Summary
这里，协议（MitoCeption）呈现给传送线粒体，从人类间质干细胞（MSC）隔离，胶质母细胞瘤干细胞（GSC），具有研究它们对GSC代谢和功能的生物效应的目的。类似的协议可以适于其它类型的细胞之间转移线粒体。
Abstract
线粒体发挥细胞代谢，能源生产和细胞凋亡的控制中心作用。不足的线粒体功能已经发现负责非常多样的疾病，从病症神经系统癌症。有趣的是，线粒体最近已显示，以显示有能力的细胞类型之间从人间充质干细胞（MSC）的共培养条件转移，特别是癌症细胞，代谢和功能的后果对线粒体受体细胞，进一步增强了当前兴趣这些细胞器的生物学性质。
评估在靶细胞的转移的MSC线粒体的效果是最重要的，以了解这样的细胞 - 细胞相互作用的生物学结果。这里所描述的MitoCeption协议允许从供体细胞中预先分离到靶细胞的线粒体的转移，使用MSC线粒体和胶质母细胞瘤干细胞（GSC）作为模型系统。该协议之前已经用于从干细胞转移线粒体，分离的，以贴壁的MDA-MB-231癌细胞。此线粒体传输协议此处适于呈递如体外神经球生长的具体特殊性GSCS。分离的线粒体的转移可以使用线粒体活体染料后跟荧光激活细胞分选（FACS）和共聚焦成像。使用线粒体供体和靶细胞具有不同的单倍型（单核苷酸多态性）的也允许基于其圆线粒体DNA（mtDNA的）的靶细胞的浓度被转印线粒体的检测。一旦该协议已经被验证这些标准，窝藏转移的线粒体的细胞可以被进一步分析，以确定对生物性能如细胞代谢，可塑性，增殖和对治疗的反应的外源线粒体的作用。
Introduction
线粒体是在他们中的养分吸收，以及在能量和代谢物生产中发挥中心作用的真核细胞中发现的细胞器。这些细胞器包含圆形线粒体DNA（mtDNA的），16.6 kb的长，编码电子传递链复合物，tRNA和个rRNA 1的蛋白质。这些细胞器的功能是对细胞稳态和几个病状已与线粒体功能障碍1，2，3相关联的关键。线粒体状态已经例如被链接到炎症，感染性疾病和癌症，与用于转移和电阻后果治疗4，5，6，7后面这种情况。
线粒体显示的非凡能力， “供体”和“目标”细胞间的转移得到。这导致在靶细胞的能量代谢的变化，以及在其它功能上的修改，例如组织修复和对化疗药物抗性，如最近由不同实验室8，9，10，11，12，13，14，15中所示16。人类间充质干细胞（MSCs）显示这个能力到线粒体转移到各种各样的靶细胞，包括心肌细胞，血管内皮细胞，肺泡上皮细胞，肾小管细胞和癌细胞，导致这些细胞的功能特性的修改8，> 9，10，12，17，18。
线粒体交换现在显示为一种广泛使用的机制，允许多个不同的细胞类型中与彼此通信并修改他们的生物特性。这种线粒体交换可以通过隧道纳米管（TNT）的形成发生，涉及连接蛋白含有43缝隙连接8或M-SEC / TNFaip2和exocyst复杂的19。可替代地，也被示出的线粒体转移到通过抑制蛋白结构域的蛋白1介导的微泡（ARMMs）20介导的。有趣的是，线粒体转移的功效是有联系的所述的Rho GTP酶1的表达率MIRO1 21，用于说明在iPSC-之间线粒体转移功效的差别的关键因素干细胞与成人骨髓间充质干22。
尽管这种财富有关的细胞 - 细胞线粒体交换数据的，相对知之甚少此线粒体转移的代谢和生物结果。因此，它完全值得设置适当的工具充分评估这种转移的生物效应。多年来，若干技术方法从供体转移到线粒体受体细胞已被提出。这包括直接注射的线粒体成卵母细胞23，24，25，细胞融合，以产生transmitochondrial胞质杂种26,27 并且，最近，利用光热分离的线粒体的转移nanoblades 28。
我们和其他人以前证明孤立的和线粒体的能力河口到由活细胞内化，因为无论是在体外和体内观察到的 29，30，31，通过机制，提出了涉及巨吞32。我们进一步开发出一种方法，叫做MitoCeption，以定量地转移（从干细胞）分离线粒体靶细胞，与（贴壁）中列举的MDA-MB-231乳腺癌细胞系31。该协议在这里被改编为分离人MSC线粒体的转移胶质母细胞瘤干细胞（GSCS）。
