Summary
Nous avons mis au point un système modulaire de criblage à haut débit pour la découverte de nouveaux composés contre la tuberculose Mycobacterium, ciblant les bactéries à croissance intracellulaire et en bouillon ainsi que cytotoxicité contre la cellule hôte mammifère.
Introduction
Mycobacterium tuberculosis, l'agent causal de la tuberculose (TB), est une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. TB sensible aux drogues est une maladie traitable qui nécessite de multiples antibiotiques pour une période de 6 mois. En dépit d' être une maladie curable, la tuberculose mortalité a été estimée à 1,5 million en 2015 1. Au cours des 10 dernières années, il y a eu des préoccupations croissantes quant à la prévalence de la tuberculose M. pharmacorésistante. TB multirésistante (MDR-TB) est définie comme la tuberculose qui est résistante à au moins l'isoniazide (INH) et rifampicine (RMP), et la plupart des souches de MDR-TB sont également résistantes à sélectionner des médicaments antituberculeux de deuxième ligne, limitant ainsi les options de traitement . Les effets de la résistance aux médicaments créent un plus grand défi pour le traitement des patients co-infectés par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH); 400.000 patients dans le monde sont morts de la tuberculose associée au VIH en 2015 1. Il est décevant, la Food and Drug États-Unis Administration a approuvé un seul nouveau médicament contre la tuberculose MDR-TB, bédaquiline, au cours des 40 dernières années 2. Les progrès dans la recherche de meilleures thérapies et de la tuberculose plus courtes sont nécessaires de toute urgence afin de rester en tête dans la lutte contre la tuberculose et la tuberculose multirésistante.
Traditionnellement, les écrans de médicaments antituberculeux sont effectuées sous des conditions in vitro de la croissance dans un milieu de croissance, de sorte que les composés sont ajoutés à une culture en croissance et de leur efficacité dans l' élimination des micro - organismes sont déterminés en comptant les unités formant des colonies (CFU) sur un milieu solide. Comme UFC compte sont chronophage intensifs, la main-d'œuvre, et coûteuse, diverses méthodes indirectes ont été développées pour remédier à ce problème. Ces procédés comprennent le dosage de viabilité Alamar Bleu 3, la détermination de la fluorescence à partir de 4 protéine fluorescente verte (GFP) ou la luminescence 5 à partir de bactéries exprimant la luciférase, et l'estimation de l' adénosine triphosphate totale (ATP) 6, 7.
TB typique est caractérisée par une infection par M. tuberculosis du poumon, où les bactéries se trouvent et se répliquent à l' intérieur des phagosomes des macrophages alvéolaires 8. L'écran phénotypiques simple bouillon peut convenir à des agents pathogènes extracellulaires; Cependant, dans la perspective historique, ont frappé des composés contre M. tuberculosis identifiés en utilisant cette méthode ne parviennent souvent pas à la hauteur des attentes au cours des étapes de validation en aval dans les modèles d'infection. Nous proposons que médicaments contre la tuberculose est mieux réalisée dans un modèle d'infection de la cellule hôte intracellulaire. Néanmoins, les modèles intracellulaires possèdent de nombreux obstacles technologiques et biologiques au développement de criblage à haut débit (HTS). Un grand obstacle est la complexité du processus d'infection, illustrée par de nombreuses étapes et l'élimination complexe de bactéries extracellulaires par lavage entre-deux. Un deuxième obstacle majeur est le long temps requirements, comme la détection de la croissance, normalement effectuée par comptage CFU sur les plaques de culture, est un processus qui prend plus de 3 semaines. Une solution pour remplacer CFU chiffres a été fournie par microscopie à fluorescence automatisée en combinaison avec des bactéries fluorescentes. Cependant, cette solution nécessite un investissement initial de l'équipement qui est hors de portée pour de nombreux laboratoires de recherche. Un simple, à faible coût, et la méthode de HTS pertinente maladie améliorerait considérablement le processus de découverte de médicaments.
Dans cette étude, nous présentons un nouveau système modulaire qui HTS vise à fournir une réponse rapide et hautement évolutive, mais économique, dosage approprié pour déterminer l'activité des composés contre intracellulaire M. tuberculosis. Ce système est composé de trois modules: (i) intracellulaire, (ii) la cytotoxicité, et (iii) des essais in-bouillon. Le résultat final combiné fournit une description complète des propriétés du composé, avec des informations supplémentaires quant au mode d'action potentiel. cette scSystème écologisation a été utilisé dans plusieurs projets avec diverses banques de composés qui ciblent le mode d'action, y compris l'analyse de la synergie des médicaments 9, la stimulation de l' autophagie 10, et l'inhibition de M. tuberculosis -secreted facteur de virulence (non publié). Les composés de mode d'action inconnu ont également été étudiés 11. Une version modifiée de cette méthode a également été adoptée par notre partenaire industriel comme la principale méthode de criblage pour identifier de nouveaux composés contre la tuberculose intracellulaire M. 11.
