger anfällig für unelastisch gestreute Elektronen als herkömmliche TEM. Darüber hinaus gibt es keine Linse post-Probe in STEM, wodurch die chromatischen Aberrationen zu vermeiden, die in TEM auftreten können. Die Kameralänge kann eingestellt werden, so daß der Detektor hauptsächlich BF ungestreute Elektronen detektiert. Mit dem DF-Detektor dicken Proben zu studieren ist nicht wegen der Mehrfachstreuung empfohlen, die ungenaue Bilder erzeugt. Stattdessen kann der BF - Detektor 11 verwendet werden. Während STEM hohe SNR Bilder erzeugen kann, hat es eine relativ geringe Schärfentiefe-Bereich aufgrund des relativ hohen Strahlkonvergenz im Vergleich zu TEM, die Menge der eingehenden Informationen abnimmt, die von dicken wiederhergestellt werden könnenProben. Im Falle von fehlerkorrigierten STEM Mikroskope, wo der Konvergenzwinkel so hoch wie 30 mrad sein kann, kann die Tiefe des Feldes niedrig genug sein, so dass die Informationen, die in Fokus von einer Brennebene stammt von nur wenigen Nanometern . Einstellen des Elektronenstrahls im Parallelbetrieb bis erhöht die Schärfentiefe-Bereich des Elektronenstrahls zu Lasten der Auflösung 12. Allerdings ist diese Einstellung nicht immer möglich.

Wann immer es notwendig ist, einen konvergenten Elektronenstrahl zu verwenden, muss man Techniken verwenden, die die Tiefe der Bereich des Elektronenstrahls erhöhen, wenn dicke Proben zu studieren. Jüngste Studien haben die Übernahme von mehreren Bildern an verschiedenen Fokusebenen in der gesamten Probe angegeben in-focus die maximale Menge an Informationen wiederherzustellen 13, 14. Die beiden Studien beschreiben verschiedene Möglichkeiten, um die Informationen aus den verschiedenen Fokusebenen zu behandeln. Hovden et al.im Fourierraum kombiniert , um die Bilder , die bei verschiedenen Brennebenen gesammelt wurden, und die endgültige Rekonstruktion wurde direkt aus dem 3D inverse Fourier - Transformation 13 erhalten. Im Gegensatz dazu Dahmen et al. eine konvergente Strahlrekonstruktionsmaschine entwickelt , um das 3D - Volumen aus den verschiedenen Brennebenen 14 im realen Raum zu rekonstruieren. Unser Labor entwickelt auch ein Verfahren zur Abbildung dicken biologischen Proben. Unsere Strategie war anders als die beiden oben beschriebenen Verfahren, dass wir die Informationen zusammengefasst , die in den verschiedenen Brennebenen fokussiert ist und rekonstruiert die endgültige 3D - Volumen im realen Raum einen parallelen Strahl Projektor 15 verwendet wird . Unser Ziel war es, ein Verfahren zu entwickeln, die leicht in jeder Elektronenmikroskopie Labor durchgeführt werden kann. Zu diesem Zweck war es unser Ziel, die Brenn Bilder in einer begrenzten Zeit, vergleichbar mit dem Zeitrahmen von herkömmlichen Tomographie Experimenten zu sammeln. Darüber hinaus ist unsere vorgeschlagene Verfahren could für die Verwendung mit verschiedenen Arten von Ausrichtung und Rekonstruktionssoftware angepasst werden.

Im Rahmen unserer Veröffentlichung ab dem Jahr 2015 15, wollten wir die Erholung der depth-of-field zu visualisieren und zu charakterisieren, so haben wir eine große Konvergenz Halbwinkel von 25 mrad. Hier präsentieren wir eine Schritt- für -Schritt - Protokoll zur Durchführung einer Durchbrenn Bildgebung in STEM nach der Methode entwickelt in unserem Labor im Jahr 2015 15, und wir präsentieren , wie die Daten von 2015 verarbeitet wurde. Diese Methode erholt sich im Fokus befindlichen Informationen aus mehreren Fokusebenen über einen dicken (750 nm) biologischen Probe und ermöglicht qualitativ hochwertige 3D-Rekonstruktionen. Gegebenenfalls sind die Unterschiede in dieser Methodik im Vergleich zu den Methoden, die von anderen Gruppen verwendet werden ebenfalls vorgestellt.

