Summary
여기에, 프로토콜 (MitoCeption)는 GSC 대사와 기능에 대한 생물학적 효과를 연구 목적으로, 아교 모세포종 줄기 세포 (GSC)로, 인간 중간 엽 줄기 세포 (MSC)에서 격리 된 미토콘드리아를 전송하기 위해 제공됩니다. 유사한 프로토콜이 다른 세포 유형 간 미토콘드리아를 전송하도록 구성 될 수있다.
Abstract
미토콘드리아는 세포 대사, 에너지 생산 및 세포 사멸의 제어를위한 중심적인 역할을한다. 부적절한 미토콘드리아 기능은 신경 학적 병변에서 암에 이르기까지 매우 다양한 질병에 대한 책임이 발견되었다. 흥미롭게도, 미토콘드리아 최근 용량을 표시하도록 도시 된 상기 현재 관심을 향상 미토콘드리아받는 세포 대사 및 기능적 결과와 공 배양 조건에서 암 세포에 인간 중간 엽 줄기 세포 (MSC)에서 특히 세포 유형 사이에서 전송 될 이러한 세포 소기관의 생물학적 특성에 대한.
표적 세포에서 전사 MSC 미토콘드리아의 효과를 평가하는 것은 예컨대 세포 - 세포 상호 작용의 생물학적 결과를 이해하기 위해 가장 중요하다. 여기에 설명 MitoCeption 프로토콜 MSC 미토콘드리아를 이용하여 표적 세포를 도너 세포로부터 미리 격리 미토콘드리아의 전송을 허용모델 시스템으로서 교 모세포종 및 줄기 세포 (GSC). 이 프로토콜은 이전에 MDA-MB-231 유방암 세포를 접착하는 중간 엽 줄기 세포에서 미토콘드리아 격리를 전송하는 데 사용되었다. 이것은 미토콘드리아 전송 프로토콜은 체외로 neurosphere를 성장시키는 특정 특이성을 제시 GSC를 여기하도록 구성된다. 격리 된 미토콘드리아의 전달은 미토콘드리아에게 중요한 염료를 사용하여 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)와 공 초점 이미징 다음에 할 수 있습니다. 별개의 일배 체형 (SNP가)와 미토콘드리아 공여체 및 목표 세포의 사용은 또한 표적 세포에서의 원형 미토콘드리아 DNA (미토콘드리아)의 농도에 기초하여 상기 전송 된 미토콘드리아의 검출을 허용한다. 프로토콜이 이러한 기준을 검증 한 후에, 전사 된 미토콘드리아 형질 세포를 상기와 같은 세포 대사, 소성, 증식 및 치료에 대한 응답으로서 생물학적 특성에 외인성 미토콘드리아의 효과를 결정하기 위해 분석 될 수있다.
Introduction
미토콘드리아는 영양소 흡수뿐만 아니라 에너지 대사 산물 생산의 중심적인 역할을 진핵 세포에서 발견되는 세포 내 소기관이다. 이 세포 소기관은 원형 미토콘드리아 DNA 전자 수송 체인 단지,의 tRNA 및 rRNAs 1의 단백질을 인코딩 16.6 KB 긴 (미토콘드리아 DNA)를 포함합니다. 이러한 소기관의 기능은 세포 항상성 여러 병리는 미토콘드리아 장애 1, 2, 3과 연관되어 매우 중요하다. 미토콘드리아 상태는 예를 들어 치료를 4, 5, 6, 7 전이 저항에 대한 영향이 후자의 경우에, 염증, 감염증, 암에 연결되어있다.
미토콘드리아는의 놀라운 능력을 표시 "기증자"과 "대상"세포 사이에 전송하기. 최근에, 15 개의 실험실 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14에 의해 도시 된 바와 같이,이 같은 조직 복구 및 화학 요법 제에 대한 저항성과 같은 다른 기능적인 변형뿐만 아니라 표적 세포의 에너지 대사의 변화를 초래 16. 인간 중간 엽 줄기 세포 (MSC들)이 세포의 기능적 특성의 변형 선도, 심근 세포, 내피 세포, 폐의 폐포 상피 세포, 신 세뇨관 세포와 암 세포를 포함하여 표적 세포의 매우 다양한 미토콘드리아를 전송하는 이러한 능력을 표시 8,> 9, 10, 12, 17, 18.
미토콘드리아 교환 이제 다른 세포 유형의 수가 서로 통신 및 생물학적 특성을 수정할 수있는 광범위하게 사용되는 메커니즘으로 나타난다. 이 미토콘드리아 교환은 19 복잡한 넥신 43 함유 간극 연접 8 또는 M-초 / TNFaip2 및 exocyst를 포함하는, 터널링 나노 튜브 (TNT) 형성을 통해 발생할 수 있습니다. 대안 적으로, 미토콘드리아 전송은 도메인 함유 단백질 일 매개 마이크로 소포 (ARMMs) 20 아레스에 의해 매개되는 것으로 나타났다. 흥미롭게도, 미토콘드리아 전송의 효능는 GTPase ρ-1의 발현 속도 MIRO1 21 iPSC- 간의 미토콘드리아 전사 효능의 차이를 설명하기위한 핵심 요소에 링크 된중간 엽 줄기 세포와 성인 BM-중간 엽 줄기 세포 22.
