Summary
Atualmente qualquer tipo de vascularizado composto allotransplantation depende de longo-prazo-imunossupressão, difícil de suportar para indicações não-vida-crítico. Apresentamos um novo porcina tibial VCA modelo que pode ser usado para estudar o osso VCA e demonstrar o uso da angiogênese cirúrgico para manter a viabilidade do osso sem a necessidade de modulação imune a longo prazo.
Abstract
Perda óssea segmentar resultantes de trauma, infecção malignidade e anomalia congênita permanece um grande desafio reconstrutivo. Opções terapêuticas atuais têm risco significativo de falha e morbidade substancial.
Uso do osso vascularizado composto allotransplantation (VCA) iria oferecer a ambos uma correspondência próxima do osso ressecado tamanho e forma e cicatrização e remodelação potencial de osso vivo. Actualmente, a imunossupressão drogas ao longo da vida (IS) é necessária. Riscos de neoplasia, infecção oportunista e toxicidade do órgão são motivo de preocupação para tratar tais indicações não-letal.
Demonstramos anteriormente que osso e articulação viabilidade VCA pode ser mantida em ratos e coelhos, sem a necessidade de longo-prazo-imunossupressão pela implantação do destinatários derivadas navios dentro a VCA. Ele gera uma circulação de neoangiogenic autógena, com fluxo mensurável e ativo osso que remodela, necessitando de apenas 2 semanas de IS. Como pequenos animais diferem de homem substancialmente em anatomia, fisiologia do osso e Imunologia, desenvolvemos um modelo VCA de osso de suínos para avaliar esta técnica antes de aplicação clínica é realizada. Suína em miniatura é atualmente amplamente utilizada para pesquisa de allotransplantation, dada suas similaridades imunológicas, anatômicas, fisiológicas e tamanho para homem. Aqui, descrevemos um novo osso tibial ortotópico porcina modelo VCA para testar o papel da angiogênese cirúrgico autógena para manter a viabilidade VCA.
Modelo defeitos segmentares osso tibial reconstrói usando segmentos de alogênico osso tibial tamanho - e forma-combinada, transplantadas através de uma grande incompatibilidade de antígeno (SLA) de leucócitos suína na suína de miniatura de Yucatán. Reparação de vasos nutrientes e implantação do destinatários derivadas autógenas navios dentro do canal medular dos segmentos ósseos tibial alogênico é executada em combinação com simultânea IS a curto prazo. Isto permite uma circulação autógenas neoangiogenic desenvolver a partir do tecido implantado, mantendo o fluxo através os alogênico vasos nutrientes para um curto período de tempo. Uma vez estabelecida, a nova circulação autógena mantém a viabilidade óssea após cessação da terapia medicamentosa e trombose de vasos nutrientes subsequentes.
Introduction
Grandes defeitos ósseos segmentares resultam de trauma, infecção ou cirurgia conservadora membro depois de malignidade. Atuais opções reconstrutivas como enxerto ósseo autógeno vascularizado, transporte ósseo, substituição protética e criopreservados aloenxertos necróticos, usado sozinho ou em combinação, são associadas com morbidade significativa e têm altas taxas de complicações1,2,3.
A presença de uma rede microvascular é essencial para a formação e a homeostase do osso, apoiando osteogênica, chondrogenic e células-tronco mesenquimais necessárias para reparação de osso4.
O transplante de osso alogênico vivo, uma forma de allotransplantation de tecido vascularizado composto (osso VCA), realizada com anastomose microcirúrgica de seu pedículo nutriente, pode representar uma futura alternativa reconstrutiva. Como osso alogênico criopreservado, estabilidade imediata é fornecida pela estreita correspondência morfologia do defeito ósseo. Como enxerto vascularizado autógeno, pois dá a cura reforçada e remodelação de viver tecido do osso. O obstáculo em qualquer procedimento de allotransplant permanece a necessidade de longo-prazo-imunossupressão (IS). O problema é mais agudo em tecidos músculo-esqueléticos, que exigem doses de drogas 2 - 3 vezes maiores do que5transplantes de órgãos. Riscos concomitantes, incluindo toxicidade do órgão, malignidade, infecção ou desenvolvimento de doença do enxerto - versus - host são difíceis de justificar estes nonlife--aplicativos críticos6. No entanto, episódios de rejeição aguda e crônica permanecem um grande problema com o atual a longo prazo é7. Esforço contínuo para perto coincidir com antígenos de histocompatibilidade, induzir tolerância específicos do doador e/ou melhorar a imunoterapia droga não ainda rotineiramente conseguiram no processo de licenciamento clínico drogas tecido sobrevivência8,9.
