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चूहे में मल्टीपल स्केलेरोसिस की EAE मॉडल में ऑप्टिक न्युरैटिस और मस्तिष्क में सूजन के bioluminescence और लगभग अवरक्त इमेजिंग

Published: March 1, 2017 doi: 10.3791/55321
Automatic Translation
1, 1
1Institute of Clinical Pharmacology, University Hospital Frankfurt

Summary

हम इन विवो लाइव bioluminescence के लिए और लगभग अवरक्त ऑप्टिक न्युरैटिस और SJL / जम्मू चूहों में एकाधिक काठिन्य के लिए प्रयोगात्मक autoimmune encephalomyelitis (EAE) मॉडल में इन्सेफेलाइटिस की इमेजिंग के लिए एक तकनीक दिखा।

Abstract

प्रायोगिक स्व-प्रतिरक्षित encephalomyelitis (EAE) SJL / जम्मू चूहों में पुनरावर्तन-प्रेषण मल्टीपल स्केलेरोसिस (RR एम्एस) के लिए एक मॉडल है। नैदानिक ​​EAE मोटर समारोह घाटे का वर्णन स्कोर रीढ़ की हड्डी की प्रतिरक्षा की मध्यस्थता सूजन के बुनियादी readouts हैं। हालांकि, स्कोर और शरीर के वजन को मस्तिष्क में सूजन और ऑप्टिक न्युरैटिस का इन विवो मूल्यांकन के लिए अनुमति नहीं है। बाद के बारे में 2/3 एमएस रोगियों के में एक प्रारंभिक और लगातार अभिव्यक्ति है। यहाँ, हम vivo इमेजिंग प्रणाली का उपयोग रहने वाले चूहों में bioluminescence और लगभग अवरक्त रहते इमेजिंग EAE ऑप्टिक न्युरैटिस पैदा आकलन करने के लिए, मस्तिष्क में सूजन, और रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) विघटन के लिए तरीकों को दिखाने के। एक bioluminescent सब्सट्रेट oxidases से सक्रिय मुख्य रूप से ऑप्टिक न्युरैटिस दिखाया। संकेत विशिष्ट था और दवा के प्रभाव और रोग समय पाठ्यक्रम के दृश्य है, जो नैदानिक ​​स्कोर paralleled की अनुमति दी। PEGylated फ्लोरोसेंट नैनोकणों कि vasculatur के भीतर बनेसमय की विस्तारित अवधि के लिए ई बीबीबी अखंडता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया। लगभग अवरक्त इमेजिंग रोग के चरम पर एक बीबीबी रिसाव का पता चला। संकेत आंखों के आसपास मजबूत था। मैट्रिक्स metalloproteinases के लिए एक के पास अवरक्त सब्सट्रेट EAE पैदा सूजन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। ऑटो प्रतिदीप्ति संकेत के साथ दखल, मात्रा का ठहराव के लिए वर्णक्रमीय unmixing की जरूरत पड़ेगी। कुल मिलाकर, bioluminescence इमेजिंग EAE जुड़े ऑप्टिक न्युरैटिस और दवा प्रभाव का आकलन करने के लिए एक विश्वसनीय विधि थी और संकेत विशिष्टता, मजबूती, मात्रा का ठहराव में आसानी, और लागत के मामले में लगभग अवरक्त तकनीक से बेहतर था।

