Summary
Här beskriver vi en 4-stegs-protokollet för att skilja mänskliga embryonala stamceller till NKX6-1 + bukspottkörteln stamceller in vitro. Detta protokoll kan tillämpas på en mängd olika humana pluripotenta stamcellinjer.
Abstract
Pluripotenta stamceller har förmågan att själv förnya och differentiera till flera härstamningar, vilket gör dem till en attraktiv källa för generering av pankreatiska progenitorceller som kan användas för att studera och framtida behandling av diabetes. Denna artikel beskriver en fyrstegs differentiering protokoll som syftar till att generera bukspottkörteln progenitorceller från mänskliga embryonala stamceller (hESCs). Detta protokoll kan tillämpas på ett antal humana pluripotenta stamcell (hPSC) linjer. Tillvägagångssättet för att generera bukspottkörteln progenitorceller är att differentiera hESCs att noggrant modellera viktiga skeden av bukspottskörteln utveckling. Detta börjar med induktionen av den slutgiltiga endoderm, vilket uppnås genom odling av cellerna i närvaro av Aktivin A, basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) och CHIR990210. Ytterligare differentiering och mönstring med fibroblasttillväxtfaktor 10 (FGF10) och Dorsomorphin genererar celler som liknar den bakre foregut. Tillsatsen av Retinsyra, SKALLE, SANT-1 och FGF10 skiljer bakre foregut celler till celler som är karakteristiska för pankreas endoderm. Slutligen, en kombination av epidermal tillväxtfaktor (EGF), Nikotinamid och SKALLE leder till den effektiva genereringen av PDX1 + / NKX6-1 + -celler. Flödescytometri utförs för att bekräfta uttrycket av specifika markörer i viktiga skeden av bukspottskörteln utveckling. De PDX1 + / NKX6-1 + bukspottkörteln stamceller i slutet av etapp 4 kan generera mogna p-celler vid transplantation i möss med immunbrist och kan differentieras ytterligare för att generera insulinproducerande celler in vitro. Således, en effektiv generering av PDX1 + / NKX6-1 + bukspottkörteln stamceller, vilket framgår i detta protokoll, är av stor betydelse eftersom det ger en plattform för att studera human pankreas utveckling in vitro och ger en källa av celler med potential att differentiera till p-celler som skulle kunna eVentually användas för behandling av diabetes.
Introduction
Prevalensen av diabetes ökar och enligt den kanadensiska Diabetes Association, är det uppskattas att över 11 miljoner människor i Kanada är diabetiker eller prediabetic, med 5-10% av dessa individer med typ 1 diabetes (T1D) 1. T1D är en autoimmun sjukdom som orsakas av förstörelsen av de insulinproducerande P-celler som finns inom de Langerhanska öarna. För närvarande individer som bor med T1D kräver exogena källor av insulin två. Trots framsteg inom insulinterapi, T1D patienter fortsätter att ha en svår tid att reglera sina blodglukosnivåer och fortsätta att lida både hypo- och hyperglykemi. En lovande behandlingsform för att återställa normoglykemi i T1D är användningen av mänskliga embryonala stamceller (hESCs), som kan användas för att generera ett obegränsat utbud av insulinproducerande P-celler både in vivo och in vitro 3,
Den mest framgångsrika försöket att alstra insulinproducerande celler från hESCs in vitro är att rekapitulera de embryonala händelser som inträffar under pankreatisk utveckling 4, 5. Detta innebär manipulering av olika signalvägar för att noggrant modellera viktiga steg i utvecklings bukspottkörteln. Pankreatisk utveckling börjar med induktionen av den slutgiltiga endoderm, vilket kännetecknas av uttrycket av CXCR4 och CD117 (c-KIT) 8, 9. Exakt reglering av Definitive endoderm organisation krävs för bildningen av tarmröret, som därefter undergår anterior-till-bakre och ventral-dorsal mönstring. Rygg och ventrala bukspottkörteln knoppar ut från området av den bakre foregut som uttrycker bukspottskörteln och duodenal homeobox genen (Pdx1), vilket är nödvändigt för pancreatic utveckling 10. Rygg och ventrala knoppar säkring för att bilda bukspottkörteln, som sedan genomgår omfattande epitel ombyggnad och utbyggnad 11. Engagemang för det endokrina och exokrina härstamning åtföljs av generering av multi progenitorceller (partnerländerna) som uttrycker bland annat transkriptionsfaktorer Pdx1, Nkx6.1 och Ptf1a 12, 13. Partnerländerna som kommer att bli endokrina och duktala celler fortsätter att uttrycka Nkx6-1 samtidigt minska Ptf1a uttryck. I motsats till detta kommer exokrina härstamning celler förlorar expression av Nkx6-1 och upprätthålla Ptf1a uttryck 12.