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Protocol

Achtung: Konsultieren Sie die Sicherheitsdatenblätter (MSDS) der verschiedenen Reagenzien vor der Verwendung. Einige der Chemikalien bei der Probenvorbereitung verwendet werden, sind giftig, krebserregend, erbgutverändernd und / oder fortpflanzungsgefährdende. Persönliche Schutzausrüstung (Handschuhe, Kittel, in voller Länge Hosen und geschlossene Schuhe) und arbeiten unter einem Abzug, während die Probe Handhabung. Sectioning der Probe mit einem Ultramikrotom beinhaltet die Verwendung von scharfen Instrumenten, und sorgfältige Verwendung dieser Werkzeuge ist obligatorisch. In den Schritten unten beschrieben, nehmen die Autoren, dass die Probe eine Zellkulturprobe ist. Das Protokoll müssen nach dem Probentyp geändert werden, vor allem die Zentrifugationsschritte.

1. Herstellung von Puffern und Mischungen

  1. Bereiten phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) -Lösung (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 und 1,76 mM KH 2 PO 4).
  2. Herstellung von Lösungen, die 30%, 50% und 70% etHANOL in PBS für die Dehydratisierung Probe. Führen Austrocknung Probe durch die schrittweise Inkubation der Probe Ethanolkonzentrationen zu erhöhen.
  3. Bereiten Epoxyharz durch Mischen von Bisphenol-A- (Epichlorhydrin) (20 ml), Dodecenylbernsteinsäureanhydrid (9 ml), Methyl-5-norbornen-2,3-dicarbonsäure (11 ml) und 2,4,6-tris ( dimethylaminomethyl) phenol (0,7 ml); andere Mischungsverhältnisse können in Abhängigkeit von der gewünschten Härte des Harzes verwendet werden.
  4. Herstellung von Lösungen, die 30%, 50% und 70% Epoxyharz in Ethanol zur Probeneinbettung. Führen Harzeinbettung durch schrittweise Inkubation der Probe mit Harzkonzentrationen erhöhen.
    HINWEIS: Die Volumina der hergestellten Lösungen sind abhängig von der Art der Probe, die untersucht wird. Weitere Lösungen sind für Gewebe benötigt als für Zellkulturen.

2. Fixierung und Färbung der Probe

  1. Zentrifugieren der Zellkultur für 5 min bei 5000 x g. Führen alle folgenden Zentrifugationen die gleichen Bedingungen.
  2. Überstand verwerfen und befestigen Sie das Zellpellet durch sie in PBS resuspendiert (1 ml) mit 4% Paraformaldehyd und 2% Glutaraldehyd. Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 min (1A). Alternativ dazu fixieren die Zellen bei 4 ° C über Nacht am Wochenende oder über.
  3. Nach dem Zentrifugieren der Überstand entfernt und waschen Sie das Pellet 3 mal mit PBS (1 ml), um die Fixierungsmittel vollständig zu entfernen.
  4. Post-fix die Probe mit 1% OsO 4 in PBS (1 ml) für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
  5. Nach dem Zentrifugieren der Überstand entfernt und waschen Sie das Pellet 3 mal mit PBS (1 ml) wurde die OsO 4 vollständig zu entfernen. Deaktivieren Sie die OsO 4 in Öl und entsorgen.
  6. Fügen Sie 2% Uranylacetat in PBS (1 ml) als Kontrastmittel und Inkubieren der Probe für 30 min bei Raumtemperatur (1B).
  7. Nach dem Zentrifugieren der Überstand entfernt und waschen Sie das Pellet 3 mal mit PBS (1 ml) des ungebundenen uranyl ac zu entfernenetate; Uranylacetat enthält radioaktive Elemente und sollte in einem Behälter für radioaktive Abfälle gewidmet entsorgt werden.
    HINWEIS: Die Inkubationszeiten können entsprechend der Größe der Probe verändert werden. Beispielsweise Fixierung und Färbung von dickeren Proben, wie Gewebeproben, erfordern längere Inkubationszeiten. Längere Inkubationszeiten können auch für die Dehydratation und den Einbettungsschritte besser sein. Uranylacetat kann durch eine "uranyl lose" Lösung ersetzt werden, die Gadolinium Salze enthält.

3. Probe Dehydration

  1. Die Probe 30 min bei 4 ° C in PBS (1 ml) mit 30% Ethanol (1C) nach dem Zentrifugieren der Überstand verworfen und inkubieren.
  2. Wiederholen Sie Schritt 3.1 Lösungen mit allmählich zunehmenden Ethanolkonzentrationen (50%, 70% und bis zu 100%) verwendet wird. Während dieser Entwässerungsschritten beizubehalten die Probe bei 4 ° C für Konservierungszwecke Probe.
  3. Nach der Zentrifugation verwerfen die SupernatAmeise und das Pellet in reinem Ethanol (1 ml) suspendieren; über Nacht bei 4 ° C inkubiert.