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Protocol
1. La souche bactérienne et la croissance moyenne
- Faire dextrose albumine et solution de réserve de sel (ADS) en solubilisant 25 g d'albumine de sérum bovin, 10,0 g de dextrose et 4,05 g de chlorure de sodium dans 460 ml d'eau déminéralisée. Filtre-stériliser l'ADS et stocker à 4 ° C.
- Ajouter le bouillon 7H9 en ajoutant 4,7 g de poudre 7H9 et 2 ml de glycerol à 900 mL d'eau purifiée. Autoclaver le bouillon 7H9 à 121 ° C pendant 10 minutes et laisser refroidir à la température ambiante avant de procéder. Faire 7H9ADST en ajoutant 100 ml d'ADS et 0,5 ml de Tween80 à 900 ml de bouillon 7H9. Conserver à 4 ° C.
- Peser 50 mg de sulfate de kanamycine et on dissout dans 1 ml d'eau déminéralisée; la concentration finale est de 50 mg / mL. Filtre-stériliser et stocker à -20 ° C. Ajouter 0,5 ml de kanamycine solution mère par 1 L de 7H9ADST.
NOTE: Ce milieu doit être frais, si les volumes échelle appropriée en fonction de la taille de la culture. - Cultivez M. tuberculosis dans 7H9ADST complété par la kanamycine dans la culture debout. Secouez la culture quotidienne et diluer avant la DO600 atteint 1,0 pour éviter agglomérante.
NOTE: La souche de M. tuberculosis utilisé pour le développement de cette méthode a été H37Rv transformée avec le plasmide pJAK2.A 12. pJAK2.A est un plasmide intégratif sur la base du vecteur pMV361, qui permet l' expression de haut niveau du gène de la luciférase de luciole à partir du promoteur hsp60 et peut être sélectionné en utilisant la kanamycine.
2. THP-1 moyen et entretien
- Ajouter 50 ml de sérum de fœtus bovin inactivé par la chaleur (FBS) et 5 mL de 200 mM de L-glutamine à 500 ml de RPMI 1640 à faire milieu RPMI incomplète (environ 10% de FBS et 2 mM de glutamine).
- Maintenir une culture de cellules THP-1 selon le protocole standard 13. En bref, cultiver les cellules THP-1 dans du milieu RPMI incomplète, tout en maintenant une densité de cellules de 0,2 à 1 million par ml de milieu entre les passages.
3. Intracellulaire à haut débit utilisant le dépistage Luciferase exprimant M. tuberculosis H37Rv
- Mesurer la densité optique d'une suspension de bactéries en croissance active dans un spectrophotomètre à une longueur d'onde de 600 nm. Calculer la densité bactérienne en utilisant le facteur de conversion de 0,1 OD 600 = 3 x 10 7 bactéries par ml.
- Pipeter les bactéries suffisantes pour une multiplicité d'infection (MOI) de 10: 1 dans un nouveau tube de centrifugation. Pellet à 3000 xg pendant 10 min et aspirer le liquide. Ajouter 50 pi de sérum humain à 450 pi de RPMI1640. Échelle du volume à des valeurs appropriées pour l'expérience.
- Pour opsoniser les bactéries, resuspendre le culot à une densité de 1 x 10 8 bactéries par 500 ul de RPMI 1640 contenant 10% de sérum humain. Laisser le mélange à incuber à 37 ° C pendant 30 min. Déterminer la densité de la culture de cellules THP-1 par comptage avec un hémocytomètre et un microsco inversépe.
- Pellet les cellules dans des tubes de centrifugation stériles à 100 xg et 37 ° C pendant 10 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans du RPMI incomplète à une densité de 1 million de cellules par ml. Ajouter phorbol-12-myristate-13-acétate (PMA) à une 40 ng / ml concentration finale.
NOTE: Ce sera appelée mélange de différenciation. - Moissonneuse opsonisé M. tuberculosis avec le mélange de la différenciation de THP-1 à une MOI de 10: 1 et aliquoter le mélange final à 100 ul par puits dans une plaque blanche à 96 puits à fond plat. agiter régulièrement le mélange pour assurer l'uniformité. Permettent la différenciation et de l' infection à dérouler pendant une nuit à 37 ° C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO 2.
