Summary
כיום כל סוג של vascularized אלוגרפט ללא הפרדות צבע תלוי וארוך-טווח-החיסוני, קשה לתמוך עבור אינדיקציות לא החיים-קריטיות. אנו מציגים חזירי הטיביאלי VCA מודל חדש שניתן ללמוד עצם VCA ואף מדגימים את השימוש אנגיוגנזה כירורגית כדי לשמור על עצם הקיום ללא הצורך של החיסון לטווח ארוך-אפנון.
Abstract
איבוד העצם סגמנטלי הנובע טראומה, זיהום ממאירות, חריגה congenital נשאר אתגר שיקומיים. אפשרויות טיפוליות הנוכחי יש סיכון משמעותי של כשלון, תחלואה משמעותית.
השימוש של עצם vascularized ללא הפרדות צבע אלוגרפט (VCA), הייתי מציע שני התאמה בקירוב של עצם resected גודל, צורת ריפוי ואת שיפוץ הפוטנציאל של עצם החיים. כיום, נדרש סמים חיים ארוך החיסוני (IS). איברים רעילות, זיהום סתגלני וסיכונים ניאופלזיה הם הדאגה לטיפול כזה אינדיקציות קטלניים.
בעבר הראו הכדאיות VCA עצם, משותף יכול להיות מתוחזק ב חולדות וארנבות, ללא צורך החיסוני לטווח ארוך על ידי ההשרשה של הנמען נגזר כלי בתוך VCA. זה יוצר של מחזור neoangiogenic autogenous, עם זרימה מדידה ועצם פעיל שיפוץ, דרישה רק 2 שבועות של IS. כמו חיות קטנות שונות מן הגבר באופן ניכר באנטומיה, פיזיולוגיה עצם ואימונולוגיה, פיתחנו מודל VCA עצם חזירי להעריך טכניקה זו לפני יישום קליני הוא נערך. בחזירים מיניאטוריים נמצאים בשימוש נרחב כיום למחקר אלוגרפט, שגבה הדמיון שלהם אוטואימונית, אנטומי, הפיזיולוגיות, בגודל אדם. כאן, אנו מתארים חדשים חזירי orthotopic הטיביאלי עצם VCA דגם כדי לבחון את התפקיד של אנגיוגנזה כירורגי autogenous כדי לשמור על יכולת הקיום VCA.
הליקויים העצם בשוקה סגמנטלי בנייה מחדש של מודל באמצעות מקטעים העצם בשוקה allogeneic מתאימים גודל, צורה, מושתלים על פני רב סרן החזירים ליקוציט אנטיגן (SLA) אי-התאמה בחזירים מיניאטוריים יוקטן. השרשה של הנמען כלי autogenous נגזר לתוך התעלה מדולרי של העצם בשוקה allogeneic מקטעי ותיקון הכלי התזונתי מבוצע בשילוב סימולטני הוא לטווח קצר. זה מאפשר סירקולציה autogenous neoangiogenic לפתח מתוך הרקמה מושתל, שמירה על זרימה דרך כלי מזין allogeneic לזמן קצר. הוקמה לאחר, מחזור הדם autogenous החדש שומר על עצם הקיום בעקבות הפסקת טיפול תרופתי, פקקת כלי מזין עוקבות.
Introduction
פגמים osseous סגמנטלי גדולים הם תוצאה של טראומה, זיהום או ניתוח חלקי איבר לאחר גידול ממאיר. אפשרויות שחזור הנוכחיות כגון בעזרת השתלת עצם autogenous vascularized, עצם תחבורה, החלפת תותבת cryopreserved allografts נמק, בשימוש לבד או בשילוב, קשורים עם תחלואה משמעותית, יש שיעור גבוה של סיבוכים1,2,3.
הנוכחות של רשת microvascular חיונית היווצרות הומאוסטזיס של העצם, תמיכה osteogenic, chondrogenic, גזע mesenchymal נדרש עבור עצם תיקון4.
השתלת עצם allogeneic חי, צורת אלוגרפט vascularized רקמות ללא הפרדות צבע (העצם VCA), הופיעה עם השקה השתלה של pedicle התזונתי שלו, עשוי לייצג חלופה שיקומיים בעתיד. כמו cryopreserved העצם allogeneic, יציבות מיידית מסופק על ידי מקרוב התאמת העצם פגם מורפולוגיה. כמו השתל vascularized autogenous, הוא מספק את ריפוי משופר ובניה של חיים רקמת העצם. המכשול בכל הליך allotransplant נותר הצורך של ארוך-טווח-החיסוני (IS). הבעיה חריפה יותר ברקמות השלד והשרירים, אשר דורשים תרופה במינון 2 - 3 פעמים יותר מאשר5ניתוחי השתלת איברים. סיכונים והמצוות כולל איברים רעילות, ממאירות, זיהום או פיתוח של שתל – מול – מארח מחלות קשים להצדיק בפרמיות--יישומים קריטיים אלה6. עם זאת, פרקים של דחייה אקוטי וכרוני נותרו נושא מרכזי עם הנוכחי לטווח ארוך הוא7. במאמץ המתמשך מקרוב להתאים histocompatibility אנטיגנים, זירוז סובלנות תורם ספציפי ו/או לשפר את חיסוני סמים לא עדיין באופן שגרתי הצליחו המתיר רקמות מסמים קליניים הישרדות8,9.