Nós demonstramos anteriormente os meios para manter o osso viabilidade VCA e melhorar o osso que remodela em modelos animais pequenos, pela promoção de uma nova circulação autógena dentro osso transplantado. Isso é feito pelo uso adicional da angiogênese cirúrgica de tecido autógeno implantado10,11,12. Segmentos ósseos alogênico são transplantados hipoglossal com anastomose do pedículo de segmento ósseo de nutrientes. Além disso anfitrião-derivado dos navios são implantados dentro do canal medular do segmento ósseo vascularizado alogênico. Durante esse processo de 2 semanas, patência do vaso nutriente alogênico é mantida com imunossupressão drogas. Após IS-retirada, o pedículo nutriente irá eventualmente thrombose13. O novo leito capilar, baseado nos navios derivado de acolhimento fornece suficiente circulação para manter a viabilidade do tecido. Óssea, remodelação e cura é reforçada desde a osteogênese e angiogênese é acoplados10,11,12. Imunoterapia não mais é necessária e viabilidade do osso é mantida a longo prazo, apesar de um host imunologicamente competente e ausência de tolerância específicos do doador.
Tradução deste novo método de allotransplantation óssea na prática clínica melhor deve ser precedida por um estudo mais aprofundado de cura, mecânica Propriedades e Imunologia em um modelo animal grande. O modelo porcino é ideal para tais VCA pesquisa14,15,16. Suína em miniatura é comparáveis em tamanho e anatomia para homem, permitindo a reconstrução esquelética, utilizando técnicas e implantes cirúrgicos essencialmente idênticos. Imunologia de suínos é bem definida, incluindo a suína leucócitos haplótipos de antígeno (SLA) e tipos de sangue, necessários para a cirurgia de transplante. Estudos de linhagem de célula são possíveis com transplante de sexo-incompatíveis, como análises detalhadas das respostas imunes17,18,19,20,21.
Aqui, descrevemos um modelo de allotransplantation de VCA de osso no porco de miniatura de Yucatan, apropriado para o estudo da perda óssea segmentar e reconstrução. Este modelo pode ser usado para investigar a interação da angiogênese cirúrgica e a curto prazo é osso sobrevivência VCA função, incluindo a linhagem osteócito, óssea e fluxo de sangue, cura e remodela as capacidades, alloresponsiveness e biomecânica, bem como para teste outras estratégias inovadoras de moduladora imunológica.
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Protocol
O estudo foi aprovado pelo Comitê de uso (IACUC) na Mayo Clinic Rochester e institucional Cuidado Animal. Suína em miniatura de Yucatan estava servindo como doadores e receptores durante este procedimento cirúrgico de VCA. Emparelhamento do doador e do receptor foi baseada em DNA sequência suína leucócitos haplotyping de antígeno (SLA) para garantir uma grande incompatibilidade no. 22,os SLAs23. Os animais foram idade e peso-correspondência e do tipo de sangue idêntico. Duas equipes cirúrgicas colhidas de um segmento de osso da tíbia suína com seu navio nutriente do doador e preparado o destinatário para receber o segmento colocado orthopically óssea alogênico tibial simultaneamente. Simultaneamente com microvascular reparar o vaso nutriente de osso, um pacote arteriovenoso derivado de destinatário foi colocado dentro do segmento tibial para angiogênese autógeno.
1. pré-operatória preparações
- Rápido suína de Yucatan em miniatura no dia antes do procedimento e pesá-los para a administração de drogas controladas.
- Sedar animais com xilazina (2 mg/kg) e a combinação de tiletamina HCL e eficiente HCL (5 mg/kg), administrados por via subcutânea.
- Coloque um cateter periférico em uma veia de orelha para drogas intravenosas e entrega de solução salina e administrar a buprenorfina (0,18 mg/kg) e antibioticoterapia profilática (1G cefazolina intravenosa e 5 mg/kg ceftiofur intramuscular).
- Raspe o membro posterior direito e esquerdo pescoço que servirá como local de colheita para o segmento ósseo vascularizado tibial e local para a colocação do cateter venoso central, respectivamente.
- Verificar os sinais vitais e o nível de sedação, testando o relaxamento dos músculos da boca.
- Entube o animal com um tubo endotraqueal apropriadamente dimensionado em prostração esternal24.
- Transferir os suínos em miniatura para a mesa de operação e se conectar a uma máquina de ventilador para a manutenção da anestesia através da administração de isoflurano (1-3%).
- Confirme a profundidade anestésica através do teste de reflexos de luz e corneais palpebrais, Pupilares.
- Monitorar a saturação de oxigênio com uma sonda de transmissão do oxímetro de pulso anexada à orelha. Use uma sonda de pressão braçadeira e temperatura para monitorização intraoperatória sinal vital.
- Coloque suína de Yucatan em miniatura na posição supina sobre uma almofada de aquecimento. Além disso, use uma manta de aquecimento de ar forçado durante a operação para evitar a hipotermia.
- Use vet pomada nos olhos para evitar ressecamento enquanto sob anestesia.
2. a colheita de um segmento ósseo vascularizado Tibial
- Lave a perna direita de cada suíno em miniatura com solução de iodo-povidona. Secar a pele com uma toalha estéril e armar a extremidade de forma estéril. Envelop e isolar o membro com uma cortina de incisão adesivo impregnados de iodo para minimizar o risco de contaminação.