- Laver les puits deux fois avec 100 ul de RPMI chacun. Ajouter composés dilués aux concentrations souhaitées dans du RPMI incomplète et incuber pendant 3 jours.
- Aspirer le milieu des puits. Ajouter 50 ul de réactif de dosage de luciférase à chaque puits. Sceller les plaques avec tscellants de plaques adhésives ransparent. Laisser 5 min d'incubation à 22 ° C, puis obtenir une lecture dans un luminomètre à 1 s par puits.
4. Analyse de cytotoxicité L' utilisation d' un acide 3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-diphényltétrazolium (MTT) Dosage 14
- Différencier les cellules THP-1 dans du milieu RPMI additionné de 40 incomplète ng / ml de PMA en clair des plaques à 96 puits. Maintenir une densité cellulaire de 1 million par ml et aliquote de 100 pi par puits. Permettre une différenciation de procéder pendant une nuit à 37 ° C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO 2.
- Aspirer le milieu des puits et les laver deux fois avec du RPMI 1640. Ajouter composés dilués dans du RPMI incomplète dans les puits. Incuber pendant 3 jours.
- Dissoudre 0,5 g de MTT pour constituer une solution mère de 5 mg / mL 100 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Filtre stérile et conserver à -20 ° C, à l'abri de la lumière; il est préférable de faire de cette nouvelle solution.
- 2,5 h BÉFORe la fin de la période d'incubation de 3 jours, ajouter 25 ul de solution de MTT à chaque puits et terminer la période d'incubation.
- Préparer N 50%, N - diméthyl formamide (DMF) en mélangeant 250 ml de DMF avec 250 ml d'eau déminéralisée.
- Préparer du tampon d'extraction MTT comme suit: Peser 100 g de SDS dans une bouteille de 500 ml et ajouter 300 ml de DMF à 50%. Appliquer à feu doux pour permettre au SDS de se dissoudre. Ajouter 10 ml d'acide acétique pur et 12,5 ml de 1 M HCl. Remplir jusqu'à la marque de 500 ml avec 50% de DMF; la composition finale du tampon d'extraction est de 50% de DMF, 20% de SDS, 2,5% d'acide acétique, et de 2,5% 1 M d'acide chlorhydrique.
- A la fin de la période de traitement, ajouter 100 ul de tampon d'extraction (réchauffé à 45 ° C pour dissoudre tous les cristaux) dans chaque puits. Laisser le mélange à incuber pendant une nuit à 37 ° C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO 2. Lire l'absorbance à 570 nm.
NOTE: Le test de cytotoxicité est mieux réalisée en parallèle avec un intra-celluleécran Ular en utilisant même lot et l'âge des cellules THP-1.
5. Dans le bouillon Analyse d'activité à l' aide d' un dosage résazurine 3
- Cultiver M. tuberculosis dans 7H9ADST à la phase mi-log (~ 0,5 à 0,8 DO 600). Diluer la culture avec le 7H9ADST à 0,01 DO 600. Diluer les composés dans 7H9ADST 2 fois les concentrations d'essai et aliquote de 100 uL de chaque composé dilué dans chaque puits.
- Transférer 100 pl de la suspension bactérienne diluée dans chaque puits. Laisser les plaques à incuber à 37 ° C dans un incubateur humidifié pendant 5 jours. Dissoudre 10 mg de résazurine dans 100 mL d'eau désionisée et d'un filtre stérile.
- Ajouter 30 pi de solution de résazurine et de surveiller le changement de couleur après 48 h; la croissance bactérienne est indiquée par une conversion de couleur du bleu au rose.
NOTE: L'analyse quantitative peut également être effectuée soit par la mesure de la fluorescence à 590 nm avec une excitation à 530-560nm ou l'absorbance à 570 nm et 600 nm 15.