בעבר הראו את האמצעים כדי לשמור על עצם הקיום VCA ולשפר את עצם שיפוץ במודלים של בעלי חיים קטנים על ידי קידום של סחרור autogenous חדש בתוך עצם מהתורם. פעולה זו מתבצעת על ידי שימוש נוסף אנגיוגנזה כירורגי מושתל רקמת autogenous10,11,12. עצם allogeneic מקטעי מושתלים מתחת ללשון עם השקה של pedicle קטע עצם התזונתי. בנוסף כלי מארח-derived מושתלים לתוך התעלה מדולרי של המקטע allogeneic עצם vascularized. במהלך תהליך זה 2-שבוע, patency של הכלי התזונתי allogeneic נשמר עם סמים החיסוני. לאחר IS-נסיגה, pedicle מזין בסופו של דבר thrombose13 המיטה נימי החדש, המבוסס על כלי מארח-derived מספקת מחזור מספיק כדי לשמור על יכולת הקיום של רקמות. עצם ריפוי ובניה משופרים מאז פרכת והם אנגיוגנזה בשילוב10,11,12. אין חיסוני נוסף נדרש, עצם הקיום נשמרת לטווח ארוך למרות המארח immunologically המוסמכת היעדר סובלנות תורם ספציפי.
תרגום של שיטת הרומן עצם אלוגרפט לתוך הקלינית צריכה להיות קדמו הטוב מחקר נוסף של ריפוי, מכניים המאפיינים ואימונולוגיה במודל בעלי חיים גדולים. המודל חזירי אידיאלי כזה VCA מחקר14,15,16. בחזירים מיניאטוריים דומים בגודלם אנטומיה לאיש, ומאפשר השלד שיקום באמצעות שתלים זהה בעיקרו כירורגי וטכניקות. אימונולוגיה החזירים מוגדרת היטב, כולל החזירים ליקוציט אנטיגן (SLA) haplotypes וסוגי דם, צורך בניתוח השתלת. תא שושלת היוחסין מחקרים אפשריות עם השתלת תואמים-מין, כמו גם ניתוח מפורט של תגובות חיסוניות17,18,19,20,21.
כאן נתאר מודל אלוגרפט VCA עצם בחזירים מיניאטוריים יוקטן, מתאימים למחקר של אובדן עצם סגמנטלי ושיחזור. מודל זה יכול לשמש כדי לחקור את יחסי הגומלין של אנגיוגנזה כירורגי ועצמות IS לטווח קצר על עצם ההישרדות VCA ותפקוד, כולל osteocyte, שושלת היוחסין, זרימת הדם, ריפוי ובניה קיבולות, alloresponsiveness, ביומכניקה גם בתור כדי מבחן אסטרטגיות modulatory המערכת החיסונית חדשניים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
המחקר אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) מאיו קליניק ברוצ'סטר. בחזירים מיניאטוריים יוקטן שהיו לכהן תורמים ומקבלים במהלך הליך כירורגי VCA. ההתאמה של התורם, חתן היה מבוסס על ה-DNA רצף החזירים ליקוציט אנטיגן (SLA) haplotyping כדי להבטיח התאמה העיקריים ב- Sla 22,23. בעלי חיים היו מתאימים לגיל, משקל של סוג דם זהה. שני צוותים כירורגיים במקביל שנקטפו מקטע העצם בשוקה חזירי עם הכלי התזונתי שלה מהתורם והכינו שהנמען יקבל על קטע orthopically להציב את allogeneic העצם בשוקה. בו זמנית עם תיקון microvascular של עצם מזין כלי השיט, צרור עורקית הנמען-derived הונח בתוך המקטע הטיביאלי עבור autogenous אנגיוגנזה.
1. ההכנות presurgical
- מהר בחזירים מיניאטוריים יוקטן ביום שלפני ההליך, לשקול אותם לניהול מבוקר הסמים.
- חיות צמודה עם חריגות השירותים הווטרינריים (2 מ"ג/ק"ג), השילוב של tiletamine HCL ו zolazepam HCL (5 מ"ג/ק"ג), מנוהל subcutaneously.
- למקם צנתר היקפיים תקחי את האוזן סמים ואספקה מלוחים ולפקח הבופרנורפין (0.18 mg/kg) ואנטיביוטיקה מניעתי (1 g cefazoline תוך ורידית, 5 מ"ג/ק"ג ceftiofur תוך שרירית).
- לגלח את hindlimb נכון, הצוואר השמאלי אשר ישמש כאתר הקציר עבור קטע העצם בשוקה vascularized ואתר את המיקום של הקטטר ורידים במרכז, בהתאמה.
- בדיקת סימנים חיוניים הרמה של הרגעה על-ידי בדיקת ההרפיה של שרירי הפה.
- לצנרר את החיה עם הרכבת התחתית אנדוטרכאליות בגודל מתאים בחזה ובצלעות recumbency24.
- להעביר בחזירים מיניאטוריים השולחן מבצע ולהתחבר מכונת ההנשמה לצורך תחזוקה של הרדמה על ידי מתן איזופלוריין (1-3%).
- לאשר את עומק הרדמה על ידי בדיקות רפלקסים הקרנית המוארים palpebral, האישון.
- צג רווית חמצן גשש שידור דופק דופק צמוד לאוזן. השתמש מכשיר לחץ דם שהקפל וטמפרטורה בדיקה לניטור סימן חיוני פוסט ניתוחית.
- הצב בחזירים מיניאטוריים יוקטן במצב פרקדן על משטח התחממות כדור הארץ. בנוסף, השתמש שמיכה התחממות האוויר אילצו במהלך המבצע כדי למנוע היפותרמיה.
- השתמש משחה הוטרינר על העיניים למניעת יובש תחת הרדמה.