Protocol

1. SJL में EAE प्रेरण / जम्मू चूहे

  1. चूहे
    1. 11 सप्ताह पुराने महिला SJL / जम्मू चूहों का उपयोग करें और उनके बारे में 7 दिनों के लिए प्रयोगात्मक कमरे के लिए अभ्यस्त करने के लिए अनुमति देते हैं। समूह के प्रति N = 10 चूहों का प्रयोग करें।
    2. दवा प्रभाव के आकलन के लिए, लगातार पीने के पानी के माध्यम से या 3 या 5 दिन टीकाकरण के बाद (एन = 10 समूह प्रति) शुरू खाना छर्रों के माध्यम से नियंत्रण समूह के लिए दवा और प्लेसबो प्रशासन। रोग के शिखर के दौरान, दूध या 3% चीनी पानी से लथपथ मकई के गुच्छे के साथ दवा या प्लेसबो प्रशासन।
  2. टीकाकरण सामग्री
    1. पूरा Freund के सहायक (सीएफए, गर्मी की मौत हो माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग H37 रा) और 2 शीशियों (5 माइक्रोग्राम प्रत्येक) के साथ एक पायस में एक EAE प्रेरण किट प्रतिजन से मिलकर (proteolipid प्रोटीन की पेप्टाइड, PLP139-151, 1 मिलीग्राम / एमएल पायस) का प्रयोग करें lyophilized काली खांसी विष के (PTX)।
    2. , यानी <; PTX (2 माइक्रोग्राम / एमएल) 1x फॉस्फेट बफर खारा में (पीबीएस भंग/ Em> पीबीएस के 1.5 एमएल प्रत्येक PTX ट्यूब को जोड़ने, मिश्रण अच्छी तरह से, एक ही pipet टिप से हटाने, और एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में पीबीएस के 1 एमएल में जोड़ने के लिए); अच्छी तरह मिलाएं।
  3. प्रतिरक्षा
    1. पूंछ के आधार पर, 2 भागों में पीएलपी / सीएफए subcutaneously इंजेक्षन प्रत्येक 100 μL, दोनों। गर्दन के पीछे में इंजेक्षन मत करो, क्योंकि ऊपरी पीठ या गर्दन में त्वचा में किसी भी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं सिर और रीढ़ की हड्डी की इमेजिंग परेशान नहीं करेगा।
    2. 2 घंटे के टीकाकरण के बाद और 24 घंटे में दूसरी - PTX intraperitoneally (आईपी) के 100 μL, दो बार माउस प्रति, पहले 1 इंजेक्षन।
    3. चूहों पर नियंत्रण के लिए, पीएलपी के बिना पीएलपी के बिना सीएफए (100 μL के 2 भाग) प्लस PTX इंजेक्षन।
  4. माउस टीकाकरण के बाद से निपटने
    1. चूहों 7 दिन के लिए हर दूसरे दिन तक वजन, और फिर उन्हें दैनिक तौलना।
      नोट: चूहे के बारे में 1 खो - EAE के दौरान शरीर के वजन के 2 जी। गिरावट EAE की शुरुआत के निशान।
    2. दिन 7 समझौते से दैनिक नैदानिक ​​लक्षणों का आकलनमानक स्कोरिंग सिस्टम में आईएनजी (यानी, स्कोर 0: मोटर कार्यों में कोई स्पष्ट परिवर्तन; स्कोर 0.5: पूंछ के बाहर का पक्षाघात, 1: स्कोर का पूरा पूंछ पक्षाघात, स्कोर 1.5: एक या दोनों पिछले पैरों के हल्के केवल पेशियों; स्कोर 2: पिछले पैरों के गंभीर केवल पेशियों; स्कोर 2.5: एक हिंद पैर की पूरी पक्षाघात; स्कोर 3: दोनों पिछले पैरों की पूरी पक्षाघात; स्कोर 3.5:। पिछले पैरों और एक सामने पैर के केवल पेशियों की पूरी पक्षाघात के लिए 3.5 या उच्चतर के स्कोर के साथ चूहों euthanize > 12 ज।
  5. EAE पाठ्यक्रम और इमेजिंग के समय
    1. रोग की शुरुआत में पहली इमेजिंग प्रदर्शन, जब चूहों स्कोर> 1 है, जो 10 दिन के आसपास घटित होगा तक पहुँचने - 12 टीकाकरण के बाद।
    2. 3 दिन - चोटी है, जो 1 या 2 दिन तक पहुँच जाएगा प्रारंभिक लक्षण विकसित होने के बाद और 1 के लिए पिछले जाएगा पर दूसरे इमेजिंग प्रदर्शन।
      नोट: इसके बाद चूहों पूरी तरह से 7 से 10 दिनों के भीतर ठीक हो जाएगी। अंतराल के दौरान इमेजिंग अभी भी संवहनी लीक दिखा सकते हैं,लेकिन सूजन संकेतक नकारात्मक होना चाहिए।

