Summary
Hier wird ein Protokoll (MitoCeption) dargestellt Mitochondrien zu übertragen, isoliert aus humanen mesenchymalen Stammzellen (MSC), zu Glioblastom Stammzellen (GSC), mit dem Ziel, ihre biologischen Wirkungen auf Stoffwechsel und GSC Funktionen studieren. kann ein ähnliches Protokoll Mitochondrien zwischen anderen Zelltypen zu übertragen, angepasst werden.
Abstract
Mitochondrien spielen eine zentrale Rolle für den Zellstoffwechsel, Energieerzeugung und Kontrolle der Apoptose. Eine unzureichende Funktion der Mitochondrien ist verantwortlich für die verschiedensten Krankheiten gefunden, von neurologischen Krankheiten bis hin zum Krebs. Interessanterweise haben Mitochondrien kürzlich die Fähigkeit zur Anzeige übertragen werden zwischen Zelltypen, insbesondere von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSC), um Krebszellen in Kokultur Bedingungen mit metabolischen und funktionellen Konsequenzen für den Mitochondrien Empfängerzellen gezeigt worden, das weiterhin den aktuellen Interesse zu verstärken für die biologischen Eigenschaften dieser Organellen.
Evaluierung der Effekte der übertragenen MSC Mitochondrien in den Zielzellen ist von vorrangiger Bedeutung, die biologische Ergebnis solcher Zell-Zell-Wechselwirkungen zu verstehen. Das MitoCeption hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Übertragung der zuvor aus der Spenderzellen zu den Zielzellen isolierten Mitochondrien, MSC Mitochondrien unter Verwendungund Glioblastom Stammzellen (GSC) als Modellsystem. Dieses Protokoll ist zuvor verwendet worden, Mitochondrien, isoliert von MSCs zu übertragen, MDA-MB-231 Krebszellen haftend. Diese Mitochondrien - Transfer - Protokoll wird hier für GSCs angepasst, die die spezifische Besonderheit der wachsenden als Neurosphären in vitro präsentieren. Die Übertragung der isolierten Mitochondrien kann durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) und konfokaler Bildgebung Mitochondrien Vitalfarbstoffen verfolgt werden. Die Verwendung von Mitochondrien Donor- und Zielzellen mit unterschiedlichen Haplotypen (SNPs) ermöglicht auch Detektion der übertragenen basierend Mitochondrien von der Konzentration ihrer Kreis mitochondriale DNA (mtDNA) in den Zielzellen. Sobald das Protokoll mit diesen Kriterien überprüft wurde, können die Zellen, die übertragenen Mitochondrien beherbergen die Wirkungen der exogenen Mitochondrien auf biologische Eigenschaften zu bestimmen, untersucht werden, wie beispielsweise Zellstoffwechsels, Plastizität, Proliferation und Ansprechen auf die Therapie.
Introduction
Mitochondrien sind Organellen in eukaryotischen Zellen zu finden, wo sie eine zentrale Rolle bei der Nährstoffaufnahme sowie in der Energie- und Stoffproduktion spielen. Diese Organellen enthalten Kreis mitochondriale DNA (mtDNA), 16,6 kb lang, die Proteine der Elektronentransportkette Komplexe, tRNAs und rRNAs 1 kodiert. Die Funktionalität dieser Organellen ist entscheidend für die Homöostase Zelle und mehreren Pathologien haben mit Mitochondrien - Dysfunktion 1, 2, 3 verbunden. Die Mitochondrien - Status hat , beispielsweise auf eine Entzündung, Infektionskrankheiten und Krebs in Verbindung gebracht worden, in diesem letzteren Fall mit Folgen für Metastasierung und Therapieresistenz 4, 5, 6, 7.
Mitochondria zeigen die bemerkenswerte Fähigkeit von Immer zwischen "Spender" und "Ziel" Zellen übertragen. Dies führt zu Änderungen im Energiestoffwechsel der Zielzellen sowie in andere funktionelle Modifikationen wie die Reparatur von Gewebe und Beständigkeit gegenüber chemotherapeutischen Mitteln, wie kürzlich von verschiedenen Laboratorien 8 gezeigt, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16. Die humanen mesenchymalen Stammzellen (MSCs) zeigen diese Fähigkeit Mitochondrien zu einer Vielzahl von Zielzellen zu übertragen, einschließlich Kardiomyozyten, Endothelzellen, Lungen alveolaren Epithelzellen, renale tubuläre Zellen und Krebszellen, Änderungen der funktionellen Eigenschaften dieser Zellen führt 8,> 9, 10, 12, 17, 18.
Mitochondria Austausch erscheint nun als weit verbreiteter Mechanismus, der eine Reihe von verschiedenen Zelltypen ermöglicht, miteinander und ändern ihre biologischen Eigenschaften zu kommunizieren. Diese Mitochondrien Austausch kann Tunneling - Nanoröhrchen (TNT) Bildung kommen durch, an denen Connexin 43 enthaltenden gap junctions 8 oder M-Sec / TNFaip2 und die Exocyst Komplex 19. Alternativ wurde die Mitochondrien Übertragung auch durch Arrestin domain-containing protein 1-vermittelten Mikrovesikel (ARMMs) 20 vermittelt gezeigt werden. Interessanterweise wurde die Wirksamkeit der Mitochondrien Übertragung auf die Expressionsrate des Rho - GTPase 1 Miro1 21 verbunden ist , ein Schlüsselfaktor zur Erklärung der Unterschiede in den Mitochondrien Transfer Wirksamkeiten zwischen iPSC-MSCs und Erwachsenen BM-MSCs 22.
