Summary
여기에서는 시험 관내 NKX6-1 + 췌장 전구 세포에 인간 배아 줄기 세포가 분화하는 4 단째의 프로토콜을 설명한다. 이 프로토콜은, 인간 다 능성 줄기 세포의 종류에 적용될 수있다.
Abstract
다 능성 줄기 세포는 자기를 갱신하고의 연구 및 미래 당뇨병 치료에 사용될 수있는 췌장 선조 세포의 생성을위한 매력적인 소스 만드는 다중 계통으로 분화하는 능력을 가지고있다. 이 문서에서는 인간 배아 줄기 세포 (hESCs는)에서 췌장 전구 세포를 생성하도록 설계된 4 단계의 분화 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은, 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSC) 라인의 수에 적용 할 수있다. 췌장 전구 세포를 생성하기 위해 취해진 방식은 정확하게 췌장 개발의 주요 단계를 모델링 hESCs는 구별한다. 이것은 티빈 A, 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF에) 및 CHIR990210의 존재 하에서 세포를 배양함으로써 달성되는 최종 내배엽의 유도와 함께 시작된다. 섬유 아세포 성장 인자 10 (FGF10) 및 Dorsomorphin와 또한 차별화 및 패터닝 후방 foregut를 닮은 세포를 생성합니다. 레틴의 추가OIC 산, 소량는 SANT-1과 FGF10은 췌장 내배엽의 특성 세포로 후방 foregut 세포를 구별합니다. 마지막으로, 표피 성장 인자 (EGF)의 조합은, 니코틴 및 소량은 PDX1 + / NKX6-1 + 세포의 효율적인 생성을 이끈다. 유동 세포 계측법 췌장 개발의 주요 단계에서 특이 마커의 발현을 확인하기 위해 수행된다. 스테이지 (4)의 끝에 PDX1 + / + 췌장 선조 NKX6-1은 면역 결핍 마우스에 이식시 성숙한 β 세포를 발생시킬 수 있으며 상기 체외 인슐린 생성 세포를 생성하기 위해 구별된다. 따라서, PDX1의 효율적인 생성 + / NKX6-1 + 췌장 전구 세포,이 프로토콜에서 입증 된 바와 같이,이 시험 관내에서 인간의 췌장 개발을 연구하기위한 플랫폼을 제공하기 때문에 매우 중요하고 분화 잠재력 세포의 공급원을 제공한다 EV 수 β 세포entually 당뇨병 치료에 이용 될 수있다.
Introduction
당뇨병의 유병률은 증가하고 캐나다 당뇨병 협회에 따르면, 제 1 형 당뇨병 (T1D) 1을 가진이 개인의 5 ~ 10 %로, 캐나다에서 만 11 이상의 개인이 당뇨병 또는 당뇨병 진단 전의 것으로 추정된다. T1D는 랑게르한스섬 내에 위치 인슐린 생성 β 세포의 파괴에 의해 야기 된자가 면역 질환이다. 현재 T1D 함께 사는 사람들은 인슐린이의 외인성 소스를 필요로한다. 인슐린 치료에서의 진보에도 불구하고, T1D 환자는 혈당 수치를 조절하는데 어려움이 있고 하이포 고혈당 모두 고생 계속합니다. 치료의 유망한 형태는 T1D에서 정상 혈당이 생체 내 및 시험 관내 3 모두 β 세포의 인슐린 생산의 무제한 공급을 생성하는데 사용될 수있는 인간 배아 줄기 세포 (hESCs는)의 사용이다 복원
체외에서 hESCs는에서 인슐린 생산 세포를 생성에서 가장 성공적인 시도는 췌장 개발 4, 5시에 발생하는 배아 이벤트를 요점을 되풀이하는 것입니다. 이것은 정확하게 현상 췌장의 주요 단계를 모델링 별개의 신호 경로의 조작을 포함한다. 췌장 개발은 CXCR4 및 CD117 (C-KIT) 8, 9의 발현을 특징으로 최종 내배엽의 유도로 시작합니다. definit의 정확한 조절필자 내배엽 조직은 다음 전방 - - 후방 및 복부 - 등의 패턴 거쳐 창자 관의 형성이 필요합니다. 지느러미와 복부 췌장 싹이 췌장 개발 (10)에 필요한 췌장과 십이지장 호 메오 박스 유전자 (Pdx1)를 표현하는 후방 foregut의 영역에서 등장. 지느러미와 복부 싹 퓨즈는 광범위한 상피 리모델링 및 확장 (11)를 거쳐 췌장을 형성한다. 내분비 및 외분비 혈통에 의지가 표현하는 다 능성 전구 세포 (MPC와)의 생성을 동반, 다른 사람의 사이에서, 전사는 Pdx1, Nkx6.1 및 Ptf1a 12, 13 요인. 내분비 및 유관 세포가 될 것이다 MPC와는 Ptf1a 식을 줄이면서 Nkx6-1을 표현하는 것을 계속한다. 이에 대하여, 외분비 혈통 세포는 expressio 잃게됩니다Nkx6-1의 n 및 Ptf1a 식 (12)을 유지한다.