胶质母细胞瘤是大脑中迅速成为处理有抗性，主要是由于胶质母细胞瘤干细胞（GSC）的肿瘤33内本侵略性恶性肿瘤。这些GSCS成长为体外神经球并产生异种移植模型的肿瘤。胶质母细胞瘤中的肿瘤细胞具有容量，使细胞与细胞间的连接，如最近所示为星形细胞脑肿瘤细胞通过扩展的微管，配线，通过该线粒体（以及钙和细胞核）可以迁移，导致耐放疗星形网络34。胶质母细胞瘤可以招募肿瘤微环境内的许多不同的细胞，包括干细胞35，36。我们表明，干细胞可以与在共培养GSCS细胞 - 细胞连接，并传送其线粒体（数据未显示），这是预期到修改GSC功能特性。本协议说明了MitoCeption技术如何可用于从人MSC与确定它们的功能的生物结果的目的传送线粒体，分离的预先，对人类GSCS。的多能和高致瘤性GB4 GSC线37在本研究中使用。
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Protocol
1天
1.间充质干细胞的标记（MSC）线粒体（可选）
- 线粒体制备前两天，种子人MSC在100毫米培养皿中，在10毫升αMEM/ FBS 10％，以便具有在第1天在培养4×10 5个干细胞。
- 冲洗的MSC用PBS（4毫升）中，并添加4毫升αMEM/ FBS 1％（预热至37℃）。
- 添加所需的线粒体活体染料的量，并培育细胞30分钟，在37℃培养箱。
- 除去线粒体染料溶液，用预热4毫升（37℃）αMEM/ FBS 1％冲洗细胞两次，并加回4毫升αMEM/ FBS 10％。孵育在37℃的细胞。
- 30分钟后，改变培养基（10毫升αMEM/ FBS 10％）和，另一次，2小时后。
1天
2.标签胶质母细胞瘤干细胞（GSC）（可选，见讨论部分）
| 细胞培养基 | 组成 |
| GSC基础培养基 | DMEM / F-12补充有 |
| 胰岛素20毫克/毫升 | |
| N2补充1X | |
| 葡萄糖3g / L的 | |
| L-谷氨酰胺2mM的 | |
| GSC增殖培养基 | 添加到基础培养基： |
| B27的补充1X | |
| EGF 10毫微克/毫升 | |
| bFGF的10毫微克/毫升 | |
| 为Fungine 10毫克/毫升 | |
| 两性霉素B 0.25毫克/毫升 | |
| 肝素2mg / ml的 | |
| 环丙沙星2微克/毫升 | |
| 庆大霉素2微克/毫升 | |
| MSC增殖培养基 | ＆＃945; MEM补充有 |
| L-谷氨酰胺2mM的 | |
| 10％FBS的 | |
| bFGF的2毫微克/毫升 |
表1：文化传媒。
- 分离生长为在聚HEMA包被的细胞培养烧瓶神经球GSCS（GB4细胞线32（10×10 6个细胞）（参见步骤3.1至3.12）。
- 在10 5个细胞在48孔板种子GSCS /孔在GSC增殖培养基（500微升）（ 见表1）。
- 离心板在270×g离心20℃5分钟。
- 添加所需的细胞活体染料的量，并在37℃下孵育30分钟。
- 加入500μlGSC基础培养基（ 表1）每48孔板的孔。
- 离心在270 xg离心该板在20℃下5分钟。吸出上清液。
- 重复步骤2.5至2.6。
- 加入500μlGSC基础培养基中，并在37℃孵育30分钟。
- 离心在270 xg离心该板在20℃下5分钟。吸出上清液。
- 加入500μlGSC增殖培养基的每孔的48孔板，并在37℃培养箱孵育。
注意：GSCS的量表示（10×10 6个细胞）允许执行不同的剂量-反应实验和FACS对照。一旦实验条件更精确地定义此量可被缩减。
第2天
3.胶质母细胞瘤干细胞接种
- 在50ml管中收集的GSC神经球（10×10 6个细胞）通过离心在270×g离心5分钟，在20℃。
- 在20℃下洗涤细胞用5毫升的HBSS，和离心机在270×g离心5分钟。
- 吸出上清液。
- 轻轻重悬在100μl胰蛋白酶-EDTA（0.25％）（在GSC粒料每10×10
- 孵育在37℃下3分钟。
- 添加10微升的CaCl 2（20毫米）和2μlDNA酶I（10毫克/毫升）。
- 通过与P200吸管轻轻吹打向上和向下（30-50x）游离神经球。避免气泡。检查所有GSCS解离的显微镜下。