Trotz dieser Vielzahl von Daten über Zell-zu-Zell-Mitochondrien Austausch wird relativ wenig über die metabolischen und biologischen Ergebnisse dieser Mitochondrien Übertragung bekannt. Daher voll es garantiert, dass die entsprechenden Tools einrichten, um vollständig die biologischen Wirkungen dieser Übertragung beurteilen. Im Laufe der Jahre auf mehrere technische Ansätze Mitochondrien von Spender zu Akzeptor-Zellen übertragen wurden vorgeschlagen. Dazu gehören die direkte Injektion von Mitochondrien in Oozyten 23, 24, 25, Zellfusion transmitochondrial cybrids 26, 27 zu erzeugen , und in jüngster Zeit , die Übertragung von isolierten Mitochondrien Lichtwärmeumsetzmaterial Verwendung nanoblades 28.
Wir und andere haben bereits gezeigt, die Fähigkeit von isolierten mitochondria durch lebende Zellen internalisiert zu werden, sowohl in vitro als auch in vivo als beobachtet 29, 30, 31, durch Mechanismen vorgeschlagen Makropinozytose 32 einzubeziehen. Wir entwickelten außerdem ein Verfahren, genannt MitoCeption, quantitativ zu isolierten Mitochondrien übertragen (von MSCs) an die Zielzellen, wie mit dem (adhärenten) beispielhaft MDA-MB-231 Brustkrebszelllinie 31. Dieses Protokoll wurde hier für die Übertragung von isolierten humanen MSC Mitochondrien Glioblastom Stammzellen (GSCs) angepasst ist.
Glioblastome sind aggressive bösartige Tumoren des Gehirns, die sich schnell auf die Behandlung resistent werden, vor allem wegen Glioblastom Stammzellen (GSC) , die innerhalb des Tumors 33. Diese GSCs wachsen als Neurosphären in vitro und erzeugen Tumoren in Xenotransplantatmodellen. Krebszellen innerhalb Glioblastom haben dieKapazitäts Zell-zu-Zell Verbindungen herzustellen, wie kürzlich für Astrozyten Gehirntumorzellen gezeigt , die Zwischenverbindung über erweiterte Mikroröhrchen, durch die Mitochondrien (sowie Calcium und Zellkerne) wandern kann, was zu einer Strahlentherapie festen Astrozytom Netzwerke 34. Glioblastom können viele verschiedene Zellen innerhalb der Tumor - Mikroumgebung rekrutieren, darunter MSCs 35, 36. Wir haben gezeigt, dass MSCs können Zell-Zell-Verbindungen mit GSCs in Co-Kultur machen und übertragen ihre Mitochondrien (Daten nicht gezeigt), die voraussichtlich GSC funktionelle Eigenschaften zu modifizieren. Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie die MitoCeption Technik Mitochondrien, isoliert vorher aus menschlichen MSCs, die menschliche GSCs mit dem Zweck zu übertragen verwendet werden können, deren funktionelle biologische Ergebnis zu bestimmen. Die multi- und hoch tumorigenen Gb4 GSC Linie 37 wurde in dieser Studie verwendet.
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Protocol
Tag 1
1. Markieren des mesenchymalen Stammzelle (MSC) Mitochondria (Optional)
- Zwei Tage vor der Mitochondrien Präparation, Samen humane MSCs in einer 100 mm Kulturschale in 10 ml & agr; MEM / 10% FBS, um bis 4 haben x 10 5 MSCs in Kultur am Tag 1.
- Spülen Sie MSCs mit PBS (4 ml) und 4 ml & agr; MEM / FBS 1% (vorgewärmt auf 37 ° C).
- Fügen Sie die erforderliche Menge an Mitochondrien Vitalfarbstoff und inkubieren Zellen für 30 Minuten im 37 ° C-Inkubator.
- Entfernen Sie die Mitochondrien Farbstofflösung, spülen Sie die Zellen zweimal mit 4 ml vorgewärmtem (37 ° C) & agr; MEM / FBS 1% und fügen Sie zurück 4 ml & agr; MEM / FBS 10%. Inkubiere Zellen bei 37 ° C.
- Ändern Sie das Kulturmedium (10 ml & agr; MEM / FBS 10%) nach 30 min und ein weiteres Mal, zwei Stunden später.
