Summary
Ici, un protocole (MitoCeption) est présenté pour transférer les mitochondries, isolées à partir de cellules souches mésenchymateuses humaines (MSC), des cellules souches de glioblastome (CGC), dans le but d'étudier leurs effets biologiques sur le métabolisme et les fonctions CGC. Un protocole similaire peut être adapté pour transférer des mitochondries entre les autres types de cellules.
Abstract
Les mitochondries jouent un rôle central pour le métabolisme cellulaire, la production d'énergie et le contrôle de l'apoptose. la fonction mitochondriale inadéquate a été trouvé responsable de la très diverses maladies, allant de pathologies neurologiques au cancer. Fait intéressant, les mitochondries ont été récemment démontré pour afficher la capacité d'être transféré entre les types de cellules, notamment de cellules souches mésenchymateuses humaines (MSC) pour des cellules cancéreuses dans des conditions de co-culture avec métaboliques et fonctionnels conséquences pour les cellules réceptrices des mitochondries, améliorant encore l'intérêt actuel pour les propriétés biologiques de ces organites.
L'évaluation des effets des mitochondries MSC transférés dans les cellules cibles est de première importance pour comprendre le résultat biologique de ces interactions cellule-cellule. Le protocole MitoCeption décrit ici permet le transfert des mitochondries préalablement isolées à partir des cellules du donneur aux cellules cibles, en utilisant MSC mitochondrieset les cellules souches de glioblastome (CGC) en tant que système modèle. Ce protocole a été précédemment utilisé pour transférer des mitochondries, isolée de cellules souches mésenchymateuses pour adhérentes cellules cancéreuses MDA-MB-231. Ce protocole de transfert de mitochondries est adapté ici pour GSCs qui présentent la particularité spécifique de plus en plus comme neurosphères in vitro. Le transfert des mitochondries isolées peut être suivie par les cellules activées par fluorescence (FACS) et la microscopie confocale en utilisant des colorants vitaux mitochondries. L'utilisation de cellules donneuses et cible mitochondries avec des haplotypes distincts (SNP) permet également la détection des mitochondries transférés en fonction de la concentration de l'ADN mitochondrial circulaire (ADNmt) dans les cellules cibles. Une fois que le protocole a été validé avec ces critères, les cellules hébergeant les mitochondries transférées peuvent être analysés plus avant pour déterminer les effets des mitochondries exogènes sur les propriétés biologiques telles que le métabolisme cellulaire, la plasticité, la prolifération et la réponse au traitement.
Introduction
Les mitochondries sont des organites présents dans les cellules eucaryotes où ils jouent un rôle central dans l'absorption des nutriments, ainsi que dans l'énergie et métabolite production. Ces organites contiennent circulaire de l' ADN mitochondrial (ADNmt), 16,6 kb, qui code pour les protéines des complexes de la chaîne de transport d'électrons, ARNt et ARNr 1. La fonctionnalité de ces organites est essentielle pour l' homéostasie cellulaire et de nombreuses pathologies sont associées à une dysfonction mitochondriale 1, 2, 3. L'état de la mitochondrie a par exemple été liée à l' inflammation, les maladies infectieuses et le cancer, dans ce dernier cas avec des conséquences sur les métastases et la résistance à la thérapie 4, 5, 6, 7.
Mitochondries afficher la capacité remarquable de se transférer entre «donneur» et les cellules «cibles». Cela conduit à des changements dans le métabolisme énergétique des cellules cibles, ainsi que dans d' autres modifications fonctionnelles telles que la réparation tissulaire et la résistance aux agents chimiothérapeutiques, comme montré récemment par différents laboratoires 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16. Les cellules souches mésenchymateuses humaines (CSM) présentent cette aptitude à transférer les mitochondries à une grande variété de cellules cibles, y compris les cardiomyocytes, les cellules endothéliales, les cellules épithéliales alvéolaires pulmonaires, des cellules tubulaires rénales et les cellules cancéreuses, ce qui conduit à des modifications des propriétés fonctionnelles de ces cellules 8,> 9, 10, 12, 17, 18.
l'échange de mitochondrie apparaît maintenant comme un mécanisme largement utilisé qui permet à un certain nombre de types cellulaires différents de communiquer entre eux et modifier leurs propriétés biologiques. Cet échange de mitochondries peut se produire par effet tunnel nanotubes (TNT) formation, impliquant connexine 43 contenant des jonctions lacunaires 8 ou M-Sec / TNFaip2 et exocyste complexes 19. En variante, le transfert de mitochondries a également été montré pour être médiée par arrestine microvésicules domaine contenant la protéine 1-médiation (ARMMS) 20. Fait intéressant, l'efficacité du transfert de mitochondries était liée au taux d'expression de la Rho GTPase 1 MIRO1 21, un facteur clé pour expliquer les différences dans les efficacités de transfert de mitochondries entre iPSC-MSCs et adulte BM-MSCs 22.