- 添加10微升胰蛋白酶抑制剂（5％）和10毫升的HBSS。
- 离心机GSCS在在20℃下270×g离心7分钟。
- 弃上清，加入10 mL GSC基础培养基（ 表1）。
- 算GSCS用托马计数室，然后离心细胞以270×g离心7分钟，在20℃。
- 添加GSC增殖培养基（ 表1）的适当的体积达到10 6 GSCS / ml的细胞浓度。
- 种子10 5 GSCS每一个96孔板的孔（100微升细胞悬浮液）。
- 离心在270×g离心7分钟将板在20℃在机器人以获得GSCS井汤姆。
- 在37℃下的96孔板直到第5节。
第2天
4. MSC线粒体隔离
- 调整微管离心机温度至4℃。
- 准备2个1.5毫升管的“A”和“C”含有线粒体萃取（200微升试剂A和400μl的试剂C，二者均含有的不含EDTA的蛋白酶抑制剂）的试剂。准备其他两管，标有“地中海”和“美图”。置于冰上所有的管子。还准备为管线粒体连续稀释。
- 洗的MSC与预热10毫升（37℃）的PBS。
- 洗的MSC用2ml胰蛋白酶（无EDTA）中10秒，并加入1 ml的胰蛋白酶（无EDTA）中。孵育细胞5-10分钟，在37℃。
- 通过加入10mlαMEM/ FBS 10％，转移到50ml管中收回的MSC。
- 离心细胞于在20℃下270×g离心5分钟。
- 弃去上清液，加入10毫升αMEM/ FBS 10％至细胞沉淀。
- 计数和计时Malassez室中的干细胞。
- 离心机的MSCs（4-5×10 5）在20℃270×g离心5分钟。
- 弃去上清液，加入1米冰冷αMEM/ FBS 10％到细胞沉淀，将细胞转移到“MSC”标记的管（在步骤4.2中制备）。保持管冰。
- 离心机包含的MSC在900×g离心5分钟的管中，在4℃下。
- 取下管所有剩余的网上平台。
- 加入200μl线粒体提取试剂A（含不含EDTA的蛋白酶抑制剂）的。旋涡中速，持续5秒，离开冰管整整2分钟。
- 以最大的速度添加2.5微升线粒体分离试剂B涡流的10秒，然后离开冰管中。重复每30秒5分钟。
- 加入200μl线粒体提取试剂C（含不含EDTA的蛋白酶抑制剂）的。通过倾斜混合管（ROughly 30次，不要旋涡）。离心管中，在700×g离心在4℃下10分钟。
- 转移上清液（含有MSC线粒体）至“三刀”管（在步骤4.2中制备）。
- 离心机在3000 XG，在4℃下15分钟，得到线粒体沉淀。弃去上清液。沉淀包含分离线粒体。
- 冲洗用200μl试剂C的。然后，离心分离的线粒体沉淀以12,000 xg离心，于4℃下5分钟，以获得线粒体沉淀。
5.转让隔离MSC线粒体到GSCS（MitoCeption）
- 添加200微升预冷的（0℃）的GSC增殖培养基由干细胞（4×10 5）中分离出的线粒体沉淀。
- 稀释线粒体制剂（在GSC增殖培养基），以20微升的线粒体悬浮液的一贯添加到GSCS。
- 添加分离线粒体的体积到96-W的孔中ELL板含有GSCS（从步骤3.15），在所需的浓度（0.1至10微克）。添加线粒体慢慢靠近井的底部，覆盖了整个表面至少一次。
- 用于控制MSC线粒体活体染料渗漏，添加相同量的线粒体制剂（0.1至10微克）的含有GSC增殖培养基只（无GSCS）（参见用于活体染料泄漏检测部6.2）的96孔平板的孔中。
- 离心机含有与MSC线粒体（步骤5.3）和控制板（步骤5.4）的线粒体收件人GSCS在1500 xg离心在4℃下15分钟的96孔板中。
- 放置在37℃细胞培养箱培养板离心后立即。
注意：线粒体传输协议依赖于在足够的离心力的培养细胞的线粒体悬浮液的离心分离，具有一批离心，可以根据不同的SYST调整线粒体供体/受体细胞的他们。
第3天
6.流式细胞仪和共焦成像的线粒体传递的分析
- GSC样品的制备用于FACS分析
注意：如果MSC线粒体用活体染料预先（第1）标记的，效率可通过FACS线粒体转移后24小时监视。- 离心机的96孔板用在270×g离心5分钟MitoCepted GSCS在20℃。
- 弃去上清液。
- 在每个孔中加入100μl胰蛋白酶（无EDTA）中。孵育在37℃下3分钟。吸管上下解离形成在24小时时间段的神经球。