세포 간 미토콘드리아 교환에 관한이 데이터 부에도 불구하고, 상대적으로 적은이 미토콘드리아 전송의 대사 및 생물학적 결과에 대해 공지되어있다. 따라서,이 완전히 충분히 전달의 생물학적 효과를 평가하기위한 적절한 툴을 설정 보증. 수년에 걸쳐, 여러 기술적 접근법 수용체 세포 공여자로부터 미토콘드리아를 전송하는 것이 제안되어있다. 이것은 27 transmitochondrial cybrids (26)를 생성하는 난자 23, 24, 25, 세포 융합으로 미토콘드리아의 직접 분사를 포함 그리고, 최근, 광열를 사용하여 격리 된 미토콘드리아의 전송은 28 nanoblades.
우리는 이전과 다른 절연 mitochond의 능력을 입증시험 관내 및 생체 내 모두에서 관찰 RIA는 살아있는 세포에 의해 내부화 될 메커니즘을 통해 29, 30, 31, macropinocytosis (32)을 포함 할 것을 제안. 우리는 더 정량적 (점착성)로 예시 된 바와 같이, 표적 세포 MDA-MB-231 유방암 세포주 (31) (MSC들)에서 격리 된 미토콘드리아를 전송하기 MitoCeption라는 방법을 개발 하였다. 이 프로토콜은 아교 모세포종 줄기 세포에 고립 된 인간의 MSC 미토콘드리아의 전송 (GSC를) 여기 적응했다.
교 모세포종은 빠르게 주로 종양 (33) 내에 존재하는 아교 모세포종 줄기 세포 (GSC)로, 치료에 내성 뇌의 적극적인 악성 종양이다. 이 GSC를 시험관에서 neurosphere를로 성장하고 이종 이식 모델에서 종양을 생성합니다. 아교 모세포종 내 암 세포를방사선 내성 성상 네트워크 (34)에 생성 된 확장 된 모세관을 통해 상호 연결되는 미토콘드리아 (또한 칼슘 세포 핵)을 통해 이전 할 수 성상 뇌종양 세포에 대해 최근에 도시 된 바와 같이, 용량은 세포 간 연결을한다. 아교 모세포종은 MSC들 (35), (36)를 포함하여 종양 미세 환경 내에서 여러 셀을 채용 할 수있다. 우리는 중간 엽 줄기 세포를 공 배양에 GSC를 가진 세포 - 세포 연결을하고 GSC 기능적 특성을 수정할 것으로 예상된다 그들의 미토콘드리아 (도시되지 않은 데이터)를 전송할 수 있음을 보여 주었다. 본 프로토콜은 MitoCeption 기법 기능적 생물학적 결과를 결정하기위한 목적으로 인간에게 GSC를 인간 중간 엽 줄기 세포에서 미토콘드리아 절연 미리 전송하는 방법을 설명한다. 능성 높은 종양 GB4 GSC 라인 37는이 연구에 사용 하였다.
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Protocol
1 일
중간 엽 줄기 세포의 1 라벨링 (MSC) 미토콘드리아 (선택 사항)
- 1 일에 문화에 4 × 10 5 엽 줄기 세포를 갖도록 이틀 미토콘드리아 준비하기 전에, 10 ml의 αMEM / FBS 10 %에서 100 밀리미터 배양 접시에서 인간 중간 엽 줄기 세포를 시드.
- PBS (4 ml)로 중간 엽 줄기 세포를 씻어 4 ml의 αMEM / FBS 1 %를 추가 (37 ° C로 데워진).
- 37 ° C 배양기에서 30 분 동안 세포를 미토콘드리아 중요한 염료의 필요한 양을 추가하고 품어.
- , 미토콘드리아 염료 용액을 제거 데워진 4 ㎖ (37 ° C) αMEM / FBS 1 %로 두 번 세포를 씻어 내고 다시 4 ml의 αMEM / FBS 10 %를 추가합니다. 37 ° C에서 세포를 품어.
- 2 시간 후, 다른 시간 30 분 후 배지 (αMEM 10 ㎖ / FBS 10 %)을 변경하고.
1 일
아교 모세포종 줄기 세포 (GSC) 2. 라벨 (선택 사항, 토론 섹션 참조)
| 세포 배양 배지 | 구성 |
| GSC 기초 배지 | DMEM / F-12로 보충 |
| 인슐린 20 ㎎ / ㎖ | |
| N2 보충 1 배 | |
| 포도당 3g의 /의 L | |
| L 글루타민 2 mM의 | |
| GSC 증식 매체 | 기초 매체에 추가 |
| B27 보충제의 1 배 | |
| EGF (10) NG / ㎖ | |
| bFGF를 10 NG / ㎖ | |
| Fungine 10 ㎎ / ㎖ | |
| Fungizone 0.25 ㎎ / ㎖ | |
| 헤파린 2 ㎎ / ㎖ | |
| 시프로플록사신 2 μg의 / ㎖ | |
| 겐타 마이신 2 μg의 / ㎖ | |
| MSC 증식 매체 | & #945; MEM은 보충 |
| L 글루타민 2 mM의 | |
| 10 % FBS | |
| bFGF를 2 NG / ㎖ |
표 1 : 문화 미디어.