2. הקציר של קטע Vascularized העצם בשוקה
- לשטוף את רגל ימין של כל בחזירים מיניאטוריים עם povidone יוד פתרון. לייבש את העור עם מגבת נקיה, לעטוף את הגפיים בצורה סטרילית. לעטוף ולבודד את האיבר באמצעות תלויה החתך דבק ספוג יוד כדי למזער את הסיכון של זיהום.
- ביצוע חתך עם anterolaterally ומהדקים hindlimb, מתחיל במפרק הברך, הרחבת רחוק לאורך הרכס הקדמי של עצם השוקה המשותף tibiotalar.
- לנתח את העור ואת הרקמה התת עורית במספריים ומשכו את שרירי חלקה הקדמי של עצם השוקה רוחבית.
הערה: שחרורו של מקור השריר הקדמי השוקתי מאפשר חשיפה. קרום interosseous עכשיו נחשף. - לזהות את העורק הטיביאלי הגולגולת, הווריד (כדי מאוחר יותר לשמש את הצרור עורקית אנגיוגנזה כירורגית).
הערה: הגולגולת הטיביאליס ואת הווריד לשכב על המשטח הקדמי של קרום interosseous. - כדי לשפר את שדה הראייה פעיל, לשחרר חלק מן השריר הקדמי הטיביאלי מן ההכנסה שלה ולהסיר חלק הרכס הטיביאלי באמצעות מסור של נדנוד.
- הגנה על כלי הטיביאלי הגולגולת, פצעים וחתכים ההתחלה ממברנה interosseous ברמה של tubercle הטיביאלי עם מספריים.
- דמיינו את כלי הטיביאלי סימטרית, פועל יש מתחת הקרום.
הערה: הם הסניף מכלי הדם הטיביאלי הגולגולת, להצמיח pedicle התזונתי של diaphysis הטיביאלי דיסטלי רק tubercle. עכשיו זה אפשרי לדמיין נקב מזין וכלי הזנת בשוקיים על משטח לרוחב האחורי דיסטלי רק tubercle הטיביאלי. - לתייג pedicle מזין עם microclamp. אל תנתק כעת pedicle כלי הדם.
- לזהות ענף שריר בתא הקדמי הטיביאלי ליד נקב מזין; זה עשוי לשמש עבור ההשקה לכלי השיט מזין allotransplant עצם vascularized. סמן את הענף שריר עם microclamp.
-
הקציר של קטע העצם בשוקה 3.5 ס"מ כולל pedicle כלי הדם.
- השתמש ג'יג חיתוך כדי להבטיח כריתה של עצם לשחזור ומדויק. מיקום ו תיקון החיתוך רקדן על פני השטח המדיאלי של עצם השוקה כדי לכלול את נקב התזונתיים ואת כלי.
- מונחה על ידי ג ' יג, לבצע חתכים עצם מקבילים ראינו נדנוד להסיר מקטע הטיביאלי 3.5 ס"מ. השתמש באותו מיקום פאזל משח עבור התורם והן חיות הנמען להגדיל את גודל - ואת הצורה-match.
- השתמש ג'יג חיתוך כדי להבטיח כריתה של עצם לשחזור ומדויק. מיקום ו תיקון החיתוך רקדן על פני השטח המדיאלי של עצם השוקה כדי לכלול את נקב התזונתיים ואת כלי.
- לאחר שני החתכים נעשו עם המסור נדנוד, סובב על קטע העצם בשוקה להמחיש pedicle התזונתי על המשטח האחורי. לחלק pedicle התזונתי על מוצאו של העורק הטיביאלי הגולגולת עם מספריים. לנתח וגישה חופשית על קטע הטיביאלי עם מספריים, עוזב מגבון דק של קרום העצם, השריר על פני השטח שלו.
- לחזור על קטע העצם בשוקה ולרומם על קטע העצם בשוקה עם pedicle כלי הדם שלו עם מלחציים חדה, עוזב את העורק הטיביאלי הגולגולת במקום.
הערה: קטע עצם vascularized עכשיו מוכן להעברה microvascular, פגם העצם בשוקה 3.5 ס"מ נוצר כל בחזירים מיניאטוריים יוקטן. - מאתרים ומפסיקים כלי הטיביאלי הגולגולת הקרסול עם polyglactin שנספג התפרים 3-0, משחרר אותם עם מגבון רקמת perivascular כדי ליצור של צרור עורקית (AV). . עזוב התפרים לפחות 5 ס מ כדי להקל את ההשתלה לתוך המקטע העצם בשוקה.
3. Orthotopic העצם בשוקה VCA שחזור בשילוב עם ניתוח אנגיוגנזה
-
להחליף את מקטעי העצם בשוקה שנקטפו עם עוקצים התזונתי שלו בין שני בעלי החיים להשתמש בהם כמו עצם VCAs.
- כדי לאפשר מעבר של הצרור (AV) של עורקית הטיביאלי גולגולתי לתוך המקטע העצם בשוקה, להסיר למבקרים בצורת קטע מתוך אתר צומת proximal בעזרת המסור נדנוד.
- לקדוח חור של 0.5 ס מ קוטר בחלק הדיסטלי של האתר פגם העצם בשוקה ואל התעלה מדולרי של המקטע העצם בשוקה ולהציג את הצרור AV נמען זה יש כבר מאתרים רחוק, אל תוך התעלה intramedullary כדי לקדם את העוקבים autogenous אספקת דם חדש.
-
מניחים את orthotopically קטע העצם בשוקה vascularized הפגם הנמען.