- 加入100微升GSC基础培养基。
- 离心板在270×g离心5分钟，在20℃，并丢弃上清液。
- 悬浮在GSCS 300微升GSC基础培养基，并转移到FACS适应管。
- 执行的FACSalysis。
- 从分离线粒体线粒体活体染料泄漏控制（FACS）
注意：该步骤的目的是确定本底的FACS信号，不会反映真正的MSC线粒体转移，而是从用于MitoCeption（步骤5.3）标记的MSC线粒体活体染料的光泄漏。- GSC种子细胞在步骤3.1所描述的3.15。
- 孵育所述细胞在37℃下1小时。
- 离心机仅在1500 xg离心含有线粒体（来自步骤5.4到5.6）中5分钟，在20℃的96孔板中。
- 从GSC 96孔板（步骤6.2.2）吸出培养基，并通过与线粒体只（上清液从步骤6.2.3）孵育培养基更换。
- 孵育含有GSCS的96孔板在37℃下2小时。
- 请按步骤6.1.1 6.1.7 FACS分析。
- GSC SAMP的制备LES的共焦成像
注意：如果MSC线粒体转移到GSCS是通过荧光成像分析，无论是MSC和GSCS需要预先分别与线粒体（步骤1）和小区（步骤2）活体染料标记。- 准备GSCS如步骤6.1.1到6.1.5。
- 悬浮GSCS在2毫升含2％FBS和种子35毫米培养皿（玻璃底）GSC增殖培养基。
- 用转让荧光MSC线粒体24小时后的GSCS执行共焦成像。
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Representative Results
概述从间质干细胞（MSC）和由MitoCeption其转移到靶向胶质母细胞瘤干细胞（GSC）线粒体的分离的过程步骤示于图1。 GSCS生长神经球，以维护自己的干细胞特性的肿瘤干细胞。用于协议，GSCS接种为单细胞几小时线粒体（步骤3），以允许更高的线粒体转印效率的转印之前（见的FACS数据图3B）。以下第5（第3天），这些细胞被再次观察到作为形成神经球（图1）。
所述GB4 GSCS的成像，用荧光标记的MSC线粒体MitoCeption后72小时，表明MSC线粒体本地化GB4 GSCS内，通过从共焦图象中得到的正交视图所证明（ 图2B）。所传送的MSC线粒体出现局部整个GSCS，因为这也是内源性GSC线粒体（ 图2A）的情况。还与用深红色活体染料使得相同GSC样品通过FACS分析都预先标记的MSC线粒体（ 见图3A）和成像（ 图2C）进行MitoCepted GSCS的共焦成像。 MSC线粒体的转移可以为大多数GSCS观察（图a）和从GSC共焦图像的3D重建确认所传送的MSC线粒体的细胞内定位（板B，C）。 Prelabeling与允许可视化传送的MSC线粒体的定位都蓝色细胞和红线粒体活体染料GSCS（第1天）（着色为绿色）相对于所述内源性GSC线粒体（红色），继MSC线粒体转移（ 图2D） 。
虽然confo校准成像允许检查所传送的MSC线粒体以下MitoCeption，荧光激活细胞分选（FACS）细胞内定位被选择量化线粒体转移的工具，提供的MSC线粒体用活体染料预先标记。 如图3A所示 ，MitoCeption随导致增加的FACS信号荧光MSC线粒体的量。值得注意的是，这个信号（红色）为大小比对照条件得到的信号高几个数量级（蓝色，参见步骤6.2）。这进一步提供了证据，该FACS信号代表的MSC线粒体内GSCS传送的，而不是仅仅从标记的MSC线粒体荧光活体染料渗漏的结果。这里介绍的线粒体传输协议，在单细胞GSCS执行，呈剂量依赖性响应（ 图3B）。在MSC线粒体转移效率还评价上neurospheres。尽管这也导致MSC线粒体转移到GSCS，转移的功效较低，如图代表性实验（ 图3B）。