Tag 1
2. Markierung der Glioblastom Stammzellen (GSC) (optional, siehe Diskussion Sektion)
| Zellkulturmedium , | Zusammensetzung |
| GSC Basalmedium | DMEM / F-12, ergänzt mit |
| Insulin 20 mg / ml | |
| N2 Ergänzung 1x | |
| Glucose 3 g / L | |
| L-Glutamin 2 mM | |
| GSC Proliferationsmedium | In den Basismedium: |
| B27 Ergänzung 1x | |
| EGF 10 ng / ml | |
| bFGF 10 ng / ml | |
| Fungine 10 mg / ml | |
| Fungizone 0,25 mg / ml | |
| Heparin 2 mg / ml | |
| Ciprofloxacin 2 & mgr; g / ml | |
| Gentamicin 2 & mgr; g / ml | |
| MSC Proliferationsmedium | & #945; MEM, ergänzt mit |
| L-Glutamin 2 mM | |
| 10% FBS | |
| bFGF 2 ng / ml |
Tabelle 1: Kulturmedien.
- Distanzieren GSCs (Gb4 Zelllinie 32 (10 x 10 6 Zellen) als Neurosphären auf Poly-HEMA beschichteten Zellkulturflaschen gezüchtet (siehe Schritte 3,1-3,12).
- Seed GSCs in einer 48-Well - Platte bei 10 5 Zellen / Vertiefung in GSC Proliferationsmedium (500 & mgr; l) (siehe Tabelle 1).
- Zentrifugieren Sie die Platte bei 270 g für 5 min bei 20 ° C.
- Die erforderliche Menge an Zellvitalfarbstoff und Inkubation für 30 min bei 37 ° C.
- In 500 ul GSC Basalmedium (Tabelle 1) pro Vertiefung der 48-Well - Platte.
- Zentrifugieren Sie die Platte bei 270 × g bei 20 ° C für 5 min. Den Überstand aspirieren.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.5 auf 2.6.
- In 500 ul GSC Basismedium und Inkubation für 30 min bei 37 ° C.
- Zentrifugieren Sie die Platte bei 270 × g bei 20 ° C für 5 min. Den Überstand aspirieren.
- In 500 ul GSC Proliferationsmedium pro Vertiefung der 48-Well-Platte und Inkubation in dem 37 ° C Inkubator.
Anmerkung: Die Menge an GSCs angegeben (10 x 10 6 Zellen) ermöglicht , die verschiedenen Dosis-Wirkungs-Experimente und FACS Kontrollen durchzuführen. Sobald die Versuchsbedingungen mehr exakt diese Menge definiert ist, kann verkleinert werden.
Tag 2
3. Seeding von Glioblastom Stammzellen
- Sammeln Sie die GSC Neurosphären (10 x 10 6 Zellen) durch Zentrifugation bei 270 g für 5 min bei 20 ° C in einem 50 - ml - Tube.
- Wasche die Zellen mit 5 ml HBSS, und die Zentrifuge bei 270 × g für 5 min bei 20 ° C.
- Den Überstand aspirieren.
- resuspendieren vorsichtig die GSC-Pellet in 100 ul Trypsin-EDTA (0,25%) (je 10 x 10
- 3 min bei 37 ° C inkubieren.
- Zugabe von 10 & mgr; l CaCl 2 (20 mM) und 2 & mgr; l DNase I (10 mg / ml).
- Distanzieren die Neurosphären durch sanftes Auf- und Abpipettieren (30-50x) mit einer P200 Pipette. Vermeiden Sie Blasen. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, dass alle GSCs gelöst sind.
- Zugabe von 10 & mgr; l Trypsin-Inhibitor (5%) und 10 ml HBSS.
- Zentrifuge GSCs bei 270 xg für 7 min bei 20 ° C.
- Überstand verwerfen und 10 ml GSC Basis - Medium (Tabelle 1).
- Graf GSCs mit einer Thoma-Zählkammer und dann zentrifugiert werden die Zellen bei 270 g für 7 min bei 20 ° C.
- Fügen Sie das entsprechende Volumen von GSC Proliferationsmedium (Tabelle 1) , um die zelluläre Konzentration von 10 6 GSCs / ml zu erreichen.
- Seed 10 5 GSCs (100 & mgr; l der Zellsuspension) pro Well einer 96-Well - Platte.
- Zentrifugieren Sie die Platten bei 270 g für 7 min bei 20 ° C GSCs zu erhalten bei den Bottom von Brunnen.
- Inkubieren Sie die 96-Well-Platte bei 37 ° C bis Abschnitt 5.
Tag 2
4. MSC Mitochondria Isolation
- Stellen Sie die microtube Zentrifugentemperatur auf 4 ° C.
- Bereiten Sie zwei 1,5-ml-Röhrchen "A" und "C" enthält die Reagenzien für den Mitochondrien Extraktion (200 ul Reagens A und 400 ul Reagenz C, enthalten beide die EDTA-freie Protease-Inhibitoren). Bereiten Sie zwei weitere Rohre, die mit "MSC" und "Mito". Halten Sie alle Röhrchen auf Eis. Auch bereiten Röhren für den Mitochondrien Reihenverdünnungen.
- Wasch MSCs mit 10 ml vorgewärmtem (37 ° C) PBS.
- Wash MSCs mit 2 ml Trypsin (kein EDTA) für 10 Sekunden und 1 ml Trypsin (kein EDTA). Inkubiere Zellen für 5-10 min bei 37 ° C.
- Recover die MSCs durch Zugabe von 10 ml & agr; MEM / FBS 10%, in einen 50-ml-Tube.