En dépit de cette richesse des données relatives à l'échange de mitochondries de cellule à cellule, on sait relativement peu sur le métabolisme et le résultat biologique de ce transfert de mitochondries. Par conséquent, il justifie pleinement la mise en place des outils appropriés pour évaluer pleinement les effets biologiques de ce transfert. Au fil des années, plusieurs approches techniques pour transférer les mitochondries des cellules du donneur accepteur ont été proposés. Cela comprend l' injection directe de mitochondries dans des ovocytes 23, 24, 25, la fusion cellulaire pour produire transmitochondrial cybrides 26, 27 et, plus récemment, le transfert des mitochondries isolées à l' aide photothermique nanoblades 28.
Nous et d'autres ont démontré précédemment la capacité de mitochond isoléeria à être internalisé par les cellules vivantes, comme on l' observe à la fois in vitro et in vivo , 29, 30, 31, grâce à des mécanismes proposés pour impliquer macropinocytose 32. Nous avons également mis au point un procédé, appelé MitoCeption, pour transférer quantitativement mitochondries isolées ( à partir de cellules souches mésenchymateuses) à des cellules cibles, comme le montre le (adhérent) MDA-MB-231 lignée de cellules de cancer du sein 31. Ce protocole a été adapté ici pour le transfert des mitochondries isolées de MSC humaines aux cellules souches de glioblastome (CSS).
Le glioblastome est une tumeur maligne agressives du cerveau qui sont rapidement devenues résistantes au traitement, principalement en raison des cellules souches de glioblastome (GSC) présents dans la tumeur 33. Ces GSCs poussent comme neurosphères in vitro et de générer des tumeurs dans des modèles de xénogreffe. Les cellules cancéreuses au sein de glioblastome ont lala capacité d'établir des connexions de cellule à cellule, comme indiqué récemment pour les cellules astrocytaires de tumeurs cérébrales qui relient via microtubes élargie, à travers laquelle les mitochondries (ainsi que de calcium et de cellules noyaux) peut migrer, ce qui entraîne dans les réseaux d'astrocytome radiothérapie résistant à 34. Glioblastome peut recruter de nombreuses cellules différentes au sein du microenvironnement tumoral, y compris MSCs 35, 36. Nous avons montré que MSCs peut établir des connexions entre cellules avec CSS en coculture et transférer leurs mitochondries (données non représentées), qui devrait modifier les propriétés fonctionnelles de la CGC. Le présent protocole décrit comment la technique de MitoCeption peut être utilisé pour transférer des mitochondries, préalablement isolé de cellules souches mésenchymateuses humaines, GSCs humaines dans le but de déterminer leur résultat biologique fonctionnel. Le multipotentes et la ligne Gb4 CGC hautement tumorigène 37 a été utilisé dans cette étude.
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Protocol
jour 1
1. Le marquage de la cellule souches mésenchymateuses (MSC) mitochondries (Facultatif)
- Deux jours avant la préparation des mitochondries, des semences MSCs humaines dans une boîte de culture de 100 mm, dans 10 ml aMEM / FBS 10%, de manière à avoir 4 x 10 5 MSCs en culture le jour 1.
- Rincer avec du PBS MSCs (4 ml) et on ajoute 4 ml d'aMEM / FBS à 1% (préchauffée à 37 ° C).
- Ajouter la quantité requise de mitochondries colorant vital et laisser incuber les cellules pendant 30 minutes dans l'incubateur à 37 ° C.
- Retirer la solution mitochondries de colorant, rincer les cellules deux fois avec 4 ml préchauffée (37 ° C) aMEM / FBS 1% et rajouter 4 ml aMEM / FBS 10%. Incuber les cellules à 37 ° C.
- Changer le milieu de culture (10 ml aMEM / FBS 10%) après 30 minutes et, une autre fois, 2 heures plus tard.
jour 1
2. Étiquetage des cellules de glioblastome souches (CGC) (facultatif, voir la section Discussion)
| Milieu de culture cellulaire | Composition |
| CGC milieu de base | DMEM / F-12 complété avec |
| Insuline 20 mg / ml | |
| N2 1x supplément | |
| Glucose 3 g / l | |
| L-glutamine 2 mM, | |
| milieu de prolifération CGC | Ajouter au milieu de base: |
| B27 1x supplément | |
| EGF 10 ng / ml | |
| bFGF de 10 ng / ml | |
| Fungine 10 mg / ml | |
| Fungizone 0,25 mg / ml | |
| Héparine 2 mg / ml | |
| Ciprofloxacine 2 pg / ml | |
| Gentamicine 2 pg / ml | |
| milieu de prolifération MSC | & #945; MEM complété par |
| L-glutamine 2 mM, | |
| 10% de FBS | |
| bFGF 2 ng / ml |
Tableau 1: Culture Media.