2. Bioluminescent और ऑप्टिक न्युरैटिस और मस्तिष्क में सूजन के पास इन्फ्रारेड इमेजिंग

  1. इमेजिंग प्रणाली की स्थापना
    1. किसी भी उपकरण है कि bioluminescence और लगभग अवरक्त संकेतों के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है के साथ vivo इमेजिंग में प्रदर्शन।
    2. सभी इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान 2.5% isoflurane संज्ञाहरण - 2 के तहत चूहों रखें।
    3. स्थिति एक या एक दूसरे के बगल में दो चूहों तंत्र में बीच गैस की आपूर्ति का उपयोग कर। केंद्र में ऊपरी रीढ़ की स्थिति।
    4. दो चूहों के साथ-साथ, समूह प्रति एक का प्रयोग करें, दवा प्रभाव के मूल्यांकन के जोड़े की तुलना करने के लिए। इस bioluminescent इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है।
    5. काले कपड़े से टीकाकरण की साइट शील्ड और माउस / चूहों की सही स्थिति का आकलन करने के लिए एक तस्वीर और आधारभूत छवि ले। सभी छवियों के लिए कैमरे के लिए एक 6.5 सेमी की दूरी के साथ बी-ध्यान का प्रयोग करें।
  2. इंजेक्शन और bioluminescent सूजन जांच की इमेजिंग
    1. Vivo इमेजिंग प्रणाली सेटिंग्स का उपयोग करें:, पूर्व फिल्टर ब्लॉक महामारी BLI, उन्हें खुले फिल्टर, fstop 1, 8 binning, बी = 6.5 सेमी, विज्ञापन प्रदर्शन 120 S ध्यान केंद्रित; एक आधारभूत छवि ले।
    2. तैयार करने के लिए उपयोग chemiluminescent अभिकर्मक (40 मिलीग्राम / एमएल) के 100 μL आईपी इंजेक्षन। सिरिंज भरने से पहले अच्छी तरह से मिलाएं।
    3. bioluminescence छवियों 5, 10, और इंजेक्शन के बाद 15 मिनट पर कब्जा। bioluminescent चोटी के समय पाठ्यक्रम पशुओं के बीच अलग है।
      नोट: पीक घटित होगा 5 - इंजेक्शन के बाद 10 मिनट; 15 मिनट में गिरावट का संकेत है कि आगे कोई चित्र की आवश्यकता है। अलग-अलग समय पाठ्यक्रमों के कारण मामूली पूर्वाग्रहों को समाप्त करने के लिए नियंत्रण और उपचार समूहों के माउस जोड़े का प्रयोग करें।
    4. प्रयोग के लिए प्रासंगिक विवरण में भरें। एक संवाद बॉक्स का निरीक्षण स्वचालित रूप से पॉप अप; यह इस तरह के माउस तनाव, लिंग, समय बिंदु, जांच इंजेक्शन, समूह, आदि के समय के रूप में जानकारी शामिल हैं। फ़ाइलें सभी में ओ सहेजेंne फ़ोल्डर; वे समय के टैग और सभी विवरण होगा।
  3. इंजेक्शन और बीबीबी अखंडता के लिए लगभग अवरक्त फ्लोरोसेंट नैनोकणों के इमेजिंग
    1. बी-फोकस (6.5 सेमी की दूरी) में लगभग अवरक्त epifluorescence इमेजिंग का प्रयोग करें। PEGylated फ्लोरोसेंट नैनोकणों / उत्तेजना उत्सर्जन Maxima 675/690 एनएम हैं। अलग तरंग दैर्ध्य, Ex640 / Em700 और Ex675 / Em720 पर दो छवियों पर कब्जा; एक 2-एस जोखिम, 8 binning उपयोग करें, और fstop 2. एक आधारभूत छवि ले लो।
    2. पूंछ नस के माध्यम से PEGylated फ्लोरोसेंट अवरक्त नैनोकणों के 70 μL चतुर्थ इंजेक्षन और कल्पना चूहों 3 घंटे और ऊपर सेटिंग्स का उपयोग कर 24 घंटे के इंजेक्शन के बाद। सिरिंज भरने से पहले समाधान अच्छी तरह से मिलाएं।
    3. चूहों पर नियंत्रण है, जो संकेत की विशिष्टता का आकलन करने की जरूरत होगी में 0.9% सोडियम क्लोराइड इंजेक्षन।
  4. इंजेक्शन और एमएमपी गतिविधि के लिए लगभग अवरक्त फ्लोरोसेंट जांच की इमेजिंग
    1. दाढ़ी या सिर बाल हटाना और यूpper रीढ़ क्षेत्र आधारभूत की छवि लेने से पहले सावधानी से एक दिन। त्वचा घायल नहीं किया जाना चाहिए।
    2. बी-फोकस (6.5 सेमी की दूरी) में लगभग अवरक्त epifluorescence इमेजिंग का प्रयोग करें। एमएमपी सक्रिय जांच की उत्तेजना / उत्सर्जन Maxima 680/700 एनएम हैं। अलग तरंग दैर्ध्य, Ex640 / Em700 और Ex675 / Em720 पर दो छवियों पर कब्जा; एक 1-एस जोखिम, 8 binning उपयोग करें, और fstop 2. एक आधारभूत छवि ले लो।
    3. 200 1x पीबीएस के μL तैयार करने के लिए उपयोग समाधान (1x पीबीएस में 20 nmol / 1.5 एमएल) इतना है कि यह 10 चूहों के लिए पर्याप्त होगा की 1.5 एमएल ट्यूब को जोड़ने; सिरिंज भरने से पहले अच्छी तरह से मिलाएं।
      नोट: प्रदान की मात्रा खाते है कि कुछ मात्रा सिरिंज भरने और इंजेक्शन के दौरान खो दिया है में नहीं ले करता है।
    4. इमेजिंग से पहले 24 घंटे के पूंछ नस के माध्यम से जांच चतुर्थ के 150 μL इंजेक्षन। संकेत की विशिष्टता का आकलन करने के लिए ही नियंत्रण पशुओं में पीबीएस इंजेक्षन।
    5. 24 घंटे के इंजेक्शन के बाद कम से कम से कम दो तरंग दैर्ध्य, Ex640 / Em700 और पूर्व 675 / ई पर महामारी फ्लोरिडा चित्र लेनेm720, सेटिंग्स के साथ ऊपर (1-एस जोखिम, ध्यान बी, 8, और fstop 2 binning) की व्याख्या की।
      नोट: दो तरंग दैर्ध्य का उपयोग unspecific संकेत घटा कर वर्णक्रमीय unmixing के लिए अनुमति देता है।

