Summary
Hemos desarrollado un sistema de cribado de alto rendimiento modular para el descubrimiento de nuevos compuestos contra Mycobacterium tuberculosis, la orientación intracelular y en caldo creciente bacterias, así como la citotoxicidad contra la célula huésped de mamífero.
Introduction
Mycobacterium tuberculosis, el agente causal de la tuberculosis (TB), es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. TB-Drogas sensible es una enfermedad tratable que requiere múltiples antibióticos para un período de 6 meses. A pesar de ser una enfermedad tratable, la mortalidad por tuberculosis se estimó en 1,5 millones en 2015 1. En los últimos 10 años, han aumentado las preocupaciones sobre la prevalencia de resistente a los medicamentos M. tuberculosis. Multirresistente TB (MDR-TB) se define como la tuberculosis que es resistente a al menos isoniazida (INH) y la rifampicina (RMP), y la mayoría de las cepas MDR-TB son también resistentes para seleccionar fármacos antituberculosos de segunda línea, lo que limita las opciones de tratamiento . Los efectos de la resistencia a los medicamentos crean un mayor desafío para el tratamiento de pacientes coinfectados con virus de inmunodeficiencia humana (VIH); 400.000 pacientes en todo el mundo murieron de tuberculosis asociada al VIH en 2015 1. Lamentablemente, los Estados Unidos de Alimentos y Medicamentos Administración ha aprobado sólo un nuevo medicamento contra la tuberculosis MDR-TB, bedaquiline, en los últimos 40 años 2. Se necesitan con urgencia los avances en la búsqueda de mejores y más cortas las terapias de TB con el fin de mantenerse a la vanguardia en la lucha contra la tuberculosis y la tuberculosis multirresistente.
Tradicionalmente, las pantallas de drogas TB se llevan a cabo en condiciones de crecimiento in vitro en medio de crecimiento, con lo que se añaden compuestos a un cultivo en crecimiento y de su eficacia en la erradicación de los microorganismos se determinó por recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) en medio sólido. Como recuentos de CFU requieren mucho trabajo, mucho tiempo, y costoso, diversos métodos indirectos se han desarrollado para aliviar este problema. Tales métodos incluyen el ensayo Alamar Blue viabilidad 3, la determinación de la fluorescencia 4 de la proteína verde fluorescente (GFP) o luminiscencia 5 a partir de bacterias de luciferasa que expresan, y la estimación de la adenosina trifosfato total de (ATP) 6, 7.
TB típica se caracteriza por una infección por M. tuberculosis del pulmón, donde las bacterias residen y se replican dentro de las fagosomas de los macrófagos alveolares 8. El simple pantalla fenotípica en caldo puede adaptarse a los patógenos extracelulares; sin embargo, en la perspectiva histórica, golpean compuestos contra M. tuberculosis identificados mediante este método a menudo no logran cumplir con las expectativas durante las etapas de validación aguas abajo en modelos de infección. Proponemos que los medicamentos antituberculosos se realiza mejor en un modelo de infección de la célula huésped intracelular. Sin embargo, los modelos intracelulares poseen muchas barreras tecnológicas y biológicas a screening (HTS) el desarrollo de alto rendimiento. Un gran obstáculo es la complejidad del proceso de infección, ejemplificada por numerosos pasos y el elaborado eliminación de bacterias extracelulares en el medio de lavado. Un segundo obstáculo importante es el largo tiempo de requirements, como la detección de crecimiento, normalmente realizado por CFU contando en placas de cultivo, es un proceso que toma más de 3 semanas en completarse. Una solución para reemplazar los recuentos de CFU ha sido proporcionada por microscopía fluorescente automatizado en combinación con las bacterias fluorescentes. Sin embargo, esta solución requiere una inversión inicial del equipo que está fuera del alcance de muchos laboratorios de investigación. A simple, de bajo costo, y el método HTS-enfermedad pertinente mejoraría en gran medida el proceso de descubrimiento de fármacos.