4. Harz Embedding

  1. Nach dem Zentrifugieren der Überstand verworfen und das Pellet in Ethanol mit 30% Epoxidharz (1 ml) für 30 min bei RT (Figur 1D).
  2. Wiederholen Sie Schritt 4.1 Lösungen mit allmählich zunehmender Epoxidharz-Konzentrationen (50%, 70% und bis zu 100%) verwendet wird.
  3. Nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen und das Pellet in reinem Epoxidharz (1 ml); über Nacht bei RT inkubiert. Die Anwesenheit von Härte DMP-30 könnte die Polymerisation des Harzes auszulösen; Wenn dies geschieht, bereiten zwei Chargen von Epoxidharz, eines mit und eines ohne DMP-30.
  4. Nach der Zentrifugation das Pellet in 200 & mgr; l reinem Epoxidharz in einer Kunststoffkapsel (den Härter enthält); die Probe sollte auf der Unterseite der Kunststoffkapsel sein.

5. Harzpolymerisation

  1. ichncubate die Kunststoffkapsel, die Probe in einem Inkubator eingestellt bei 60 ° C für 48 h enthält; andere Arten von Harz kann mit verschiedenen Einstellungen polymerisieren.
  2. Entfernen Sie die Kapsel aus dem Inkubator und stellen Sie sicher, dass das Harz polymerisiert werden; das Harz sollte hart sein, wenn gegen eine harte Oberfläche gedrückt wird.
  3. Hinzufügen reinen Epoxidharz (mit der Härter) auf der Oberseite des polymerisierten Harzes mit der Probe; diese zusätzliche Schicht aus Harz wird es leichter, die Probe zu schneiden. Inkubieren der Kapsel bei 60 ° C für 48 h.

6. Proben Sectioning

  1. Montieren Sie die Probe Kopf nach unten in einen Probenhalter, so dass die Probe nach oben und fixieren sie auf dem Trimmblock des Ultramikrotom. Dicht verriegeln Sie den Hebel, um den Trimmblock mit dem Ultramikrotom zu sichern.
  2. Mit einer Rasierklinge oder einem ähnlichen scharfen Schneidinstrument, schneiden Sie die Kunststoffkapsel heraus, dass es aus dem polymerisierten Harz zu trennen. Schneiden Sie das Harz, so dass die Probe enthalten ist,ed in Harz in etwa die Form einer Pyramide. Es besteht keine Notwendigkeit, die gesamte Kunststoffkapsel zu entfernen; nur entfernen Sie den Teil des polymerisierten Probe abdeckt.
  3. Nehmen Sie die Kapsel und den Probenhalter aus der Trimmblock und installieren sie auf dem beweglichen Arm des Ultramikrotom.
  4. Installieren Sie ein Schneidmesser auf dem Messerblock und schneiden genau die Gesichter der Pyramide. Die Verwendung von Fernglas wird empfohlen, eine perfekte Form der Pyramide zu geben; desto besser ist die Pyramide, desto besser sind die Abschnitte werden.
  5. Nehmen Sie die Beschneidmesser und ersetzen sie durch eine Histologie Messer ab, die verwendet werden können, Abschnitte zu schneiden, die dicker als 0,5 um.
  6. die Küvette der Histologie Messer mit der richtigen Menge an Wasser, bringen die Schneide des Messers auf der Oberfläche der Probe und verwenden Sie das Fernglas Nach dem Befüllen der Kapsel Steigungswinkel einzustellen, so dass das Messer in die Pyramide in Scheiben schneiden senkrecht wird.
  7. Stellen Sie die Schnittgeschwindigkeit entsprechend der gewünschtenSchnittdicke zu erholen homogene Abschnitte.
  8. Lassen Sie den Abschnitt Schwimmer über das Wasser und fischen sie mit einer Schleife.
  9. Bewegen, um die Schleife zu einer Elektronenmikroskopie Kupfergitter, das oben auf Filterpapier gelegt ist.
    HINWEIS: Das Raster behandelt wurden, sollte vorher seine Hydrophilie zu erhöhen. Dies kann mit einem gitter Beschichtung Stift durchgeführt werden.
  10. Durch die Wasseraufnahme durch das Filterpapier, lassen Sie den Abschnitt an das Netz bleiben. Lassen Sie es trocken für ein paar Minuten, bevor es in das Elektronenmikroskop eingeführt wird.