- Realize uma incisão com um bisturi anterolateralmente o membro posterior, começando na articulação do joelho, estendendo distalmente ao longo da crista anterior da tíbia na articulação tibiotalar.
- Dissecar a pele e o tecido subcutâneo com uma tesoura e retrair os músculos do compartimento anterior da tíbia lateralmente.
Nota: Lançamento da origem músculo anterior tibial facilita a exposição. A membrana interóssea agora é exposta. - Identificar a artéria tibial cranial e veia (para ser mais tarde usado como o pacote arteriovenoso para a angiogênese cirúrgica).
Nota: A veia e artéria tibial cranial mentem na face anterior da membrana interóssea. - Para melhorar o campo de visão operativo, liberar uma parte do músculo tibial anterior de sua inserção e remover uma parte da crista da tíbia usando uma serra oscilatória.
- Protegendo os vasos tibiais cranianos, entalha o início de membrana interóssea a nível do tubérculo tibial com uma tesoura.
- Visualize os vasos tibiais caudais, executando distalmente sob a membrana.
Nota: Eles ramificação dos vasos tibiais cranianos e dão origem ao pedículo nutrientes da diáfise da tíbia apenas distal ao tubérculo. Agora é possível visualizar o forame nutriente e os navios que entram a tíbia em sua superfície lateral posterior só distal ao tubérculo tibial. - Marca o pedículo nutriente com um microclamp. Não retire o pedículo vascular.
- Identificar um ramo do músculo no compartimento anterior da tíbia perto do forame de nutrientes; Isto pode ser utilizado para a anastomose no navio de nutrientes allotransplant ósseo vascularizado. Marca o ramo muscular com um microclamp.
-
Colheita de um segmento de osso da tíbia de 3,5 cm incluindo o pedículo vascular.
- Use um gabarito de corte para garantir uma ressecção óssea precisos e reprodutíveis. Posição e correção o corte o gabarito na superfície medial da tíbia para incluir o forame nutriente e vasos.
- Guiado pelo jig, realize cortes ósseos paralela com uma serra oscilatória para remover um segmento tibial de 3,5 cm. Use o mesmo posicionamento e gabarito para doador e receptor animais para maximizar o tamanho e forma combinar.
- Use um gabarito de corte para garantir uma ressecção óssea precisos e reprodutíveis. Posição e correção o corte o gabarito na superfície medial da tíbia para incluir o forame nutriente e vasos.
- Uma vez que ambos os cortes foram feitos com a serra oscilatória, rode o segmento ósseo tibial para visualizar o pedículo nutriente na superfície posterior. Divida o pedículo nutriente na origem da artéria tibial cranial com uma tesoura. Dissecar e livre do segmento tibial com tesoura, deixando um manguito fino do periósteo e músculo na sua superfície.
- Retrair o segmento ósseo tibial e elevar o segmento ósseo da tíbia com seu pedículo vascular com uma pinça afiada, deixando a artéria tibial cranial no lugar.
Nota: O segmento ósseo vascularizado está agora pronto para transferência microvascular e foi criado um defeito ósseo tibial de 3,5 cm em cada suína de miniatura de Yucatán. - Ligar os vasos tibiais cranianos no tornozelo com Poliglactina absorvível suturas 3-0, libertando-os com uma braçadeira de tecido perivascular para criar um pacote de arteriovenosa (AV). Deixe o suturas pelo menos 5 cm de comprimento para facilitar a implantação no segmento de osso da tíbia.
3. ortotópico osso Tibial VCA reconstrução em combinação com angiogênese cirúrgica
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Troca os segmentos de osso tibial colhidos com seus pedículos nutrientes entre os dois animais para usá-los como VCAs de ossos.
- Para permitir a passagem do crânio tibial bundle arteriovenosa (AV) no segmento de osso tibial, remova o V em forma de segmento do site da junção proximal usando a serra oscilatória.
- Faça um furo de 0,5 cm de diâmetro na parte distal do local do defeito ósseo tibial e dentro do canal medular do segmento ósseo tibial e introduzir o feixe AV destinatário que tem sido ligado distalmente, o canal intramedullary promover subsequentes autógenas fornecimento de sangue novo.
-
Coloque o orthotopically de segmento ósseo tibial vascularizado o defeito do destinatário.
- Se anastomosam pedículo nutriente do segmento ósseo tibial ao ramo muscular preparado do compartimento anterior da tíbia de fim-de-final forma usando a técnica de sutura interrompido simples e 9-0 suturas25.
- Confirme a patência de anastomose microvascular utilizando o teste de ordenha26.
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Alcançar a osteossíntese usando um 9 buracos 3,5 mm placa de bloqueio.