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Representative Results
Criblage intracellulaire à haut débit en utilisant M. tuberculosis exprimant le gène de la luciférase
La figure 2A et le tableau 1 contiennent les données brutes recueillies par le luminomètre, exprimés en unités luminescentes relatives (RLU), montrant l'effet d'une concentration croissante de la rifampicine aux antituberculeux de M. tuberculosis dans les cellules THP-1. La figure 2A est un diagramme de dispersion de la luminescence brute mesurée en RLU pour diverses concentrations de rifampicine. Les barres d'erreur indiquent l'erreur type de la moyenne (SEM). La figure 2B montre la réduction pour cent de la luminescence dans des puits traités par rapport aux puits non traités. Les données montrent que la rifampicine est capable de réduire> 99,9% des RLU de tuberculose intracellulaire M. à une concentration de 0,1 ug / mL. Ceci est conforme à la previously publiée MIC entre 0,1 et 0,4 pg / ml 16. Luminescence produit dans chaque puits est une indication de la luciférase totale exprimée par M. tuberculosis et est donc un indicateur de l'état métabolique de M. tuberculosis à l' intérieur du puits. Il est normal que les niveaux luminescentes premières pour varier entre les expériences. A ce titre, une comparaison des données brutes générerait des conclusions peu fiables. Ainsi, les données doivent être normalisées contre un contrôle négatif défini, ce qui serait les échantillons traités avec du DMSO seulement. Les valeurs résultantes peuvent être exprimées comme pour cent de réduction de M. tuberculosis dans les puits (figure 2B).
l'analyse de la cytotoxicité en utilisant l'essai MTT
Le test MTT est un test bien établi pour la cytotoxicité eucaryote. Ce test indique colorimétrique des cellules vivantes par la conversion de MTT (jaune)formazan de couleur pourpre. Cet essai est réalisé sans une infection par M. tuberculosis , car les bactéries sont capables de métaboliser le MTT, ce qui réduit la toxicité observée des composés. Une suggestion commune pour le test MTT consiste à utiliser des supports sans l'indicateur de pH rouge de phénol en raison de l'absorption à 570 nm 17. Cependant, le tampon d'extraction acidifié décrit dans le présent procédé est capable de réduire au minimum les interférences provoquées par le rouge de phénol 17.
La figure 3 illustre la cytotoxicité provoquée par une augmentation de la concentration d'un composé d'essai G1-1H codé. Normalement, la concentration inhibitrice 50% (CI 50) est utilisé pour indiquer le niveau de cytotoxicité. Dans le cas de G1-1H, des concentrations de 10 uM et 3 uM sont nettement en dessous de la concentration IC 50.
analyse de l'activité en bouillon nousING Le dosage de la résazurine
L'essai REMA est couramment utilisé pour l'analyse de la cytotoxicité dans les cellules eucaryotes, mais il peut également être utilisé pour surveiller des bactéries vivantes dans un bouillon 3. Le dosage de la résazurine est un dosage à base redox similaire à l'essai MTT. Il mesure les niveaux de NADPH et de l'activité déshydrogénase NADPH par la conversion de résazurine en résorufine, un fluorophore rouge. Le moyen le plus rapide et facile de déterminer l'efficacité des médicaments est de rechercher la concentration de traitement le plus bas où les puits restent de couleur bleue. La figure 4 montre une partie d'une plaque à 96 puits montrant les effets de diverses concentrations des antibiotiques apramycine ont sur conversion résazurine par M. tuberculosis. La CMI en bouillon a été déterminé comme étant compris entre 2,5 et 5 ug / mL. Ce chiffre est légèrement supérieur à la valeur précédemment publiée de 1,5 pg / ml 18, mais il est encore bien dans le acceptable choix. Dans de nombreux cas, le changement de couleur est plutôt progressive, il est donc difficile de prendre une décision confiance. Dans ces conditions, il est préférable de quantifier le montant réel de la conversion résazurine utilisant l'absorbance ou la fluorescence. En raison des caractéristiques d'absorbance similaires de résazurine et de résorufine, la détermination MIC à l' aide d' absorbance nécessite des mesures à l' aide de deux longueurs d' onde différentes et des calculs complexes 15. Par conséquent, la meilleure méthode consiste à mesurer la fluorescence en utilisant 530- à 560 nm longueur d' onde d'excitation et une longueur d' onde d'émission de 590 nm, comme décrit dans la documentation du fabricant 15.
La figure 4 représente une source potentielle d'incohérence associés à des incubations de plusieurs jours qui pourraient modifier considérablement les résultats du dépistage. En raison de l'humidification incorrecte de l'incubateur 37 ° C utilisée pour cette expérience, les puits sur les bords de la p lates souffert significativement plus evaporation. Tous les 15 puits traités DMSO sont censés être identiques, mais les puits le long des bords gauche et en haut avaient réduit les volumes. Ces puits semblent également avoir différentes couleurs que les autres puits traités DMSO dans le milieu de la plaque. La même incohérence peut également être observée dans des puits traités à l'apramycine 2,5 ug / ml. Dans ce cas, le volume réduit conduirait également à une lecture quantitative par un spectrophotomètre et fluorimètre. L'évaporation devient importante pour toutes les expériences avec des temps d'incubation prolongée, donc il faut prendre soin de garder les incubateurs bien humidifiés pour éviter cette source d'incohérence.