전사 인자 Nkx6-1 특히 세포와 β 내분비 전구 세포의 분화 과정, 췌장 발달에 중요한 역할을한다. 이전 췌장 개발 14 중 β 세포 장애가 형성 Nkx6-1 결과, 결실 한 바와 같이. 따라서, 생체 외 및 생체 내 인슐린 생성 β 세포를 발생시키는 Nkx6-1의 효율적인 도입을 필요로한다.
우리는 최근에 효율적으로 hPSCs에서 PDX1 + / NKX6-1 + 췌장 전구 세포를 생성 할 수있는 프로토콜을 개발했다. 이 hPSC 파생 췌장 전구 세포는 면역 결핍 마우스 3에 이식에 따라 성숙 β 세포를 생성합니다. 1) 최종 내배엽 유도 : 분화 프로토콜 4로 분할 될 수 특징 스테이지2) 후방 foregut 패터닝, 3) 췌장 사양 및 4) NKX6-1 유도. 여기서 우리는 분화 방향의 각 단계에 대한 상세한 설명을 제공한다.
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Protocol
솔루션 및 미디어 1. 준비
주 : 무균 환경에서 세포 배양에 대한 모든 미디어를 준비합니다. 미디어 만든 즉시 사용할 수 있습니다. 시약 세부 사항은 재료 표에 나와 있습니다.
- 차별화 미디어
- 1 % 글루타민, 2 μM CHIR 99021, (100) NG / ㎖ 티빈 A, 104 M MTG와 RPMI 매체 : 일 0 차별화 미디어를 준비합니다.
- 1 % 글루타민, 100 NG / ㎖ 티빈 A, 104 M MTG, 5 NG / ㎖의 bFGF, 50 μg의 / ㎖ 아스 코르 산으로 RPMI 매체 : 하루 1-2 차별화 미디어를 준비합니다.
- 1 % 글루타민, 1 % B27, 104 M MTG, 0.75 μM Dorsomorphin, 50 NG / ㎖ FGF10로 RPMI 매체 : 하루 3-5 차별화 미디어를 준비합니다.
- 하루 6 ~ 7 차별화 미디어를 준비 : DMEM을 1 % 글루타민, 1 % B27, 50 μg의 / ㎖ 아스 코르 산, 50 NG / ㎖ FGF10, 0.25 μM의 SANT-1, 2 μM 레티노 산, 50 NG / ㎖ 소량으로.
참고 : 레티노산성 마지막 배지에 첨가되어야하며, 용지가 산화 분해 (15)을 방지하기 위해 빛으로부터 보호되어야한다. - 일 8-12 차별화 미디어를 준비 : DMEM을 1 % 글루타민, 1 % B27, 50 μg의 / ㎖ 아스 코르 산, 50 NG / ㎖ 소량, 100 NG / ㎖ hEGF, 10 mM의 니코틴 아미드와 함께.
- PBS에서 10 % FBS, 마이너스 칼슘과 마그네슘 : FACS 버퍼를 준비합니다.
2. HESC 차별화
참고 : HESC는 해동 계대과의 bFGF (16) 보충 KOSR 기반 미디어의 존재에 조사 된 마우스 배아 섬유 아세포에 확장됩니다. 세포가 80-95%의 포화 상태에 도달했을 때 hESCs는 차별화를위한 준비가되어 있습니다. 이 때 식민지 정의 테두리와 'domelike'구조 (그림 1A)와 커야합니다. 모든 세포 배양 평면 바닥 0.1 % 젤라틴으로 코팅 된 조직 배양 처리 된 플레이트에서 수행된다. 일반적으로, 세포 (6)에서 재배되거나각각 2 ml의 또는 1 ㎖의의 매체 볼륨의 12 웰 플레이트.
- 0 일에서 일 0 차별화 미디어로 KOSR 기반 미디어를 대체하여 차별화를 시작합니다.
- 일 1과 2에서 부드럽게 흡입하기 전에 단일 층에서 죽은 세포를 제거하기 위해 판을 흔들어. 주 1 ~ 2 차별화 미디어로 교체하십시오.