- Anastomose pedicle התזונתי של המקטע העצם בשוקה לענף שריר מוכן של התא הקדמי הטיביאלי בצורה הקצה-אל קצה באמצעות הטכניקה פשוטה תפר קטעה ו- 9-0 התפרים25.
- אשר patency של ההשקה microvascular באמצעות מבחן החליבה26.
-
להשיג osteosynthesis באמצעות 9 גומות 3.5 מ מ נעילה צלחת.
- מניחים את הצלחת 9 חורים על anteromedially שוקה. לתקן את הצלחת עם ושלושה ברגים bicortical מעל ומתחת על קטע עצם הטיביאלי. בנוסף, מקום unicortical ברגים קטע העצם בשוקה עבור קיבוע פנימי. כדי לאשר נכונות מיצוב של העצם VCA צלחת, להשתמש anteroposterior ואת צילומי לרוחב.
- לבצע fascial, שכבות העור באמצעות סגירת קטע 3-0 ו- 2-0 נספגים. סוף סוף לסגור את הפצע עם רוטב שקוף ריטלין.
4. מרכזי השמתם צוואר וריד חיצוני
-
לאחר הניתוח והתרופות האמריקני וניטור לדיכוי המערכת החיסונית (IS) סמים ברמה, להכניס קטטר ורידי בתוך ומוחלף על חיצוני באמצעות טכניקה פתוחה. לבצע את מיקום בסיומו של ההליך אלוגרפט בהרדמה (ראו סעיף 1).
- לבצע חתך anterolateral בצוואר עם אזמל. לנתח את הרקמה התת עורית במספריים ולחשוף ומוחלף על שמאל.
- להכניס קטטר היקמן בתוך ומוחלף על דרך חור קטן עורק הצוואר ואבטח אותו בתפרים נספגים. Exteriorize את הצנתר מאחור על ידי מנהור subcutaneously.
- מאובטחים הצנתר במקום על העור, קרוב לצוואר בשכבות באמצעות קטע 3-0 ו- 2-0 נספגים.
- הצב תחבושות ריטלין מעל החתך. השתמש תחבושת תתעכבו בתמונות של הסרט כדי להחזיק את התחבושות, הקטטר במקום.
5. לאחר הניתוח טיפול ומעקב
- מיד לאחר הניתוח, לטפל בחזירים מיניאטוריים של יוקטן עם זריקה תוך שרירית של carprofen (4 מ"ג/ק"ג) על שיכוך כאבים לאחר הניתוח. לנהל הבופרנורפין (0.18 mg/kg) לטיפול בכאב בעוצמה גבוהה כנדרש.
- לאפשר חזיר כדי לשחזר עבור 60 דקות ולאחר מכן להחזיר את החזיר פאן מיוחד נמרץ, צג מקרוב עד החלמה מלאה.
- הזז בחזירים מיניאטוריים יוקטן כדי רגיל כלוב and לספק גישה ad libitum מים ומזון.
- לנהל טקרולימוס (0.8-1.5 mg/kg/day), mycophenolate mofetil (MMF) (50-70 מ"ג/ק"ג/יום) בעל פה, succinate נתרן מתילפרהדניזולון לווריד (החל 500 מ ג ליום) במשך שבועיים.
- להתאים את המינון היומי של תרופות לדיכוי המערכת החיסונית על-פי רמות בדם שוקת, מכוון 5.0 30.0 ננוגרם למ"לעבור טקרולימוס ו- 1.0-3.5 µg/mL עבור MMF, בהתאמה. להפחית בהדרגה את המינון של מתילפרהדניזולון עד המינון אחזקה של 50 מ"ג ליום.
- ניהול טיפול אנטיביוטי מונע גנטמיצין (3 מ"ג/ק"ג דרך הווריד), ceftiofur (5 מ"ג/ק"ג intramuscularly) במשך שבועיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הטכניקה המתוארת בוצעה בהצלחה ארבע לא תואמת הגדולות SLA יוקטן בחזירים מיניאטוריים, סגמנטלי פגמים הטיביאלי שיחזר באמצעות מתאימים גודל VCA הטיביאלי. הכלי התזונתי בו זמנית של allotransplant העצם ותיקון השרשה של צרור AV מהחיה הנמען בתוך התעלה מדולרי allotransplant מותרת מחזור עצם מיידית והן פיתוח של הספקת דם autogenous חדש מעל הזמן (איור 1). בן 16 שבועות סירקולציה neoangiogenic הוקמה בתוך כל tibial VCAs, דמיינו ידי מיקרו-שחושב מסתמים (מיקרו-CT) טומוגרפי לאחר הזרקה של פולימר angiographic בלייזר (125 מ"ל) לתוך כלי הירך ואת decalcification של VCA הטיביאלי (איור 2).