- Dissocier GSCs (Gb4 lignée cellulaire 32 (10 x 10 6 cellules) cultivées comme neurosphères sur poly-HEMA flacons de culture cellulaire revêtu (voir les étapes 3.1 à 3.12).
- GSCs de semences dans une plaque de 48 puits à 10 5 cellules / puits dans du milieu de prolifération CGC (500 pi) (voir le tableau 1).
- Centrifuger la plaque à 270 g pendant 5 min à 20 ° C.
- Ajouter la quantité requise de la cellule colorant vital et incuber pendant 30 min à 37 ° C.
- Ajouter 500 pi de la CGC milieu de base (tableau 1) par puits de la plaque de 48 puits.
- Centrifuger la plaque à 270 xg à 20 ° C pendant 5 min. Aspirer le surnageant.
- Répétez les étapes 02.05 à 02.06.
- Ajouter 500 ul de milieu de base CGC et incuber à 37 ° C pendant 30 min.
- Centrifuger la plaque à 270 xg à 20 ° C pendant 5 min. Aspirer le surnageant.
- Ajouter 500 ul de milieu de prolifération CGC par puits de la plaque de 48 puits et incuber dans le 37 ° C incubateur.
Note: La quantité de GSCs indiqué (10 x 10 6 cellules) permet d' effectuer les différentes expériences dose-réponse et les contrôles FACS. Une fois que les conditions expérimentales sont définies plus précisément ce montant peut être réduit.
Jour 2
3. Ensemencement des glioblastome cellules souches
- Recueillir les neurosphères CGC (10 x 10 6 cellules) par centrifugation à 270 g pendant 5 min, à 20 ° C dans un tube de 50 ml.
- Laver les cellules avec 5 ml de HBSS, et centrifuger à 270 g pendant 5 min à 20 ° C.
- Aspirer le surnageant.
- Resuspendre doucement le culot de la CGC dans 100 pi de trypsine-EDTA (0,25%) (par 10 x 10
- Incuber à 37 ° C pendant 3 min.
- Ajouter 10 ul de CaCl2 (20 mM) et 2 ul de DNase I (10 mg / ml).
- Dissocier les neurosphères par pipetage de haut en bas (30-50x) avec une pipette P200. Éviter les bulles. Vérifiez sous le microscope que tous les CSS sont dissociées.
- Ajouter 10 ul inhibiteur de trypsine (5%) et 10 ml de HBSS.
- Centrifugeuse GSCs à 270 xg pendant 7 minutes à 20 ° C.
- Jeter le surnageant et ajouter 10 ml CGC milieu de base (tableau 1).
- Comptez GSCs avec une chambre de comptage Thoma puis centrifuger les cellules à 270 xg pendant 7 minutes à 20 ° C.
- Ajouter le volume approprié de milieu de prolifération CGC (tableau 1) pour atteindre la concentration cellulaire de 10 6 AFEDC / ml.
- Seed 10 5 GSCs (100 pi de la suspension cellulaire) par puits d'une plaque de 96 puits.
- Centrifuger les plaques à 270 xg pendant 7 minutes à 20 ° C pour obtenir GSCs au bottom de puits.
- Incuber la plaque à 96 puits à 37 ° C jusqu'à ce que la section 5.
Jour 2
4. MSC mitochondries Isolation
- Réglez la température microtube de centrifugation à 4 ° C.
- Préparer deux tubes de 1,5 ml "A" et "C" contenant les réactifs pour l'extraction des mitochondries (200 ul de réactif A et de 400 ul de réactif C, les deux contenant les inhibiteurs de protéase exempt d'EDTA). Préparer 2 autres tubes, labellisés "MSC" et "Mito". Conservez tous les tubes sur la glace. Préparer également des tubes pour les mitochondries des dilutions en série.
- Lavage avec 10 ml MSCs préchauffée (37 ° C) PBS.
- Laver MSCs avec 2 ml de trypsine (pas EDTA) pendant 10 secondes et ajouter 1 ml de trypsine (pas EDTA). Incuber les cellules pendant 5-10 min à 37 ° C.
- Récupérer les cellules souches mésenchymateuses en ajoutant 10 ml d'aMEM / 10% FBS, transférer dans un tube de 50 ml.