7. Entwurf des Durchbrenn Tilt-Serie

  1. Sammeln Sie durch fokalen Bilder bei konstanten Fokus-Intervallen.
    HINWEIS: Die Durchbrenn tilt-Serie bestehen aus einem Satz von Durchgangsbrenn Bildern, die bei jedem Neigungswinkel der Neigungs Reihe gesammelt werden. Die ganze Konzentration Amplitude sollte ausreichen, um die gesamte Probendicke zu decken.
  2. Bestimmen Sie den Wert des Fokusintervalls. Wenn das Intervall gleich dem depth-Bereich, die gesamte Probe im Fokus sammeln; Diese Einstellung stellt den höchsten Sampling möglich. Wenn das Intervall größer ist als die Tiefe des Feldes ist, werden einige Teile der Probe nicht im Fokus erhalten werden, was bedeutet, dass einige Teile der Probe nicht in Fokus gesammelt werden.
  3. Berechne die Tiefe-Feld eines Elektronenstrahls von der Wellenlänge des Elektrons und der Konvergenzhalbwinkel des Elektronenstrahls. Während die Wellenlänge der Elektronen direkt mit der Beschleunigungsspannung verknüpft ist, verwenden , um die Konvergenzhalbwinkel durch das Elektronenmikroskop Hersteller oder experimentell aus dem Beugungsmuster 16 einer bekannten Probe bestimmen. Da Elektronen bei einer Wellenlänge λ treffen die Probe mit einem Konvergenzhalbwinkel von α in einem Elektronenmikroskop beschleunigt, verwenden Sie die folgende Gleichung, um die Schärfentiefe-Bereich (DOF) zu bestimmen:

    Gleichung
  4. Entwurfdie Brenn Serie , so dass der ganze Fokus Amplitude der Probe bei ihrer maximalen scheinbaren Dicke (dh am höchsten Neigung) abdecken.
    HINWEIS: Eine 0,75 um dicke Probe bei einer 70 ° Neigung eine scheinbare Dicke von 2,19 & mgr; m haben, so sollte der Fokus Amplitude größer als 2,19 & mgr; m. Für dieses Beispiel, wenn der Fokus Intervall oben bestimmt ist gleich 50 nm, wird es 44 Bilder (2,19 & mgr; m / 50 nm) erfordern die Probe bei seiner maximalen scheinbaren Dicke zu bedecken. Die ganze Fokusamplitude durch die Anzahl der Brennschritte multipliziert mit dem Wert des Fokusintervall gleich. Bei der höchsten Neigung (θ), wird die Probe scheinbare Dicke wie die folgenden definiert:

    Gleichung

8. Beispiel Imaging

HINWEIS: Es geht über den Rahmen dieses Protokolls zu beschreiben, wie ein Elektronenmikroskop in STEM-Modus einzurichten; die meisten dieser Informationen kann ich findenn das Referenzhandbuch mit Hilfe des Elektronenmikroskops Hersteller zur Verfügung gestellt. Allerdings ist folgendes zu beachten: i) die Punktgröße entsprechend gewählt werden sollte auf die gewünschte Vergrößerung; ii) die Ronchigram müssen gut ausgerichtet ist; und iii) in BF-Modus muss die Kameralänge eingestellt werden ungestreute Elektronen zu wählen, während eine gute Beleuchtung des Detektors aufrechterhalten wird. Resin Abschnitte auf Elektronenmikroskopie Kupfergitter aufgebracht sollten vor der Bildaufnahme beleuchtet werden Schrumpfen zu verhindern. Harzschrumpfung und Aufladungseffekte könnten bei der Bildaufnahme verwechselt werden. Die Verwendung einer Objektivlinse Öffnung könnte die Probenstabilität zu verbessern, wenn Aufladungseffekte auftreten. Jedoch in dem speziellen Fall der STEM-Setups, die Objektivöffnung ist nicht kompatibel mit HAADF Bildgebungsmodus, und sehr kleine Öffnungen Ziel nicht mit BF Bildgebungsmodus kompatibel.