- 폴리 HEMA 코팅 된 세포 배양 플라스크에 neurosphere를 성장 중 GSC를 (GB4 세포주 (32) (10 × 106 세포) (단계 3.12-3.1 참조) 해리.
- 105 세포로 48- 웰 플레이트에 시드 GSC를 / 웰 GSC 증식 배지 (500 μL)를 (표 1 참조).
- 20 ° C에서 5 분 동안 270 XG에 플레이트를 원심 분리기.
- 세포 중요한 염료의 필요한 양을 추가하고 37 ° C에서 30 분 동안 품어.
- 48 웰 플레이트의 웰 당 GSC 기초 배지 500 ㎕의 (표 1)를 추가합니다.
- 5 분 동안 20 ℃에서 270 × g으로 원심 분리 판. 뜨는을 대기음.
- 반복 2.6-2.5 단계를 반복합니다.
- GSC 기초 배지 500 μl를 추가하고 30 분 동안 37 ° C에서 품어.
- 5 분 동안 20 ℃에서 270 × g으로 원심 분리 판. 뜨는을 대기음.
- 48 웰 플레이트의 웰 당 GSC 증식 배지 500 μl를 추가하고 37 ° C 배양기에서 배양한다.
주 : GSC를 금액이 표시 (10 × 106 세포)를 상이한 선량 - 반응 실험 FACS 제어를 수행 할 수 있습니다. 실험 조건은보다 정확하게 정의되면이 금액의 크기가 축소 될 수있다.
2 일
아교 모세포종 줄기 세포의 3 시드
- 한 50㎖ 튜브에서 20 ° C에서 5 분, 270 × g으로 원심 분리하여 GSC의 neurosphere를 (10 × 106 세포)를 수집한다.
- 20 ° C에서 5 분 동안 270 XG에서 5 HBSS ml의, 원심 분리로 세포를 씻으십시오.
- 뜨는을 대기음.
- 부드럽게 100 μL 트립신 EDTA (0.25 %) (에서 GSC 펠렛을 재현 탁 10 × 10 당
- 3 분 37 ° C에서 품어.
- 10 μL 염화칼슘 2 (20 mM)을 2 μL의 DNase I (10 ㎎ / ㎖)를 추가합니다.
- 부드럽게 P200 피펫와 피펫 팅 아래 (30-50x)에 의해 neurosphere를을 떼어 놓다. 거품을 피하십시오. 모든 GSC를이 분해되는 현미경으로 확인합니다.
- 10 μL 트립신 억제제 (5 %) 및 10 ml의 HBSS를 추가합니다.
- 20 ° C에서 7 분 270 XG에 원심 분리기 GSC를.
- 뜨는을 취소하고 10 ml의 GSC 기초 배지 (표 1)를 추가합니다.
- 토마스 계산 챔버와 GSC를 계산 한 다음 20 ℃에서 7 분 동안 270 XG에서 세포를 원심 분리기.
- GSC를 106 / ㎖의 세포 농도에 도달 GSC 증식 배지 (표 1)의 적절한 부피를 추가한다.
- 시드 105 GSC를 96- 웰 플레이트의 웰 당 (세포 현탁액 100 ㎕).
- 봇에 GSC를 얻을 20 ° C에서 7 분 270 XG에 접시를 원심 분리기우물의 톰.
- 제 5 절까지 37 ° C에서 96 웰 플레이트를 품어.
2 일
4. MSC 미토콘드리아 격리
- 4 °의 C에 마이크로 튜브 원심 분리기의 온도를 조정합니다.
- 두 튜브를 1.5 ml의 "A"및 (모두 EDTA 프리 프로테아제 억제제 함유하는 200 ㎕의 반응물 (A)와 400 μL 시약 C) 미토콘드리아 추출 용 시약을 함유하는 "C"를 준비한다. 2 다른 튜브, "MSC"와 "미토"를 표시를 준비합니다. 얼음에있는 모든 튜브를 유지합니다. 또한 미토콘드리아 연속 희석 용 튜브를 준비합니다.
- 데워진 10 ㎖ (37 ° C) PBS로 세척 중간 엽 줄기 세포.
- 2 ml를 10 초 동안 트립신 (없음 EDTA) 1 ㎖의 트립신 (없음 EDTA)를 추가 씻을 중간 엽 줄기 세포. 37 ° C에서 5 ~ 10 분 동안 세포를 품어.
- 10 ㎖ αMEM / FBS 10 %, 50 ㎖의 튜브에 전송을 추가하여 중간 엽 줄기 세포를 복구.
- 20 ° C에서 5 분 270 XG에 원심 분리기 세포.