Figure 1: Schéma Méthode. Diagramme illustrant des schémas de dosage pour 3 modules distincts du système de criblage à haut débit. _upload / 55273 / 55273fig1large.jpg » target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Les données représentant d'un Intracellulaire pour examiner l'efficacité de Rifampicine dans l' élimination de la tuberculose M. l' intérieur des cellules THP-1. (A) Graphique de la lecture de la luminescence moyenne (en unités relatives de luminescence) pour chaque traitement (rifampicine) concentration. Les barres d'erreur représentent l'erreur type de la moyenne pour chaque triple. (B) Le graphique de la réduction de pour cent calculée en luminescence provoquée par un traitement de rifampicine, où des valeurs plus élevées indiquent une plus grande efficacité. La concentration inhibitrice 90% (CI 90) , dans ce cas se situe entre 0,01 et 0,1 ug / mL.nk "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: des données représentatives d'un Cytotoxicité (MTT) pour examiner les effets toxiques du composé G1-1H sur Differentiated cellules THP-1. Graphique des valeurs « pour cent des témoins » calculé pour chaque concentration du composé de traitement G1-1H, où des valeurs plus élevées indiquent des cellules THP-1 saines. L'IC 50 dans ce cas se situe entre 10 et 30 uM. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: des données représentatives d'un résazurine test pour examiner l'EEFFICACITE de Apramycine à M. tuberculosis Inhibiting In-bouillon. données qualitatives ne sont recueillies dans ce cas, en raison des limitations de l'équipement du laboratoire de biosécurité de niveau 3 (BSL3). La photo montre une partie d'une plaque à 96 puits contenant M. tuberculosis traités avec soit du DMSO ou des quantités variables d'apramycine. Les puits traités au DMSO ont montré une conversion de résazurine à résorufine, comme indiqué par la conversion de couleur du bleu au rose. Les échantillons traités apramycine ont subi clairement la conversion de couleur inférieure à 5 pg / ml. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| [Rifampicine] | rep1 | REP2 | rep3 | % Réduction | |
| 4 ug / mL | 184 | 190 | 210 | 195 | 100 |
| 1 ug / mL | 244 | 215 | 159 | 206 | 100 |
| 0,1 ug / mL | 1037 | 731 | 976 | 915 | 98 |
| 0,01 ug / mL | 19200 | 24400 | 23919 | 22506 | 54 |
| 0 ug / mL | 39877 | 49655 | 57728 | 49087 | 0 |
Tableau 1: Données brutes à partir du dosage de la luciférase pour la détermination de l'IC 90 intracellulaire de la rifampicine.
| [G1-1H] | Rep 1 A570 | Rep 2 A570 | Rep 3 A570 | moyenne A570 | % Des non traités |
| 30 pM | 0,056 | 0,056 | 0,055 | 0,056 | 7 |
| 10 pM | 0,518 | 0,488 | 0,492 | 0,499 | 62 |
| 3 pM | 0,652 | 0,638 | 0,656 | 0,649 | 80 |
| 0 pM | 0,822 | 0,782 | 0,815 | 0,806 | 100 |
Tableau 2: données brutes de l'essai pour la détermination MTT de la cytotoxicité du composé test G1-1H à Différént concentrations.
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Discussion
L'objectif de cette étude était de créer une méthode simple et rentable en utilisant un modèle HTS d'infection intracellulaire humaine pour M. tuberculosis. La tuberculose est une maladie humaine caractérisée par l'infection des macrophages alvéolaires par M. tuberculosis. En raison de problèmes de biosécurité, la recherche sur des modèles biologiques à la fois la bactérie et les cellules hôtes a été utilisé dans le passé. Cependant, il a été démontré que l'utilisation des bactéries de substitution et les modèles non humains sont des facteurs prédictifs pauvres de succès hit-to-lead dans le développement de médicaments, ce qui indique que le dépistage des drogues est le mieux fait avec des cellules humaines infectées par M. tuberculosis 19, 20, 21, 22.