- 3 일에, 유동 세포 계측법을위한 수확 세포. 세포가 90 % 이상 CXCR4 + / CD117 + 표현하면 2.4 단계로 진행합니다.
- 일 3, 5, 부드럽게 이전에 흡입에 단일 층에서 죽은 세포를 제거하기 위해 판을 흔들어. 하루 3-5 차별화 미디어로 교체하십시오.
- 일 6, 7 일, 하루 6 ~ 7 차별화 미디어로 교체합니다.
- 일 8, 10 및 12에서 하루 8-12 차별화 미디어로 교체합니다.
- 날 13 일, 흐름에 대한 수확 세포는 세포 계측법 PDX1과 NKX6-1 식을 결정합니다.
유동 세포 계측법 분석 3. 수확 세포
- 와 세포를 떼어 놓다제조 업체의 프로토콜과 3 분 동안 37 ° C에서 부화에 따라 1 배 상업 트립신 솔루션입니다.
- 30 μL의 DNase의의 I. 1,000 μL FACS 버퍼에 단일 세포를 상용 트립신 용액을 제거하고 재현 탁
- 미세 원심 분리 관에 35 ㎛의 나일론 메쉬 셀 스트레이너 및 전달을 이용하여 필터 셀.
- 5 분 455 XG에 원심 분리기 세포. 어느 라이브 또는 고정 염색 세포를 준비합니다.
유동 세포 계측법 4. 염색
- 3 일에 라이브 염색에 대비 흐름
- 1000 μL FACS 버퍼에 재현 탁 세포. 전송 200 μL (모두 흠 염색 샘플) 96- 웰 플레이트의 웰에 두 개 (약 1-3 × 105 세포).
- 2 분 동안 931 XG에 접시를 원심 분리기. 접시를 반전하여 상층 액을 제거합니다.
- APC 및 CD117 : 차 복합 항체, CXCR4으로 얼룩 PE는 3 (M의 aterials 표 참조)실온에서 0 분 빛으로부터 보호.
- 2 분 동안 931 XG에 접시를 원심 분리기. 접시를 반전하여 상층 액을 제거합니다.
- 100 μL FACS 버퍼에 재현 탁 샘플.
- 2 분 동안 931 XG에 접시를 원심 분리기. 접시를 반전하여 상층 액을 제거합니다.
- 1 ml의 마이크로 테스트 튜브 또는 5 ㎖ 둥근 바닥 튜브 300-500 μL FACS 완충액에서 총 부피 각각의 샘플 및 전송을 재현 탁.
- (17) 흐름 cytometer에서 실행 샘플. 샘플을 즉시 실행할 수없는 경우, 4 ℃에서 보관 빛으로부터 보호.
- 하루 (13)에 고정 염색에 대비 흐름
- 4 ℃에서 24 시간 동안 상업 고정 / permeabilization 솔루션에서 세포 펠렛을 Resuspend.
- 5 분 동안 455 XG에서 샘플을 원심 분리기. 400 μL 파마 / 세척 용액을 Resuspend.
- (TW)에 샘플 (약 0.5 × 10 6 세포)의 200 μl를 전송(IgG의 제어 및 PDX1 / NKX6-1 염색 용) 96 웰 플레이트의 O를하는 것은 우물. 2 분 동안 931 XG에 원심 분리기.
- 안티 PDX1 및 안티 NKX6-1 차 또는 이소 제어 항체를 포함하는 100 ㎕의 파마 / 세척 용액의 세포 펠렛을 재현 탁 (재료 표 참조). 4 ℃에서 밤새 품어.
- 2 분 동안 931 XG에 접시를 원심 분리기. 접시를 반전하여 상층 액을 제거합니다. 100 μL 파마 / 세척 용액을 Resuspend 샘플.
- 2 분 동안 931 XG에 접시를 원심 분리기. 접시를 반전하여 상층 액을 제거합니다.
- 빛으로부터 보호 실온에서 1 시간 동안 이차 항체를 포함하는 100 μL 파마 / 워시 샘플을 재현 탁.
- 2 분 동안 931 XG에 접시를 원심 분리기. 접시를 반전하여 상층 액을 제거합니다.
- 100 μL 파마 / 세척 용액에 재현 탁 샘플.
- 2 분 동안 931 XG에 접시를 원심 분리기. 접시를 반전하여 상층 액을 제거합니다.
- 대표단계 4.2.9 및 4.2.10을 먹는다.