- Centrifuger les cellules à 270 g pendant 5 min à 20 ° C.
- Jeter le surnageant et ajouter10 ml d'aMEM / 10% FBS au culot cellulaire.
- Compter les cellules souches mésenchymateuses avec une chambre de comptage de Malassez.
- Centrifugeuse MSCs (4-5 x 10 5) à 270 g pendant 5 min à 20 ° C.
- Jeter le surnageant, ajouter 1 m glacée aMEM / FBS 10% au culot cellulaire et transférer les cellules du tube "MSC" marqué au (préparé à l'étape 4.2). Garder le tube sur la glace.
- Centrifugeuse le tube contenant les cellules souches mésenchymateuses à 900 xg pendant 5 min, à 4 ° C.
- Retirez tout moyen résiduel du tube.
- Ajouter 200 pi de mitochondries Isolation Réactif A (contenant des inhibiteurs de la protéase du libre-EDTA). Vortex à vitesse moyenne pendant 5 sec et laisser les tubes sur la glace pendant exactement 2 minutes.
- Ajouter 2,5 pi de mitochondries Isolation Réactif B. Vortex à vitesse maximale pendant 10 secondes, puis laisser les tubes sur la glace. Répéter toutes les 30 secondes pendant 5 min.
- Ajouter 200 pi de mitochondries Isolation Réactif C (contenant des inhibiteurs de la protéase du libre-EDTA). Mélanger en inclinant le tube (roughly 30 fois, ne pas vortex). Centrifuger le tube à 700 g pendant 10 min à 4 ° C.
- Transférer le surnageant (contenant les mitochondries MSC) dans le tube "Mito" (préparé à l'étape 4.2).
- Centrifuger à 3000 xg, 15 min à 4 ° C, pour obtenir le culot de mitochondries. Jeter le surnageant. Le culot contient des mitochondries isolées.
- Rincer le culot de mitochondries avec 200 ul du réactif C. Ensuite, centrifuger à 12 000 x g, 5 min à 4 ° C, pour obtenir le culot de mitochondries.
5. Transfert de Isolated MSC mitochondries à GSCs (MitoCeption)
- Ajouter 200 ul de (0 ° C) , CGC milieu de prolifération pré-refroidi au culot de mitochondries isolées à partir MSCs (4 x 10 5).
- Diluer la préparation de mitochondries (en milieu de prolifération CGC) à ajouter systématiquement 20 pi de suspension mitochondriale aux CSS.
- Ajouter le volume des mitochondries isolées dans les puits de la 96-well plaque contenant les CSS (étape 3.15), à la concentration désirée (0,1 à 10 ug). Ajouter lentement la mitochondrie, à proximité du fond du puits, couvrant toute la surface au moins une fois.
- Pour le contrôle de MSC mitochondries colorant vital fuites, ajouter les mêmes quantités de la préparation de mitochondries (0,1 à 10 ug) aux puits d'une plaque à 96 puits contenant CGC milieu de prolifération uniquement (pas de CSS) (voir la partie 6.2 pour la détection de fuite de colorant vital).
- Centrifuger la plaque à 96 puits contenant les GSCs bénéficiaires des mitochondries avec les mitochondries MSC (étape 5.3) et la plaque de commande (étape 5.4) à 1500 g pendant 15 min à 4 ° C.
- Placez les plaques de culture à 37 ° C cellulaire incubateur immédiatement après centrifugation.
Remarque: le protocole de transfert de mitochondries repose sur la centrifugation de la suspension de mitochondries dans les cellules mises en culture à la force de centrifugation convenable, avec un certain nombre de centrifugations qui peut être ajustée en fonction de la SYSTem des cellules donneur / receveur mitochondries.
jour 3
6. Analyse du transfert mitochondries par FACS et imagerie confocale
- Préparation des échantillons de la CGC pour l' analyse FACS
Remarque: Si les mitochondries MSC ont été marquées avec un colorant vital préalable (section 1), l'efficacité peut être contrôlée par FACS, 24 heures après le transfert de mitochondries.- Centrifuger la plaque à 96 puits avec les GSCs MitoCepted à 270 g pendant 5 min à 20 ° C.
- Jeter le surnageant.
- Ajouter 100 trypsine ul (pas EDTA) dans chaque puits. Incuber à 37 ° C pendant 3 min. Pipet haut et en bas de dissocier les neurosphères formés dans la période de 24 h.
- Ajouter 100 pi de la CGC milieu de base.
- Centrifuger la plaque à 270 g pendant 5 min à 20 ° C et jeter le surnageant.