Dans cette méthode, nous avons avancé et adapté état actuel de l'art des protocoles de dépistage de la lignée cellulaire THP-1-macrophage humaine. Afin d'atteindre hautele débit, nous avons introduit plusieurs améliorations techniques au protocole d'infection. Tout d'abord, nous avons remplacé toutes les étapes de la détermination et les CFU substitués par un système rapporteur basé luciférase. la luciférase de luciole a été choisi en raison du simple essai de point final, la dégradation rapide par les enzymes lysosomes de la cellule hôte, et les besoins en équipement minimal. Cette substitution a effectivement éliminé une période d'incubation de 30 jours, ainsi que les coûts de main-d'œuvre et consommables associés à placage et étapes des colonies de comptage.
Une deuxième amélioration importante nous avons introduit est le traitement par lots et l'infection, ce qui améliore encore le débit et la cohérence entre les puits avec un protocole d'infection plus simple. En combinant la différenciation et étapes infection en une seule étape, nous avons pu raccourcir le protocole d'un jour. En même temps, nous avons pu réduire les trois tours de lavage qui se produiraient normalement entre différenciation et infection, ce qui est une source de perte de cellules THP-1 en raison de détachement possible.
Ce protocole a été mis au point pour le dépistage dans la lignée cellulaire THP-1, ce qui confère plusieurs avantages. THP-1, comme une lignée cellulaire immortalisée, de manière fiable peut être cultivé in vitro pendant plus de 20 passages 23. Ceci est particulièrement important pour les grandes campagnes de dépistage, où il peut être difficile de maintenir suffisamment de cellules pour fournir une configuration à haut débit. En outre, les essais en THP-1 fournit un arrière-plan génétique homogène qui réduit au minimum la variabilité des résultats. Ceci est très bénéfique pour tester les composés qui influencent les réponses des cellules hôtes 10. A titre d'avantage supplémentaire, l' expression du gène dans la lignée cellulaire THP-1 peut être régulée à la baisse par des petits ARN interférents (siRNA) 24. Cela fournit un outil précieux pour les enquêtes en aval dans le mode d'action des composés de succès. Bien que cette méthode a été conçu en utilisant la lignée cellulaire THP-1, ilpeut être facilement adapté pour des cellules primaires humaines, telles que les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC), comme cela a été précédemment montré 10.
Pour imiter le mieux l'interaction réelle entre les macrophages alvéolaires et M. tuberculosis, le protocole de dosage intracellulaire comprend une étape consistant à opsoniser les bactéries. Opsonisation avec les couches de sérum humain M. tuberculosis et facilite l' entrée de la cellule par l' intermédiaire de récepteur de complément 3 (CR3) 25. Bactéries nues sont susceptibles d'entrer plus macrophages par l'intermédiaire du récepteur de lectine 8. Étant donné que le fluide broncho -alvéolaire est connu pour contenir des composants de sérum humain 25, opsonisation, ou l'absence de celui - ci, peut avoir un impact fondamental sur les résultats du dépistage. Cependant, certains peuvent choisir de sauter cette étape afin de simplifier davantage le processus d'infection 16, ou il peut ne pas être possible d'obtenir suffisamment de sérum humain en raison de la taille de la library projeté 11.
Le dosage intracellulaire comprend une étape consistant à éliminer tout le liquide contenant de la matière non fixée dans les puits avant l'addition du réactif de luciférase. Cette étape est conçue pour augmenter le rapport signal sur bruit tout en réduisant le réactif de quantité utilisée par puits. Cependant, l'inclusion de cette étape peut générer des données de faux positifs pour les composés qui tuent THP-1 , mais pas M. tuberculosis, car détaché et lysées THP-1 et de la tuberculose flottante M. seraient supprimés. Par conséquent, le protocole suggéré par le fabricant de l' addition de quantités égales de réactif luciférase (100 ul) à chaque puits doit être suivie afin de doser de M. tuberculosis survie dans des puits contenant des composés cytotoxiques.
Contrairement au système de luciférase luciole, le système bactérien lux ne nécessite pas de réactifs externes pour la génération de signaux 26. cependant,le système luciole est préféré sur le système de lux pour les raisons suivantes: Premièrement, le système bactérien peut être toxique dans 26 mycobactéries. Deuxièmement, un système rapporteur plus complexe (5 gènes lux pour une contre gène de luciole) est plus susceptible de signaler l' inhibition par les composés d'essai. Enfin, les réactifs disponibles dans le commerce pour le dosage de la luciférase de luciole fournissent les conditions nécessaires à la génération d'un signal optimal. D'autre part, le système de la luciférase bactérienne repose sur la production d'ATP et les cofacteurs présents à l'intérieur des bactéries pour la production de signaux. Ceux-ci peuvent varier entre les différents traitements et ne sont pas aussi faciles à contrôler. Par conséquent, l'ajout du réactif de luciférase au système luciole standardise les conditions de réaction et fournit des mesures plus fiables de l'activité luciférase dans tous les traitements.