- 뜨는을 취소하고 추가세포 펠렛을 10 mL의 αMEM / FBS 10 %.
- Malassez 계산 챔버와 중간 엽 줄기 세포를 계산합니다.
- 중간 엽 줄기 세포를 원심 분리기 (4-5 × 105) 20 ° C에서 5 분 동안 270에서 XG.
- , 상층 액을 버리고 세포 펠렛에 1m 얼음처럼 차가운 αMEM / FBS에게 10 %를 추가하고 "MSC"라벨이 지정된 튜브 (단계 4.2에서 준비)에 세포를 전송합니다. 얼음에 튜브를 유지합니다.
- 원심 분리기 4 ° C에서 5 분 900 XG에서 중간 엽 줄기 세포를 포함하는 튜브.
- 튜브의 모든 잔여 매체를 제거합니다.
- 미토콘드리아 절연 시약 A (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)이없는 단백질 분해 효소 억제제를 포함)의 200 μl를 추가합니다. 5 초 동안 중간 속도로 소용돌이 정확히 2 분 동안 얼음에 튜브를 둡니다.
- 10 초 동안 최대 속도로 미토콘드리아의 분리 시약 B. 소용돌이의 2.5 μl를 추가 한 다음 얼음에 튜브를 둡니다. 5 분마다 30 초를 반복합니다.
- 미토콘드리아 절연 시약 C합니다 (EDTA없는 단백질 분해 효소 억제제를 포함)의 200 μl를 추가합니다. RO (튜브를 기울 믹스ughly 30 회)하지 소용돌이 않습니다. 4 ℃에서 10 분 동안 700 XG에 튜브를 원심 분리기.
- 은 "미토"튜브 (단계 4.2에서 준비)에 뜨는합니다 (MSC의 미토콘드리아를 포함)를 전송합니다.
- 3000 XG, 4 ° C에서 15 분, 원심 분리기는 미토콘드리아 펠렛을 얻을 수 있습니다. 상층 액을 버린다. 펠렛은 고립 된 미토콘드리아가 포함되어 있습니다.
- 미토콘드리아 펠렛을 얻기 위해, 12,000 XG, 4 ° C에서 5 분에서 다음 시약 C. 200 μL, 원심 분리기와 미토콘드리아 펠렛을 씻어.
GSC를 격리 된 MSC 미토콘드리아 5. 전송 (MitoCeption)
- 중간 엽 줄기 세포 (4 × 10 5)에서 분리 된 미토콘드리아 펠릿에 미리 냉각 (0 ° C) GSC 증식 배지 200 μl를 추가합니다.
- 지속적으로 GSC를에 미토콘드리아 현탁액의 20 μl를 추가 (GSC 증식 배지에서) 미토콘드리아 준비를 희석.
- 96-w의 우물에 절연 미토콘드리아의 양을 추가원하는 농도 (0.1-10 μg의)에서 (단계 3.15에서)를 GSC를을 포함 엘 플레이트. 한 번 이상 전체 표면을 덮고, 가까운 우물의 바닥에 천천히 미토콘드리아를 추가합니다.
- MSC 미토콘드리아 중요한 색소의 누출을 제어, GSC 증식 배지 전용 (GSC를)를 (중대한 염료 누출 감지 부 6.2 참조)를 함유하는 96- 웰 플레이트의 웰에 미토콘드리아 제제 (0.1 μg의 10)의 동일한 양을 추가한다.
- 원심 4 ℃에서 15 분 동안 1,500 XG에서 MSC 미토콘드리아 (스텝 5.3)과 상기 제어 플레이트 (스텝 5.4)과 미토콘드리아받는 GSC를 함유 96- 웰 플레이트.
- 즉시 원심 분리 후 37 ℃ 세포 배양기에서 배양 플레이트를 놓습니다.
주 : 미토콘드리아 전송 프로토콜이 SYST에 따라 조정될 수 회 원심 다수의 적절한 원심 력에서 배양 된 세포의 미토콘드리아 현탁액의 원심 분리에 의존미토콘드리아 기증자 /받는 사람 세포의 그들.
3 일
FACS와 공 촛점 이미징에 의해 미토콘드리아 전송 6. 분석
- FACS 분석 GSC 샘플의 제조
주 : MSC 미토콘드리아 미리 중요한 색소 (제 1)로 표지 된 경우, 효율은 24 시간 미토콘드리아 전송 후에, FACS로 모니터링 할 수있다.- 원심 분리기 20 ° C에서 5 분 270 XG에서 MitoCepted GSC를 가진 96 웰 플레이트.
- 상층 액을 버린다.
- 각 웰에 100 ㎕의 트립신 (없음 EDTA)를 추가합니다. 3 분 37 ° C에서 품어. 피펫은 위아래로 24 시간 기간에 형성된 neurosphere를을 해리.
- GSC 기초 배지 100 μl를 추가합니다.
- 20 ° C에서 5 분 동안 270 XG에 접시를 원심 분리기 및 상층 액을 버린다.