  1. Mit geringer Vergrößerung (etwa 20.000-in STEM), blättern Sie durch die Probe und suchen Sie die Region von Interesse.
  2. Passen ter euzentrischen Höhe (Z-Achse), so dass der Bereich von Interesse nicht abtreibt, während die Probe dreht.
  3. Stellen Sie sicher, dass das Objekt von Interesse in der gesamten Neigungsbereich sichtbar bleiben.
  4. Wegen der erheblichen Anzahl von Bildern während eines Durchbrenn Tilt-Serie erworben haben, verwenden eine automatische Erfassungssoftware. Verwenden Sie entweder eine kommerzielle Lösung oder eine Software individuelle Datenerfassung entwerfen, falls gewünscht. Stellen Sie sicher, dass das Software-Programm in der Lage ist, die drei folgenden Schritte durchzuführen:
    1. Verfolgen und konzentrieren sich wie in einem Standard-Tilt-Serie Sammelsystem.
    2. Sicherzustellen, dass die Durchbrenn Bilder mit der Z-Position der Probe überlappen.
    3. eine Reihe von Durchbrenn Bilder bei jedem Neigungswinkel automatisch erwerben.
  5. Geben das Software - Programm die wichtigsten Parameter des Durchbrenn tilt-Serie (dh Brenn Intervallen Brennschritt minimalen Neigungswinkel, maximale Neigungswinkel, Neigungsschritt und Abtastgeschwindigkeit).
  6. Anfangdie Bildsammlung Prozess und warten, bis das Software-Programm zu beenden.

9. Bildverarbeitung

HINWEIS: In diesem Protokoll, das durch Brenn Tilt-Serie Verarbeitung wird mit ImageJ ausgeführt Plugins 17. Ergänzende Daten 1 zeigt ein ImageJ Makro für den Ausrichtungsschritt (TURBOREG) und In-Fokus-Informationen (Extended Depth of Field) für einen Durchbrenn Tilt-Serie entwickelt, um mit drei Fokuswerte für die Zusammenführung.

  1. Ausrichten der Bilder auf dem gleichen Neigungswinkel gesammelt (dh die Durchbrenn images). Da Bilder nicht das gleiche im Fokus befindlichen Informationen haben, nicht auf sie doch nicht die gleichen Funktionen für die Ausrichtung; führen Ausrichtung von benachbarten Bildern zwei durch zwei Ausrichtung (dh eine pyramidale Hierarchie folgend, mit den engsten Fokuswerte zuerst) mit TURBOREG 18, ein ImageJ Plugin.
  2. überprüfen konsequent die Ausrichtung der Durchbrenn Bilder bei jedem Neigungswinkel.Stapeln Sie die ausgerichteten Durchbrenn Bilder Sichtkontrolle zu verbessern.
    ANMERKUNG: Nur die Zone, die im Fokus sollte bewegen, während durch den Stapel blättern. Eine genaue Ausrichtung ist die wichtigste Sache, da der folgende Schritt der Wiederherstellung der Informationen besteht, die im Fokus von verschiedenen Bildern.
  3. Zusammenführen der Informationen , die im Fokus über Extended Depth of Field 19, ein ImageJ Plugin ist; Dies wird schließlich ein einzelnes Bild aus dem Stapel von Bildern erzeugen. Mehrere Einstellungen können während der depth-of-field Erholung, aber verwenden die höchsten Einstellungen, um die Bildinformation zu erhalten verwendet werden.
    HINWEIS: Der Neigungs-Serie jetzt aus einem einzigen Bild pro Neigungswinkel zusammengesetzt ist, wobei jedes Bild in der Fokusinformation enthält, aus dem Durchgangsbrenn Bilder gewonnen.
  4. Verarbeiten Sie die Daten.
    HINWEIS: Standard-Tools für die Ausrichtung und Rekonstruktion kann verwendet werden, da die Daten nun zu einem Standard-Tilt-Serie reduziert wurde. In diesem Protokoll ist TomoJ used für Datenabgleich und Datenrekonstruktion 20, 21. Weitere Informationen darüber , wie TomoJ verwenden können 22 in der ursprünglichen Veröffentlichung.
  5. Führen Sie eine Feinausrichtung der Tilt-Serie.
    HINWEIS: Eine gute Strategie ist Gold Perlen als Fiducial-Marker zu verwenden, um genau zu Verschiebungen zwischen den Bildern zu verfolgen. Lokale Minima können auch verwendet werden, wenn Goldkügelchen kann nicht zu der Probe gegeben werden.
  6. Durchführen einer 3D-Rekonstruktion der ausgerichteten Daten; mehrere Algorithmen zur Verfügung stehen für die Rekonstruktionen im realen Raum oder Fourier-Raum durchführen, die jeweils mit Vor- und Nachteile.
  7. Wenn die endgültige Ausrichtung der Tilt-Serie ist schlecht, einige Verbesserungen zu machen, indem sie die ersten Schritte zu optimieren. Halten die Ausrichtungsschritte, wenn die endgültige 3D-Rekonstruktion verschwommen erscheint oder deformiert; desto besser ist der Kontrast und die Details des 3D-Rekonstruktion in der Praxis, je größer die Anzahl der gesammelten Fokalebenen.
    HINWEIS: SeVeral Software-Programme können die Durchbrenn tilt-Serie zu verarbeiten verwendet werden. Allerdings sind die in diesem Protokoll verwendeten Werkzeuge wurden gewählt, weil in unserer Erfahrung, führten sie das Beste. TURBOREG 18 durchgeführt besser in Bezug auf die Ausrichtung der Bilder , wenn ein Gradient von Fokus vorhanden war. Weitere Informationen finden Sie auf der eigens eingerichteten Website 23 zu finden. Die Extended Depth of Field Plugin 19 entwickelte sich sehr gut in Bezug auf die In-Fokus - Informationen aus verschiedenen Bildern erholt, während andere Werkzeuge im sichtbaren Pixel Änderungen zur Folge. Weitere Informationen, insbesondere in Bezug auf Skript schreiben, finden Sie auf dieser speziellen Website 24 zu finden.

