Summary
在这里，我们介绍一种通过使用体内猪腰椎模型来评估椎弓根螺钉的方法。
Abstract
椎弓根螺钉固定术是治疗脊柱疾病的黄金标准。然而，许多研究报道了脊柱手术后松动椎弓根螺钉的问题，这是一个严重的问题。为了解决这个问题，已经对多种类型的椎弓根螺钉进行了检查，以确定脊柱骨中具有良好的固定强度和骨整合的那些。由于解剖尺寸，机械特性和成本，猪脊柱是评估椎弓根螺钉的人类脊柱的良好替代品。尽管有几项研究报道，在猪模型中椎弓根螺钉是有效的，但没有研究已经描述了使用猪模型评估椎弓根螺钉的详细方案。在这里，我们描述了使用体内猪腰椎模型评估经椎弓根螺钉的详细方法。这里提供的麻醉，脊柱手术和收获的技术细节将有助于评估t睾丸螺钉固定模型。
Protocol
春武国立大学体制动物护理与使用委员会批准了本研究。动物的治疗，使用和处理遵循所有指导方针和政策。保持手术室在24°C。
麻醉
- 适应12个月的小型猪在实验单位至少一周。进行临床检查，测量呼吸频率，心率和体温。在麻醉程序前不要喂养每只小型猪12小时。
- 将阿托品（0.05mg / kg）和氯胺酮（20mg / kg）/西拉星（2mg / kg）注射入耳后侧颈部肌肉区域进行预处理。
- 镇静后，将橡皮筋紧贴耳朵底部，用局部酒精清洁耳朵。
- 将一根针头上的塑料导管置于耳静脉中并取出橡皮筋。确认导管正确放置。流感用肝素化生理盐水导管，用胶带固定。
- 对于气管内气管插管，将微型猪置于胸骨放置位置。在助手的帮助下，用适当的吊索握住猪的下巴，张开嘴巴。
- 将喉镜尖端插入咽腔，以从软腭中取代会厌。使用喉镜刀片的尖端使声带可见，并在呼气期间将气管内导管推入气管。
- 感觉自由通过空气进行适当的插管，并检查小型猪左右两侧呼吸声的胸部听诊。
- 使用10 mL注射器，用空气将气管插管的适当体积的空气填充袖带，并使用胶带将管固定到鼻孔。
- 通过内皮提供2.0％浓度的异氟烷，一种吸入麻醉剂用于长时间麻醉acheal插管。测试角膜和睑板反射以确认麻醉并使用眼睛上的软膏以防止干燥。
- 在麻醉期间至少每5分钟监测心血管系统，呼吸系统和体温，直到微型猪恢复。
- 在脊柱手术前30分钟，缓慢应用30 mg / kg头孢唑啉，第一代头孢菌素抗生素。
- 使用IV管线施用5-10mL / kg / h的温（37℃）盐水以维持体内平衡，并提供50μg/ kg / min的芬太尼以控制疼痛。
- 脊柱手术后，当强烈的吞咽反射明显时，进行拔管。
- 将小型猪带入房间并进行监测，直到从麻醉中恢复。当微型猪充分意识到时，提供食物和水。
- 每天服用3 mg / kg的恩氟沙星抗生素，每天服用4.4 mg / kg卡洛芬，用于控制头痛。
- 莫尼每天去猪，直到缝合线去除。
脊柱手术
- 按照制造商的指导方针，将经椎弓根螺钉和后固定器系统高压灭菌。
- 当猪处于仰卧位时，使用剃须刀将小型猪的背部从中心向左或向右约10厘米处剃去。用聚维酮碘溶液和70％酒精清洁皮肤。
- 使用手术刀从腰椎的第二棘突进行纵向中线切口至第一中位神经嵴。通过皮下组织和筋膜解剖到棘突的尖端。
- 使用Cobb电梯从底层薄片骨膜下降下椎旁肌。解剖沿着棘突和椎板限于小关节。
- 打开入口点的浅层皮层（其略低于L3的哺乳动物进程）到两边的L5），用毛刺或羊毛。
- 将导销插入开放位置，平行于上端板并与棘突成20度角。使用C型臂或便携式的前后/横向X射线定义理想的起点。
- 根据X光片将椎弓根探针插入25 mm。使用椎弓根探测装置通过椎弓根和身体触诊确认完整的骨内轨迹。
- 将六个椎弓根螺钉插入准备的L3至L5的椎弓根，直到螺钉头固定好。将植入物头的侧面开口指向所需的方向，并将水平位置与杆的轨迹对齐。
- 将两根杆分别插入椎弓根螺钉头的两侧。使用通用手柄将套筒和螺母放入椎弓根螺钉头。
- 使用直套扳手松开螺母，并使用反扭矩扳手牢固地拧紧螺母。
- 确认职位of椎弓根螺钉使用便携式的前后/横向X射线。
注意：等待小型猪醒来，检查后肢的步态和运动功能，以确定螺丝是否被严重植入。 - 使用带有抽吸的球泡灌注注射器，用3L生理盐水冲洗手术部位。
- 在手术部位放置硅胶排水管，取出硅胶头。使用1.0公尺可吸收的缝合线关闭椎旁肌和皮下。用2.0公尺不吸收尼龙缝合线缝合皮肤。