MSC线粒体和它们在GSCS内维护的转移之后可以通过量化在GSCS MSC线粒体DNA（mtDNA的）。这就要求MSC和GSCS到来自不同供体获得，具有鲜明的单倍型。 图3C示出了在3'末端位置指示两个供体的单核苷酸多态性（SNP）的D-环内发现的线粒体DNA序列。对于PCR引物的设计，特别是从供体1或供体2，被引入任一个额外的突变相的PCR引物的3'末端的n-2扩增的mtDNA在位置。从供体1的线粒体DNA可以与该组的引物进行扩增：5'-TAACAGTACATAGCACATACAA-3'和5'-GAGGATGGTGGTCAAGGGA-3'（通用小号equencing底漆38），而该组的引物：5'-TTAACTCCACCATTAGCACC-3'38（通用测序引物）和5'-AGTATTTATGGTACCGTCCG-3'用于从供体2扩增线粒体DNA。
图1：工作流为孤立MSC线粒体通过MitoCeption转移到GSCS。的7个步骤为MSC线粒体GSCS和随后的GSC分析的MitoCeption被示出。步骤编号被表示为在协议部分。如果不执行MSC和GSC标记，作为用于功能分析，步骤1和步骤可以省略2和协议可以从第2天被遵循。相衬图像代表GB4 GSCS如神经球（第1天），如单细胞培养准备在MSC线粒体转移（第2天）和24小时的线粒体转移（第3天）后。比例尺=100微米。在步骤4中，分离的MSC线粒体，从干细胞分离之前与MitoTracker红CMXRos预先标记的代表性显微照片。比例尺=5μm以下。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：通过MitoCeption转移到GB4 GSCS后GB4内源性线粒体的成像MSC线粒体的和。 （A，B，C）GB4 GSCS分别标有绿活体染料。 （B，C，D）GB4 GSCS用2.5微克MSC线粒体准备（10 5 GSCS）MitoCepted。 （A）进行GSCS标有红色MitoTracker和CMXRos 48小时培养（GSC增殖培养基W / O EGF / bFGF）的。（B）的GSC共焦部及正交视图，MitoCeption后72小时与MitoTracker红CMXRos标记的MSC线粒体（培养基：GSC增殖培养基/ FBS 2％）。 （C，D）的MSC用MSC线粒体转移到GSCS之前深红色线粒体活体染料（相同的条件用于FACS分析）预先标记。海安线粒体转移后，在GSCS含FBS 10％GSC增殖培养基接种。 （C）等值面视图（B，C）与焦图像的GSC三维重建的xy平面部分（C）（MitoCeption后48小时）。 （D）GB4 GSCS分别标有蓝色细胞活体染料和红色线粒体活体染料深红色线粒体活体染料预先标记MSC线粒体的转移之前（绿色成像）。用XZ（b）和XY（三）等值面的观点从共焦图象（在MSC线粒体转移后72小时）一个GSC三维重建的平面部分。所有CELLS WERE接种于培养皿玻璃底部和图像拍摄活细胞。比例尺=5μm时，除了图像C面板（a）在比例尺= 10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：通过荧光激活细胞分选在GSCS线粒体转移（FACS）和检测的MSC线粒体DNA（mtDNA的）的定量。 （A，B）GSCS用深红色线粒体活体染料预先标记并通过FACS分析MSC线粒体MitoCepted。 （A）和MitoCepted GSCS获得代表性的FACS结果（红色，从上到下：0.6; 1.2; 2.5; 5; 10微克的MSC线粒体制备（10 5 GSCS））。蓝色，为EACħ面板，控制GSCS的FACS轮廓与用相同量的MSC线粒体的条件培养基温育作为用于MitoCeption（参见步骤5.4）。在黑色（顶部）与未标记GSCS控制的情况。 （ - •）上的单细胞GSCS线粒体转移之后（MFI）得到的（B）的相对平均荧光强度（平均值的3个实验，用SEM），在一天的GSC神经球（ - O），并与GSC控制线粒体上清液单细胞（ - ）。 mtDNA的D-环内（C）的DNA序列和供体1和2个SNPs之间的SNP的差异以蓝色的序列的3'末端。用于从任一施主线粒体DNA的特异性PCR扩增引物的设计（引物SPE 1和2）。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