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Representative Results

In unserer Studie wurden die Elektronen 200 kV in der Feldemissionskanone Transmissionselektronenmikroskop beschleunigt. Die Bilder wurden in MINT-BF-Modus unter Verwendung eines 20-us Verweilzeit gesammelt. In Bezug auf die Gestaltung der Durchbrenn Tilt-Serie, fanden wir, dass der Fokus Abstand von 150 nm für die ultrastrukturelle Untersuchung einer 750 nm dicken biologischen Probe-obwohl die Tiefe der Bereich des Elektronenstrahls nur befriedigende Ergebnisse gab, war 3 nm-da wir eine sehr große Konvergenz halb~~POS=TRUNC von 25 mrad verwendet.

Die Probe wird in diesem Bericht analysiert ist Trypanosoma brucei, ein einzelliger Eukaryonten , deren flagellum intensiv untersucht , da diese Organell deutlich von Protisten auf Säugetiere 25 konserviert ist. Die Zellen wurden in der Probenvorbereitung Protokoll vorgestellt behandelt, und wir uns darauf konzentriert , die Strukturanalyse auf der Flagellen - Tasche von T. brucei ( (2B, C und D). Auf den gesammelten Bilder, die die Zone im Fokus erscheint dünn, und der größte Teil des Bildes wegen der begrenzten Tiefe der Bereich unscharf. Die Zusammenführung der In-Fokus - Information wird auf den gesammelten Bildern durchgeführt und erzeugt ein Einzelbild, in dem der in-focus - Zone ist viel breiter (Figur 2E).

Die Zusammenführung der In-Fokus - Information kann besser durch Hervorheben der Hochfrequenzbereiche der Durchbrenn tilt-Serie - Bilder (weiße Pixel in 2F, G, und H) visualisiert werden. Der ImageJ Befehl "Konturen finden" war unsin der vorliegenden Studie ed. Mit diesem Befehl wird ein Sobel-Filter Änderungen in Intensitäten benachbarten Pixel zu erkennen. Die Verschiebung der detektierten Hochfrequenzbereich kann von einem Bild zum anderen zu beobachten. Auf dem Bild , wo die Scharf Informationen verschmolzen wurde, überspannen die hohen Frequenzen den größten Teil des Bildes (2I). Dieses Verfahren erlaubt die Überprüfung der guten Verarbeitung der Durchbrenn tilt-Serie.

Mit Durchbrenn Tilt-Serie, extra im Fokus befindlichen Informationen werden während des 3D-Rekonstruktionsprozess gesammelt und verwendet werden. Dies führt zu einem höheren Kontrast und SNR und reduziert die Verwischung beobachteten Effekte in den 3D - Rekonstruktionen von depth-of-field-begrenzte Bilder 15. Im Fourierraum wird zusätzliche Informationen gewonnen im Vergleich zu einem klassischen Tilt-Serie Sammelsystem, bei dem nur auf der Brennebene 13 gesammelt. Insgesamt 3 die Qualität während des gesamtenD-Rekonstruktion ist isotrop im Vergleich zu einem klassischen Tilt-Serie Sammelsystem.