- Resuspendre GSCs dans 300 ul CGC milieu de base et transfert à FACS adapté tubes.
- Effectuez l'une FACSaly.
- Contrôle des fuites mitochondries de colorant vital de la mitochondries isolées (FACS)
Note: Le but de cette étape est de déterminer le signal de FACS de fond qui ne reflète pas un véritable transfert MSC mitochondries, mais plutôt la simple fuite de colorant vital de la mitochondrie MSC marqué utilisé pour MitoCeption (étape 5.3).- Seed cellules CGC comme décrit dans les étapes 3.1 à 3.15.
- Incuber les cellules à 37 ° C pendant 1 heure.
- Centrifuger la plaque à 96 puits contenant des mitochondries seulement (de l'étape 05.04 à 05.06) à 1500 g pendant 5 min à 20 ° C.
- Aspirer le milieu de culture de la CGC plaque à 96 puits (étape 6.2.2) et le remplacer par le milieu incubé avec des mitochondries seulement (surnageant de l'étape 6.2.3).
- Incuber la plaque à 96 puits contenant les GSCs à 37 ° C pendant 2 heures.
- Procédez comme dans les étapes 6.1.1 à 6.1.7 pour l'analyse FACS.
- Préparation de samp CGCles pour l'imagerie confocale
Remarque: Si le transfert de MSC mitochondries à GSCs doit être analysé par imagerie de fluorescence, les deux MSCs et CSS doivent être préalablement marqué, respectivement avec des mitochondries (étape 1) et de la cellule (étape 2) colorants vitaux.- Préparer GSCs comme dans les étapes 6.1.1 à 6.1.5.
- Resuspendre GSCs dans 2 ml de milieu de prolifération CGC contenant 2% de FBS et de graines dans des boîtes de culture de 35 mm (à fond de verre).
- Effectuer l'imagerie confocale sur les CSS avec les mitochondries fluorescentes transférées MSC 24 heures plus tard.
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Representative Results
Les étapes de la procédure décrivant l'isolement des mitochondries à partir de cellules souches mésenchymateuses (MSC) et leur transfert vers les cellules souches de glioblastome ciblées (CGC) par MitoCeption sont représentés sur la figure 1. GSCs sont des cellules souches cancéreuses cultivées en neurosphères pour préserver leurs propriétés de cellules souches. Pour le protocole, les CSS sont ensemencées comme des cellules individuelles d' un couple d'heures avant le transfert des mitochondries (étape 3) pour permettre une plus grande efficacité de transfert de mitochondries (voir les données FACS Figure 3B). Suite à l' article 5 (jour 3), ces cellules sont observées à nouveau comme formant neurosphères (Figure 1).
Imagerie des GSCs GB4, 72 h après MitoCeption avec marquage fluorescent mitochondries MSC, montre que les mitochondries de MSC sont localisées à l' intérieur des GSCs GB4, comme le montrent les vues orthogonales obtenues à partir d' images confocale (figure 2B). Les mitochondries MSC transférées apparaissent localisées à travers les CSS, comme cela est également le cas pour les mitochondries de la CGC endogènes (Figure 2A). L' imagerie confocale de l'MitoCepted GSCs a également été réalisée avec MSC mitochondries préalablement marqué avec un colorant vital rouge profond de sorte que les mêmes échantillons ont été analysés à la fois de la CGC par FACS (voir la figure 3A) et l' imagerie (figure 2C). Le transfert des mitochondries MSC a pu être observée pour la plupart des CSS (panneau a) et à la reconstruction 3D à partir de la CGC images confocale a confirmé la localisation intracellulaire des mitochondries MSC transférés (panneaux b, c). Marquage préalable CSS (le jour 1) avec les deux colorants vitaux bleus cellulaires et rouges mitochondriales permis de visualiser la localisation des mitochondries MSC transférée (colorée en vert) par rapport à la mitochondrie CGC endogène (en rouge), à la suite du transfert de mitochondries MSC (figure 2D) .
Alors que confocal imagerie permet de vérifier la localisation intracellulaire des mitochondries MSC transférées suivant MitoCeption, cellule activé par fluorescence (FACS) est l'outil de choix pour quantifier le transfert des mitochondries, à condition mitochondries MSC ont été préalablement marqués avec un colorant vital. Comme on le voit sur la figure 3A, avec des quantités MitoCeption des mitochondries MSC fluorescent conduit à une augmentation des signaux FACS augmente. Il convient de noter, ce signal (en rouge) est de plusieurs ordres de grandeur plus élevé que le signal obtenu dans les conditions de contrôle (en bleu, voir étape 6.2). Ces éléments de preuve en outre que le signal FACS est représentatif du MSC mitochondries transféré à l'intérieur GSCs et non pas seulement le résultat de la fluorescence vitale fuite de colorant de la mitochondries MSC marqué. Le protocole de transfert de mitochondries présenté ici, réalisée sur GSC monocellulaires, a montré une réponse dépendante de la dose (figure 3B). L'efficacité du transfert de mitochondries MSC a également été évaluée sur neurospheres. Bien que cela a également conduit à un transfert de mitochondries MSC aux CSS, l'efficacité du transfert était plus faible, comme le montre une expérience représentative (figure 3B).