- Coloque a placa de 9 buracos no anteromedially da tíbia. Fixe a placa com três parafusos bicorticais, acima e abaixo do segmento ósseo tibial. Além disso, colocar os parafusos monocortical no segmento ósseo tibial para fixação interna. Para confirmar correto posicionamento do osso VCA e placa, use ântero-posterior e laterais radiografias.
- Executar fascial e fechamento de pele em camadas usando interrompido 3-0 e 2-0 reabsorvível. Finalmente feche a ferida com um penso oclusivo transparente.
4. colocação de cateter venoso central na veia Jugular externa
-
Para a administração de drogas pós-operatório e imunossupressoras (IS) drogas monitoramento em nível, coloca um cateter venoso em veia jugular externa, usando uma técnica aberta. Execute a colocação na conclusão do processo de allotransplantation sob anestesia (ver seção 1).
- Realize uma incisão ântero-lateral no pescoço com um bisturi. Dissecar o tecido subcutâneo com uma tesoura e expor a veia jugular esquerda.
- Coloque um cateter de Hickman na veia jugular através de um pequeno buraco na veia jugular externa e fixe-a com suturas não absorvíveis. Exteriorize o cateter nas costas por tunelamento por via subcutânea.
- Fixar o cateter no lugar para a pele e fechar o pescoço em camadas usando interrompido absorvível 3-0 e 2-0.
- Coloque curativos oclusivos sobre a incisão. Use um curativo de arrastão para segurar as bandagens e o cateter no lugar.
5. no pós-operatório de tratamento e seguimento
- Imediatamente após a operação, trate o porco de miniatura de Yucatan com uma injeção intramuscular de carprofeno (4 mg/kg) para analgesia pós-operatória. Administre a buprenorfina (0,18 mg/kg) para tratar a dor de intensidade elevada, conforme necessário.
- Permitir que o porco se recuperar para 60 min e em seguida, retornar o porco para uma unidade de cuidados intensivos especial pan e monitor de perto até a completa recuperação.
- Mova os suínos de miniatura de Yucatan para um normal da gaiola e fornecem acesso ad libitum para água e comida.
- Administrar o tacrolimus (0,8-1,5 mg/kg/dia) e micofenolato mofetil (MMF) (50-70 mg/kg/dia) por via oral e metilprednisolona succinato de sódio por via intravenosa (começando com 500 mg/dia) por duas semanas.
- Ajustar doses diárias de drogas imunossupressoras, de acordo com os níveis de sangue de calha, apontando para 5.0-30,0 ng/mLpara tacrolimus e 1.0-3.5 µ g/mL para MMF, respectivamente. Reduza a dose de metilprednisolona gradualmente até atingir a dose de manutenção de 50 mg por dia.
- Administrar gentamicina antibióticos profiláticos (3 mg/kg por via intravenosa) e ceftiofur (5 mg/kg por via intramuscular) por duas semanas.
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Representative Results
A técnica descrita foi realizada com sucesso em quatro SLA grande incompatíveis Yucatan miniatura suína e segmentares defeitos tibiais reconstruídos usando VCA tibial tamanho correspondente. Reparação de vasos nutrientes simultânea de allotransplant o osso e a implantação de um pacote de AV do destinatário animal dentro do canal medular allotransplant permitido tanto circulação óssea imediata e desenvolvimento de um novo suprimento de sangue autógeno sobre tempo (Figura 1). Às 16 semanas uma circulação de neoangiogenic tinha sido estabelecida VCAs tudo tibiais, visualizados por Micro computado tomográfica angiografia (micro-CT) após injeção de um polímero angiográfico radiopaco (125 ml) para os vasos femorais e descalcificação de o VCA tibial (Figura 2).
Figura 1 : Ortotópico osso tibial procedimento VCA. Diagrama mostrando o procedimento cirúrgico. (A) procedimento de doador: colheita de um segmento ósseo da tíbia com seu nutrientes do pedículo. (B) troca de segmentos de osso tibial entre SLA grande incompatibilidade de porcos. (C) procedimento de destinatário: implantação do bundle arteriovenosa: vasos tibiais cranianos são cuidadosamente inseridos dentro do canal medular. (D) anastomose Microvascular do pedículo nutriente ao ramo muscular da osteossíntese da tíbia anterior compartimento e placa da diáfise da tíbia. Usado com permissão da Fundação de Mayo para a educação médica e pesquisa. Todos os direitos reservados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Representante 3D micro-CT angiográfica imagem de um segmento VCA tibial descalcificada. A circulação de neongiogenic (seta amarela) é retratada após perfusão com uma solução de silicone radiopaco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Suínos de miniatura não mostrou sinais de aflição ou automutilação. Todas as feridas sararam sem infecção e animais ambulated, normalmente, em última análise, capazes de suportar todo o peso sobre o membro operado certo desde o primeiro dia de pós-operatório em. No ponto de extremidade estudo de 16 semanas deth todos os suínos de miniatura de Yucatán ganhou mais 150% de seu peso original (pretransplant: 56.0 ± 6,1 versus 16 semanas pós-transplante: 84.5 ± 6.0).