- Zentrifugen Zellen bei 270 xg für 5 min bei 20 ° C.
- Überstand verwerfen und fügen10 ml & agr; MEM / FBS 10% zum Zellpellet.
- Zählen Sie die MSCs mit einem Malassez Zählkammer.
- Zentrifuge MSCs (4-5 x 10 & sup5 ; ) bei 270 xg für 5 min bei 20 ° C.
- Überstand verwerfen, fügen Sie 1 m eiskalter & agr; MEM / FBS 10% auf dem Zellpellet und übertragen Sie die Zellen auf die "MSC" -markierten Rohr (hergestellt in Schritt 4.2). Halten Sie das Röhrchen auf Eis.
- Zentrifugieren Sie die Röhrchen die MSCs bei 900 xg für 5 min bei 4 ° C enthält.
- Entfernen Sie alle Reste des Mediums aus der Tube.
- In 200 ul Mitochondria Isolation Reagenz A (die EDTA-freie Proteaseinhibitoren). Vortex bei mittlerer Geschwindigkeit für 5 Sekunden und lassen Röhrchen auf Eis genau 2 min.
- Hinzufügen, 2,5 ul Mitochondria Isolation Reagent B. Vortex bei maximaler Geschwindigkeit für 10 sec, und dann Röhrchen auf Eis belassen. Wiederholen Sie alle 30 Sekunden für 5 min.
- In 200 ul Mitochondria Isolation Reagenz C (die EDTA-freie Proteaseinhibitoren). Mischen Sie durch das Rohr Kippen (roughly 30-mal, nicht vortexen). Zentrifugiere die Röhrchen bei 700 xg für 10 min bei 4 ° C.
- Den Überstand (mit der MSC Mitochondrien) in die "Mito" Rohr (hergestellt in Schritt 4.2).
- Zentrifuge bei 3000 xg, 15 min bei 4 ° C, die Mitochondrien-Pellet zu erhalten. Überstand verwerfen. Das Pellet enthält die isolierten Mitochondrien.
- Spülen Sie die Mitochondrien-Pellet mit 200 & mgr; l des Reagenz C. Dann Zentrifuge bei 12.000 xg, 5 min bei 4 ° C, die Mitochondrien-Pellet zu erhalten.
5. Übertragung von isolierten MSC Mitochondria zu GSCs (MitoCeption)
- Zugabe von 200 ul der vorgekühlten (0 ° C) GSC Proliferationsmedium in die Mitochondrien - Pellet von MSCs isoliert (4 x 10 5).
- Verdünnen Sie die Mitochondrien Vorbereitung (in GSC Proliferationsmedium) konsequent 20 ul mitochondriale Suspension zu den GSCs hinzuzufügen.
- Füge das Volumen von isolierten Mitochondrien in die Vertiefungen der 96-well Platte die GSCs (aus Schritt 3.15), in der gewünschten Konzentration (0,1 bis 10 & mgr; g) enthielt. Fügen Sie den Mitochondrien langsam, nahe dem Boden des Bohrlochs, um die gesamte Oberfläche mindestens einmal abdeckt.
- MSC Mitochondrien Vitalfarbstoff Leckage Zur Steuerung, fügen Sie die gleichen Mengen der Mitochondrien-Präparat (0,1 bis 10 ug) in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte GSC Proliferationsmedium, das nur (keine GSCs) (Teil 6.2 für Vitalfarbstoff Leckageerkennung sehen).
- Zentrifuge die 96-well Platte die Mitochondrien Empfänger GSCs mit der MSC Mitochondrien (Schritt 5.3) und der Steuerplatte (Schritt 5.4) bei 1.500 xg für 15 min bei 4 ° C enthält.
- Legen Sie die Kulturplatten in der 37 ° C Zellinkubators unmittelbar nach dem Zentrifugieren.
Hinweis: Die Mitochondrien Übertragungsprotokoll beruht auf der Zentrifugation der Mitochondrien-Suspension auf die kultivierten Zellen am ausreichende Zentrifugationskraft, mit einer Reihe von Zentrifugationen, die in Abhängigkeit von der syst eingestellt werden kann,em von Mitochondrien Donor / Empfängerzellen.
Tag 3
6. Analyse der Mitochondria Übertragung durch FACS und konfokale Bildgebung
- Herstellung von GSC Proben für die FACS - Analyse
Hinweis: Wenn MSC Mitochondrien mit einem vitalen Farbstoff markiert wurden vorher (Abschnitt 1) kann die Effizienz durch FACS überwacht werden, 24 Stunden nach der Mitochondrien Übertragung.- Zentrifuge die 96-well Platte mit den MitoCepted GSCs bei 270 xg für 5 min bei 20 ° C.
- Überstand verwerfen.
- 100 l Trypsin (kein EDTA) in jede Vertiefung geben. 3 min bei 37 ° C inkubieren. Pipettieren nach oben und unten die Neurosphären in der 24-Stunden-Zeitraum gebildet zu distanzieren.
- 100 l GSC Basalmedium.
- Zentrifugieren Sie die Platte bei 270 g für 5 min bei 20 ° C und den Überstand verwerfen.
- Resuspendieren GSCs in 300 ul GSC Basismedium und Transfer zum FACS angepasst Rohre.