3. छवि विश्लेषण

  1. Bioluminescence विश्लेषण (BLI)
    1. इसे खोलने के लिए सॉफ्टवेयर डबल क्लिक करें।
    2. ऊपरी मेनू पट्टी में, फ़ाइल ब्राउज़र आइकन पर क्लिक करें प्रयोग के फ़ोल्डर की निर्देशिका में जाना है, और उसका चयन करें; इस तालिका में फ़ोल्डर में सभी फ़ाइलों खुल जाएगा।
    3. प्रयोग के लिए प्रासंगिक विवरण दिखा कॉलम विन्यास करें।
    4. गुणवत्ता नियंत्रण के लिए, EAE और / या एक माउस भोले के लक्षणों के बिना एक गैर-प्रत्युत्तर माउस की एक फ़ाइल पर डबल क्लिक करें EAE संकेतों की विशिष्टता जाँच करें।
      ध्यान दें: भोले चूहों और गैर-प्रत्युत्तर चूहों में कम से कम संकेत में कोई संकेत नहीं होना चाहिए।
      1. समर्थक के इंजेक्शन से पहले आधारभूत छवि की जाँच करेंसंकेत की विशिष्टता के आगे नियंत्रण के रूप में प्रत्येक माउस के लिए हो; यह नकारात्मक होना चाहिए।
    5. एक छवि का चयन करने के लिए, पहली EAE माउस की पहली फाइल पर डबल क्लिक करें और bioluminescent तीव्रता (lut बार रेंज) और स्थानीयकरण की जाँच करें। सभी छवियों को एक के बाद एक की जाँच करें। प्रत्येक माउस के लिए सबसे कम तीव्रता के साथ फ़ाइल बंद (यानी, 2 से 3 से बाहर प्रत्येक माउस के लिए छवियों को रखने के लिए)।
    6. छवि समायोजन और निर्यात
      1. मात्रा निर्धारित किया जा करने के लिए पहली फ़ाइल डबल क्लिक करें। एक नई विंडो पॉप अप का निरीक्षण करें। "विकल्प" (ऊपरी मेनू) के तहत प्रत्येक छवि में प्रदर्शित करने के लिए लेबल को अनुकूलित।
      2. सही उपकरण पट्टी में, पर जाएँ "छवि समायोजन।" डिफ़ॉल्ट रूप से, न्यूनतम और अधिकतम तीव्रता "ऑटो" करने के लिए सेट और इंद्रधनुष pseudocolor में प्रदर्शित कर रहे हैं। यदि आवश्यक हो तो सेटिंग में बदलाव करने के लिए "मैनुअल" का चयन करें।
        नोट: उदाहरण के लिए, सभी निर्यात छवियों के समान lut के सलाखों (समान minima और Maxima) हो सकता है आसानी से बराबर हो।न्यूनतम और Maxima के समायोजन मात्रात्मक परिणाम पर कोई असर पड़ता है।
      3. छवि निर्यात, का चयन पीएनजी, निर्देशिका, और एक छवि नाम पर क्लिक करें
    7. हित के क्षेत्रों की मात्रा (आरओआई)
      1. उपकरण पट्टी में "रॉय" उपकरण के लिए जाओ। रॉय विधि (वृत्त, आयताकार, ऑटो, या मुफ्त हाथ) और ROIs की संख्या का चयन करें। रॉय खिड़की छवि विंडो में पॉप अप का निरीक्षण करें।
      2. माउस का प्रयोग, आकार और स्थिति को समायोजित। सभी छवियों के लिए समान रॉय थ्रेसहोल्ड का प्रयोग करें अगर ऑटो रॉय उपकरण का इस्तेमाल किया जाता है। सभी छवियों के लिए समान क्षेत्रों का प्रयोग करें अगर रॉय आकार और स्थिति स्वयं (जैसे, परिपत्र ROIs) परिभाषित कर रहे हैं।