越来越多的研究表明，细胞可以交换线粒体，这些线粒体对靶细胞的代谢和功能产生深远影响。因此，重要的是掌握工具来定量从供体细胞中这些靶细胞转移线粒体使它们的生物效应的精确研究。
这里所描述的协议最初是摸索出从人间充质干细胞中分离出的线粒体转移到粘附癌细胞系MDA-MB-231 33。如这里所示，它可适于该成长为体外神经球癌症干细胞。虽然当MSC线粒体被添加到GSC神经球确实发生线粒体传输时，它被认为是在单细胞GSCS更有效，因为在本方案所述。该协议也可以被外推到其他非粘附细胞，如T细胞，与需要一DAPT为MitoCeption步种子细胞浓度。
线粒体准备工作应在冰上进行，以保持其完整性。以获得与来自其他胞浆化合物减少污染线粒体制剂，离心线粒体的恢复是在3000×g离心15分钟进行。并监控用于传输到GSCS MSC线粒体的量，线粒体蛋白质含量被确定。为了这个目的，线粒体蛋白质提取物在使用补充有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中制备。使用二辛可宁酸测定法测定蛋白质浓度，根据制造商的说明。牛血清白蛋白用作标准。平均10微克蛋白质中，10万干细胞获得。
标记的MSC线粒体用活体染料允许定量线粒体转移的效率，通过荧光激活细胞分选（FACS），并通过共聚焦成像来确定所传送的线粒体的本地化。该GSCS可以用相同的线粒体活体染料的干细胞进行标记。这些细胞将被用作用于FACS分析的阳性对照。可替代地，GSCS可与来自该MSC的不同线粒体活体染料进行标记，从而允许相对于内源性GSC线粒体的转移MSC线粒体的本地化。而绿色和红色线粒体染料优选用于共焦成像深红色线粒体活体染料是非常适合用于FACS分析。非常重要，MSC接触EDTA应在协议中的所有步骤来避免。因此，细胞胰蛋白酶化，建议用胰蛋白酶和无EDTA;用于线粒体准备蛋白酶抑制剂的鸡尾酒应该为好，泯灭EDTA的。在EDTA存在下，观察到从MSC线粒体线粒体活体染料的泄漏。如果线粒体transfeR以GSCS是通过显微镜分析，收件人成胶质细胞瘤细胞也应用活体染料标记。的绿色和蓝色细胞染料（见材料和试剂表 ）中优选的，因为它们得到更均匀的细胞标记，使从共焦图像的3D重建。
一旦该协议已经通过他的具体细胞用户验证，线粒体标签会被舍弃掉的功能性研究，以排除可能的生物偏见。剂量反应分析在宽范围内的MSC线粒体浓度，与线粒体制备的连续稀释液，是可取的。事实上，应当注意的是，所传送的线粒体生物效应可能为低线粒体浓度通过FACS或成像来实现，在较低的范围内进行检测。这些功能研究，包括对GSC代谢，增殖和治疗反应的调查，进行了以下的一天线粒体转移。
如果MSC和GSCS来自不同供体中分离（用不同的线粒体DNA单倍型），所传送的MSC线粒体可以通过测量在目标GSCS MSC线粒体DNA的浓度进行监测。在MSC和内源GSC线粒体DNA之间的鉴别是基于单核苷酸多态性的存在，特定于每个细胞类型，在线粒体高变D-环区域。因此，MitoCeption技术的各种应用程序当中，转印线粒体窝藏线粒体DNA具有不同的单倍型的可能性不仅允许传送线粒体的检测，但也提供了工具来研究的线粒体DNA维修生物学，包括单倍型排斥的分析。
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Disclosures
INSERM（国家研究所德拉桑特等德拉RECHERCHE MEDICALE），与CJ和ML.V.挂靠，对MitoCeption技术（EP14306154.7）申请了专利。
Acknowledgments
我们感谢安德烈Parmeggiani（L2C和DIMNP，蒙彼利埃），伯努瓦夏洛（IES，蒙彼利埃），以及实验室的有益讨论的成员，克里斯托夫Duperray与流式细胞仪分析，蒙彼利埃RIO成像设备（MRI）提供帮助对于FACS和共聚焦显微镜充足的环境。国行是从LabEx Numev（ANR公约-10-的LabX-20）一个研究生奖学金的支持。 AB是由来自华沙和欧洲联盟的大学本科生奖学金支持（N°POKL.04.01.02-00-221 / 12）。 MLV是从国家科学研究中心（CNRS）工作的科学家。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitochondria Isolation Kit for Tissue | Fisher Scientific | 10579663 | |