- 재현 탁 GSC를 300 ㎕의 GSC에 FACS에 기초 배지 및 전송 튜브를 채택.
- 외과를 수행alysis.
- 격리 된 미토콘드리아에서 미토콘드리아 중요한 염료 누출에 대한 제어 (FACS)
주 :이 단계의 목적은 오히려 진정한 MSC 미토콘드리아 전송을 반영하지만 것이다 백그라운드 FACS 신호 MitoCeption (단계 5.3)에 사용되는 표지 된 MSC 미토콘드리아에서 중요한 염료의 단순한 리크를 결정하는 것이다.- 3.15에 단계 3.1에 설명 된대로 GSC 세포를 시드.
- 1 시간 동안 37 ℃에서 세포를 인큐베이션.
- 원심 20 ° C에서 5 분 동안 1,500 XG에 (단계 5.4에서 5.6)만을 미토콘드리아를 함유하는 96- 웰 플레이트.
- GSC 96 웰 플레이트 (단계 6.2.2)에서 문화 매체를 기음과 미토콘드리아 만 (단계 6.2.3에서 상층 액)와 함께 배양 배지로 교체합니다.
- 2 시간 동안 37 ° C에서 GSC를 함유 96- 웰 플레이트를 인큐베이션.
- FACS 분석 6.1.7하기위한 단계 6.1.1에서와 같이 진행합니다.
- GSC의 SAMP의 제조공 촛점 이미징을위한 레
주 : GSC를 MSC에 미토콘드리아의 전송 형광 이미징에 의해 분석 할 경우, 중간 엽 줄기 세포와 GSC를 모두 미토콘드리아 (단계 1)과 셀 (단계 2) 중요한 염료 각각 미리 표시하여야 할 필요가있다.- 단계 6.1.5에 6.1.1에서와 같이 GSC를 준비.
- 재현 탁 GSC를 35mm 배양 접시 (유리 하단)에서 2 %를 FBS와 씨앗을 포함하는 2 ml의 GSC 증식 매체입니다.
- 24 시간 후 전송 된 형광 MSC의 미토콘드리아와 GSC를에 공 촛점 이미징을 수행합니다.
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Representative Results
간엽 줄기 세포 (MSC) 및 MitoCeption하여 타겟 아교 모세포종 줄기 세포 (GSC) 그들의 전송에서 미토콘드리아의 분리를 개설 절차의 단계는도 1에 도시된다. GSC를 자신의 줄기 세포 특성을 유지하기 neurosphere를로 성장 암 줄기 세포이다. 이 프로토콜의 경우, GSC를 미토콘드리아가 높은 전송 효율을 허용 미토콘드리아 (단계 3)의 전송 전에 단일 세포로 두 시간을 시딩 (FACS 데이터도 3b 참조). 제 5 조 (3 일) 후,이 세포를 neurosphere를을 (그림 1) 형성으로 다시 관찰된다.
GB4 GSC를의 이미징, 형광 표지 된 MSC의 미토콘드리아와 MitoCeption 후 72 시간은, 공 초점 이미지에서 얻은 직교 뷰에 의해 입증으로 MSC의 미토콘드리아에서, GB4 GSC를 내부에 지역화 된 것을 보여줍니다 (그림 2B). 이것은 또한 내인성 GSC 미토콘드리아 (도 2a)의 경우와 같이 MSC 전송 미토콘드리아는 GSC를 통하여 국소 보일. MitoCepted GSC를 공 촛점 이미지는 MSC의 동일한 GSC 샘플 FACS 모두에 의해 분석 하였다되도록 깊은 붉은 중요한 염료 prelabeled 미토콘드리아 (도 3a 참조), 영상 (도 2C)로 수행 하였다. MSC의 미토콘드리아의 전송이 가장 GSC를 관찰 할 수 있었다 (패널은) 및 GSC 공 초점 이미지에서 3D 재구성이 전송 된 MSC의 미토콘드리아의 세포 내 현지화를 확인 (패널 B, C). 전송 된 MSC의 미토콘드리아의 현지화를 시각화 허용 파란색 휴대과 빨간색 미토콘드리아 중요한 염료 모두 (1 일)에 GSC를을 Prelabeling 석사 미토콘드리아 전송 다음, (빨간색) 내생 GSC 미토콘드리아에 대해 (녹색 색) (그림 2D) .
confo 동안칼 영상은 미토콘드리아 전송을 정량화하는 선택의 도구 MitoCeption, 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)를 다음 전송 된 MSC의 미토콘드리아의 세포 내 현지화되어 검사를 허용, MSC의 미토콘드리아가 중요한 염료 prelabeled되었다 제공했다. 증가 FACS 신호에 LED 형광 MSC 미토콘드리아의 양이 증가함에 따라도 3a, MitoCeption에 도시 된 바와 같이. 주목,이 신호는 (빨간색) (파란색으로, 단계 6.2 참조) 제어 조건에서 얻어진 신호보다 몇 배이었다. FACS 신호가 GSC를 내부에 전송 MSC 미토콘드리아의 대표 레이블 MSC의 미토콘드리아에서 형광 중요한 염료 누출 단순히 결과라고이 추가로 제공 증거. 단세포 GSC를 수행 여기에 제시된 미토콘드리아 전송 프로토콜은 용량 의존적 반응 (도 3b)를 나타내었다. MSC는 미토콘드리아의 전달 효율도 neur 평가 하였다ospheres. 이것도 GSC를 MSC에 미토콘드리아 전송되었다하더라도 대표적인 실험 (도 3B)에 도시 된 바와 같이, 전사의 효과가 낮았다.