Duas semanas de imunossupressão, consistindo de tacrolimus, micofenolato de mofetil (MMF) e succinato de metilprednisolona foram usados para manter o fluxo de sangue através do pedículo nutriente até um novo suprimento de sangue autógeno tinha sido estabelecido o alogênico allotransplant de osso. Durante a semana 2 foram colhidas amostras de sangue periódicas de imunossupressão do cateter na jugular para avaliar os níveis sanguíneos de drogas. Doses foram ajustados para manter os níveis sanguíneos de calha de 5-30 ng/ml para tacrolimus e 1-3.5 µ g/ml para MMF (tabela 1). Nenhuma droga relacionadas com complicações ocorreram e visam, níveis de calha para tacrolimus e micofenolato mofetil poderia ser alcançado (Figura 3 e Figura 4).
| Imunossupressor | Dose inicial | Níveis de calha | Dose de manutenção |
| Tacrolimus | 0.8-1.5 mg/kg/dia | 5-30 ng/ml | |
| O micofenolato de Mofetil | 50-70 mg/kg/dia | 1-3 µ g/ml | |
| Metilprednisolona succinato de sódio | 500 mg | 50 mg |
Tabela 1: curto protocolo de imunossupressão termo. Retratado é o protocolo de imunossupressor nas primeiras 2 semanas pós transplante com a dose inicial para Tacrolimus, micofenolato de mofetil e prednisolona. Níveis de calha adicionalmente voltada para Tacrolimus e micofenolato de mofetil e a dose de manutenção de prednisolona são mostrados.
Figura 3 : Os níveis sanguíneos de calha para Tacrolimus. A mediana e intervalo interquartil dos níveis alcançados calha para Tacrolimus sobre o primeiro 2 semanas pós transplante são retratados. Barras de erro indicam o intervalo interquartil. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Os níveis sanguíneos de calha para micofenolato de mofetil. A mediana e intervalo interquartil de níveis sanguíneos de calha de micofenolato de mofetil durante o período de immunosupression a curto prazo de 2 semanas são mostrados. Barras de erro indicam o intervalo interquartil. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Apesar de cessação de imunossupressão após duas semanas, a avaliação radiológica periódica nos pontos de tempo diferentes (2, 4, 6, 10 e 16 semanas) de certo membro hind operado com raios x revelou progressiva consolidação sobre o estudo período de 16 semanas, quando classificados por 27,de dois observadores independentes e cegos (Figura 5)28. Análise de micro-CT às 16 semanas deth foi utilizada para quantificar o volume e densidade de calo, bem como a formação de osso no osso VCA allotransplant aparência27e entroncamentos VCA/osso hospedeiro-ponte. Manutenção de fixação interna, sem perda de redução ou perda, promovido pela nova oferta de sangue autógeno, poderia ser demonstrada28. União óssea foi alcançado em todas as tíbias (Figura 6).
Figura 5: Osso cura progressão ao longo de 16 semanas. Para definir a progressão de um modelo de regressão não-linear de consolidação foi usada. O valor R2 foi usado para definir o ajuste do modelo aos dados. Usando um sistema de pontuação, com base na radiografia ântero-posterior e lateral da osseointegração do osso que VCA em defeito ósseo segmentar foi marcado com um valor máximo de 25 pontos em horários diferentes pontos ao longo do período de estudo (2, 4, 6, 10 e 16 semanas) por dois observadores independentes e cegos30,31. O modelo de regressão não-linear retrata a mediana e intervalo interquartil para a consolidação de valores ao longo do período de estudo (R2 = 0,931) mostrando uma contínua consolidação progressão aproximar o valor de 25 em 16 semanas. Barras de erro indicam o intervalo interquartil. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Reconstrução tridimensional da diáfise da tíbia suína após avaliação tomográfica micro computado. Representante tridimensional computadorizada imagem da tíbia reconstruída com fixação da placa interna em 2x o tamanho real. A 16 semanas completa União depois de osso tibial VCAs com angiogênese cirúrgica é mostrado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A análise histológica em hematoxilina-eosina undecalcified manchada seções, usando uma escala descrita anteriormente classificação rejeição (nenhum, leve, moderada e severa) não revelou nenhum sinal de rejeição severa, segundo a qual sinais leves e moderados de rejeição podem ser demonstrada em três porcos (Figura 7)29.
Figura 7: Imagem representativa de um horizontal hematoxilina-eosina manchado seção de um VCA tibial. Silicone radiopaco, vasos cheio de solução são exibidos marrom (asterisco). Leve infiltração endosteal e reação (seta grossa) é visto com mais de dois terços das lacunas cheios osteócitos (seta pequena) em conformidade com o osso viável. Ampliação de 10x. Barra de escala = 300 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O transplante de osso alogênico vascularizado (osso VCA) pode representar uma futura opção reconstrutiva para grandes defeitos ósseos segmentares. No entanto, a necessidade de longo-prazo-imunossupressão (IS) e seus efeitos colaterais significativos necessários para osso sobrevivência VCA são difíceis de justificar estes nonlife--aplicativos críticos6.