- Führen Sie die FACS einalysis.
- Steuerung für Mitochondrien Vitalfarbstoff Leckage aus dem isolierten Mitochondrien (FACS)
Hinweis: Der Zweck dieses Schrittes ist es, das Hintergrund FACS-Signal zu bestimmen, die nicht eine echte MSC Mitochondrien Übertragung widerspiegeln würde, sondern vielmehr das bloße Leckage von Vitalfarbstoff aus der MSC markierten Mitochondrien für MitoCeption verwendet (Schritt 5.3).- Seed GSC-Zellen wie in den Schritten 3,1-3,15 beschrieben.
- Inkubieren der Zellen bei 37 ° C für 1 Stunde.
- Zentrifuge die Platte mit 96 Vertiefungen nur Mitochondrien enthält (aus Schritt 5,4 bis 5,6) bei 1.500 xg für 5 min bei 20 ° C.
- Saugen Sie das Kulturmedium aus dem GSC 96-Well-Platte (Schritt 6.2.2) und ersetzen Sie es nur durch das Medium mit Mitochondrien inkubiert (Stand aus Schritt 6.2.3).
- Inkubiere die Platte mit 96 Vertiefungen, die GSCs bei 37 ° C für 2 Stunden enthält.
- Gehen Sie wie in den Schritten 6.1.1 bis 6.1.7 für FACS-Analyse.
- Herstellung von GSC samples für die konfokale Bildgebung
Hinweis: Wenn die Übertragung der MSC Mitochondrien GSCs ist durch Fluoreszenz-Bildgebung untersucht werden, wobei beide MSCs und GSCs müssen vorher markiert werden, die jeweils mit den Mitochondrien (Schritt 1) und Zelle (Schritt 2) Vitalfarbstoffe.- Bereiten Sie GSCs wie in den Schritten 6.1.1 bis 6.1.5.
- Resuspendieren GSCs in 2 ml GSC Proliferationsmedium, das 2% FBS und Samen in 35 mm Kulturschalen (Glasboden).
- Führen Sie die konfokale Abbildung auf den GSCs mit den übertragenen Fluoreszenz MSC Mitochondrien 24 Stunden später.
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Representative Results
Die Verfahrensschritte die Isolierung von Mitochondrien aus mesenchymalen Stammzellen (MSC) und deren Übertragung auf die gezielte Glioblastom Stammzellen (GSC) durch MitoCeption skizziert sind in Abbildung 1 dargestellt. GSCs sind Krebsstammzellen als Neurosphären gewachsen ihre Stammzelleigenschaften zu erhalten. Für das Protokoll werden GSCs ausgesät als einzelne Zellen ein paar Stunden vor der Übertragung der Mitochondrien (Schritt 3) zu höheren Mitochondrien Übertragungseffizienz ermöglichen (siehe FACS Daten 3B). Nach § 5 (Tag 3), werden diese Zellen beobachtet wieder als Bildung Neurosphären (Abbildung 1).
Imaging der Gb4 GSCs, 72 Stunden nach der MitoCeption mit fluoreszenzmarkierten MSC Mitochondrien, zeigt , dass die MSC Mitochondrien innerhalb der Gb4 GSCs lokalisiert sind, wie sie von den orthogonalen Ansichten von konfokalen Bildern (2B) erhalten demonstriert. Die übertragenen MSC Mitochondrien erscheinen in den GSCs lokalisiert ist , wie dies auch der Fall für die endogenen GSC Mitochondrien ist (2A). Konfokale Bildgebung des MitoCepted GSCs wurde auch mit MSC Mitochondrien durchgeführt vormarkiert mit einer tiefroten Vitalfarbstoff , so dass die gleichen GSC Proben sowohl analysiert wurden durch FACS (siehe 3A) und imaging (2C). Die Übertragung von MSC Mitochondrien konnte für die meisten GSCs beobachtet werden (Tafel a) und 3D-Rekonstruktion von GSC konfokale Bilder bestätigte die intrazelluläre Lokalisation des transferierten MSC Mitochondrien (Panels b, c). Prelabeling sowohl mit blauen Vitalfarbstoffen mitochondrialen zellulären und roten GSCs (am Tag 1) erlaubt , die Lokalisierung der transferierten MSC Mitochondrien Visualisierung (farbig in grün) relativ zu dem endogenen GSC Mitochondrien (in rot), im Anschluss an die MSC Mitochondrien Transfer (2D) .
während confocal Bildgebung ermöglicht die intrazelluläre Lokalisation des übertragenen MSC Mitochondrien folgende MitoCeption, Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) ist das Werkzeug der Wahl Überprüfung der Mitochondrien Transfer zu quantifizieren, sofern MSC Mitochondrien mit einem vitalen Farbstoff vormarkiert wurden. Wie in 3A gezeigt MitoCeption mit Mengen an Fluoreszenz MSC Mitochondrien führte zu einer erhöhten FACS - Signale zu erhöhen. Bemerkenswert ist dieses Signal (in rot) war um mehrere Größenordnungen höher ist als das Signal in den Steuerbedingungen erhalten (in blau, siehe Schritt 6.2). Diese weitere Beweise dafür, dass die FACS Signal repräsentativ für MSC Mitochondrien innerhalb GSCs übertragen und nicht nur das Ergebnis der Fluoreszenzvitalfarbstoff Leckage von der MSC gekennzeichnet Mitochondrien. Die Mitochondrien - Transfer - Protokoll hier vorgestellten auf Einzelzell GSCs durchgeführt, zeigte eine dosisabhängige Antwort (3B). Die Effizienz der MSC Mitochondrien Übertragung wurde auch ausgewertet neurospheres. Obwohl dies auch auf die GSCs zu MSC Mitochondrien Übertragung geführt wurde die Wirksamkeit der Übertragung geringer, da in einem repräsentativen Experiment (3B) gezeigt ist .