En este estudio, se presenta un nuevo sistema, HTS modular que está dirigido a proporcionar un rápido y altamente escalable, con todo económica, ensayo adecuado para determinar la actividad de los compuestos contra M. tuberculosis intracelular. Este sistema se compone de tres módulos: (i) intracelular, (ii) la citotoxicidad, y (iii) ensayos in-caldo. El resultado final combinado proporciona una descripción completa de las propiedades del compuesto, con información adicional en cuanto al modo de acción potencial. este SCsistema reening se ha utilizado en varios proyectos con diversas bibliotecas de compuestos que modo de acción objetivo, incluyendo el análisis de la sinergia de drogas 9, la estimulación de la autofagia 10, y la inhibición de M. tuberculosis -secreted factor de virulencia (no publicado). Los compuestos de modo de acción desconocido también se han estudiado 11. Una versión modificada de este método fue también adoptado por nuestro socio industrial como método de cribado primario de identificar nuevos compuestos contra intracelular M. tuberculosis 11.
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Protocol
1. cepa bacteriana y el medio de crecimiento
- Hacer dextrosa albúmina y solución de sal de stock (ADS) por solubilización de 25 g de albúmina de suero bovino, 10,0 g de dextrosa, y 4,05 g de cloruro de sodio en 460 ml de agua desionizada. Filter-esterilizar el ADS y almacenar a 4 ° C.
- Hacer caldo 7H9 mediante la adición de 4,7 g de 7H9 en polvo y 2 ml de glicerol a 900 ml de agua purificada. Autoclave el caldo 7H9 a 121 ° C durante 10 min y permitir que se enfríe a temperatura ambiente antes de proceder. Hacer 7H9ADST mediante la adición de 100 ml de ADS y 0,5 ml de Tween 80 a 900 ml de caldo 7H9. Almacenar a 4 ° C.
- Pesar 50 mg de sulfato de kanamicina y se disuelven en 1 ml de agua desionizada; la concentración final es de 50 mg / mL. Filter-esterilizar y almacenar a -20 ° C. Añadir 0,5 ml de kanamicina solución madre por 1 L de 7H9ADST.
NOTA: Este medio debe hacerse fresco, así escalar los volúmenes apropiadamente de acuerdo con el tamaño cultura. - Crecer M. tuberculosis en 7H9ADST suplementado con kanamicina en pie cultura. Agitar la cultura diaria y diluir antes de que la DO600 alcanza 1,0 para evitar la formación de grumos.
NOTA: La cepa de M. tuberculosis utilizado para el desarrollo de este método fue H37Rv transformó con pJAK2.A plásmido 12. pJAK2.A es un plásmido integrativo basado en el vector pMV361, que permite la expresión de alto nivel del gen de la luciferasa de luciérnaga a partir del promotor hsp60 y se pueden seleccionar utilizando kanamicina.
2. THP-1 Medium y mantenimiento
- Añadir 50 ml de suero inactivado por calor fetal bovino (FBS) y 5 ml de 200 mM de L-glutamina a 500 ml de RPMI 1640 para hacer RPMI medio incompleto (aproximadamente 10% de FBS y glutamina 2 mM).
- Mantener un cultivo de células THP-1 según el protocolo estándar de 13. Brevemente, crecer células THP-1 en medio RPMI incompleto mientras se mantiene una densidad celular de 0,2 a 1 millón por ml de medio de entre passabios.
3. Alto rendimiento Screening intracelular Uso de luciferasa que expresan M. tuberculosis H37Rv
- Medir la densidad óptica de una suspensión bacteriana en crecimiento activo en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 600 nm. Calcular la densidad bacteriana usando el factor de conversión de 0,1 OD 600 = 3 x 10 7 bacterias por ml.
- Pipeta de las bacterias suficientes para una multiplicidad de infección (MOI) de 10: 1 en un nuevo tubo de centrífuga. Se precipitan a 3.000 xg durante 10 min y aspirar el líquido. Añadir 50 l de suero humano a 450 l de RPMI1640. Escala el volumen de apropiarse de los valores para el experimento.