| N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 11520536 | |
| B-27 Supplement W/O VIT A (50x) | Fisher Scientific | 11500446 | |
| HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Sigma | H4385 | |
| poly Heme | Sigma | P3932 | |
| aMEM w/o glutamine | Ozyme | BE12-169F | |
| DMEM/F-12 without glutamine | Fisher Scientific | 11540566 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-024 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Insuline | Sigma | I 1882 | |
| Human bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| CaCl2 | MERCK | 2382 | |
| Trypsine Inhibitor | Sigma | T9003 | |
| DNase I | SIGMA | 10104159001 | |
| Trypsine 0.25% / EDTA 1 mM | Invitrogen | 25200056 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Protease inhibitors EDTA free | Sigma | 4693159001 | |
| Ciprofloxacine | Sigma | 17850-5G-F | |
| Fungine | Invivogen | ant-fn-1 | |
| Fungizone | Thermofisher | 15290018 | |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410 | |
| MitoTracker Green FM | Molecular Probes | M7514 | |
| MitoTracker Red CMXRos | Molecular Probes | M7512 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Molecular Probes | M22426 | |
| CellTracker Green CMFDA | Molecular Probes | C7025 | |
| CellTracker Blue CMF2HC | Molecular Probes | C12881 | |
| RIPA | Santa Cruz | sc-24948 | |
| FluoroDish Sterile Culture Dish | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| FACS tubes | Beckman Coulter | 2,523,749 | |
| FACS apparatus | Gallios | 3L 10C | |
| LC FAST START DNA MASTER PLUS | Roche | 3515885001 |
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