- 用聚维酮碘消毒缝合部位，并使用灭菌的纱布和胶带进行敷料。
收获程序
- 术后12周，将耳塞后侧颈部肌肉区域注射赛拉嗪（2mg / kg）和氯胺酮（10mg / kg）进行预处理。
- 镇静后，将15mg / kg KCl直接给予耳静脉导管用于安乐死。
- 在以前的手术瘢痕病变中进行纵向中线切口。解剖软组织和椎旁肌肉。
- 暴露腰椎，椎板，棒，螺母和横向过程的棘突从L3到L5。
- 使用反扭矩扳手和杆拆下螺母。使用振荡锯切割L2-3光盘空间和L5-S1光盘空间。
- 用Cobb电梯和塔镊解剖L3-5脊柱的中部和前部两侧。收获后，如果不能立即测试脊椎，请将其包裹在用盐水浸泡的纱布中并储存在-20°C。
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Representative Results
这里描述了使用体内猪腰椎模型来评估经椎弓根螺钉的麻醉，手术和收获的详细方案。该协议适用于许多下游分析，包括机械测试（ 图1 ），定量微CT评估（ 图2 ）和组织学（ 图3 ）。代表性机械测试（ 图1 ）显示平均提取扭转峰值扭矩。它代表了使用机械测试仪的椎弓根螺钉和骨骼之间的结合强度。评估了三种类型的椎弓根螺钉：未涂覆，羟磷灰石（HA）涂层和钛涂层。从三组中的14个椎弓根螺钉收集数据。钛涂层椎弓根螺钉组的平均提取扭转峰值扭矩较大。
图2A ）表明，感兴趣的区域（螺钉全长的内部空间）可以通过微CT程序来评估，用于分析骨骼体积分数（ 图2B1 ），骨表面密度（ 图2B2 ）和特异性骨表面（ 图2B3 ）。从三组中的每一个的椎弓根螺钉收集数据。
用Goldner 三色染色代表性组织学图像（ 图3 ）。椎弓根螺钉和骨骼之间的界面是可观察的。红色表示纤维组织，蓝色表示骨骼。在未涂覆的椎弓根螺钉中，在椎弓根螺钉和骨之间的界面处观察到纤维组织。在HA和钛涂层的椎弓根螺钉和骨的螺纹之间的界面处发现新骨形成。在t钛涂层椎弓根螺钉组，螺钉和骨的螺纹间距用骨压实（ 图3 ）。
图1：猪腰椎椎弓根螺钉的机械分析。用机械测试仪测量椎弓根螺钉和骨骼之间的粘合强度的平均提取扭转峰值扭矩。参考文献6修改。这些值表示为平均值±SEM（ n = 14）。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2. P型椎弓根螺钉的组织形态学分析脊椎脊柱。 （ A ）手动感兴趣区域（ROI）设置有螺钉全长的内部空间。 （ B ）用微CT测量骨体积分数，骨表面密度和特异性骨表面积。参考文献6修改。这些值表示为平均值±SEM（ n = 4）。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3：猪腰椎椎弓根螺钉的组织学分析。进行Goldner三色染色（x1，x20和x40）观察椎弓根螺钉表面与骨骼之间的界面。参考文献6修改。刻度棒（黑色）= 1 mm。比例尺（white）=500μm。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
经脊椎螺钉在猪脊柱中的评估需要很多时间和精力。首先，小型猪是大型动物。对于动物护理和麻醉，研究人员需要一个专门的协议。第二，手术应保持与人体手术相似的环境。评估脊椎椎弓根螺钉的目的是开发一种可应用于人类的高效螺钉。第三，评估经椎弓根螺钉的长期稳定性需要在脊柱手术后大约三个月。因此，椎弓根螺钉固定领域的研究人员需要通过准确的规划来规范协议。尽管已经对脊柱模型中的椎弓根螺钉进行了许多研究9,10,11，没有研究为使用体内猪腰椎的经椎弓根螺钉评估提供了详细的方案松树模型。
虽然不存在人类脊椎的理想模型，但由于本实验的性质和脊柱的解剖尺寸和机械特性，猪脊柱模型是一种替代方案。此外，它相对便宜。麦克莱恩12比较了人，猪，羊，羊和狗标本的第四腰椎的形态测定，并得出结论，猪标本比其他动物模型显示出与人类脊柱相替的优势。此外，猪模型的四足脊椎基本上以与人脊椎8相同的方式加载。因此，猪脊柱作为人类脊柱的替代模型，用于涉及脊柱固定和仪器技术的实验。