- Para opsonizar las bacterias, resuspender el precipitado a una densidad de 1 x 10 8 bacterias por 500 l de RPMI1640 que contiene suero humano al 10%. Dejar que la mezcla se incuba a 37 ° C durante 30 min. Determinar la densidad de cultivo de células THP-1 mediante el recuento con un hemocitómetro y un microsco invertidaEducación física.
- Sedimentar las células en tubos de centrífuga estériles a 100 xg y 37 ° C durante 10 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en RPMI incompleto a una densidad de 1 millón de células por ml. Añadir forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) a una 40 ng / ml de concentración final.
NOTA: Esto se conoce como la mezcla diferenciación. - Combinar opsonizado M. tuberculosis con THP-1 mezcla diferenciación a una MOI de 10: 1 y alícuota la mezcla final a 100! L por pocillo en una placa blanca de 96 pocillos de fondo plano. Regularmente se agita la mezcla para asegurar la uniformidad. Permitir a la diferenciación y la infección de proceder durante la noche a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5% de CO2.
- Lavar los pocillos dos veces con 100! L de medio RPMI cada uno. Añadir compuestos diluidos a las concentraciones deseadas en RPMI incompleto e incubar durante 3 días.
- Aspirar el medio de los pocillos. Añadir 50 l de reactivo de ensayo de luciferasa a cada pocillo. Sellar las placas con tRansparent selladores de placas adhesivas. Permitir 5 min de incubación a 22 ° C y luego obtener una lectura en un luminómetro en 1 s por pocillo.
4. Análisis de citotoxicidad El uso de un 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) Ensayo 14
- Diferenciar las células THP-1 en medio RPMI incompleto suplementado con 40 ng / ml de PMA en claras placas de 96 pocillos. Mantener una densidad celular de 1 millón por ml y alícuota de 100 l por pocillo. Permitir la diferenciación de proceder durante la noche a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5% de CO2.
- Aspirar el medio de los pocillos y lavar dos veces con RPMI 1640. Añadir compuestos diluidos en medio RPMI incompleto a los pocillos. Incubar durante 3 días.
- Disolver 0,5 g de MTT en 100 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para hacer una solución madre de 5 mg / mL. Filtro estéril y se almacena a -20 ° C, lejos de la luz; lo mejor es hacer que esta solución fresca.
- 2,5 h se acabene el final del período de incubación de 3 días, se añaden 25 l de solución de MTT a cada pocillo y completar el período de incubación.
- Preparar 50% de N, N -dimetil formamida (DMF) mediante la mezcla de 250 ml de DMF con 250 ml de agua desionizada.
- Preparar tampón de extracción MTT como sigue: Pesar 100 g de SDS en una botella de 500 ml y añadir 300 ml de DMF al 50%. Aplicar calor suave para permitir que el SDS se disuelva. Añadir 10 ml de ácido acético puro y 12,5 ml de HCl 1 M. Llenar hasta la marca de 500 ml con 50% de DMF; la composición final de tampón de extracción es de 50% de DMF, 20% de SDS, ácido acético 2,5%, y 2,5% de ácido clorhídrico 1 M.
- Al final del período de tratamiento, añadir 100 l de tampón de extracción (calentado a 45 ° C para disolver cualquier cristales) a cada pocillo. Dejar que la mezcla se incuba durante la noche a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5% de CO2. Leer la absorbancia a 570 nm.
NOTA: El ensayo de citotoxicidad se realiza mejor en paralelo con un intracelularpantalla ular usando el mismo lote y la edad de las células THP-1.
5. En caldo Actividad análisis utilizando un resazurina Ensayo 3
- Crecer M. tuberculosis en 7H9ADST a la fase semilogarítmica (~ 0,5-0,8 OD 600). Diluir el cultivo con la 7H9ADST a 0,01 OD 600. Diluir los compuestos en 7H9ADST a 2x las concentraciones de ensayo y alícuota de 100 l de cada compuesto diluido en cada pocillo.