      3. "मापने RO.I. एक नई विंडो पॉप अप का निरीक्षण करें पर क्लिक करें। कॉलम कस्टमाइज़ (जैसे, फ़ाइल नाम, पशु संख्या, समूह, प्रयोग, क्षेत्र, कुल मायने रखता है, औसत मायने रखता है, एसडी मायने रखता है, न्यूनतम और अधिकतम मायने रखता है, क्षेत्र, समय बिंदु, जांच इंजेक्शन, आदि) के समय। सहेजें अनुकूलित सेटिंग्स। जब फिरady, सब (Ctrl + A) का चयन करें, और कॉपी और एक स्प्रेडशीट में मेज पेस्ट करें।
      4. जगह में ROIs के साथ एक PNG के रूप में छवि निर्यात करें। बचाने के लिए और छवि फ़ाइल को बंद करें।
    8. सभी छवि फ़ाइलों मात्रा निर्धारित करने की आवश्यकता है के लिए - प्रक्रिया दोहराएँ (3.1.7 3.1.6 कदम)। स्प्रेडशीट में सभी रॉय quantifications कॉपी करें।
      नोट: यहाँ, परिणाम समूह, समय बिंदु, आदि के द्वारा हल किया जा सकता है और सांख्यिकीय विश्लेषण किया। सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए ROIs में bioluminescence संकेतों के कुल मायने रखता प्रयोग करें।
  2. फ्लोरोसेंट नैनोकणों के लगभग अवरक्त (NIR) विश्लेषण
    1. सॉफ्टवेयर में नियंत्रण का उपयोग, छवि की दहलीज समायोजित करें।
      नोट: यह मात्रात्मक परिणाम पर कोई असर पड़ता है।
    2. दिखने में छवियों पूर्व / एम 675/720 और पूर्व / एम 640/700 पर कब्जा कर लिया संकेत की विशिष्टता का आकलन करने के लिए की तुलना करें।
    3. मात्रात्मक विश्लेषण के लिए छवियों पूर्व / एम 675/720 पर कब्जा कर लिया प्रयोग (उत्तेजना अधिकतम: 680 एनएम)। ROIs, जिसके लिए ऑटो रॉय उपकरण का इस्तेमाल किया जा सकता है परिभाषित करें। ऑटो रॉय सीमा को समायोजित करें और सभी छवियों के लिए इस्तेमाल करते हैं। ROIs में कुल उज्ज्वल दक्षता यों (3.1 कदम देखें)।
  3. प्रोटीज के प्रति संवेदनशील जांच के लगभग अवरक्त (NIR) विश्लेषण
    1. सॉफ्टवेयर नियंत्रण का प्रयोग, छवि की दहलीज समायोजित करें।
      नोट: यह मात्रात्मक परिणाम पर कोई असर पड़ता है। ऑटो प्रतिदीप्ति के वर्णक्रमीय unmixing प्रदर्शन करना। unmixing उपकरण छवि के रहने में कार्यान्वित किया जाता है। ऑटो unmixing विशिष्ट और 675/720 ऑटो फ्लोरोसेंट छवि के रूप में के रूप में पूर्व / एम 640/700 उपयोग करता है।
    2. अमिश्रित छवि का चयन करें और के रूप में ऊपर वर्णित है, ROIs परिभाषित करते हैं। मात्रात्मक और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए ROIs में कुल उज्ज्वल दक्षता का प्रयोग करें।