Le transfert de MSC mitochondries et de leur entretien à l'intérieur des CSS peut être suivie par la quantification MSC ADN mitochondrial (ADNmt) dans les CSS. Cela nécessite MSCs et GSCs à être obtenus à partir de donneurs différents, avec des haplotypes distincts. La figure 3C montre les séquences trouvées dans la boucle D de deux donneurs avec des polymorphismes de nucléotides simples (SNP) à la position indiquée ADNmt de l' extrémité 3 '. Pour la conception d'amorces de PCR pour amplifier spécifiquement l'ADN mitochondrial à partir de chaque donneur 1 donneur ou 2, une mutation supplémentaire a été introduit à la position n-2 par rapport à l'extrémité 3 'des amorces de PCR. L'ADNmt du donneur 1 pourrait être amplifié avec l'ensemble des amorces: 5'-TAACAGTACATAGCACATACAA-3 'et 5'-GAGGATGGTGGTCAAGGGA-3' (s universelsequencing amorce 38), tandis que l'ensemble des amorces: 5'-TTAACTCCACCATTAGCACC-3 '(amorce de séquençage universelle à partir de 38) et 5'-AGTATTTATGGTACCGTCCG-3' a été utilisé pour amplifier le ADNmt du donneur 2.
Figure 1: Workflow pour le transfert des mitochondries isolées de MSC à GSCs par MitoCeption. Les 7 étapes pour le MitoCeption du MSC mitochondries à GSCs et les analyses ultérieures de la CGC sont présentés. Les numéros des étapes sont indiquées comme dans la section de protocole. Si MSC et l'étiquetage de la CGC ne sont pas effectuées, que pour les analyses fonctionnelles, les étapes 1 et 2 peut être omise et le protocole peut être suivie du jour 2 sur. images de contraste de phase représentent GSCs GB4 que neurosphères (jour 1), que la culture unicellulaire prêt pour le transfert MSC mitochondries (jour 2) et 24 h après le transfert de mitochondries (jour 3). Barre d'échelle =100 um. À l'étape 4, microphotographie représentative des mitochondries MSC isolées, avec MitoTracker Red préalablement marquées CMXRos avant l'isolement de cellules souches mésenchymateuses. Barre d'échelle = 5 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Imagerie des Gb4 mitochondries endogène et du MSC mitochondries après transfert aux GSCs GB4 par MitoCeption. (A, B, C) GB4 GSCs ont été marqués avec un colorant vital vert. (B, C, D) GB4 GSCs ont été MitoCepted avec 2,5 pg MSC préparation de mitochondries (pour 10 5 GSCs). (A) GSCs ont été marquées avec MitoTracker Red CMXRos et cultivées pendant 48 heures (milieu de prolifération CGC w / o EGF / bFGF).Section confocal (B) de la CGC et de vues orthogonales, 72 h après MitoCeption avec des mitochondries MitoTracker Red CMXRos marqué MSC (milieu de culture: milieu de prolifération GSC / FBS 2%). (C, D) MSC ont été préalablement marqués avec un colorant vital des mitochondries rouges profonds (mêmes conditions que pour l' analyse FACS) avant le transfert du MSC mitochondries à GSCs. Après le transfert MSC mitochondries, GSCs ont été ensemencées dans un milieu de prolifération CGC contenant du FBS 10%. (C) des vues de isosurface (b, c) de l' article xy plane (c) d'une reconstruction de la CGC 3D à partir d' images confocale (48 h après MitoCeption). (D) GB4 GSCs ont été marqués avec un colorant vital bleu cellule et un mitochondries rouge colorant vital avant le transfert du MSC mitochondries préalablement marqué avec un colorant vital des mitochondries rouges profonds (imagées en vert). vue sur isosurface avec xz (b) et xy (c) les sections planes de la reconstruction de la CGC 3D à partir d'images confocale (72 heures après le transfert de mitochondries MSC). Toutes les cellules wavant ensemencée sur des boîtes de culture à fond de verre et les images ont été prises sur des cellules vivantes. Barres d'échelle = 5 um, à l'exception de l'image C panneau (a) lorsque Barre d'échelle = 10 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Quantification du transfert de mitochondries par cellule activé par fluorescence (FACS) et la détection de l' ADN mitochondrial du MSC (ADNmt) dans les CSS. (A, B) GSCs ont été MitoCepted avec MSC mitochondries préalablement marqué avec un mitochondries rouge colorant vital profond et analysé par FACS. (A) FACS représentatifs des résultats obtenus avec MitoCepted GSCs (en rouge, de haut en bas: 0,6; 1,2; 2,5; 5; 10 pg MSC préparation de mitochondries (pour 10 5 GSCs)). En bleu, pour each panel, contrôler le profil FACS de GSCs incubé avec le milieu de culture conditionné avec la même quantité de MSC mitochondries que celle utilisée pour MitoCeption (voir étape 5.4). conditions de contrôle avec GSCs non marqués en noir (en haut). (B) relative de l' intensité de fluorescence moyenne (MFI) obtenu après le transfert de mitochondries sur GSCs unicellulaires (- •) (moyenne de 3 expériences, avec SEM), le neurosphères CGC d' une journée (- o) et avec les mitochondries de contrôle surnageants sur la CGC des cellules individuelles (-). (C) des séquences d'ADN au sein de la boucle D ADNmt et les différences entre les SNP donneurs 1 et 2. Les SNP sont indiquées en bleu à l' extrémité 3 'des séquences. Conception d'amorces pour l'amplification par PCR spécifique de l'ADNmt soit de donneur (amorces spe 1 et 2). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Un nombre croissant d'études montrent que les cellules peuvent échanger des mitochondries et que ces mitochondries ont des effets profonds sur le métabolisme et les fonctions de la cellule cible. Par conséquent, il est essentiel de maîtriser les outils pour transférer quantitativement dans les mitochondries des cellules du donneur à ces cellules cibles afin de permettre une étude précise de leurs effets biologiques.
Le protocole décrit ici a été initialement élaboré pour transférer des mitochondries isolées à partir de cellules souches mésenchymateuses humaines de la lignée cellulaire de cancer adhérent MDA-MB-231 33. Comme on le voit ici, il peut être adapté pour des cellules souches cancéreuses qui se développent en tant que neurosphères in vitro. Bien que le transfert de mitochondries ne se produit lorsque les mitochondries MSC sont ajoutées aux neurosphères CGC, il a été trouvé pour être plus efficace sur GSCs unicellulaires, comme décrit dans le présent protocole. Ce protocole peut également être extrapolées à d'autres cellules non adhérentes, comme les cellules T, avec la nécessité d'undApt la concentration cellulaire ensemencé pour l'étape de MitoCeption.
La préparation des mitochondries doit être effectuée sur la glace pour maintenir leur intégrité. Pour obtenir des préparations mitochondriales présentant une contamination réduite par d'autres composés de cytosol, la centrifugation pour la récupération des mitochondries est effectuée à 3000 x g pendant 15 min. Pour surveiller la quantité de MSC mitochondries utilisé pour le transfert des CSS, la teneur en protéines des mitochondries est déterminée. Dans ce but, des extraits protéiques de mitochondries sont préparées en utilisant un tampon RIPA additionné d'inhibiteurs de protéase. La concentration en protéine a été déterminée en utilisant le dosage à l'acide bicinchoninique, selon les instructions du fabricant. albumine de sérum bovin a été utilisée comme étalon. En moyenne, 10 pg de protéines ont été obtenus à partir de 100.000 cellules souches mésenchymateuses.
Étiquetage MSC mitochondries avec un colorant vital permet de quantifier l'efficacité du transfert de mitochondries par cellule activé par fluorescence(FACS), et la détermination de la localisation des mitochondries transmises par imagerie confocale. Les CSS peuvent être étiquetés avec le même mitochondries colorant vital que le MSC. Ces cellules seront utilisées en tant que témoin positif pour l'analyse FACS. En variante, GSC peuvent être marqués avec un colorant vital différent de celui mitochondries des cellules souches mésenchymateuses, permettant la localisation des mitochondries MSC transférées par rapport aux mitochondries CGC endogènes. Le colorant vital mitochondriale rouge profond est bien adaptée à l'analyse FACS, tandis que les colorants de mitochondries verts et rouges sont préférés pour l'imagerie confocale. D'une grande importance, l'exposition MSC à l'EDTA doit être évitée à toutes les étapes du protocole. Par conséquent, la trypsine cellulaire est recommandé à la trypsine et pas d'EDTA; le cocktail d'inhibiteurs de protéase utilisés pour la préparation des mitochondries doit, également, être dépourvu d'EDTA. En présence d'EDTA, une fuite du colorant vital des mitochondries à partir du MSC mitochondries n'a été observée. Si le transfe mitochondrialer à GSCs doit être analysé par microscopie, les cellules de glioblastome destinataire devraient également être marqués avec un colorant vital. Les colorants verts et bleus cellulaires (voir Matériaux et réactifs Table) ont été préférés car ils donnent un marquage cellulaire plus homogène, ce qui permet la reconstruction 3D à partir d' images confocale.