- Transferir 100 l de la suspensión bacteriana diluida en cada pocillo. Permitir a las placas incubar a 37 ° C en un incubador humidificado durante 5 días. Disolver 10 mg de resazurina en 100 ml de agua desionizada y el filtro estéril.
- Añadir 30 l de solución de resazurina y controlar el cambio de color después de 48 h; el crecimiento bacteriano se indica mediante una conversión de color de azul a rosa.
NOTA: Un análisis cuantitativo también se puede realizar mediante la medición de ya sea la fluorescencia a 590 nm con excitación a 530 hasta 560nm o la absorbancia a 570 nm y 600 nm 15.
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Representative Results
Detección intracelular de alto rendimiento usando M. tuberculosis que expresa el gen de la luciferasa
La figura 2A y en la Tabla 1 contienen los datos brutos recogidos por el luminómetro, expresados en unidades luminiscentes relativas (RLU), que muestra el efecto de una concentración creciente de la rifampicina fármaco TB en M. tuberculosis dentro de las células THP-1. La Figura 2A es un gráfico de dispersión de la luminiscencia medida en bruto en RLU para varias concentraciones de rifampicina. Las barras de error indican el error estándar de la media (SEM). La figura 2B muestra el porcentaje de reducción en la luminiscencia en pocillos tratados en comparación con los pocillos no tratados. Los datos muestran que la rifampicina es capaz de reducir> 99,9% de RLU de intracelular M. tuberculosis a una concentración de 0,1 g / ml. Esto está de acuerdo con el previously publicó MIC entre 0,1 y 0,4 g / ml 16. Luminiscencia producida en cada pocillo es una indicación de la luciferasa total expresado por M. tuberculosis y por lo tanto es un indicador del estado metabólico de M. tuberculosis dentro del pozo. Es normal que los niveles luminiscentes primas para variar entre los experimentos. Como tal, una comparación de los datos en bruto generaría conclusiones fiables. Por lo tanto, los datos deben ser normalizaron frente a un control negativo definido, lo que sería las muestras tratadas sólo con DMSO. Los valores resultantes pueden expresarse como el porcentaje de reducción en M. tuberculosis en los pocillos (Figura 2B).
análisis de citotoxicidad utilizando el ensayo MTT
El ensayo MTT es un ensayo bien establecido para la citotoxicidad eucariota. Este ensayo colorimétrico indica células vivas a través de la conversión de MTT (amarillo) aformazán de color púrpura. Este ensayo se realiza sin una infección por M. tuberculosis debido a que las bacterias son capaces de metabolizar MTT, lo que reduce la toxicidad observada de los compuestos. Una sugerencia común para el ensayo de MTT es el uso de medios de comunicación sin el indicador de pH rojo fenol debido a la absorción a 570 nm 17. Sin embargo, el tampón de extracción acidificado se describe en este método es capaz de minimizar la interferencia causada por el rojo de fenol 17.
La Figura 3 ilustra la citotoxicidad causada por una concentración creciente de una G1-1H codificado compuesto de ensayo. Normalmente, se emplea una concentración inhibitoria del 50% (IC 50) para indicar el nivel de citotoxicidad. En el caso de G1-1H, las concentraciones de 10? M y 3 M son claramente por debajo de la concentración IC 50.