Abbildung 1
Abbildung 1: Die Bilder , die verschiedenen Schritte des biologischen Probenvorbereitungsprotokoll präsentiert. Die Probenvorbereitung Protokoll kann in vier Netz Schritte unterteilt werden. Die Probe wird A) fixiert in Paraformaldehyd und Glutaraldehyd, B) nachfixiert in Osmiumtetroxid und mit Uranylacetat, C) in Ethanol dehydriert kontrastiert, und D) in Harz eingebettet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Überprüfung der depth-of-field Erholung. Die Erholung der Tiefe-Feld kann auf die Bilder eines gekippten Probe überprüft werden. A) bei 0 ° Neigung, mehrere Details können in der Flagellen - Tasche (Flag Tasche) des Harz-eingebettet T. brucei Zelle beobachtet werden. Die Flagella Tasche im Zytoplasma (Cyt) liegt und die basale Körper (BB) verankert das Flagellum (Flag) an die Flagellen Membran. B, C, und D) Drei Bilder der gleichen Flagella Tasche, bei 70 ° im Elektronenmikroskop geneigt, erworben. Sie wurden mit Fokusabständen von 300 nm gesammelt. Dieses Bild E) wurde von der Extended Depth of Field ImageJ Plugin erzeugt und enthält die im Fokus befindlichen Informationen von B, C und D. F, G, H und I) Diese Bilder wurden mit dem "Find Edges" Befehl berechnet in ImageJ, um highlight die Hochfrequenzinformation enthalten in B, C, D und E bezeichnet. Weiße Pixel stehen für hohe Frequenzen, entsprechend im Fokus befindlichen Informationen. Der Maßstab beträgt 250 nm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Supplemental - Datei 1. Klicken Sie hier um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

In diesem Artikel stellen wir eine konventionelle Probenvorbereitungsprotokoll zusammen mit einem Schritt-für-Schritt-Anleitung für die 3D-Analyse auf dicken biologischen Proben durchführen STEM durchBrennTomographie. Harz Einbettung von biologischen Proben ist seit Jahrzehnten 26 und alternative Protokolle verwendet, die auf unterschiedliche Arten von Proben geeignet sind , können in der gesamten 27 - Literatur gefunden werden. Im Gegensatz dazu Bildgebung dicken Proben in MINT mit Durch Fokus Methoden ein neues Unternehmen ist, und die Methoden werden wahrscheinlich verbessert werden, wie es weiter verbreitet wird.

Das Ziel dieser Arbeit war es, ein Probenvorbereitungsprotokoll und, genauer gesagt, Abbildungsbedingungen für die Durchführung durch Brenn Tilt-Serie Akquisition in STEM mit Ausrüstung zu beschreiben, die zur Zeit verfügbar und in einer angemessenen Höhe der Zeit ist. Aus diesem Grund wurden große Fokus Intervalle verwendet. Tatsächlich gibt es keinen Konsens darüber, wie nahe dieBrennebenen sollten zur Abbildung einer dicken Probe mit STEM für Durchbrenn Tilt-Serie sein. Es dauert in der Regel bis zu mehreren Sekunden bis zu STEM Bilder sammeln, und eine ganze herkömmlichen Tilt-Serie kann Stunden dauern. Als proof-of-concept ist es möglich, Hunderte oder sogar Tausende von Bildern zu sammeln. Es ist jedoch klar, dass lange Leerungszeiten sind nicht für den täglichen Gebrauch geeignet. Strahlstabilität und Probendrift muss berücksichtigt werden, wenn eine solche lange Experimente zu entwerfen. Ferner erhöhen lange Leerungszeiten die Frage der Elektronendosis gesammelt. So wird vorerst durch STEM-focal neigungs Serie nur geeignet für die Untersuchung von Strahlfesten Proben, wie in Harz eingebetteten biologischen Proben oder anorganischen Materialien, vor allem wegen der erheblichen Elektronendosis erforderlich. Wegen der Trade-off zwischen Erfassungszeit und Qualität des fertigen 3D-Rekonstruktion, empfehlen wir einige durch fokalen Abständen in Projekten, bei denen hohe Auflösung nicht erforderlich ist, einnd empfehlen wir eine größere Menge an durch fokalen Abständen in Projekte mit denen eine hohe Auflösung erforderlich ist.