MSC의 미토콘드리아와 GSC를 내 자신의 유지 보수의 전송은 GSC를에서 MSC 미토콘드리아 DNA (미토콘드리아 DNA)를 정량화 다음에 할 수 있습니다. 이것은 중간 엽 줄기 세포와 GSC를 별개의 일배 체형과 다른 기증자로부터 얻을 수 있어야합니다. 도 3c는 미토콘드리아 DNA의 단일 염기 다형성 (SNP를) 두 기증자의 D 루프 내에서 발견 서열 3 '말단 위치에 표시를 보여줍니다. 구체적으로 어느 위치에 도너 1 또는 2 도너가 추가의 돌연변이가 도입 된로부터 PCR 프라이머의 3 '말단에 N-2- 대해 미토콘드리아 DNA를 증폭하기위한 PCR 프라이머의 디자인에 대해서는. 도너 (1)로부터의 미토콘드리아 DNA 프라이머 세트로 증폭 될 수있다 : 5'-TAACAGTACATAGCACATACAA-3 '와 5'-GAGGATGGTGGTCAAGGGA-3'(범용의프라이머 38) equencing 동안 프라이머 세트 5'-TTAACTCCACCATTAGCACC-3 '(서열 유니버설 38 프라이머) 및-AGTATTTATGGTACCGTCCG 5'-3'가 두 공여체로부터 미토콘드리아 DNA를 증폭 하였다.
그림 1 : MitoCeption에 의해 GSC를에 고립 된 MSC의 미토콘드리아의 전송을위한 워크 플로우. GSC를하고 이후 GSC 분석에 MSC 미토콘드리아의 MitoCeption의 7 단계가 표시됩니다. 스텝 번호 프로토콜 섹션으로 표시된다. MSC와 GSC 라벨이 수행되지 않는 경우, 기능 분석 용으로, 1 단계와 2 단계는 생략 될 수 있으며, 프로토콜은 하루에 2로부터 다음 수있다. 위상차 이미지는 미토콘드리아 전송 (3 일) 후 MSC의 미토콘드리아 전송 (2 일), 24 시간 동안 준비 단세포 문화 neurosphere를 같은 GB4 GSC를 (1 일)을 나타냅니다. 스케일 바 =100 μm의. 4 단계에서 중간 엽 줄기 세포에서 분리하기 전에 MitoTracker 레드 CMXRos와 prelabeled 고립 된 MSC의 미토콘드리아의 대표 현미경 사진. 스케일 바 = 5 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : MitoCeption에 의해 GB4 GSC를로 전송 후 GB4 내생 미토콘드리아의 이미징 및 MSC 미토콘드리아의. (A, B, C)은 GSC를 GB4 녹색 중요한 염료로 표지 하였다. (B, C, D) GB4 GSC를은 (105 GSC를위한) 2.5 μg의 MSC의 미토콘드리아 준비와 MitoCepted했다. (A) GSC를가 MitoTracker 레드 CMXRos으로 표시하고 (/ EGF / bFGF를 오 w GSC 증식 배지) 48 시간 동안 배양 하였다.(B) GSC 공 초점 섹션과 직교 뷰, MitoTracker 레드 CMXRos 표지 MSC의 미토콘드리아와 MitoCeption 후 72 시간 (배지 : GSC 확산 매체 / FBS 2 %). (C, D) 중간 엽 줄기 세포는 GSC를에 MSC 미토콘드리아의 전송 전에 깊은 붉은 미토콘드리아 중요한 염료 (FACS 분석을위한 동일 조건)으로 prelabeled했다. MSC는 미토콘드리아 전송 후에는 GSC를 10 % FBS를 함유 GSC 증식 배지에 접종 하였다. (C)있는 isosurface 조회수 (B, C) 공 초점 이미지에서 GSC 3D 재건의 xy 평면 부 (C) (MitoCeption 후 48 시간)와 함께. (D) GB4 GSC를은 파란색 세포 중요한 염료 및 중요한 염료가 깊은 붉은 미토콘드리아 중요한 염료로 prelabeled MSC 미토콘드리아의 전송 전에 (녹색 군데) 빨간색 미토콘드리아으로 표시 하였다. XZ (b) 및 XY (다)에있는 isosurface보기 공 초점 이미지 (72 시간 석사 미토콘드리아 전송 후)에서 GSC 3D 재건의 평면 부분. 모든 세포 w감수는 유리 바닥으로 배양 접시에 시드와 이미지는 살아있는 세포에 촬영했다. 이미지 C 패널을 제외하고 스케일 바 = 5 μm의 (a)는 여기서 스케일 바 = 10 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : GSC를에서 MSC 미토콘드리아 DNA의 미토콘드리아 형광 활성화 된 세포로 전달 정렬 (FACS) 및 검출 (미토콘드리아)의 정량화. (A, B) GSC를이 깊은 붉은 미토콘드리아 중요한 염료로 prelabeled 및 FACS로 분석 MSC의 미토콘드리아와 MitoCepted했다. (A) 대표 FACS 결과 MitoCepted GSC를 얻어 (위에서 아래로, 빨간색 : 1.2, 2.5, 5, 0.6 10 μg의 MSC의 미토콘드리아 준비 (10 5 GSC를위한)). 