En caldo nos análisis de la actividading el ensayo resazurina
El ensayo de resazurina se utiliza comúnmente para el análisis de la citotoxicidad en células eucariotas, pero también puede ser usado para monitorear bacterias vivas en caldo 3. El ensayo resazurina es un ensayo basado en redox similar al ensayo MTT. Se mide los niveles de NADPH y la actividad deshidrogenasa NADPH a través de la conversión de la resazurina en resorufina, un fluoróforo rojo. La manera más fácil y rápida para determinar la eficacia del fármaco es la búsqueda de la concentración de tratamiento más bajo, donde los pozos se mantienen de color azul. La Figura 4 muestra parte de una placa de 96 pocillos que muestra los efectos diferentes concentraciones de los apramicina antibióticos tienen sobre resazurina conversión por M. tuberculosis. El MIC en caldo se determinó que era entre 2,5 y 5 mg / ml. Esta cifra es ligeramente mayor que el valor publicado previamente de 1,5 g / ml 18, pero aún está dentro de la acceptabgama le. En muchos casos, el cambio de color es más bien gradual, por lo que es difícil hacer una determinación segura. En estas condiciones, es mejor para cuantificar la cantidad real de resazurina conversión utilizando la absorbancia o fluorescencia. Debido a las características de absorbancia similares de resazurina y resorufina, la determinación MIC utilizando la absorbancia requiere mediciones utilizando dos longitudes de onda diferentes y cálculos complejos 15. Por lo tanto, el mejor método es para medir la fluorescencia usando 530- a 560-nm longitudes de onda de excitación y una longitud de onda de emisión de 590-nm, como se describe en la literatura del fabricante 15.
La Figura 4 ilustra una posible fuente de inconsistencia asociado con incubaciones de varios días que podrían alterar drásticamente los resultados del cribado. Debido a humidificación inadecuada de la incubadora a 37 ° utilizado para este experimento, los pocillos en los bordes de la p lates sufrieron significativamente más evaporación. Todos los 15 pozos tratados con DMSO se supone que son idénticos, pero los pocillos a lo largo de los bordes izquierdo y superior habían reducido volúmenes. Estos pozos también parecen tener diferentes colores que los otros pocillos tratados con DMSO en el medio de la placa. La misma inconsistencia también se puede observar en 2,5 g / ml pozos apramicina tratada. En este caso, el volumen reducido también daría lugar a una lectura cuantitativa mediante un espectrofotómetro y fluorímetro. La evaporación se vuelve significativo para todos los experimentos con tiempos de incubación prolongados, por lo que se debe tener cuidado para mantener así incubadoras humidificadas-para evitar esta fuente de inconsistencia.
Figura 1: Método Esquemas. Diagrama que representa los esquemas de ensayo por 3 módulos separados del sistema de cribado de alto rendimiento. _upload / 55273 / 55273fig1large.jpg" target = '_ blank'> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Los datos representativos de una intracelulares para examinar la eficacia de rifampicina en la eliminación de M. tuberculosis dentro de células THP-1. (A) Gráfica de la luminiscencia media lectura (en unidades relativas de luminiscencia) para cada tratamiento de concentración (rifampicina). Las barras de error indican el error estándar de la media para cada triplicado. (B) Gráfica de la reducción porcentual calculada de la luminiscencia causada por un tratamiento de rifampicina, donde los valores más altos indican una mayor eficacia. La concentración inhibitoria 90% (IC 90) en este caso es en algún lugar entre 0,01 y 0,1 g / ml.nk "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: datos representativos de un ensayo de citotoxicidad (MTT) para examinar los efectos tóxicos de G1-1H compuesto sobre diferenciadas THP-1 células. Gráfica de la "porcentaje de control" calculado valores para cada concentración de la G1-1H compuesto de tratamiento, donde los valores más altos indican más saludables células THP-1. El IC 50 en este caso es en algún lugar entre 10 y 30? M. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Los datos representativos de un ensayo para examinar la resazurina EFICACIA de apramicina en la inhibición de M. tuberculosis en-caldo. Sólo los datos cualitativos se recoge en este caso debido a las limitaciones del equipo en el laboratorio de bioseguridad de nivel 3 (BSL3). La foto muestra parte de una placa de 96 pocillos que contenía M. tuberculosis tratados con DMSO o cantidades variables de apramicina. Los pocillos tratados con DMSO exhibió una conversión de la resazurina a resorufina, como se indica por la conversión de color de azul a rosa. Las muestras apramicina tratado se sometieron claramente la conversión de color por debajo de 5 mg / ml. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| [Rifampicina] | Rep1 | Rep2 | rep3 | Reducción% | |
| 4 g / ml | 184 | 190 | 210 | 195 | 100 |
| 1 g / ml | 244 | 215 | 159 | 206 | 100 |
| 0,1 g / ml | 1037 | 731 | 976 | 915 | 98 |
| 0,01 g / ml | 19200 | 24400 | 23919 | 22506 | 54 |
| 0 g / ml | 39877 | 49655 | 57728 | 49087 | 0 |
Tabla 1: Datos sin procesar desde el ensayo de luciferasa para la determinación de la intracelular IC 90 de rifampicina.