UFC détermination est longue l'étalon-or pour quantifier la densité bactérienne. Dans un contrat, Bioluminescence, comme la plupart des journalistes, ne sont pas une mesure directe de bactéries. , ULR est plutôt une fonction à la fois UFC et l'état métabolique des bactéries. D' autres ont démontré la relation essentiellement linéaire entre ULR et UFC pour les mycobactéries bioluminescentes dans des conditions spécifiques 5. Dans tous les cas, une réduction significative du signal de dosage de la luciférase, quelle que soit la cause sous - jacente autre que l'inhibition de l' activité réelle-enzyme luciférase serait indiquer une diminution de l'aptitude de M. tuberculosis dans la cellule hôte. Par conséquent, ces composés seraient d'intérêt du point de vue de dépistage des drogues et ne devraient pas être exclus dans le développement de la méthode.
Une alternative au protocole de criblage intracellulaire à base de luciférase est l'approche par microscopie à fluorescence automatisée 11, 27, 28, 29. la luciférasesortie dosage est mesurée par un luminomètre, et les données obtenues est quantitative, alors que la microscopie à fluorescence génère des images qui sont qualitatifs. Cependant, grâce à la programmation informatique intelligente, les images peuvent être analysées pour générer des données quantitatives. De plus, la microscopie à fluorescence permet à plusieurs fluorophores à utiliser en même temps, ce qui est très utile pour recueillir des paramètres de valeur tels que la viabilité des cellules, le nombre de cellules, et le taux réel d'infection. Comme on pouvait prévoir, ces avantages viennent avec quelques revers. L'investissement initial de l'équipement de microscopie à fluorescence automatisé est plusieurs fois supérieur au coût d'un luminomètre ou fluorimètre et est donc hors de portée pour de nombreux laboratoires de recherche. Pour ceux qui ont accès à l'équipement, le traitement des échantillons doit être considéré avant l'acquisition et l'analyse des données d'image. Ces deux étapes affectent l'investissement global de temps avec augmentation de la taille de la bibliothèque. L'inclusion de marqueurs fluorescents supplémentaires dans des cellules hôtes requires fixation, coloration, et les étapes de lavage, ce qui nécessite donc l'intervention de l'utilisateur et des investissements supplémentaires. temps De plus, la collecte de données de microscopie par fluorescence et l'analyse, bien que automatisée, nécessite encore beaucoup plus de temps et de ressources que la lecture simple dosage de la luciférase. Par conséquent, le procédé de criblage intracellulaire à base de luciférase reporter-est plus simple et capable d'un débit plus élevé.
Le procédé de criblage intracellulaire à base de luciférase a une limitation significative par rapport à des procédés de criblage à base de microscope fluorescent. Cela est dû au fait que le dosage de la luciférase ne fournit aucune donnée sur l'état de santé des macrophages hôtes. composés cytotoxiques provoqueraient la mort des macrophages, et peuvent donc être libérées des bactéries vivantes dans le milieu et ne seraient plus contribuer au signal d'essai de luciférase final. En conséquence, des composés cytotoxiques semble entraîner la mort de la tuberculose intracellulaire M. et donc generatea grand nombre de faux positifs. Pour résoudre ce problème, nous avons complété notre méthode avec un dosage de MTT pour évaluer la cytotoxicité des composés sur les macrophages hôtes. Ce module de la méthode de sélection nous donne des informations supplémentaires sur le drugability des composés d'intérêt et permet l'élimination précoce des candidats médicaments moins qu'idéales.
En variante, on peut également utiliser le dosage intracellulaire à base de luciférase avant d'effectuer la microscopie à fluorescence automatisée. Dans les écrans de grandes bibliothèques de composés, cela permet l'évaluation rapide et efficace de l'efficacité du composé dans le modèle d'infection macrophage. En conséquence, la microscopie à fluorescence automatisé peut être réservé pour des études détaillées sur de meilleurs candidats, comme le montre une étude publiée précédemment 11.