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Representative Results

ऑप्टिक न्युरैटिस के bioluminescence का टाइम कोर्स

सूजन जांच के bioluminescence संकेत आंखों के आसपास मजबूत था और ऑप्टिक न्युरैटिस साथ EAE चूहों में विशेष रूप से हुई। एक संकेत न गैर EAE चूहों और न ही सूजन जांच के साथ इंजेक्शन नहीं चूहों में हुई। सिग्नल गायब हो गया जब चूहों बरामद किए। इसलिए, संकेत ऑप्टिक न्युरैटिस के लिए विशिष्ट है, और संकेत के शिखर नैदानिक ​​EAE स्कोर के शिखर समानताएं। चित्रा 1 EAE शामिल होने के बाद दिन में 10 और 14 पर imaged SJL / जम्मू चूहों के दो उदाहरण दिखाता है। bioluminescent संकेत 10 दिन पर सबसे ज्यादा था और गायब हो गया जब चूहों को ठीक करने के लिए शुरू कर दिया। नैदानिक ​​स्कोर के समय पाठ्यक्रम bioluminescent संकेत (उदाहरण-1) या पहले (उदाहरण-2) अंक की गिरावट के लापता होने का मिलान नहीं हुआ।


चित्रा 1. ऑप्टिक न्युरैटिस और ईएएस-SJL / जम्मू चूहे में क्लिनिकल स्कोर के समय पाठ्यक्रम। ऑप्टिक न्युरैटिस के bioluminescent छवियों टीकाकरण के बाद अलग अलग समय बिंदुओं पर दो SJL / जम्मू चूहों में इस बीमारी के 1 सेंट भड़क दौरान सूजन जांच (100 μL आईपी) के इंजेक्शन के बाद 10 मिनट पर कब्जा कर लिया गया था। bioluminescent छवियों (बाएं पैनल) 10 और 14 दिनों के टीकाकरण के बाद कब्जा कर लिया गया और इंद्रधनुष pseudocolor फोटोग्राफ ओवरले के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं। लूत सलाखों नीला (कम) लाल (उच्च bioluminescence) को लेकर। स्केल पट्टी: 1 सेमी। सही पैनल ROIs में अलग-अलग कुल bioluminescence की गिनती के बार चार्ट से पता चलता है और नैदानिक ​​EAE स्कोर के समय पाठ्यक्रम (3 छवियों प्रत्येक के एसडी ± मतलब है)। लाल तीर इमेजिंग दिनों निशान। एक बड़ा ve देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा की rsion।