| [G1-1H] | Rep 1 A570 | Rep 2 A570 | Rep 3 A570 | A570 media | % De no tratado |
| 30 M | 0,056 | 0,056 | 0,055 | 0,056 | 7 |
| 10 M | 0,518 | 0,488 | 0,492 | 0,499 | 62 |
| 3 M | 0,652 | 0,638 | 0,656 | 0,649 | 80 |
| 0 M | 0,822 | 0,782 | 0,815 | 0,806 | 100 |
Tabla 2: Datos sin procesar a partir del ensayo MTT para la determinación de la citotoxicidad de prueba G1-1H compuesto a DiffereLas concentraciones nt.
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Discussion
El objetivo de este estudio fue la creación de una forma sencilla y rentable método HTS usando un modelo de infección intracelular humano para M. tuberculosis. La tuberculosis es una enfermedad humana caracterizada por la infección de los macrófagos alveolares por M. tuberculosis. Debido a cuestiones de bioseguridad, la investigación con modelos biológicos, tanto de la bacteria y las células huésped se ha utilizado en el pasado. Sin embargo, se ha demostrado que el uso de bacterias portadoras y los modelos no humanos son malos predictores de éxito-golpe-a plomo en el desarrollo de fármacos, lo que indica que la detección de drogas se hace mejor con células humanas infectadas por M. tuberculosis 19, 20, 21, 22.
En este método, hemos avanzado y adaptado protocolos de cribado estado actual de la técnica para el macrófago-como THP-1 línea celular humana. Con el fin de lograr altorendimiento, hemos introducido varias mejoras técnicas en el protocolo de infección. Primero y ante todo, reemplazamos todos los pasos involucrados en la determinación de UFC y los sustituye con un sistema indicador basado en la luciferasa. La luciferasa de luciérnaga fue elegido debido a la simple ensayo de punto final, la rápida degradación por las enzimas lisosómicas célula huésped, y los requisitos de equipo mínimo. Esta sustitución elimina eficazmente un periodo de incubación de 30 días, así como los costes de mano de obra y consumibles asociados con el chapado y colonia de conteo de pasos.
Una segunda mejora importante introdujimos era el procesamiento por lotes y la infección, lo que mejora aún más el rendimiento y la coherencia entre los pocillos con un protocolo de infección más simple. Mediante la combinación de las etapas de diferenciación y de infección en un solo paso, hemos sido capaces de acortar el protocolo por un día. Al mismo tiempo, hemos sido capaces de reducir las tres rondas de lavado que normalmente ocurrir entre la diferenciación y INFECTIOn, que es una fuente de posible pérdida de células THP-1 debido a desprendimiento.
Este protocolo fue desarrollado para la detección de dentro de la línea celular THP-1, que confiere varias ventajas. THP-1, tal como una línea celular inmortalizada, puede ser fiable cultivaron in vitro durante más de 20 pasajes 23. Esto es especialmente importante para las grandes campañas de detección, donde puede ser difícil de mantener suficientes células para suministrar una instalación de alto rendimiento. Además, las pruebas en THP-1 proporciona un fondo genético homogénea que minimiza la variabilidad en los resultados. Esto es muy beneficioso para los compuestos de prueba que influyen en las respuestas de células anfitrionas 10. Como una ventaja añadida, la expresión génica en la línea celular THP-1 puede ser reducido regulado por pequeños RNAs de interferencia (siRNAs) 24. Esto proporciona una herramienta valiosa para investigaciones hacia abajo, en el modo de acción de los compuestos de golpe. Aunque este método fue diseñado usando THP-1 línea celular, sepuede ser fácilmente adaptado para células primarias humanas, tales como células mononucleares de sangre periférica (PBMC), como se ha demostrado previamente 10.