Transkriptionsfaktom Nkx6-1 har en nyckelroll i pankreatisk utveckling, särskilt under differentiering av endokrina stamfaderceller till p-celler. Som tidigare beskrivits, radering av Nkx6-1 resulterar i nedsatt bildning av p-celler under pankreatisk utveckling 14. Därför genererar insulinproducerande P-celler både in vitro och in vivo kräver effektiv induktion av Nkx6-1.
Vi utvecklade nyligen ett protokoll för att effektivt generera PDX1 + / NKX6-1 + bukspottkörteln stamceller från hPSCs. Dessa hPSC-härledda pankreatiska progenitorceller generera mogna p-celler vid transplantation till immundefekta möss 3. Differentieringen protokollet kan delas in i fyra stadier kännetecknande för: 1) definitiv endoderm induktion, 2) bakre foregut mönstring, 3) pancreatic specifikation och 4) NKX6-1 induktion. Här ger vi en detaljerad beskrivning av varje steg i den riktade differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av lösningar och media
OBS: Förbered alla medier för cellkultur i en steril miljö. Media måste göras och användas omedelbart. Reagens detaljer ges i materialtabellen.
- differentiering Media
- Förbereda Dag 0 Differentiering Media: RPMI Medium med 1% glutamin, 2 | iM CHIR 99021, 100 ng / ml Aktivin A, 10 4 M MTG.
- Förbereda Dag 1-2 Differentiering Media: RPMI Medium med 1% glutamin, 100 ng / ml Aktivin A, 10 4 M MTG, 5 ng / ml bFGF, 50 | ig / ml askorbinsyra.
- Förbered Dag 3-5 Differentiering Media: RPMI Medium med 1% glutamin, 1% B27, 10 fyra M MTG, 0,75 iM Dorsomorphin, 50 ng / ml FGF10.
- Förbereda Dag 6-7 Differentiering medier: DMEM med 1% glutamin, 1% B27, 50 | ig / ml askorbinsyra, 50 ng / ml FGF10, 0,25 | iM SANT-1, 2 ^ M retinsyra, 50 ng / ml SKALLE.
OBS: RetinoicSyra bör läggas till media sist och media bör skyddas från ljus för att förhindra oxidativ nedbrytning 15. - Förbereda Dag 8-12 Differentiering medier: DMEM med 1% glutamin, 1% B27, 50 | ig / ml askorbinsyra, 50 ng / ml SKALLE, 100 ng / ml hEGF, 10 mM Nikotinamid.
- Förbered FACS buffert: 10% FBS i PBS minus kalcium och magnesium.
2. stamceller från mänskliga embryon Differentiering
OBS: stamceller från mänskliga embryon tinas, passe och expanderat på bestrålad mus embryonala fibroblaster i närvaro av en KOSR baserade media kompletterat med bFGF 16. HESCs är redo för differentiering när cellerna når 80-95% konfluens. Vid denna tid kolonierna ska vara stor med definierade gränser och en "kupolliknande" struktur (Figur 1A). All cellodling utförs i flatbottnade, vävnadskulturbehandlade plattor belagda med 0,1% gelatin. Typiskt odlas cellerna i 6 eller12-brunnsplattor, i medie volymer av 2 ml eller 1 ml, respektive.
- På dag 0, börja differentiering genom att ersätta KOSR baserade media med Dag 0 Differentiering Media.
- På dag 1 och 2, försiktigt skaka plattan för att avlägsna eventuella döda celler från monolager innan aspirera. Ersätt med Dag 1-2 Differentiering Media.
- På dag 3, skördceller för flödescytometri. Om cellerna uttrycker mer än 90% CXCR4 + / CD117 +, gå vidare till steg 2,4.
- På dagarna 3 och 5, försiktigt skaka plattan för att avlägsna eventuella döda celler från monoskiktet före aspire. Ersätt med Dag 3-5 Differentiering Media.
- På dagarna 6 och 7, ersätt med Dag 6-7 Differentiering Media.