- 1 ml의 마이크로 테스트 튜브 또는 5 ㎖ 둥근 바닥 튜브 300-500 μL FACS 완충액에서 총 부피 각각의 샘플 및 전송을 재현 탁.
- (17) 흐름 cytometer에서 실행 샘플. 샘플을 즉시 실행할 수없는 경우, 4 ℃에서 보관 빛으로부터 보호.
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Representative Results
도 1a에 개략적으로 도시 된 바와 같이, 췌장 전구 세포의 효율적 생성, 분화 프로토콜 중 특정 신호 분자의 정확한 첨가하여 미분화 된 세포의 적절한 성장 및 유지에 의존한다. 0 일에서 미분화 세포 80-95% 합류를해야하며, 식민지 정의 가장자리 (그림 1A)를 가져야한다. 세포 사멸이 단계에서 매우 일반적이기 때문에 1 단계 동안, 미디어 가능성이 흐린 표시됩니다. 1 단계 말까지, 세포 비율 90 % 이상 (그림 1B)에서 최종 내배엽 마커, CXCR4 및 CD117를 공동으로 표현한다.
셀이 4 단에 걸쳐 분화 프로토콜로서, 가늘고 긴 타원 형상의 외관 형태 학적 변화는 (단계 1에서 관측 2)보다 작고 둥근 세포 (스테이지 3에서 볼 등 4) (
그림 1 : hESCs는 및 지원 데이터로부터 췌장 전구 분화의 도식. hESCs는에서 췌장 전구의 유도 (A) 도식. 차별화의 날, developmenta리터 단계, 기본 미디어, 모든 단계에서 추가 된 사이토 카인이 포함되어 있습니다. 이하, 췌장 분화의 중요한 단계에서 위상차 이미지를 나타낸다. 모든 대표 도면에서, H1은 상기 세포 나타낸 4 단 분화 프로토콜에 따라 구별되었다. 0 일, 미분화 hESCs는; 1 단계, 확실한 내배엽; 2 단계, 후방 Foregut; 3 단계, PDX1 + 내배엽; 4 단계, NKX6-1 +의 내배엽 / 췌장 전구 세포. 스케일 바 = 200 μm의. PE 및 CD117 : (B) 3 일 대표는 세포 계측법 CXCR4에 대한 플롯 흐름 APC 항체 염색. 오른쪽 왼쪽, 스테인드 샘플에 흠 샘플. (C)의 날 NKX6-1 및 PDX1을 표현하는 무대 (4) 파생 췌장 전구 세포 13 대표 유동 세포 계측법 플롯. 오른쪽 왼쪽, 스테인드 샘플에 대한 IgG를 제어 할 수 있습니다. ; hESC의 - 티빈 A - 인간 배아 줄기 세포는이 법 bFGF에 - 염기성 섬유 아세포 성장 인자, FGF10 - 섬유 아세포 성장 인자 (10), DM - dorsomorphin, NOG - 소량, RA - 레티노 산, EGF - 표피 성장 인자, NA - 니코틴. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
성공적으로 시험 관내에서 hPSCs에서 NKX6-1 + 췌장 전구 세포를 생성하는 췌장 개발 과정에서 중요한 발달 단계를 관리하는 특정 신호 전달 경로의 정확한 규정을 포함 hPSCs의 높은 품질의 문화와 감독 분화의 사용에 의존한다. 이전에 다음과 같은 고려가 이루어져야 NKX6-1 효율적인 생성을 위해, 3이 나타내는 바와 같이 프로토콜 hPSC 라인의 다양한 걸쳐 NKX6-1의 강력한 발현을 유도하기 위해 사용될 수 있지만. 모든 세포 배양 및 미디어 제제 오염을 방지하기 위해 살균 환경에서 수행되는 것이 중요하다. hESC의 식민지가 적절한 포화 상태에 도달 전에 분화 일 0을 시작으로 분화하기 시작하지 않은 것이 중요합니다. 최종 내배엽과 절차 개발의 비효율적 인 유도 될 수 있습니다 최적이 아닌 hESCs는와 차별화 시작알 단계. 최종 내배엽의 효율적인 도입을 위해 유동 세포 계측법에 의해 3 일째에 세포를 분석하는 중요한 이유이다. 이중 긍정적 인 CXCR4 + 3 일에서 CD117 + 세포의 비율은 효율적인 췌장 개발 3 90 % 이상이어야한다. CXCR4 및 CD117을 모두 발현하는 세포의 비율이 90 % 이하이면, 췌장 전구 세포로 효율적으로 유도 가능성 (결과 미도시)에 노출 될 것이다. 또한, 이전에 발표 된 것과 반대로, 이전의 단계로 1 매체 (16)를 먹이로 RPMI와 세포를 세척 할 필요가 없습니다. 종래 용지에 흡입 플레이트 부드러운 흔들림이 단층에서 죽은 세포를 제거하기에 충분하다.