איור 1 : Orthotopic העצם בשוקה VCA הליך. דיאגרמה המציגה את הליך כירורגי. (א) הליך התורם: הקציר של קטע העצם בשוקה עם pedicle התזונתי שלו. (B) Exchange המקטעים העצם בשוקה בין SLA העיקריים תואמים חזירים. (C) הליך הנמען: צרור עורקית ההשתלה: כלי הטיביאלי הגולגולת מוכנסים בזהירות לתוך התעלה מדולרי. (ד) Microvascular השקה של pedicle מזין לענף השריר הקדמי הטיביאלי תא וצלחת osteosynthesis של diaphysis הטיביאלי. בשימוש באישורו של מאיו קרן חינוך רפואי ומחקר. כל הזכויות שמורות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : נציג תמונה תלת-ממדית מיקרו-CT angiographic של קטע VCA tibial decalcified. מחזור הדם neongiogenic (חץ צהוב) מתואר לאחר זלוף עם פתרון הסיליקון בלייזר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
בחזירים מיניאטוריים הראה שום סימנים של מצוקה או השחתה עצמית. כל הפצעים החלימו ללא זיהום וחיות ambulated בדרך כלל, בסופו של דבר היכולת לשאת משקל על האיבר נכון המופעלים מהיום שלאחר הניתוח הראשון על. -נקודת הקצה מחקר בן 16 שבועותתאנון כל בחזירים מיניאטוריים יוקטן הרוויח מעל 150% ממשקל גופם המקורי (pretransplant: 56.0 ± 6.1 לעומת 16 שבועות posttransplant: 84.5 ± 6.0).
שבועיים של החיסוני, המורכב טקרולימוס, mycophenolate mofetil (MMF) מתילפרהדניזולון succinate שימשו כדי לשמור על זרימת הדם דרך pedicle התזונתי עד הספקת דם autogenous חדש הוקם בתוך allogeneic עצם allotransplant. במהלך השבוע 2 דגימות דם תקופתיות החיסוני לקוחים את הצנתר צוואר כדי להעריך את רמות התרופה בדם. במינון הותאמו כדי לשמור על רמות הדם שוקת של 5-30 ננוגרם למ"ל עבור טקרולימוס ו 1-3.5 µg/ml עבור MMF (טבלה 1). אין תרופה הקשורות סיבוכים אירעה וכיוונו שוקת רמות עבור טקרולימוס mycophenolate mofetil יכולה להיות מושגת (איור 3 ו 4 באיור).
| Immunosuppressant | המינון ההתחלתי | שוקת רמות | מינון אחזקה |
| טקרולימוס | 0.8-1.5 מ ג/ק ג/יום | 5-30 ננוגרם למ"ל | |
| Mycophenolate Mofetil | 50-70 מ"ג/ק"ג/יום | 1-3 µg/ml | |
| מתילפרהדניזולון נתרן succinate | 500 מ ג | 50 מ ג |
טבלה 1: המונח החיסוני פרוטוקול לקצר. מתואר הוא הפרוטוקול לדיכוי המערכת החיסונית עבור 2 השבועות הראשונים שלאחר השתלת עם המינון ההתחלתי עבור טקרולימוס, Mycophenolate mofetil ו Prednisolone. בנוסף מכוונים שוקת רמות טקרולימוס, Mycophenolate mofetil, המינון תחזוקה של Prednisolone מוצגים.
איור 3 : שוקת דם רמות טקרולימוס. החציון ואת טווח בין רבעוני של רמות שוקת מושגת עבור טקרולימוס מעל השתלת פוסט 2 שבועות הראשון מתוארים. קווי שגיאה מציינות את טווח בין רבעוני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : שוקת דם רמות Mycophenolate mofetil. החציון ואת טווח בין רבעוני של שוקת רמות הדם של Mycophenolate mofetil על התקופה immunosupression לטווח קצר של שבועיים מוצגים. קווי שגיאה מציינות את טווח בין רבעוני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
למרות הפסקת החיסוני אחרי שבועיים, הערכה תקופתית רדיולוגים בנקודות זמן שונות (2, 4, 6, 10 ו- 16 שבועות) של האיבר הינד נכון המופעלים באמצעות צילומי רנטגן גילה העצם פרוגרסיבי ריפוי על המחקר תקופה של 16 שבועות כאשר שניתנו על ידי משקיפים עצמאית, עיוור שני (איור 5)27,28. ניתוח מיקרו-CT בגיל 16 שבועותth שימש לכמת צפיפות של קסם, וכן גישור עצם היווצרות מארח/עצם VCA צמתי, עצם VCA allotransplant מראה27ונפח. תחזוקה של קיבוע פנימי ללא הפסד של הפחתה או להפסיד, קידום על ידי אספקת הדם autogenous חדש, יכול להיות והפגינו28. האיחוד osseous הושג ב כל tibias (איור 6).
איור 5: עצם התקדמות הריפוי מעל 16 שבועות. כדי להגדיר את העצם ריפוי התקדמות מודל רגרסיה לא ליניארית, היה בשימוש. ערך R2 שימש כדי להגדיר את ההתאמה של המודל לנתונים. באמצעות שיטת הניקוד, המבוסס על צילומי רנטגן anteroposterior, לרוחב, פונקציונלי אורתופדיים של העצם ש-VCA לתוך עצם סגמנטלי הפגם היה הבקיע עם ערך מרבי של 25 נקודות זמן שונות נקודות במהלך תקופת (2, 4, 6, 10 ו- 16 שבועות) על ידי שני משקיפים עצמאית, עיוור30,31. מודל רגרסיה לא ליניארית מתארת את החציון ואת טווח בין רבעוני עצם ריפוי ערכים במהלך תקופת (R2 = 0.931) מציג עצם רציפה ריפוי התקדמות קירוב את הערך של 25-16 שבועות. קווי שגיאה מציינות את טווח בין רבעוני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 : שחזור תלת מימדי של diaphysis הטיביאלי חזירי לאחר מיקרו-חישבתי הערכה טומוגרפי. נציג תלת מימדי שחושב תמונה של עצם השוקה המשוחזרת עם קיבוע פנימי צלחת-2 x גודל ממשי. בן 16 שבועות להשלים את האיחוד לאחר העצם בשוקה VCAs עם אנגיוגנזה כירורגי מוצג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
ניתוח היסטולוגית ב hematoxylin-אאוזין undecalcified צבעונית מקטעים, באמצעות סרגל כמתואר לעיל ציון דחייה (ללא, קלה, בינונית וקשה) גילה סימנים של דחייה חמורה, לפיה יכול להיות סימנים מתונים מתונות של דחייה הפגינו שלושת החזירים (איור 7)29.