उपचार प्रभावकारिता का आकलन

सूजन जांच

दवा (आर-flurbiprofen 5 मिलीग्राम / किग्रा / डी) 5 प्रभाव चित्रा 2 में दिखाया जाता है। प्रत्येक समूह में bioluminescent छवियों के पांच उदाहरण प्रस्तुत कर रहे हैं। वाहन और इलाज के समूह में स्कोर विषम थे, लेकिन सभी चूहों में, ऑप्टिक तंत्रिका में सूजन दिखा आंखों में bioluminescent संकेत दवा समूह (2A चित्रा) में कम थी। ROIs में कुल bioluminescent गिनती की मात्रा का ठहराव की पुष्टि की महत्वपूर्ण उपचार प्रभावकारिता (चित्रा 2 बी, कुल bioluminescent गिनती के बॉक्स भूखंडों के साथ, अयुगल 2 पूंछ टी परीक्षण, पी <0.05)। इमेजिंग परिणाम उपचारात्मक प्रभाव के साथ सहमतिनैदानिक स्कोर और रीढ़ की हड्डी में EAE की histopathologic अभिव्यक्तियों और ऑप्टिक तंत्रिका 5 के संदर्भ में दवा के एस।

चित्र 2
चित्रा 2. EAE-SJL / जम्मू चूहे Bioluminescent इमेजिंग का उपयोग में दवा की प्रभावकारिता। SJL / जम्मू चूहों टीकाकरण के बाद 5 दिन से वाहन या दवा (आर-flurbiprofen 5 मिलीग्राम / किग्रा / डी) प्राप्त किया। छवियाँ 1 सेंट EAE चरम पर सूजन जांच (100 μL आईपी) के इंजेक्शन के बाद कब्जा कर लिया गया, एन = 10 समूह प्रति। EAE दोनों समूहों में 7/10 में विकसित की है, और EAE गैर responders संकेत के बिना थे। ए) के रहने वाले चूहों में bioluminescence छवियों पर कब्जा 5 - सूजन जांच के 100 μL के आईपी इंजेक्शन के बाद 15 मिनट के इंद्रधनुष pseudocolor फोटोग्राफ ओवरले के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं। Lut के सलाखों नीला (कम) लाल (उच्च तीव्रता) को लेकर। स्केल पट्टी: 1 सेमी। व्यक्तिगत चोटीROIs में कुल bioluminescent गिनती की मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया गया था। ROIs सिर तक ही सीमित थे। पीएलपी इंजेक्शन साइटों काले कपड़े से परिरक्षित किया गया। बी) ROIs में कुल गिनती की मात्रा का ठहराव दिखा बॉक्स भूखंडों। बॉक्स, अन्तःचतुर्थक श्रेणी का प्रतिनिधित्व लाइन मंझला है, और मूंछ अधिकतम करने के लिए कम से कम दिखा। कुल मायने रखता काफी समूहों के बीच (2 तरफा unpaired टी परीक्षण, पी <0.05) मतभेद, दवा प्राप्त चूहों में ऑप्टिक न्युरैटिस और इन्सेफेलाइटिस की कमी को दर्शाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