2 단계에서 dorsomorphin의 추가는 특정 hPSC 라인 (18)을 위해 필요한 것으로 나타났다. 따라서, 작업시 디 dorsomorphin이 필요한지 여부를 결정하는 것이 중요 fferent hPSC 라인. 또한, 스테이지 (3)의 기간 monohormonal polyhormonal 또는 선조 세포 및 세포주 의존적 3 중 하나를 특정하기위한 중요한 것으로 밝혀졌다. 새로운 hPSC 라인 작업시 따라서, 세포 NKX6-1 유도를위한 최적 조건을 결정하는 단계 (3) 미디어를 배양해야하는 기간을 결정하는 것이 중요하다. 이를 확인하기 위해 세포를 1-4 일 동안 스테이지 3 미디어를 배양하고 NKX6-1 표현 유동 세포 계측법 5 일 후 분석해야한다.
Nkx6-1이 βcell 개발 (14)에 대한 중요 효율적으로 NKX6-1 + 세포의 풍부한 인구를 생성하는 것은 중요하다. 다른 프로토콜을 개발하는 동안 그 NKX6-1 + 세포 (약 60 % H1 유래 NKX6-1 + 세포와 55 % HUES8 유래 PDX + / NKX6-1 + 세포) 4 hESC의 차별화 할 수 있습니다,"외부 참조"> 5는, 우리의 방법은 지속적으로> 80 % H1 유래 PDX1 + / NKX6-1 + 세포를 생성합니다. 그러나, 우리의 분화 프로토콜은 우리가 좋은 제조 관행의 방법을 최적화하기 위해 아직 가지고, 연구에만 사용을 제한 마우스 배아 섬유 아세포의 사용에 의존한다. 우리가 우리의 무대-4 유래 PDX1 + / NKX6-1 + 세포를 cryopreserve 시도하지 않은 있지만,이 방법은 성공적 슐츠 등에 의해 수행되었습니다. 누가 냉동 보관 췌장 집계 생체 (19)에 그 기능을 유지 할 수 있다고 설명했다.
본 논문에서는 효율적 hPSC 라인의 다양한 PDX1 + / + NKX6-1 췌장 전구 세포를 생성하기 위해 4 단계의 프로토콜을 설명한다. 췌장 발달의 네 가지 주요 단계를 통해 hPSC을 미분함으로써,이 프로토콜은 시험 관내에서 인간의 췌장 개발 연구하는 모델을 제공한다. 푸르트PDX1 + / NKX6-1 + 세포가 생체 내 및 시험 관내에서 두 인슐린 생성 세포를 생성 할 가능성이 있기 때문에 ermore, 4, 5의 hESC 유래 PDX1 + / NKX6-1 + 췌장, 3 (데이터는 도시하지 않음) 전구 세포는 당뇨병의 치료에 대한 가능한 원인을 제공한다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
이 원고는 토론토 일반과 서양 재단과 밴팅 & 베스트 당뇨병 센터 - 대학 건강 네트워크 대학원 수상에서 자금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and cytokines | |||
| 1-Thioglycerol (MTG) | Sigma | M6145 | |
| Activin A | R&D | 338-AC/CF | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Buffer | BD Bioscience | 554722 | |
| BD Perm/Wash buffer, 1x | BD Bioscience | 554723 | |
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| CHIR990210 | Tocris | 4423a | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995 | |
| DNase I | VWR | 80510-412 | |
| Dorsomorphin | Sigma | P5499 | |
| EGF | R&D | 236-EG | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 88150 | |
| FGF10 | R&D | 345-FG | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Nicotinamide | Sigma | NO636 | |
| NOGGIN | R&D | 3344-NG | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875 | |
| SANT-1 | Tocris | 1974 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Life Technologies | 12605-010 | |
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Antibodies for flow cytometry (working dilutions) | |||
| CD117 PE (1:100) | Life Technologies | CD11705 | |
| CXCR4 APC (1:50) | BD Bioscience | 551966 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugate (1:400) | Life Technologies | A-31571 | |
| Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 705-546-147 | |
| Isotype Control Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 015-000-003 | |
| Isotype Control Goat IgG | R&D | AB-108-C | |
| NKX6-1 (1:2,000) | DSHB | F55A10 | |
| PDX1 (1:100) | R&D | AF2419 |
References
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