在本研究中，我们描述了麻醉，手术和收获的详细方法猪L3-L5腰椎用于评估椎弓根螺钉固定。许多研究已经在多级脊柱手术7,13,14之间评估椎弓根螺钉。在许多人类退行性疾病中，脊柱手术通过一个或两个脊柱融合进行。这意味着两个或三个脊椎水平的椎弓根螺钉用于固定15 。用于评估椎弓根螺钉周围骨形成的微CT的测量范围有限。在这种情况下，我们使用两个用于L3椎弓根的控制螺钉，用于L4椎弓根的两个HA涂层螺钉和用于L5椎弓根的两个钛涂层螺钉。由于L3-L5腰椎的解剖尺寸几乎相同，因此L3-L5螺钉之间的比较比多级螺钉的比较更为可靠。因此，椎间盘螺钉在两层或三层固定与多层次固定相比，脊柱更合适。
为了精确评估和比较经椎弓根螺钉，应牢记一个关键点：每个螺钉应位于椎体上相似的位置。然而，用于在动物模型中植入经椎弓根螺钉的大多数方案要求在插入椎弓根螺钉5,13,14之前暴露并预先钻取脊柱的椎弓根。另一方面，Upasani 等人提出了一种手术方案，其包括通过使用脊柱2的计算机断层摄影图像来确定手术前椎弓根螺钉的位置和尺寸。该协议建议在腰椎椎弓根螺钉的入口处插入导销。还建议使用C型臂或便携式X射线定义椎弓根螺钉的位置这个协议。此外，通过使用椎弓根探测装置，可以确认完整的骨内轨迹。该协议可用于确定椎弓根螺钉的正确定位，从而可以防止椎弓根错位。这个协议是基于我们医院使用的人类脊柱手术技术。
这种方法有一些限制。首先，用健康的猪模型进行手术。由于评估椎弓根螺钉的目的是减少骨质疏松症患者的并发症，本方案应适用于骨质疏松猪脊柱模型，以证明椎弓根螺钉的有效性。第二，猪脊柱模型需要购买和安置猪以及外科手术设备。这可以增加成本，从而限制每个研究组可以使用的动物数量。第三，这项研究只包括12个月的小型猪，因为他们是easy收购和处理。另外，虽然脊柱固定有多种类型的装置，但是在脊柱手术中最常使用的仅仅是使用刚性固定系统的方案。
总之，椎弓根螺钉固定的猪模型提供了一个重要的临床平台，用于研究有助于骨质疏松症患者并发症较少的固定技术。该方案提供麻醉，手术和猪腰椎模型收获的技术细节。这将有助于评估使用该模型的经椎弓根螺钉固定。
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Disclosures
作者与本文无关。
Acknowledgments
本研究得到了韩国春武国立大学医院生物医学研究所（CNUH-BRI）资助的赠款（CNUH-BRI-2012-02-005）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miniature pig | OrientBio | ||
| Atropine | Jeil pharmaceutical | A04900241 | Anesthesia |
| Over-the needle plastic catheter | BD | REF382412 | Maintenance of IV line |
| Ketamine | Yuhan | A04502441 | Anesthesia |
| Xylazine | Bayer Korea | A00800071 | Anesthesia |
| Laryngoscope | Karl storz | Intubation | |
| Endotracheal tube | Covidien | Intubation | |
| Isoflurane | JW pharmaceutical Co | A02104781 | Anesthesia |
| Eye ointment | Hanlim pharma | A37851721 | Protection of pig's eye |
| Cefazolin | Donga pharma | A01503951 | Antibiotics |
| Saline | JW pharmaceutical Co | A02151392 | Maintenance of fluid homeostasis |
| Fentanyl | Hana pharm | C03200032 | Pain control |
| Enrofloxacin | Bayer | 93106-60-6 | Antibiotics |