Die Übertragung von MSC Mitochondrien und deren Wartung innerhalb der GSCs kann durch Quantifizieren MSC mitochondriale DNA (mtDNA) in den GSCs folgen. Dies erfordert MSCs und GSCs zu von verschiedenen Spendern erhalten werden, mit unterschiedlichen Haplotypen. 3C zeigt mtDNA Sequenzen in der D-Schleife von zwei Spendern mit Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) gefunden angegeben am 3'Endposition. Für das Design von PCR-Primern, spezifisch zu amplifizieren mtDNA von entweder 1 oder Spender Spender 2 eine zusätzliche Mutation an Position 'n-2 relativ zu der 3 eingeführt wurde Ende der PCR-Primer. Die mtDNA von Spender 1 konnte mit dem Satz von Primern amplifiziert werden: 5'-TAACAGTACATAGCACATACAA-3 'und 5'-GAGGATGGTGGTCAAGGGA-3' (universal sequencing Primer 38), während der Satz von Primern: 5'-TTAACTCCACCATTAGCACC-3 '(Universalsequenzierungsprimer von 38) und 5'-AGTATTTATGGTACCGTCCG-3' verwendet wurde , vom Spender 2 mit der mtDNA zu amplifizieren.
Abbildung 1: Workflow für die Übertragung von isolierten MSC Mitochondrien GSCs von MitoCeption. Die 7 Stufen zur MitoCeption von MSC Mitochondrien GSCs und die nachfolgenden GSC Analysen gezeigt. Die Schrittnummern wie im Protokoll Abschnitt angegeben. Wenn MSC und GSC Kennzeichnung nicht durchgeführt wird, wie für funktionelle Analysen, die Schritte 1 und 2 kann weggelassen werden, und das Protokoll kann von Tag 2 zu folgen. Phasenkontrast-Bilder darstellen Gb4 GSCs als Neurosphären (Tag 1), als Einzeller Kultur bereit für die MSC Mitochondrien Transfer (Tag 2) und 24 Stunden nach der Mitochondrien Transfer (Tag 3). Maßstabsbalken =100 um. In Schritt 4 repräsentative Mikrophotographie von isolierten MSC Mitochondrien, vormarkiert mit MitoTracker Red CMXRos vor der Isolierung von MSCs. Maßstabsbalken = 5 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Imaging von Gb4 endogenen Mitochondrien und der MSC Mitochondrien nach Übertragung auf die Gb4 GSCs von MitoCeption. (A, B, C) Gb4 GSCs wurden mit einem grünen Vitalfarbstoff markiert. (B, C, D) Gb4 GSCs wurden mit 2,5 & mgr; g MSC Mitochondrien Präparation MitoCepted (10 5 GSCs). (A) GSCs wurden mit MitoTracker Red CMXRos markiert und kultiviert für 48 Stunden (GSC Proliferationsmedium w / o EGF / bFGF).(B) GSC konfokalen Abschnitt und orthogonalen Ansichten, 72 Stunden nach der MitoCeption mit MitoTracker Red CMXRos-markierten MSC Mitochondrien (Kulturmedium: GSC Proliferationsmedium / FBS 2%). (C, D) MSCs wurden mit einer tiefroten Mitochondrien Vitalfarbstoff (gleiche Bedingungen wie für die FACS - Analyse) vor der Übertragung der MSC Mitochondrien GSCs vormarkiert. Nach dem MSC Mitochondrien Transfer, GSCs wurden in GSC-Proliferation-Medium, das FBS 10% ausgesät. (C) Isosurface Ansichten (b, c) mit xy - Ebene Abschnitt (c) eines GSC 3D - Rekonstruktion von konfokalen Bildern (48 h nach MitoCeption). (D) Gb4 GSCs wurden mit einem blauen Zelle lebenswichtige Farbstoff markiert und einem roten Mitochondrien Vitalfarbstoff vor der Übertragung von MSC Mitochondrien vormarkiert mit einem tiefroten Mitochondrien Vitalfarbstoff (in grün abgebildet). Isosurface Ansichten mit XZ (b) und xy (c) Ebene Abschnitte eines GSC 3D-Rekonstruktion von konfokalen Bildern (72 Stunden nach der MSC Mitochondrien-Transfer). Alle Zellen were ausgesät auf Kulturschalen mit Glasboden und Bilder wurden an lebenden Zellen aufgenommen. Maßstabsbalken = 5 & mgr; m, mit Ausnahme von Bild C-Panel (a) in dem Maßstabsbalken = 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Quantifizierung der Mitochondrien Übertragung durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) und den Nachweis von MSC mitochondriale DNA (mtDNA) in den GSCs. (A, B) GSCs wurden mit MSC Mitochondrien MitoCepted vormarkiert mit einer tiefroten Mitochondrien Vitalfarbstoff und durch FACS analysiert. (A) Repräsentative FACS Ergebnisse mit MitoCepted GSCs erhalten (in rot, von oben nach unten: 0,6; 1,2; 2,5; 5; 10 ug MSC Mitochondrien Vorbereitung (für 10 5 GSCs)). In blau, für Bildung und Kulturh Panel steuern FACS-Profil von GSCs mit dem Kulturmedium mit der gleichen Menge an MSC Mitochondrien konditioniert für MitoCeption verwendet (siehe Schritt 5.4). Kontrollbedingungen mit unmarkierten GSCs in schwarz (oben). (B) Relative mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) nach den Mitochondrien Übertragung auf einzelne Zelle GSCs erhalten (- •) (Durchschnitt von 3 Versuchen mit SEM), an einem Tag GSC Neurosphären (- o) und mit Steuer Mitochondrien Stände auf GSC Einzelzellen (-). Am 3' - Ende der Sequenzen (C) DNA - Sequenzen innerhalb der mtDNA D-Schleife und SNP Unterschiede zwischen den Gebern 1 und 2 SNPs sind in blau angegeben. Design von Primern für die spezifische PCR-Amplifikation von mtDNA aus entweder Donor (Primer spe 1 und 2). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Eine wachsende Zahl von Studien zeigen, dass Zellen, die Mitochondrien austauschen können, und dass diese Mitochondrien haben tiefgreifende Auswirkungen auf die Zielzellstoffwechsel und Funktionen. Daher ist es wichtig, die Werkzeuge, zu beherrschen, um quantitativ die Mitochondrien aus den Spenderzellen zu diesen Zielzellen übertragen, um eine genaue Untersuchung ihrer biologischen Wirkungen zu ermöglichen.
Das hier beschriebene Protokoll wurde ursprünglich Mitochondrien zu übertragen , isoliert aus humanen mesenchymalen Stammzellen an die anhaftenden Krebszelllinie MDA-MB-231 33 ausgearbeitet. Wie hier gezeigt, kann es für Krebsstammzellen angepasst werden , die als Neurosphären in vitro wachsen. Obwohl die Mitochondrien Übertragung stattfindet, wenn MSC Mitochondrien an die GSC Neurosphären hinzugefügt werden, wurde es auf einzelne Zelle GSCs effizienter zu sein gefunden, wie im vorliegenden Protokoll beschrieben. Dieses Protokoll könnte auch auf andere nicht-adhärenten Zellen hochgerechnet werden, wie T-Zellen, mit der Notwendigkeit, eineDAPT der geimpften Zellkonzentration für die MitoCeption Schritt.
Die Mitochondrien Zubereitung sollte auf Eis durchgeführt werden, um ihre Integrität zu erhalten. Um Mitochondrien Präparate mit reduzierter Kontamination von anderen Cytosol Verbindungen, Zentrifugation zur Gewinnung von Mitochondrien wird bei 3000 × g für 15 min durchgeführt erhalten. Um die Menge der MSC Mitochondrien für die Übertragung zu den GSCs, die Mitochondrien Proteingehalt verwendet, zu überwachen, wird bestimmt. Hierzu Mitochondrien Proteinextrakte werden mit RIPA-Puffer mit Protease-Inhibitoren ergänzt hergestellt. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung des Bicinchoninsäure-Assays bestimmt, gemäß den Anweisungen des Herstellers. Rinderserumalbumin wurde als Standard verwendet. Im Durchschnitt 10 ug Proteine wurden aus 100.000 MSCs erhalten.
Labeling MSC Mitochondrien mit einem Vitalfarbstoff ermöglicht, die Effizienz der Übertragung Mitochondrien Quantifizierung durch fluoreszenzaktivierte ZellSortierung (FACS) und die Lokalisation der transferierten Mitochondrien durch konfokale Bildgebung zu bestimmen. Die GSCs kann mit dem gleichen Mitochondrien Vitalfarbstoff als MSCs bezeichnet werden. Diese Zellen werden als eine positive Kontrolle für die FACS-Analyse verwendet werden. Alternativ kann GSCs mit Mitochondrien vital Farbstoff markiert werden, um verschiedene von der der MSCs, die Lokalisierung der transferierten MSC Mitochondrien relativ zu den endogenen GSC Mitochondrien ermöglicht. Die tiefrote Mitochondrien Vitalfarbstoff ist gut geeignet für die FACS-Analyse, während die grünen und roten Mitochondrien Farbstoffe zur konfokalen Abbildung bevorzugt. Von großer Bedeutung, MSC Exposition gegenüber EDTA sollte bei allen Schritten des Protokolls vermieden werden. Daher Zelle Trypsinierung mit Trypsin und ohne EDTA empfohlen; die Cocktail von Protease-Inhibitoren für die Mitochondrien Zubereitung verwendet wird, sollte, als auch, sein ohne EDTA. In Gegenwart von EDTA wurde eine Leckage der Mitochondrien Vitalfarbstoffs von MSC Mitochondrien beobachtet. Wenn die Mitochondrien transfer GSCs ist durch Mikroskopie analysiert werden, wobei die Empfänger Glioblastomzellen sollten auch mit einem vitalen Farbstoff markiert werden. Die grünen und blauen Zelle Farbstoffe (siehe Materialien und Reagenzien Tabelle) wurden bevorzugt , da sie eine homogenere Zellmarkierung geben, so dass 3D - Rekonstruktion von konfokalen Bildern.