파란색, EAC에 대한H 패널은 MitoCeption (단계 5.4 참조)에서 사용 된 것과의 GSC를 FACS 프로필 MSC 미토콘드리아 동일한 양의 컨디셔닝 배지와 함께 배양 제어한다. 블랙 (위)에서 레이블이없는 GSC를 함께 제어 조건. (- O) 하루 GSC의 neurosphere를에, (SEM 3 실험의 평균) 및 GSC에 제어 미토콘드리아의 상층 액으로 - (•) (B) 상대 평균 형광 강도 (MFI) 단일 세포 GSC를에 미토콘드리아 전송 후의 단셀 (-). 미토콘드리아 D 루프 내 (C) DNA 서열과 도너 SNP를 1과 2 사이의 차이는 SNP 서열의 3 '말단에서 청색으로 표시된다. 기증자 중 하나에서 미토콘드리아 DNA의 특정 PCR 증폭 용 프라이머의 설계 (프라이머 1 SPE, 2). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
연구의 증가는 세포가 미토콘드리아를 교환 할 수 있고 이러한 미토콘드리아 표적 세포 대사와 기능에 심각한 영향을 보여준다. 따라서, 양적으로 생물학적 효과의 정확한 연구 있도록이 표적 세포에 공여 세포에서 미토콘드리아를 전송하는 툴을 습득하는 것이 필수적이다.
여기에 설명 된 프로토콜은 원래 점착성 암 세포주 MDA-MB-231 33 인간 중간 엽 줄기 세포로부터 분리 된 미토콘드리아를 전송할 아웃 처리 하였다. 여기에 도시 된 바와 같이,이 체외 neurosphere를 암으로 성장 줄기 세포에 대해 적응 될 수있다. 미토콘드리아 전송 MSC 미토콘드리아가 GSC의 neurosphere를 첨가 할 때 발생할 수 없지만, 본 프로토콜에 기재된 바와 같이, 그것은, 하나의 셀에 GSC를보다 효율적이었다. 이 프로토콜은 또한, 행의 필요성, T 세포와 같은 다른 비 - 부착 세포에 외삽 될 수있다MitoCeption 단계를위한 시딩 세포 농도를 DAPT.
미토콘드리아 제제는 그들의 무결성을 유지하기 위해 얼음을 수행하여야한다. 다른 세포질 화합물의 감소 오염과 미토콘드리아의 준비를 얻으려면, 미토콘드리아의 회복을위한 원심은 15 분 동안 3,000 XG에서 수행된다. GSC를의 전송에 사용되는 MSC 미토콘드리아의 양을 모니터하기 위해 미토콘드리아 단백질 함량이 결정된다. 이를 위해 미토콘드리아 단백질 추출물을 프로테아제 억제제 보충 된 RIPA 완충액을 사용하여 제조된다. 단백질 농도는 제조업체의 지침에 따라 bicinchoninic 산 분석법을 이용하여 측정 하였다. 소 혈청 알부민을 표준으로 사용 하였다. 평균적으로 10 μg의 단백질 100,000 엽 줄기 세포로부터 얻었다.
중요한 염료 라벨링 MSC 미토콘드리아 형광 - 활성화 된 세포에서 미토콘드리아의 전달 효율을 정량화 허용(FACS) 정렬 및 공 초점 이미징에 의해 전송 된 미토콘드리아의 현지화를 결정하는 단계를 포함한다. GSC를가 중간 엽 줄기 세포와 같은 미토콘드리아 중요한 염료로 표시 할 수 있습니다. 이들 세포들은 FACS 분석을위한 양성 대조군으로서 사용한다. 대안 적으로, GSC를는 내인성 GSC 미토콘드리아에 대하여 전사 MSC 미토콘드리아의 현지화를 허용하는 중간 엽 줄기 세포는 다른 중요한 미토콘드리아 염료로 표지 할 수있다. 녹색과 빨간색 미토콘드리아 염료가 공 초점 이미징 선호하는 동안 깊은 붉은 미토콘드리아 중요한 염료는 FACS 분석에 적합합니다. 매우 중요, EDTA에 MSC 노출 프로토콜의 모든 단계에서 피해야한다. 따라서, 세포 트립신 트립신없이 EDTA로 추천합니다; 미토콘드리아의 제조에 사용되는 단백질 분해 효소 억제제의 칵테일뿐만 아니라, EDTA없는해야한다. EDTA의 존재하에 미토콘드리아 MSC로부터 미토콘드리아 중요한 색소의 누출이 관찰되었다. 미토콘드리아의 transfe 경우GSC를에 r은 현미경으로 분석하는 것입니다,받는 사람 아교 모세포종 세포는 또한 중요한 염료로 표시되어야합니다. 그들은 더 균일 한 셀 라벨을주는 것처럼, 녹색, 청색 세포 염료 (재료 및 시약 표 참조) 공 초점 이미지에서 3D 재구성을 가능하게 선호했다.