| Morphine | Myungmoon pharma | C03700091 | Pain control |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | A07600711 | Antibiotics |
| Povidone-iodine | Hyundai pharma | Wound dressing | |
| Scalpel blade size 15 | Braun | I1 BB515 | Skin incision |
| Cobb elevator | Codman | 65-2546 | Dissection of muscle |
| Burr | Medtronic | Making of starting point of screw | |
| Rongeur | Aesculap | FO515R | Making of starting point of screw |
| Guide pin (K-wire) | CE | 01067803 | Guidance of screw trajectory |
| C-arm | GE | OEC 9800 plus | Guidance of screw trajectory |
| Portable X-ray | Siemens | Mobile XP hybrid | Guidance of screw trajectory |
| Pedicle probe | OtisBiotech | SPI-02-01 | Guidance of screw trajectory |
| Pedicle sounding device | OtisBiotech | SPI-03-01 | Guidance of screw trajectory |
| Pedicle screw | OtisBiotech | MS-40025 | |
| Posterior fixator systems | OtisBiotech | ||
| Rod | OtisBiotech | ROD-60140 | Rigid fixation between screws |
| Universal handle | OtisBiotech | SPI-08-01 | To fix the screws to the rod |
| Straight socket wrench | OtisBiotech | SPI-06-01 | To fix the screws to the rod |
| counter torque wrench | OtisBiotech | SPI-07-01 | To fix the screws to the rod |
| Bulb irrigation syringe | Hyupsug medical | HS-IR-140 | Irrigation |
| Silicone drain | Sewon medical | 2205-006 | To drain the fluid at the surgical site |
| 3.0 metric absorbable suture | Ethicon | BA1673H | Muscle suture |
| 2.0 metric nonabsorbable nylon suture | Ethicon | W1626T | Skin suture |
| Gauze | Kingphar Korea | KP120-06 | |
| Pentobarbital | Hanlim pharma | 645301221 | Euthanasia |
| Oscillating saw | Zimmer | Harvest spine | |
| Tower forceps | Aesculap | BF461R | Harvest spine |
References
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