Le faible coût et la nature simple du test intracellulaire basée luciférase bénéficie également grandement les chercheurs qui souhaitent tester petitser chimiothèques. Dans l'ensemble, le dosage intracellulaire basé luciférase est avérée être un outil extrêmement flexible pour les laboratoires de recherche de tous les calibres et des projets de dépistage de différentes tailles.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R5886 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Middlebrook 7H9 | Becton, Dickinson and Company | 271210 | |
| Tween80 | Fisher Scientific | T164 | |
| Albumin, Bovine pH7 | Affymetrix | 10857 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | BP350 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | |
| kanamycin sulfate | Fisher Scientific | BP906 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| N,N-Dimethylformamide (DMF) | Fisher Scientific | D131 | |
| 1 M Hydrocholoric acid (HCl) | Fisher Scientific | 351279212 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 351269 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166 | |
| Resazurin | Alfa Aesar | B21187 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229 | |
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB-202 | |
| M. tuberculosis H37Rv | |||
| 96-well flat bottom white plate | Corning | 3917 | |
| 95-well flat bottom clear plate | Corning | 3595 | |
| Transparent plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-0580 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate 3 | |
| Microplate spectrophotometer | Biotek | Epoch | |
| luminometer | Applied Biosystems | Tropix TR717 |
References
- WHO. Global tuberculosis report 2015. , WHO. (2016).
- USFDA. FDA news realease. , Available from: http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm333695.htm (2012).
- Yajko, D. M., et al. Colorimetric method for determining MICs of antimicrobial agents for Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 33, 2324-2327 (1995).
- Khare, G., Kumar, P., Tyagi, A. K. Whole-cell screening-based identification of inhibitors against the intraphagosomal survival of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57, 6372-6377 (2013).
- Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence. J Antimicrob Chemother. 67, 404-414 (2012).
- Mak, P. A., et al. A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Chem Biol. 7, 1190-1197 (2012).
- Pethe, K., et al. A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy. Nat Commun. 1, 57 (2010).
- Hmama, Z., Pena-Diaz, S., Joseph, S., Av-Gay, Y. Immunoevasion and immunosuppression of the macrophage by Mycobacterium tuberculosis. Immunol Rev. 264, 220-232 (2015).
- Ramon-Garcia, S., et al. Synergistic drug combinations for tuberculosis therapy identified by a novel high-throughput screen. Antimicrob Agents Chemother. 55, 3861-3869 (2011).
- Lam, K. K., et al. Nitazoxanide stimulates autophagy and inhibits mTORC1 signaling and intracellular proliferation of Mycobacterium tuberculosis. PLoS Pathog. 8, e1002691 (2012).
- Sorrentino, F., et al. Development of an Intracellular Screen for New Compounds Able To Inhibit Mycobacterium tuberculosis Growth in Human Macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60, 640-645 (2015).
- Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62, 158-165 (2009).
- ATCC. THP-1 (ATCC TIB-202). , Manassas. https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx (2016).
- Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J Immunol Methods. 119, 203-210 (1989).
- Invitrogen. AlamarBlue assay. , Invitrogen. (2008).
- Riss, T. L., et al. Cell Viability Assays. , (2004).
- Meyer, M., et al. In vivo efficacy of apramycin in murine infection models. Antimicrob Agents Chemother. 58, 6938-6941 (2014).
- Ballell, L., et al. Fueling open-source drug discovery: 177 small-molecule leads against tuberculosis. ChemMedChem. 8, 313-321 (2013).
- Grundner, C., Cox, J. S., Alber, T. Protein tyrosine phosphatase PtpA is not required for Mycobacterium tuberculosis growth in mice. FEMS Microbiol Lett. 287, 181-184 (2008).
- Wong, D., Bach, H., Sun, J., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis protein tyrosine phosphatase (PtpA) excludes host vacuolar-H+-ATPase to inhibit phagosome acidification. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 19371-19376 (2011).
- Bach, H., Papavinasasundaram, K. G., Wong, D., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis virulence is mediated by PtpA dephosphorylation of human vacuolar protein sorting 33B. Cell Host Microbe. 3, 316-322 (2008).
- Chanput, W., Peters, V., Wichers, H. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , Springer International Publishing. 147-159 (2015).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. J Vis Exp. , e51960 (2014).
- Ferguson, J. S., Weis, J. J., Martin, J. L., Schlesinger, L. S. Complement protein C3 binding to Mycobacterium tuberculosis is initiated by the classical pathway in human bronchoalveolar lavage fluid. Infect Immun. 72, 2564-2573 (2004).
- Andreu, N., et al. Optimisation of bioluminescent reporters for use with mycobacteria. PLoS One. 5, e10777 (2010).
- Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. , e51114 (2014).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5, e1000645 (2009).
- Pethe, K., et al. Discovery of Q203, a potent clinical candidate for the treatment of tuberculosis. Nat Med. 19, 1157-1160 (2013).