Sobald das Protokoll durch den Benutzer mit seinen spezifischen Zellen validiert wurde, werden Mitochondrien Kennzeichnung für funktionelle Studien weggelassen werden, mögliche biologische Verzerrungen auszuschließen. Dosis-Wirkungs-Analysen über einen weiten Bereich von MSC Mitochondrien Konzentrationen, mit seriellen Verdünnungen der Mitochondrien Präparation, ratsam. Tatsächlich sollte beachtet werden, dass die biologische Wirkung für die übertragenen Mitochondrien Mitochondrien für niedrige Konzentrationen erreicht werden können, im unteren Bereich zur Erfassung durch FACS oder Bildgebung. Diese funktionellen Studien, einschließlich Untersuchungen über GSC Stoffwechsel, Proliferation und Ansprechen auf die Therapie, sind nach dem Tag erfolgen dieMitochondrien Transfer.
Wenn MSCs und GSCs von verschiedenen Spendern (mit unterschiedlichen mtDNA Haplotypen) isoliert sind, können die übertragenen MSC Mitochondrien durch Messung der Konzentrationen von MSC mtDNA in den Ziel GSCs überwacht werden. Die Unterscheidung zwischen der MSC und endogene GSC mtDNAs basiert auf dem Vorhandensein von SNPs, die spezifisch für jeden Zelltyp, in der mtDNA hypervariablen D-loop Region. Daher ist unter den verschiedenen Anwendungen der MitoCeption Technik, der die Möglichkeit Mitochondrien beherbergen mitochondrialen DNA mit verschiedenen Haplotypen nicht nur die Übertragung ermöglicht die Detektion der übertragenen Mitochondrien, sondern bietet auch die Werkzeuge, die Biologie der mtDNA Wartung zu untersuchen, einschließlich der Analyse von Haplotypen Ausgrenzung.
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Disclosures
INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale), mit dem CJ und ML.V. angeschlossen sind, hat eine Patentanmeldung auf der MitoCeption Technik (EP14306154.7) eingereicht.
Acknowledgments
Wir danken Andrea Parmeggiani (L2C und DIMNP, Montpellier), Benoit Charlot (IES, Montpellier) sowie Mitglieder des Labors für hilfreiche Diskussionen, Christophe Duperray für die Hilfe bei der FACS-Analyse, die Montpellier RIO Imaging Facility (MRT) für die Bereitstellung von eine angemessene Umgebung für FACS und konfokale Mikroskopie. BNM wurde durch ein Graduiertenstipendium von der LABEX Numev (convention ANR-10-LABX-20) unterstützt. AB von einem Bachelor-Stipendium der Universität Warschau und der Europäischen Union unterstützt wurde (n POKL.04.01.02-00-221 / 12 °). MLV ist ein wissenschaftlicher Mitarbeiter vom Nationalen Zentrum für wissenschaftliche Forschung (CNRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitochondria Isolation Kit for Tissue | Fisher Scientific | 10579663 | |
| N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 11520536 | |
| B-27 Supplement W/O VIT A (50x) | Fisher Scientific | 11500446 | |
| HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Sigma | H4385 | |
| poly Heme | Sigma | P3932 | |
| aMEM w/o glutamine | Ozyme | BE12-169F | |
| DMEM/F-12 without glutamine | Fisher Scientific | 11540566 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-024 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Insuline | Sigma | I 1882 | |
| Human bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| CaCl2 | MERCK | 2382 | |
| Trypsine Inhibitor | Sigma | T9003 | |
| DNase I | SIGMA | 10104159001 | |
| Trypsine 0.25% / EDTA 1 mM | Invitrogen | 25200056 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Protease inhibitors EDTA free | Sigma | 4693159001 | |
| Ciprofloxacine | Sigma | 17850-5G-F | |
| Fungine | Invivogen | ant-fn-1 | |
| Fungizone | Thermofisher | 15290018 | |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410 | |
| MitoTracker Green FM | Molecular Probes | M7514 | |
| MitoTracker Red CMXRos | Molecular Probes | M7512 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Molecular Probes | M22426 | |
| CellTracker Green CMFDA | Molecular Probes | C7025 | |
| CellTracker Blue CMF2HC | Molecular Probes | C12881 | |
| RIPA | Santa Cruz | sc-24948 | |
| FluoroDish Sterile Culture Dish | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| FACS tubes | Beckman Coulter | 2,523,749 | |
| FACS apparatus | Gallios | 3L 10C | |
| LC FAST START DNA MASTER PLUS | Roche | 3515885001 |
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