Apesar de linhagens puras do rato de laboratório têm sido amplamente utilizadas na pesquisa allotransplantation para testar várias abordagens para a vacância de longo-prazo-imunossupressão, modelos suínos podem fornecer vantagens significativas8,9 . O porco mini Yucatan é ideal para o estudo do processo complexo de osso rejeição VCA. Fisiologicamente, a taxa de formação de osso novo é comparável ao homem (porcos 1,2-1,5 µm por dia; os humanos 1,0-1,5 µm por dia respectivamente)32. Semelhanças anatômicas habilitar o uso de reconstrução óssea ortotópico, usando técnicas e implantes cirúrgicos essencialmente idênticos. Talvez mais importante, o alloresponse suína bem definida-feito possível pelo progresso na detecção de suínos citocinas e desenvolvimento do cluster antisuíno de diferenciação de anticorpos-faz isto e outro VCA estuda mais rigorosa33.
Como em qualquer aplicação clínica semelhante, o método de reconstrução de defeito ósseo tibial suínos usando osso que VCA é tecnicamente exigente, exigindo um dois equipe abordagem com suficiente experiência cirúrgica em cirurgia microvascular e osso de reconstrução, a fim de obter resultados reprodutíveis. Estrita manutenção de condições estéreis intra-operatória e profilaxia antibiótica perioperatório são obrigatórios para diminuir o risco de complicações infecciosas.
Em estudos anteriores usando ratos e coelhos a curto prazo é mantido viabilidade do allotransplants ósseo vascularizado nas primeiras 2 semanas através de perfusão do osso VCA através de seu vaso nutriente alogênico. Após destinatário de retirada de imunossupressão derivado dos navios dentro do canal medular fornecidas neovascularização permitindo VCA consolidação a longo prazo e a viabilidade de11,10,12. No ponto de extremidade estudo, quimerismo allotransplant substancial poderia ser detectado34,35,36. Nós temos mudou-se para a frente e aplicado nossa metodologia bem estabelecida, rato e coelho no modelo porcino. Este modelo é viável para testar um novo meio para manter a viabilidade do tecido sem IS a longo prazo na investigação de osso VCA, com angiogênese cirúrgica de implantado autógenos navios combinados com IS a curto prazo, efetivamente mudar a circulação de osso de alogênico aos navios autógenos.
Uma grande vantagem deste modelo sobre outro osso de suínos existente contendo modelos VCA é seu design ortotópico permitindo avaliação funcional do rolamento de peso e avaliação de propriedades mecânicas, dados que são especialmente esparsa14, 37. o mecanismo complexo de osso local e sistêmico rejeição VCA facilmente pode ser monitorizado através da avaliação radiológica e histológica do segmento allotransplanted osso da tíbia, bem como a análise biológica molecular de sangue periférico. Em última análise, a baixa morbidade do procedimento cirúrgico osso VCA permite osso longo prazo sobrevivência VCA e análise.
Fixação interna estável, alinhamento de aposição e membro de segmento ósseo tibial alogênico adequada são cruciais para permitir a deambulação dos suínos no primeiro dia de pós-operatório e exigem planejamento pré-operatório cuidadoso. O método selecionadas usando um gabarito de corte especial projetado para ressecção óssea precisos e reprodutíveis combinada com osteossíntese da placa é suficientemente estável para permitir fixação rígida em allotransplants, mesmo naqueles com incompatibilidades de tamanho mínimo.
Uma limitação da técnica apresentada é que não permite a avaliação dos componentes de diferentes tecidos como pele e músculo além do componente ósseo vascularizado. Enquanto um retalho composto, incluindo componentes de diferentes tecidos é possível, este modelo foi concebido para estudar allotransplantation exclusiva de osso como a imunogenicidade de vários compontents de tecido VCA varia de38.