Para imitar mejor la interacción real entre los macrófagos alveolares y M. tuberculosis, el protocolo de ensayo intracelular incluye un paso para opsonizar las bacterias. Opsonización con capas de suero humano M. tuberculosis y facilita la entrada en la célula a través de receptor del complemento 3 (CR3) 25. Bacterias desnudas son más propensos a entrar en los macrófagos a través del receptor de lectina 8. Dado que el fluido broncoalveolar se sabe que contiene componentes de suero humano 25, la opsonización, o la falta de ella, puede tener un impacto fundamental en el resultado de detección. Sin embargo, algunos pueden elegir omitir este paso con el fin de simplificar aún más el proceso de infección 16, o puede que no sea factible obtener suficiente suero humano debido al tamaño de la library se proyectará 11.
El ensayo intracelular incluye una etapa para eliminar todo el líquido que contiene el material no unido de los pocillos antes de la adición del reactivo de luciferasa. Este paso está diseñado para aumentar la relación señal-ruido, mientras que la reducción de la cantidad usada de reactivo por pocillo. Sin embargo, la inclusión de este paso puede generar datos de falsos positivos para los compuestos que matan las células THP-1, pero no M. tuberculosis, ya que separan y se lisaron las células THP-1 y de libre flotación M. tuberculosis serían retirados. Por lo tanto, el protocolo sugerido por el fabricante de la adición de cantidades iguales de reactivo de luciferasa (100! L) a cada pocillo debe ser seguido con el fin de ensayar la supervivencia M. tuberculosis en los pocillos que contienen compuestos citotóxicos.
En contraste con el sistema de la luciferasa de luciérnaga, el sistema lux bacteriana no requiere reactivos externos para la generación de la señal 26. Sin embargo,el sistema de luciérnaga se prefiere sobre el sistema lux por las siguientes razones: En primer lugar, el sistema bacteriano puede ser tóxico en micobacterias 26. En segundo lugar, un sistema indicador más complejo (5 genes de lux frente a 1 gen de luciérnaga) es más susceptible a la señal de inhibición por los compuestos de ensayo. Por último, los reactivos disponibles comercialmente para el ensayo de luciferasa de luciérnaga proporcionan las condiciones necesarias para la generación óptima de la señal. Por otro lado, el sistema de luciferasa bacteriana se basa en la producción de ATP y los cofactores presentes dentro de la bacteria para la generación de la señal. Estos pueden variar entre los diferentes tratamientos y no son tan fáciles de controlar. Por lo tanto, la adición del reactivo de luciferasa para el sistema de luciérnaga estandariza las condiciones de reacción y proporciona mediciones más fiables de la actividad de luciferasa en todos los tratamientos.
determinación CFU ha ser mucho tiempo el estándar de oro para la cuantificación de la densidad bacteriana. En el contrato, Bioluminescence, como la mayoría de los reporteros, no es una medida directa de bacterias. En su lugar, RLU es una función tanto de CFU y el estado metabólico de las bacterias. Otros han demostrado la relación principalmente lineal entre RLU y CFU para micobacterias bioluminiscentes bajo condiciones específicas 5. En cualquier caso, una reducción significativa en la señal de ensayo de luciferasa, sin importar la causa subyacente-distintos de la inhibición real de enzima luciferasa actividad-indicaría una reducción de la tuberculosis aptitud M. dentro de la célula huésped. Por lo tanto, estos compuestos pueden ser de interés desde un punto de vista de detección de drogas y no deben ser excluidos en el desarrollo del método.