프로토콜이 자신의 특정 세포로 사용자에 의해 검증되면, 미토콘드리아의 표시가 가능한 생물학적 편견을 배제하기 위해, 기능 연구를 위해 밖으로 남아있을 것입니다. 용량 반응은 미토콘드리아 제제의 희석액과, 적당하고, MSC 미토콘드리아 농도의 넓은 범위에 걸쳐 분석한다. 실제로, 전송 된 미토콘드리아에 대한 생물학적 효과는 FACS 또는 촬상하여 검출 낮은 범위에서 낮은 미토콘드리아 농도에서 달성 될 수 있다는 것을 주목해야한다. GSC 대사, 증식 및 치료 반응에 대한 조사를 포함하여이 기능 연구는 다음과 같은 일을 수행미토콘드리아 전송.
중간 엽 줄기 세포와 GSC를가 (상이한 미토콘드리아 DNA의 일배 체형으로) 다른 공여자로부터 단리하는 경우 전사 미토콘드리아 MSC는 타겟 MSC에 GSC를 미토콘드리아 DNA의 농도를 측정하여 모니터링 할 수있다. MSC는 내생 GSC mtDNAs 간의 구별은 미토콘드리아 D 가변 루프 영역에서 각 세포 유형에 대한 특정의 SNP의 존재에 기초한다. 따라서, MitoCeption 기술의 다양한 용도 중 다른 일배 체형과 미토콘드리아 DNA를 보유하는 미토콘드리아를 전송할 가능성뿐만 아니라 전사 미토콘드리아 검출 할뿐만 아니라, 반수체 배제 분석을 포함 미토콘드리아 유지 생물학을 연구 할 수있는 도구를 제공한다.
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Disclosures
INSERM (연구소 국립 드 라 상테 등 드 라 공들인 MEDICALE),있는 CJ와 ML.V. 제휴의 MitoCeption 기술 (EP14306154.7)에 특허 출원을 제기했다.
Acknowledgments
우리는 도움이 토론에 대한 실험실의 구성원뿐만 아니라 안드레아 Parmeggiani (L2C 및 DIMNP, 몽펠리에), 벤와 샬럿 (IES, 몽펠리에를) 감사합니다, 크리스토프 Duperray를 제공하기위한 FACS 분석은 몽펠리에 RIO 영상 설비 (MRI)에 대한 도움말 FACS와 공 초점 현미경에 적합한 환경을 제공합니다. BNM은 LABEX Numev (규칙은 ANR-10 LabX에-20)에서 대학원 친교에 의해 지원되었다. AB 바르샤바과 유럽 연합 (EU)의 대학에서 학사 교제에 의해 지원되었다 (N POKL.04.01.02-00-221 / 12 °). MLV는 과학 연구를위한 국립 센터 (CNRS)에서 직원 과학자입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitochondria Isolation Kit for Tissue | Fisher Scientific | 10579663 | |
| N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 11520536 | |
| B-27 Supplement W/O VIT A (50x) | Fisher Scientific | 11500446 | |
| HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Sigma | H4385 | |
| poly Heme | Sigma | P3932 | |
| aMEM w/o glutamine | Ozyme | BE12-169F | |
| DMEM/F-12 without glutamine | Fisher Scientific | 11540566 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-024 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Insuline | Sigma | I 1882 | |
| Human bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| CaCl2 | MERCK | 2382 | |
| Trypsine Inhibitor | Sigma | T9003 | |
| DNase I | SIGMA | 10104159001 | |
| Trypsine 0.25% / EDTA 1 mM | Invitrogen | 25200056 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Protease inhibitors EDTA free | Sigma | 4693159001 | |
| Ciprofloxacine | Sigma | 17850-5G-F | |
| Fungine | Invivogen | ant-fn-1 | |
| Fungizone | Thermofisher | 15290018 | |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410 | |
| MitoTracker Green FM | Molecular Probes | M7514 | |
| MitoTracker Red CMXRos | Molecular Probes | M7512 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Molecular Probes | M22426 | |
| CellTracker Green CMFDA | Molecular Probes | C7025 | |
| CellTracker Blue CMF2HC | Molecular Probes | C12881 | |
| RIPA | Santa Cruz | sc-24948 | |
| FluoroDish Sterile Culture Dish | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| FACS tubes | Beckman Coulter | 2,523,749 | |
| FACS apparatus | Gallios | 3L 10C | |
| LC FAST START DNA MASTER PLUS | Roche | 3515885001 |
References
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