Em conclusão, este artigo fornece informações para o estabelecimento de um modelo animal grande pode ser reproduzido com genética definida para osso pesquisa VCA. Este modelo pode servir como base para futuros estudos investigando a influência da angiogênese cirúrgica no fluxo de sangue do osso e remodelação óssea e pode eliminar a necessidade de imunossupressão a longo prazo. Além dele pode ser usado para delinear o processo complexo de osso rejeição VCA e testar outras estratégias inovadoras de moduladora imunológica. Definidos SLA-haplótipos e quantificação de SRY-genes em porcos sexo-incompatíveis podem permitir a determinação do grau de quimerismo do allotransplant e do sangue periférico.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Os autores graças a divisão de mídia serviços de apoio, Mayo Clinic Rochester, MN para produção de vídeo, bem como Georgios Kotsougianis para edição de vídeo. A excelente obra de arte foi conduzida por Jim Postier, Rochester, MN. Além disso, os autores desejam agradecer à Fundação de pesquisa alemã (Deutsche Forschungsgemeinschaft) para fornecer suporte de salário para Dr. Dimitra Kotsougiani (concessão DFG: KO 4903/1-1). Este trabalho foi apoiado por um presente generoso do Tarek E. Obaid. Este trabalho foi realizado no laboratório de pesquisa Microvascular, departamento de ortopedia cirurgia Mayo Clinic Rochester, MN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylazine | VetTek, Bluesprings, MO | N/A | 2mg/kg |
| Telazol | Pfizer Inc., NY, NY | 2103 | 5mg/kg |
| Buprenorphine | Zoo Pharm, Windsor, CO | N/A | 0.18mg/kg |
| Cefazoline | Hospira, Lake Forest, IL | RL-4539 | 1g |
| Ethilon sutures | Ethicon, Sommerville, NJ | BV 130-5 | 9-0 |
| Locking plate | DePuy Synthes Vet, West Chester, PA | VP4041.09 | 9-hole 3.5mm locking plate |
| Vicryl sutures | Ethicon, Sommerville, NJ | J808T | 2-0, 3-0 |
| Tegaderm | 3M Health Care, St. Paul, MN | 16006 | 15x10cm |
| Hickman catheter | Bard Access System Inc., Salt Lake City, UT | 600560 | 9.6 French |
| Carprofen | Zoetis Inc., Kalamazoo, MI | 1760R-60-06-759 | 4mg/kg |
| Tacrolimus | Sandoz Inc., Princeton, NJ | 973975 | (0.8-1.5mg/kg/day) |
| Mycophenolate Mofetil | Sandoz Inc., Princeton, NJ | 772212 | (50-70mg/kg/day) |
| Methylprednisolone sodium succinate | Pfizer Inc., NY, NY | 2375-03-0 | 500 mg |
| Gentamicin | Sparhawk Laboratories, Lenexa, KS | 1405-41-0 | 3mg/kg |
| Dermabond Prineo | Ethicon, San Lorenzo, Puerto Rico | 6510-01-6140050 | |
| Isoflurane 99.9% 250 ml | Abbott Animal Health | 05260-5 | |
| Lactated Ringer's 1L | Baxter Corporation | JB1064 | |
| Saline 0.9%, 1 L | Baxter Corporation | 60208 | |
| Ceftiofur | Pfizer Canada Inc. | 11103 | 5mg/kg |
| Microfil | Flow Tech Inc, Carver, MA | MV-122 | 125 ml |
| Decalcifying Solution | Thermo Fisher Scientific, Chesire, WA, UK | 8340-1 |
References
- Ham, S. J., et al. Limb salvage surgery for primary bone sarcoma of the lower extremities: long-term consequences of endoprosthetic reconstructions. Ann Surg Oncol. 5, 423-436 (1998).
- Niimi, R., et al. Usefulness of limb salvage surgery for bone and soft tissue sarcomas of the distal lower leg. J Cancer Res Clin Oncol. 134, 1087-1095 (2008).
- Tukiainen, E., Asko-Seljavaara, S. Use of the Ilizarov technique after a free microvascular muscle flap transplantation in massive trauma of the lower leg. Clin Orthop Relat Res. , 129-134 (1993).
- Schipani, E., Maes, C., Carmeliet, G., Semenza, G. L. Regulation of osteogenesis-angiogenesis coupling by HIFs and VEGF. J Bone Miner Res. 24, 1347-1353 (2009).
- Murray, J. E. Organ transplantation (skin, kidney, heart) and the plastic surgeon. Plast Reconstr Surg. 47, 425-431 (1971).
- Ravindra, K. V., Wu, S., McKinney, M., Xu, H., Ildstad, S. T. Composite tissue allotransplantation: current challenges. Transplant Proc. 41, 3519-3528 (2009).
- Lantieri, L., et al. Face transplant: long-term follow-up and results of a prospective open study. Lancet. 388, 1398-1407 (2016).
- Brent, L. B. Tolerance and its clinical significance. World J Surg. 24, 787-792 (2000).
- Utsugi, R., et al. Induction of transplantation tolerance with a short course of tacrolimus (FK506): I. Rapid and stable tolerance to two-haplotype fully mhc-mismatched kidney allografts in miniature swine. Transplantation. 71, 1368-1379 (2001).
- Giessler, G. A., Zobitz, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. Host-derived neoangiogenesis with short-term immunosuppression allows incorporation and remodeling of vascularized diaphyseal allogeneic rabbit femur transplants. J Orthopaedic Res. 27, 763-770 (2009).
- Kremer, T., et al. Surgical angiogenesis with short-term immunosuppression maintains bone viability in rabbit allogenic knee joint transplantation. Plast Reconstr Surg. 131, 148e-157e (2013).
- Larsen, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. A modified vascularized whole knee joint allotransplantation model in the rat. Microsurgery. 30, 557-564 (2010).