Una alternativa al protocolo de cribado intracelular basada en la luciferasa es el fluorescente automatizado basado en microscopía de enfoque 11, 27, 28, 29. la luciferasasalida ensayo se mide mediante un luminómetro, y los datos obtenidos es cuantitativa, mientras que la microscopía fluorescente genera imágenes que son cualitativa. Sin embargo, a través de la programación informática inteligente, las imágenes pueden ser analizadas para generar datos cuantitativos. Además, la microscopía fluorescente permite múltiples fluoróforos para ser utilizados al mismo tiempo, que es muy útil para la recopilación de los parámetros de valor tales como la viabilidad celular, los recuentos de células, y la tasa real de la infección. Como era de prever, estos beneficios vienen con algunos contratiempos. La inversión inicial en equipos de microscopía de fluorescencia automatizado es muchas veces mayor que el costo de un luminómetro o fluorómetro y por lo tanto está fuera del alcance de muchos laboratorios de investigación. Para aquellos que tienen acceso a los equipos, el procesamiento de la muestra debe ser considerada antes de la adquisición de imágenes y análisis de datos. Esas dos medidas afectan a la inversión total de tiempo con el aumento de tamaño de la biblioteca. La inclusión de marcadores fluorescentes adicionales en células huésped RequirES medidas de fijación, tinción y lavado, y necesitan de inversiones intervención del usuario y tiempo adicional. Además, fluorescente recogida de datos de microscopía y análisis, aunque automatizado, todavía requiere significativamente más tiempo y recursos que la simple lectura del ensayo de luciferasa. Por lo tanto, el método de cribado intracelular a base de indicador de luciferasa es más simple y capaz de un mayor rendimiento.
El método de cribado intracelular basada en luciferasa tiene una limitación significativa en comparación con métodos de detección basados en microscopio de fluorescencia. Esto se debe al hecho de que el ensayo de luciferasa no proporciona datos acerca del estado de salud de los macrófagos del huésped. compuestos citotóxicos podrían causar la muerte de los macrófagos, y las bacterias de este modo en vivo pueden ser liberada en el medio y ya no contribuir a la señal de ensayo de luciferasa final. Como resultado, compuestos citotóxicos aparecerían para causar la muerte intracelular de M. tuberculosis y por lo tanto generatea gran número de falsos positivos. Para abordar esta cuestión, hemos complementado nuestro método con un ensayo MTT para evaluar la citotoxicidad de los compuestos en los macrófagos del huésped. Este módulo del método de selección nos da información adicional sobre el drugability de compuestos de interés y permite la eliminación temprana de los candidatos menos que ideales de drogas.
Alternativamente, también se puede usar el ensayo intracelular basada en luciferasa antes de realizar microscopía de fluorescencia automatizado. En las pantallas de grandes bibliotecas de compuestos, esto permite la evaluación rápida y eficiente de la eficacia compuesto en el modelo de infección de los macrófagos. Como resultado, microscopía fluorescente automatizado puede ser reservado para estudios detallados sobre mejores candidatos, como se ilustra por un estudio publicado previamente 11.
El bajo costo y simple naturaleza del ensayo intracelular basada en luciferasa también se beneficia en gran medida a los investigadores que desean probar pequeñaer bibliotecas químicas. En general, el ensayo intracelular basada en luciferasa ha demostrado ser una herramienta muy flexible para los laboratorios de investigación de todos los calibres y para la selección de proyectos de diversos tamaños.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R5886 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Middlebrook 7H9 | Becton, Dickinson and Company | 271210 | |
| Tween80 | Fisher Scientific | T164 | |
| Albumin, Bovine pH7 | Affymetrix | 10857 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | BP350 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | |
| kanamycin sulfate | Fisher Scientific | BP906 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| N,N-Dimethylformamide (DMF) | Fisher Scientific | D131 | |
| 1 M Hydrocholoric acid (HCl) | Fisher Scientific | 351279212 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 351269 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166 | |
| Resazurin | Alfa Aesar | B21187 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229 | |
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB-202 | |
| M. tuberculosis H37Rv | |||
| 96-well flat bottom white plate | Corning | 3917 | |
| 95-well flat bottom clear plate | Corning | 3595 | |
| Transparent plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-0580 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate 3 | |
| Microplate spectrophotometer | Biotek | Epoch | |
| luminometer | Applied Biosystems | Tropix TR717 |
References
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