- På dagarna 8, 10 och 12, ersätt med Dag 8-12 Differentiering Media.
- På dag 13, skörd celler för flödescytometri för att bestämma PDX1 och NKX6-1 uttryck.
3. Skörd Celler för flödescytometrianalys
- Dissociera cellerna med1x kommersiella trypsin lösning enligt tillverkarens protokoll och inkubera vid 37 ° C under 3 min.
- Ta bort kommersiella trypsinlösning och resuspendera enstaka celler i 1000 il FACS buffert med 30 | il DNas I.
- Filtrera celler med användning av en 35 | im nylonnät cellfilter och överför till ett mikrocentrifugrör.
- Centrifugera cellerna vid 455 xg under 5 min. Förbered celler för antingen levande eller fast färgning.
4. Färgning för flödescytometri
- Flödes förberedelse för levande färgning på dag tre
- Resuspendera celler i 1000 il FACS buffert. Överföring 200 | il (ca 1-3 x 10 5 celler) i två brunnar i en platta med 96 brunnar (för både ofärgade och färgade prover).
- Centrifugera plattan vid 931 xg under 2 min. Avlägsna supernatanten genom att vända plattan.
- Fläcken med primärt konjugerade antikroppar, CXCR4: APC och CD117: PE (se M aterial tabell) för tre0 min vid rumstemperatur skyddad från ljus.
- Centrifugera plattan vid 931 xg under 2 min. Avlägsna supernatanten genom att vända plattan.
- Resuspendera prover i 100 pl FACS buffert.
- Centrifugera plattan vid 931 xg under 2 min. Avlägsna supernatanten genom att vända plattan.
- Resuspendera varje prov och överföring i en total volym av 300 till 500 | il FACS-buffert till 1 ml mikro provrör eller 5 ml rundbottnade rör.
- Kör prover på flödescytometern 17. Om proverna inte kan köras omedelbart, förvara vid 4 ° C skyddade från ljus.
- Flödes förberedelse för fast färgning på dag 13
- Resuspendera cellpelleten i kommersiell fixering / permeabilization lösning under 24 h vid 4 ° C.
- Centrifugera provet vid 455 xg under 5 min. Resuspendera i 400 pl Perm / tvättlösning.
- Överför 200 l av provet (ca 0,5-1 x 10 6 celler) till TWo brunnar i en platta med 96 brunnar (för IgG-kontroll och PDX1 / NKX6-1 färgning). Centrifugera vid 931 xg under 2 minuter.
- Resuspendera cellpellets i 100 pl Perm / tvättlösning innehållande anti-PDX1 och anti-NKX6-1 primär eller isotyp kontrollantikroppar (se Material tabell). Inkubera över natten vid 4 ° C.
- Centrifugera plattan vid 931 xg under 2 min. Avlägsna supernatanten genom att vända plattan. Resuspendera prover i 100 pl Perm / tvättlösning.
- Centrifugera plattan vid 931 xg under 2 min. Avlägsna supernatanten genom att vända plattan.
- Resuspendera proverna i 100 | j, l Perm / Wash innehållande sekundära antikroppar vid rumstemperatur under 1 h i skydd mot ljus.
- Centrifugera plattan vid 931 xg under 2 min. Avlägsna supernatanten genom att vända plattan.
- Resuspendera prover i 100 pl Perm / tvättlösningen.
- Centrifugera plattan vid 931 xg under 2 min. Avlägsna supernatanten genom att vända plattan.
- Repäta steg 4.2.9 och 4.2.10.
- Resuspendera varje prov och överföring i en total volym av 300 till 500 | il FACS-buffert till 1 ml mikro provrör eller 5 ml rundbottnade rör.
- Kör prover på flödescytometern 17. Om proverna inte kan köras omedelbart, förvara vid 4 ° C skyddade från ljus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effektiv generering av pankreatiska progenitorceller är beroende av korrekt tillväxt och underhåll av odifferentierade celler följt av den exakta tillsatsen av specifika signalmolekyler under differentieringsprotokoll, såsom illustreras i den schematiska i fig 1A. På dag 0, bör odifferentierade celler vara 80-95% sammanflytande och kolonier ska ha definierade kanter (Figur 1A). Under etapp 1 kommer medierna sannolikt grumliga eftersom celldöd är ganska vanligt i detta skede. Vid slutet av etapp 1, bör cellerna samuttrycka de slutgiltiga endoderm markörer, CXCR4 och CD117, på en andel större än 90% (Figur 1B).