Une fois que le protocole a été validé par l'utilisateur avec ses cellules spécifiques, l'étiquetage des mitochondries sera laissé de côté pour les études fonctionnelles, pour empêcher d'éventuelles distorsions biologiques. Les analyses dose-réponse sur une large gamme de concentrations de mitochondries MSC, avec des dilutions en série de la préparation mitochondriale, est souhaitable. En effet, il convient de noter que les effets biologiques des mitochondries transférées peuvent être obtenues pour de faibles concentrations de mitochondries dans la plage inférieure pour la détection par FACS ou par imagerie. Ces études fonctionnelles, y compris les enquêtes sur le métabolisme de la CGC, la prolifération et la réponse au traitement, sont effectuées le jour suivant latransfert de mitochondries.
Si MSCs et CSS sont isolés de donneurs différents (avec différents haplotypes d'ADNmt), les mitochondries MSC transférés peuvent être surveillés en mesurant les concentrations de MSC ADNmt dans les GSCs ciblées. La discrimination entre le MSC et endogène CGC ADNmt est basé sur la présence de SNP spécifique pour chaque type de cellule, dans la région hypervariable de la boucle D ADNmt. Par conséquent, parmi les différentes applications de la technique de MitoCeption, la possibilité de transférer des mitochondries hébergeant l'ADN mitochondrial avec différents haplotypes permet non seulement de détecter les mitochondries transmises, mais fournit également les outils pour étudier la biologie de l'entretien ADNmt, y compris l'analyse de l'exclusion des haplotypes.
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Disclosures
INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale), avec lequel CJ et ML.V. sont affiliés, a déposé une demande de brevet sur la technique de MitoCeption (de EP14306154.7).
Acknowledgments
Nous remercions Andrea Parmeggiani (L2C et DIMNP, Montpellier), Benoit Charlot (IES, Montpellier), ainsi que des membres du laboratoire pour des discussions utiles, Christophe Duperray pour l'aide avec l'analyse FACS, l'installation d'imagerie RIO Montpellier (IRM) pour fournir le environnement adéquat pour FACS et microscopie confocale. BNM a été soutenue par une bourse d'études supérieures du LabEx Numev (convention ANR-10-LabX-20). AB a été soutenu par une bourse de premier cycle de l'Université de Varsovie et de l'Union européenne (n ° POKL.04.01.02-00-221 / 12). MLV est un scientifique du personnel du Centre national de la recherche scientifique (CNRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitochondria Isolation Kit for Tissue | Fisher Scientific | 10579663 | |
| N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 11520536 | |
| B-27 Supplement W/O VIT A (50x) | Fisher Scientific | 11500446 | |
| HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Sigma | H4385 | |
| poly Heme | Sigma | P3932 | |
| aMEM w/o glutamine | Ozyme | BE12-169F | |
| DMEM/F-12 without glutamine | Fisher Scientific | 11540566 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-024 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Insuline | Sigma | I 1882 | |
| Human bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| CaCl2 | MERCK | 2382 | |
| Trypsine Inhibitor | Sigma | T9003 | |
| DNase I | SIGMA | 10104159001 | |
| Trypsine 0.25% / EDTA 1 mM | Invitrogen | 25200056 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Protease inhibitors EDTA free | Sigma | 4693159001 | |
| Ciprofloxacine | Sigma | 17850-5G-F | |
| Fungine | Invivogen | ant-fn-1 | |
| Fungizone | Thermofisher | 15290018 | |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410 | |
| MitoTracker Green FM | Molecular Probes | M7514 | |
| MitoTracker Red CMXRos | Molecular Probes | M7512 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Molecular Probes | M22426 | |
| CellTracker Green CMFDA | Molecular Probes | C7025 | |
| CellTracker Blue CMF2HC | Molecular Probes | C12881 | |
| RIPA | Santa Cruz | sc-24948 | |
| FluoroDish Sterile Culture Dish | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| FACS tubes | Beckman Coulter | 2,523,749 | |
| FACS apparatus | Gallios | 3L 10C | |
| LC FAST START DNA MASTER PLUS | Roche | 3515885001 |
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