איור 7: נציג דימוי אופקי hematoxylin-אאוזין צבעונית של VCA הטיביאלי הקטע. הסיליקון בלייזר ספינות פתרון מלא מוצג בראון (כוכבית). חדירה endosteal מתון ותגובה (חץ עבה) נתפסת עם יותר משני שליש lacunas מלא osteocytes (חץ קטן) על פי עצם קיימא. 10 X הגדלה. סרגל קנה מידה = 300 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השתלת עצם allogeneic vascularized (עצם VCA) עשוי לייצג אפשרות שיחזור בעתיד עבור פגמים osseous סגמנטלי גדולים. עם זאת, הצורך של ארוך-טווח-החיסוני (IS) לבין שלה תופעות לוואי משמעותיות הדרושים עבור עצם ההישרדות VCA קשים להצדיק בפרמיות--יישומים קריטיים אלה6.
למרות זנים המפגרים של החולדה במעבדה נעשה שימוש נרחב במחקר אלוגרפט לבחון גישות שונות למניעת וארוך-טווח-החיסוני, מודלים חזירי יכול לספק יתרונות משמעותיים8,9 . החזיר מיני יוקטן הינו אידיאלי עבור חקר תהליך מורכב של העצם VCA דחייה. מבחינה פיזיולוגית, התעריף החדש של היווצרות העצם משולה לאדם (מיקרומטר חזירים 1.2-1.5 ליום; בני אדם 1.0-1.5 מיקרומטר ליום בהתאמה)32. קווי דמיון אנטומיים לאפשר את השימוש orthotopic עצם שיקום באמצעות שתלים זהה בעיקרו כירורגי וטכניקות. ואולי הכי חשוב, alloresponse חזירי מוגדרים היטב-האפשר עשה על ידי התקדמות ציטוקין חזירי גילוי ופיתוח של אשכול אנטי-חזירי של בידול נוגדנים-גורם זה ולא של אחרים VCA לימודים קפדנית יותר33.
כמו בכל יישום קליני דומה, השיטה של העצם בשוקה חזירי פגם שחזור באמצעות עצם ש-VCA הוא תובעני מבחינה טכנית, הדורשים 2 צוות גישה עם מספיק למומחיות הכירורגית בניתוח microvascular ועצמות שחזור על מנת להשיג תוצאות לשחזור. תחזוקה קפדנית של פוסט ניתוחית בתנאים סטריליים, טיפול אנטיביוטי מונע perioperative הם חובה כדי להקטין את הסיכון לסיבוכים זיהומיות.
במחקרים קודמים באמצעות חולדות וארנבות לטווח קצר הוא הקפיד הכדאיות של עצם vascularized allotransplants ב 2 השבועות הראשונים דרך זלוף של העצם VCA באמצעות הכלי התזונתי allogeneic שלה. לאחר החיסוני נסיגה נמען נגזר כלי בתוך התעלה מדולרי בתנאי כורוידאלית המאפשר לטווח ארוך VCA ריפוי עצם הכדאיות10,11,12. על הקצה של המחקר, allotransplant ניכר chimerism יכול להיות שזוהו34,35,36. לנו יש התקדמתי ומוחלים המתודולוגיה שלנו ומבוססת עכבר, ארנב על המודל חזירי. מודל זה הוא ריאלי לבחון אמצעי חדש כדי לשמור על רקמות הכדאיות ללא IS לטווח ארוך במחקר VCA העצם, באמצעות ניתוח אנגיוגנזה מכלי autogenous מושתל, בשילוב עם IS לטווח קצר, יעיל החלפת עצם מתחקה כלי allogeneic כדי autogenous.
יתרון גדול של מודל זה על עצם חזירי קיימים אחרים המכיל דגמים VCA הוא עיצובו orthotopic המאפשר הערכה תפקודית של נשיאת משקל והערכה של תכונות מכניות, נתונים אשר דלילה במיוחד14, 37. מנגנון מורכב של עצם המקומי ומערכתית דחייה VCA ניתן לנטר בקלות דרך הערכה רדיולוגים היסטולוגיים של המקטע העצם בשוקה allotransplanted, כמו גם ניתוח ביולוגי מולקולרי של הדם ההיקפיים. בסופו של דבר התחלואה נמוכים של ההליך VCA עצם כירורגית מאפשרת לטווח ארוך עצם ההישרדות VCA וניתוח.
קיבוע פנימי יציב, העצם בשוקה allogeneic קטע תמורה ואיברים יישור הם חיוניים לאפשר ambulation של החזירים ביום שלאחר הניתוח הראשון דורש תכנון קפדני presurgical. השיטה שבחרנו באמצעות ג'יג חיתוך מעוצב מיוחד עבור עצם לשחזור ומדויק כריתה בשילוב עם צלחת osteosynthesis הוא יציב מספיק בשביל יאפשר קיבוע נוקשה ב allotransplants, אפילו בחולים עם אי התאמות גודל מינימלי.
מגבלה אחת של הטכניקה הציג היא כי אינו מאפשר הערכה של רקמות שונות רכיבים כמו העור והשריר חוץ הרכיב עצם vascularized. בעוד דש ללא הפרדות צבע כולל רקמות שונות רכיבים אפשריים, מודל זה תוכנן ללמוד אלוגרפט עצם בלעדיים כמו immunogenicity של compontents שונים של רקמות VCA משתנה38.