- Ohno, T., Pelzer, M., Larsen, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. Host-derived angiogenesis maintains bone blood flow after withdrawal of immunosuppression. Microsurgery. 27, 657-663 (2007).
- Ibrahim, Z., et al. A modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (VCA) research. J Vis Exp. , (2013).
- Solla, F., et al. Composite tissue allotransplantation in newborns: a swine model. J Surg Res. 179, e235-e243 (2013).
- Ustuner, E. T., et al. Swine composite tissue allotransplant model for preclinical hand transplant studies. Microsurgery. 20, 400-406 (2000).
- Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class II genes in outbred pig populations. Anim Genet. 41, 428-432 (2010).
- Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class I genes in outbred pig populations. Anim Genet. 40, 468-478 (2009).
- Morin, N., Metrakos, P., Berman, K., Shen, Y., Lipman, M. L. Quantification of donor microchimerism in sex-mismatched porcine allotransplantation by competitive PCR. BioTechniques. 37, 74-76 (2004).
- van Dekken, H., Hagenbeek, A., Bauman, J. G. Detection of host cells following sex-mismatched bone marrow transplantation by fluorescent in situ hybridization with a Y-chromosome specific probe. Leukemia. 3, 724-728 (1989).
- Leonard, D. A., et al. Vascularized composite allograft tolerance across MHC barriers in a large animal model. Am J Transplant. 14, 343-355 (2014).
- Smith, D. M., Martens, G. W., Ho, C. S., Asbury, J. M. DNA sequence based typing of swine leukocyte antigens in Yucatan miniature pigs. Xenotransplantation. 12, 481-488 (2005).
- Ho, C. S., et al. Nomenclature for factors of the SLA system, update 2008. Tissue Antigens. 73, 307-315 (2009).
- Kaiser, G. M., Heuer, M. M., Fruhauf, N. R., Kuhne, C. A., Broelsch, C. E. General handling and anesthesia for experimental surgery in pigs. J Surg Res. 130, 73-79 (2006).
- Alghoul, M. S., et al. From simple interrupted to complex spiral: a systematic review of various suture techniques for microvascular anastomoses. Microsurgery. 31, 72-80 (2011).
- Acland, R. Signs of patency in small vessel anastomosis. Surgery. 72, 744-748 (1972).
- Kotsougiani, D., et al. Recipient-derived angiogenesis with short term immunosuppression increases bone remodeling in bone vascularized composite allotransplantation: A pilot study in a swine tibial defect model. J Orthopaedic Res. , (2016).
- Riegger, C., et al. Quantitative assessment of bone defect healing by multidetector CT in a pig model. Skeletal Radiol. 41, 531-537 (2012).
- Buttemeyer, R., Jones, N. F., Min, Z., Rao, U. Rejection of the component tissues of limb allografts in rats immunosuppressed with FK-506 and cyclosporine. Plast Reconstr Surg. 97, 149-151 (1996).
- Taira, H., Moreno, J., Ripalda, P., Forriol, F. Radiological and histological analysis of cortical allografts: an experimental study in sheep femora. Arch Orthop Trauma Surg. 124, 320-325 (2004).
- Giessler, G. A., Zobitz, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. Transplantation of a vascularized rabbit femoral diaphyseal segment: mechanical and histologic properties of a new living bone transplantation model. Microsurgery. 28, 291-299 (2008).
- Laiblin, C., Jaeschke, G. Clinical chemistry examinations of bone and muscle metabolism under stress in the Gottingen miniature pig--an experimental study. Berliner und Munchener tierarztliche Wochenschrift. 92, 124-128 (1979).
- Saalmuller, A. Characterization of swine leukocyte differentiation antigens. Immunol Today. 17, 352-354 (1996).
- Pelzer, M., Larsen, M., Friedrich, P. F., Aleff, R. A., Bishop, A. T. Repopulation of vascularized bone allotransplants with recipient-derived cells: detection by laser capture microdissection and real-time PCR. J Orthopaedic Res. 27, 1514-1520 (2009).
- Muramatsu, K., Kurokawa, Y., Kuriyama, R., Taguchi, T., Bishop, A. T. Gradual graft-cell repopulation with recipient cells following vascularized bone and limb allotransplantation. Microsurgery. 25, 599-605 (2005).
- Muramatsu, K., Bishop, A. T., Sunagawa, T., Valenzuela, R. G. Fate of donor cells in vascularized bone grafts: identification of systemic chimerism by the polymerase chain reaction. Plastic and reconstructive surgery. 111, 763-777 (2003).
- Vossen, M., et al. Bone quality and healing in a swine vascularized bone allotransplantation model using cyclosporine-based immunosuppression therapy. Plast Reconstr Surg. 115, 529-538 (2005).
- Lee, W. P., et al. Relative antigenicity of components of a vascularized limb allograft. Plast Reconstr Surg. 87, 401-411 (1991).