Es gibt einen Mangel an Konsens über die spezifischen Schritte in diesem Verfahren wegen seiner Neuheit. Es ist jedoch klar, dass mehrere Schritte sind entscheidend für hochwertige Rekonstruktionen von STEM durch Brenn Tilt-Serie Datensätze. Erstens muss die Ausrichtung der fokalen Bilder bei jedem Neigungswinkel sorgfältig ausgeführt werden, wie in den drei ursprünglichen Artikel wies darauf hin , beschreibt durch konfokalen Bildsammlung 13, 14, 15. Obwohl bei verschiedenen Brennwerte gesammelt Bilder nicht gemeinsam Informationen teilen, bleibt TURBOREG eine gute Lösung für die genaue, automatische Ausrichtung von Bildern. Zweitens ist die Zusammenführung der Brenn Bilder, wie in diesem Protokoll durchgeführt wird, hat den Vorteil, ein einziges Bild pro Neigungswinkel zu erzeugen, die leicht von jedem Neigungs Serie align gehandhabtment und Rekonstruktionssoftware 3D-Programm. Die Extended Depth of Field Plug-in wurde zunächst für die Lichtmikroskopie Bilder entworfen; dennoch scheint es , die beste Lösung zu sein , für das Zusammenführen der in-focus Informationen aus elektronenmikroskopischen Aufnahmen 28. Eine alternative Lösung ist die gesamte Gruppe von Bildern als eine einzige Tilt-Serie Datensatz mit mehreren Bildern pro Neigungswinkel zu betrachten, ähnlich zu dem, was von Hovden et al gemacht wurde. 13 und Dahmen et al. 14. Dies erfordert die Verwendung von Fourier-basierte Rekonstruktionsalgorithmen 13 oder Ettention, die von Dahmen et al entwickelt wurde. 29 und das ist die einzige 3D - Rekonstruktion Software , die 3D - Volumen von den Bildern an verschiedenen Fokuswerte im realen Raum gesammelt rekonstruieren können. Bemerkenswert ist, solche alternativen Lösungen wird eine zusätzliche Ausrichtungsschritt in der Fokusrichtung (Z-Achse) erforderlich machen, die verwirrend resu produzieren könntelts , die mit den Defokus Intervallen während der Bildsammlung gewählt inkonsistent sind, wie in Dahmen et al. 14. Die Zusammenführung der In-Fokus-Information, wie in diesem Protokoll dargestellt, hat den Vorteil, ein Bild zu erzeugen, als ob die Daten eine parallel unter Verwendung gesammelt wurden, wobei diese zusätzlichen Ausrichtungsschritt in der Z-Richtung zu vermeiden.

Durch Brenn wurden neigungs Serie Methoden entwickelt dicken Proben studieren (etwa 1 & mgr; m). Die Haupteinschränkung dieser Methoden ist, dass sie nicht-Proben verwendet werden kann, dicker als einigen Mikrometern zu untersuchen, da der Elektronenstrahl nicht solche Proben eindringen kann. Diese Einschränkung kommt von der mittleren freien Weglänge der Elektronen, die von der Beschleunigungsspannung abhängt. Obwohl sehr hoher Spannung (dh 1.000 kV) Elektronenmikroskope können zum Abbilden eukaryotischen Zellen 30, sehr dicke Proben erfordern immer noch die von anderen Techniken verwenden , verwendet werden, wie beispielsweise focused Ionenstrahl oder serielle Block-face - Rasterelektronenmikroskopie 31, 32. Jedoch erzeugen diese Verfahren anisotropen Rekonstruktionen, die Stapel von Bildern betrachtet werden kann, da die Z-Achse, die als die Schnitttiefe des Verfahrens definiert ist, auf die X- und Y- Achsen nicht äquivalent ist. Diese Techniken können nicht für hochauflösende Studien verwendet werden.

Im Jahr 2014 und 2015 berichteten drei Originalarbeiten verschiedene Methoden zur Bildgebung dicken Proben 13, 14, 15. Seitdem haben sich nur wenige Studien eine dieser Methoden verwendet , um dicke Proben 33 studieren. Verbesserungen bei den Verfahren wird dazu beitragen, durch konfokalen Bildgebung in STEM zu verallgemeinern. Vor allem im Bereich der Biowissenschaften, durch fokalen müssen Methoden zur Beobachtung Proben unter kryogenen Bedingungen optimiert werden. Dies ist eine große Herausforderung, da kryogene Probenbesonders sensible Dosierung und durch Fokusmethoden erfordern viele Bilder zu Elektron.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich P4417
Ethanol Sigma-Aldrich 2860
Epoxy resin EMS 14120
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 °C.
Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible.
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882 
Osmium Tetroxyde EMS 19150
Uranyl Acetate Sigma-Aldrich 73943
Gelatin Capsule EMS 70110
Triming and Histo knives LFG Distribution Diatome diamond knives
Electron Microscopy copper grid LFG Distribution G200-Cu
Grid Coating Pen LFG Distribution 70624
Specimen Holder JEOL EM-21311 HTR
Electron Microscope JEOL JEM-2200FS

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References

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Cellular Biology Ausgabe 121 Elektronentomographie Raster-Transmissions-Elektronen-Mikroskopie dicke biologische Probe, Depth-of-field durch Brenn Tilt-Serie
Vorbereitung und Beobachtung von Dick biologischen Proben durch Scanning Transmission Electron Tomography
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Trépout, S., Bastin, P., Marco, … More

Trépout, S., Bastin, P., Marco, S. Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography. J. Vis. Exp. (121), e55215, doi:10.3791/55215 (2017).

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