לסיכום, מאמר זה מספק מידע עבור הקמת דגם לשחזור בעלי חיים גדול עם גנטיקה שהוגדרו עבור עצם VCA מחקר. מודל זה יכול לשמש בסיס למחקרים עתידיים לחקור את ההשפעה של אנגיוגנזה כירורגי על זרימת הדם העצם ובניה עצם, עשויה למנוע את הצורך של החיסוני לטווח ארוך. יתר על כן זה יכול לשמש ניסחו את תהליך מורכב של עצם דחיית VCA ולבדוק אסטרטגיות modulatory המערכת החיסונית חדשניים אחרים. SLA-haplotypes והמוגדרים כימות של זו מדיניות-גנים חזירים תואמים-סקס עשוי לאפשר קביעת היקף chimerism של allotransplant ושל דם היקפיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
המחברים תודה את החלוקה של מדיה שירותי תמיכה, מאיו קליניק ברוצ'סטר, MN עבור הפקת וידאו וכן גאורגיוס Kotsougianis לעריכת הוידאו. הגרפיקה מעולה נערך על ידי ג'ים Postier, רוצ'סטר, MN. בנוסף, המחברים רוצים להודות קרן מחקר גרמני (פתוח) למתן תמיכה שכר עבור ד ר Dimitra Kotsougiani (DFG גרנט: KO 4903/1-1). עבודה זו נתמכה על ידי מתנה נדיבה של טארק א Obaid. עבודה זו בוצע במעבדה לחקר Microvascular, המחלקה של אורטופדי ניתוח מאיו קליניק רוצ'סטר, MN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylazine | VetTek, Bluesprings, MO | N/A | 2mg/kg |
| Telazol | Pfizer Inc., NY, NY | 2103 | 5mg/kg |
| Buprenorphine | Zoo Pharm, Windsor, CO | N/A | 0.18mg/kg |
| Cefazoline | Hospira, Lake Forest, IL | RL-4539 | 1g |
| Ethilon sutures | Ethicon, Sommerville, NJ | BV 130-5 | 9-0 |
| Locking plate | DePuy Synthes Vet, West Chester, PA | VP4041.09 | 9-hole 3.5mm locking plate |
| Vicryl sutures | Ethicon, Sommerville, NJ | J808T | 2-0, 3-0 |
| Tegaderm | 3M Health Care, St. Paul, MN | 16006 | 15x10cm |
| Hickman catheter | Bard Access System Inc., Salt Lake City, UT | 600560 | 9.6 French |
| Carprofen | Zoetis Inc., Kalamazoo, MI | 1760R-60-06-759 | 4mg/kg |
| Tacrolimus | Sandoz Inc., Princeton, NJ | 973975 | (0.8-1.5mg/kg/day) |
| Mycophenolate Mofetil | Sandoz Inc., Princeton, NJ | 772212 | (50-70mg/kg/day) |
| Methylprednisolone sodium succinate | Pfizer Inc., NY, NY | 2375-03-0 | 500 mg |
| Gentamicin | Sparhawk Laboratories, Lenexa, KS | 1405-41-0 | 3mg/kg |
| Dermabond Prineo | Ethicon, San Lorenzo, Puerto Rico | 6510-01-6140050 | |
| Isoflurane 99.9% 250 ml | Abbott Animal Health | 05260-5 | |
| Lactated Ringer's 1L | Baxter Corporation | JB1064 | |
| Saline 0.9%, 1 L | Baxter Corporation | 60208 | |
| Ceftiofur | Pfizer Canada Inc. | 11103 | 5mg/kg |
| Microfil | Flow Tech Inc, Carver, MA | MV-122 | 125 ml |
| Decalcifying Solution | Thermo Fisher Scientific, Chesire, WA, UK | 8340-1 |
References
- Ham, S. J., et al. Limb salvage surgery for primary bone sarcoma of the lower extremities: long-term consequences of endoprosthetic reconstructions. Ann Surg Oncol. 5, 423-436 (1998).
- Niimi, R., et al. Usefulness of limb salvage surgery for bone and soft tissue sarcomas of the distal lower leg. J Cancer Res Clin Oncol. 134, 1087-1095 (2008).
- Tukiainen, E., Asko-Seljavaara, S. Use of the Ilizarov technique after a free microvascular muscle flap transplantation in massive trauma of the lower leg. Clin Orthop Relat Res. , 129-134 (1993).
- Schipani, E., Maes, C., Carmeliet, G., Semenza, G. L. Regulation of osteogenesis-angiogenesis coupling by HIFs and VEGF. J Bone Miner Res. 24, 1347-1353 (2009).
- Murray, J. E. Organ transplantation (skin, kidney, heart) and the plastic surgeon. Plast Reconstr Surg. 47, 425-431 (1971).
- Ravindra, K. V., Wu, S., McKinney, M., Xu, H., Ildstad, S. T. Composite tissue allotransplantation: current challenges. Transplant Proc. 41, 3519-3528 (2009).
- Lantieri, L., et al. Face transplant: long-term follow-up and results of a prospective open study. Lancet. 388, 1398-1407 (2016).
- Brent, L. B. Tolerance and its clinical significance. World J Surg. 24, 787-792 (2000).
- Utsugi, R., et al. Induction of transplantation tolerance with a short course of tacrolimus (FK506): I. Rapid and stable tolerance to two-haplotype fully mhc-mismatched kidney allografts in miniature swine. Transplantation. 71, 1368-1379 (2001).