Som celler differentierar hela fyra steg protokoll, deras morfologi ändras från en långsträckt, ovalliknande utseende (observerades vid Etapp 1 och 2) till mindre, rundare celler (som ses vid Stages 3 och 4) (
Figur 1: Schematisk bild av bukspottskörteln föregångare differentiering från hESCs och underlag. (A) Schematisk bild av induktion av pancreatic progenitor från hESCs. Dag av differentiering, developmental skede basmedium, och cytokinerna läggs i varje skede ingår. Nedan är fas kontrastrika bilder på de viktigaste stegen i bukspottskörteln differentiering visas. I alla representativa siffror, var H1 celler differentieras utifrån fyra steg differentiering protokoll beskrivs ovan. Dag 0, odifferentierade hESCs; Steg 1, Slutgiltigt endoderm; Steg 2, bakre Foregut; Steg 3, PDX1 + endoderm; Stage 4, NKX6-1 + endoderm / pankreas stamceller. Skalstreck = 200 | j, m. (B) Dag 3 representant flödescytometri tomter för CXCR4: PE och CD117: APC antikroppar färgning. Obehandlat prov på vänster, färgade provet på höger. (C) Dag 13 representativ flödescytometri tomt för scen-4 härrör bukspottkörteln progenitorceller uttrycker NKX6-1 och PDX1. IgG-kontroll på vänster, färgade provet på höger. hESC - mänskliga embryonala stamceller, Act A - Activin A; bFGF - basisk fibroblasttillväxtfaktör, FGF10 - fibroblasttillväxtfaktor 10, DM - dorsomorphin, NOG - SKALLE, RA - retinsyra, EGF - epidermal tillväxtfaktor, NA - nikotinamid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Framgångsrikt genererar NKX6-1 + bukspottkörteln stamceller från hPSCs in vitro bygger på användning av högkvalitativa kulturer av hPSCs och riktad differentiering som omfattar exakt reglering av specifika signalvägar som styr viktiga utvecklingsstadier under pankreatisk utveckling. Även om detta protokoll kan användas för att inducera robust uttryck av NKX6-1 över en mängd olika hPSC linjer som tidigare visats 3, för att säkerställa en effektiv NKX6-1 generation följande överväganden göras. Det är viktigt att alla cellkultur och medieberedningen utförs i en steril miljö för att förhindra kontaminering. Det är viktigt att de hESC kolonier har nått lämplig konfluens och har inte börjat differentiera före början dag 0 av differentiering. Start differentiering med hESCs som inte är optimala kan resultera i ineffektiv induktion av den slutgiltiga endoderm och fortsätter utvecklingal stadier. Det är därför det är viktigt att analysera celler vid dag 3 med flödescytometri att säkerställa en effektiv induktion av definitiv endoderm. Den procentuella andelen dubbel positiv CXCR4 + CD117 + celler vid dag 3 bör vara större än 90% för effektiv bukspottskörteln utveckling 3. Om andelen celler som uttrycker både CXCR4 och CD117 är lägre än 90%, kommer effektiv induktion till bukspottkörteln stamceller sannolikt äventyras (resultat ej visade). I motsats till vad som tidigare publicerats, är det inte nödvändigt att tvätta cellerna med RPMI före utfodring med etapp 1 media 16. Försiktig skakning av plattan före aspirera mediet är tillräcklig för att avlägsna döda celler från monoskiktet.
Tillsatsen av dorsomorphin i steg 2 har visat sig endast krävas för specifika hPSC linjerna 18. Således är det viktigt att bestämma om dorsomorphin är nödvändigt när man arbetar med di fferent hPSC linjer. Dessutom har den tid då steg 3 har visat sig vara avgörande för att specificera antingen monohormonal eller polyhormonal progenitorceller och är cellinje-beroende 3. Således är det viktigt när man arbetar med ett nytt hPSC linje för att bestämma varaktigheten att cellerna skall odlas i etapp 3 media för att bestämma de optimala betingelserna för NKX6-1 induktion. För att bestämma detta, bör cellerna odlas i etapp 3 media under 1-4 dagar och analyserades 5 dagar senare genom flödescytometri för NKX6-1 uttryck.