- Giessler, G. A., Zobitz, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. Host-derived neoangiogenesis with short-term immunosuppression allows incorporation and remodeling of vascularized diaphyseal allogeneic rabbit femur transplants. J Orthopaedic Res. 27, 763-770 (2009).
- Kremer, T., et al. Surgical angiogenesis with short-term immunosuppression maintains bone viability in rabbit allogenic knee joint transplantation. Plast Reconstr Surg. 131, 148e-157e (2013).
- Larsen, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. A modified vascularized whole knee joint allotransplantation model in the rat. Microsurgery. 30, 557-564 (2010).
- Ohno, T., Pelzer, M., Larsen, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. Host-derived angiogenesis maintains bone blood flow after withdrawal of immunosuppression. Microsurgery. 27, 657-663 (2007).
- Ibrahim, Z., et al. A modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (VCA) research. J Vis Exp. , (2013).
- Solla, F., et al. Composite tissue allotransplantation in newborns: a swine model. J Surg Res. 179, e235-e243 (2013).
- Ustuner, E. T., et al. Swine composite tissue allotransplant model for preclinical hand transplant studies. Microsurgery. 20, 400-406 (2000).
- Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class II genes in outbred pig populations. Anim Genet. 41, 428-432 (2010).
- Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class I genes in outbred pig populations. Anim Genet. 40, 468-478 (2009).
- Morin, N., Metrakos, P., Berman, K., Shen, Y., Lipman, M. L. Quantification of donor microchimerism in sex-mismatched porcine allotransplantation by competitive PCR. BioTechniques. 37, 74-76 (2004).
- van Dekken, H., Hagenbeek, A., Bauman, J. G. Detection of host cells following sex-mismatched bone marrow transplantation by fluorescent in situ hybridization with a Y-chromosome specific probe. Leukemia. 3, 724-728 (1989).
- Leonard, D. A., et al. Vascularized composite allograft tolerance across MHC barriers in a large animal model. Am J Transplant. 14, 343-355 (2014).
- Smith, D. M., Martens, G. W., Ho, C. S., Asbury, J. M. DNA sequence based typing of swine leukocyte antigens in Yucatan miniature pigs. Xenotransplantation. 12, 481-488 (2005).
- Ho, C. S., et al. Nomenclature for factors of the SLA system, update 2008. Tissue Antigens. 73, 307-315 (2009).
- Kaiser, G. M., Heuer, M. M., Fruhauf, N. R., Kuhne, C. A., Broelsch, C. E. General handling and anesthesia for experimental surgery in pigs. J Surg Res. 130, 73-79 (2006).
- Alghoul, M. S., et al. From simple interrupted to complex spiral: a systematic review of various suture techniques for microvascular anastomoses. Microsurgery. 31, 72-80 (2011).
- Acland, R. Signs of patency in small vessel anastomosis. Surgery. 72, 744-748 (1972).
- Kotsougiani, D., et al. Recipient-derived angiogenesis with short term immunosuppression increases bone remodeling in bone vascularized composite allotransplantation: A pilot study in a swine tibial defect model. J Orthopaedic Res. , (2016).
- Riegger, C., et al. Quantitative assessment of bone defect healing by multidetector CT in a pig model. Skeletal Radiol. 41, 531-537 (2012).
- Buttemeyer, R., Jones, N. F., Min, Z., Rao, U. Rejection of the component tissues of limb allografts in rats immunosuppressed with FK-506 and cyclosporine. Plast Reconstr Surg. 97, 149-151 (1996).
- Taira, H., Moreno, J., Ripalda, P., Forriol, F. Radiological and histological analysis of cortical allografts: an experimental study in sheep femora. Arch Orthop Trauma Surg. 124, 320-325 (2004).
- Giessler, G. A., Zobitz, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. Transplantation of a vascularized rabbit femoral diaphyseal segment: mechanical and histologic properties of a new living bone transplantation model. Microsurgery. 28, 291-299 (2008).
- Laiblin, C., Jaeschke, G. Clinical chemistry examinations of bone and muscle metabolism under stress in the Gottingen miniature pig--an experimental study. Berliner und Munchener tierarztliche Wochenschrift. 92, 124-128 (1979).
- Saalmuller, A. Characterization of swine leukocyte differentiation antigens. Immunol Today. 17, 352-354 (1996).
- Pelzer, M., Larsen, M., Friedrich, P. F., Aleff, R. A., Bishop, A. T. Repopulation of vascularized bone allotransplants with recipient-derived cells: detection by laser capture microdissection and real-time PCR. J Orthopaedic Res. 27, 1514-1520 (2009).
- Muramatsu, K., Kurokawa, Y., Kuriyama, R., Taguchi, T., Bishop, A. T. Gradual graft-cell repopulation with recipient cells following vascularized bone and limb allotransplantation. Microsurgery. 25, 599-605 (2005).
- Muramatsu, K., Bishop, A. T., Sunagawa, T., Valenzuela, R. G. Fate of donor cells in vascularized bone grafts: identification of systemic chimerism by the polymerase chain reaction. Plastic and reconstructive surgery. 111, 763-777 (2003).
- Vossen, M., et al. Bone quality and healing in a swine vascularized bone allotransplantation model using cyclosporine-based immunosuppression therapy. Plast Reconstr Surg. 115, 529-538 (2005).
- Lee, W. P., et al. Relative antigenicity of components of a vascularized limb allograft. Plast Reconstr Surg. 87, 401-411 (1991).