Effektivt generera populationer anrikade på NKX6-1 + celler är viktig, eftersom Nkx6-1 är kritisk för βcell utveckling 14. Medan andra har utvecklat protokoll som kan skilja hESC till NKX6-1 + celler (ca 60% H1-härledda NKX6-1 + celler och 55% HUES8 härrörande PDX + / NKX6-1 + celler) 4,"xref"> 5, vår metod genererar konsekvent> 80% H1-härledda PDX1 + / NKX6-1 + celler. Men bygger vår differentiering protokollet om användning av mus embryonala fibroblaster, vilket begränsar dess användning till forskning enbart, eftersom vi ännu inte optimera metoden i Good Manufacturing Practices. Även om vi inte har försökt cryopreserve vår scen-4 härrör PDX1 + / NKX6-1 + celler, har denna metod utförts med godkänt resultat av Schulz et al. , Som visade att frysförvarade pankreas aggregat var i stånd att behålla sin funktion in vivo 19.
I detta dokument beskriver vi en 4-stegs-protokollet för att effektivt generera PDX1 + / NKX6-1 + bukspottkörteln stamceller från en mängd olika hPSC linjer. Genom att skilja hPSC genom fyra viktiga faser av bukspottskörteln utveckling, ger detta protokoll en modell för att studera utvecklingen av den mänskliga bukspottkörteln in vitro. Furthermore, eftersom PDX1 + / NKX6-1 + celler har potential att generera insulinproducerande celler både in vivo och in vitro (data ej visade) 3, 4, 5, den hESC-derived PDX1 + / NKX6-1 + pankreas progenitorceller ger en möjlig källa för behandling av diabetes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta manuskript stöddes genom finansiering från Toronto General och västra Foundation och Banting & Bästa Diabetes Centre-University Health Network Graduate Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and cytokines | |||
| 1-Thioglycerol (MTG) | Sigma | M6145 | |
| Activin A | R&D | 338-AC/CF | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Buffer | BD Bioscience | 554722 | |
| BD Perm/Wash buffer, 1x | BD Bioscience | 554723 | |
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| CHIR990210 | Tocris | 4423a | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995 | |
| DNase I | VWR | 80510-412 | |
| Dorsomorphin | Sigma | P5499 | |
| EGF | R&D | 236-EG | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 88150 | |
| FGF10 | R&D | 345-FG | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Nicotinamide | Sigma | NO636 | |
| NOGGIN | R&D | 3344-NG | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875 | |
| SANT-1 | Tocris | 1974 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Life Technologies | 12605-010 | |
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Antibodies for flow cytometry (working dilutions) | |||
| CD117 PE (1:100) | Life Technologies | CD11705 | |
| CXCR4 APC (1:50) | BD Bioscience | 551966 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugate (1:400) | Life Technologies | A-31571 | |
| Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 705-546-147 | |
| Isotype Control Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 015-000-003 | |
| Isotype Control Goat IgG | R&D | AB-108-C | |
| NKX6-1 (1:2,000) | DSHB | F55A10 | |
| PDX1 (1:100) | R&D | AF2419 |
References
- Canadian Diabetes Association. , Available from: http://www.diabetes.ca/about-diabetes/types-of-diabetes (2016).
- Cogger, K., Nostro, M. C. Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes. Endocrinology. 156 (1), 8-15 (2015).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of Functional Human Pancreatic beta Cells In Vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2014).
- Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
- D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Gouon-Evans, V., et al. BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm. Nat Biotechnol. 24 (11), 1402-1411 (2006).
- Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
- Pan, F. C., Wright, C. Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland. Dev Dyn. 240 (3), 530-565 (2011).
- Schaffer, A. E., Freude, K. K., Nelson, S. B., Sander, M. Nkx6 transcription factors and Ptf1a function as antagonistic lineage determinants in multipotent pancreatic progenitors. Dev Cell. 18 (6), 1022-1029 (2010).
- Zhou, Q., et al. A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis. Dev Cell. 13 (1), 103-114 (2007).
- Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).
- Sharow, K. A., Temkin, B., Asson-Batres, M. A. Retinoic acid stability in stem cell cultures. Int J Dev Biol. 56 (4), 273-278 (2012).
- Korytnikov, R., Nostro, M. C. Generation of polyhormonal and multipotent pancreatic progenitor lineages from human pluripotent stem cells. Methods. , 56-64 (2016).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development. 138 (5), 861-871 (2011).
- Schulz, T. C., et al. A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells. PLoS One. 7 (5), e37004 (2012).