PEGylated फ्लोरोसेंट नैनोकणों

लगभग अवरक्त नैनोकणों के epifluorescence छवियों आंखों के आसपास और दोनों को उपचार चल मैदान में मस्तिष्क में संवहनी लीक का पता चलापी एस (चित्रा 3 ए, 2 उदाहरण)। कणों बहुत धीरे धीरे सूजन, जहां डाई जम जाता है, बीबीबी अखंडता के एक आकलन के लिए अनुमति की साइटों के अलावा, मध्य अंतरिक्ष को रक्त से वितरित। रिसाव 3 घंटे और 24 घंटे के नैनोकणों के इंजेक्शन के बाद कम से स्पष्ट हो गया था, लेकिन बाद में समय बिंदु पर मजबूत था। गैर EAE चूहों या चूहों में कोई विशेष संकेत नैनोकणों (सही पैनल) के साथ नहीं इंजेक्ट किया था। इसलिए, संकेत विशिष्ट था। ROIs में उज्ज्वल दक्षता (चित्रा 3 बी) के मात्रात्मक विश्लेषण उपचार समूहों (एन = समूह प्रति 3, अयुगल 2 पूंछ टी परीक्षण, पी <0.05) के बीच महत्वपूर्ण अंतर का खुलासा नहीं किया।

चित्र तीन
चित्रा 3. PEGylated फ्लोरोसेंट नैनोकणों के साथ रक्त मस्तिष्क बाधा विघटन का आकलन। SJL / जम्मू चूहों प्राप्त वाहन या दवा (आर-flurbiprofएन टीकाकरण के बाद 5 दिन से 5 मिलीग्राम / किग्रा / डी)। छवियाँ 3 घंटे और 24 घंटे के निकट अवरक्त लेबल नैनोकणों के इंजेक्शन के बाद (70 μL iv) 1 EAE चोटी के दौरान, एन = समूह प्रति 3 कब्जा कर लिया गया। EAE गैर responders संकेत के बिना थे। ऑटो रॉय उपकरण उज्ज्वल दक्षता की मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया गया था। ROIs सिर तक ही सीमित थे। पीएलपी इंजेक्शन साइटों परिरक्षित किया गया। ए) के रहने वाले चूहों के अनुकरणीय epifluorescence छवियों पर कब्जा कर लिया 3 घंटे और 24 घंटे के नैनोकणों के इंजेक्शन के बाद। EAE के बिना या नैनोकणों के इंजेक्शन के बिना चूहों की छवियाँ इमेजिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया। स्केल पट्टी: 1 सेमी। Lut के सलाखों के गहरे लाल (कम) पीले (उच्च तीव्रता) को लेकर। बी) ROIs में उज्ज्वल दक्षता की मात्रा का ठहराव (दिखा बार चार्ट ± एसडी मतलब है)। उपचार समूहों में काफी (2 तरफा unpaired टी परीक्षण) अलग नहीं किया था। वी के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण iew।

मैट्रिक्स metalloproteinase के प्रति संवेदनशील जांच

ऑटो प्रतिदीप्ति घटाने के बाद प्रोटीज-सक्रिय एमएमपी जांच की छवियों को मस्तिष्क और EAE चूहों में रीढ़ की हड्डी (चित्रा -4 ए, समूह प्रति 4 चूहों के उदाहरण) में सूजन का पता चला। जांच के साथ इंजेक्शन नहीं चूहों में कोई संकेत नहीं था, और एक कमजोर संकेत नैदानिक ​​लक्षण (गैर प्रत्युत्तर) के बिना एक EAE माउस में हुई। चित्रा 4 में छवियां पूर्व / एम 675/720 में छवि से घटाया पूर्व / एम 640/700 में संकेत दिखा। उपचार के बीच मतभेद केवल वर्णक्रमीय unmixing के बाद ऑटो ROIs में उज्ज्वल दक्षता के मात्रात्मक विश्लेषण के बाद पता चला रहे थे (चित्रा 4 बी, अयुगल 2 पूंछ टी परीक्षण, एन = 6 और 4, पी <0.05)।

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चित्रा 4. एमएमपी संवेदनशील इमेजिंग जांच लगभग अवरक्त साथ metalloproteinase गतिविधि का आकलन। SJL / जम्मू चूहों टीकाकरण के बाद 5 दिन से वाहन या दवा (आर-flurbiprofen 5 मिलीग्राम / किग्रा / डी) प्राप्त किया। छवियाँ 1 EAE चरम पर (150 μL iv) जांच के इंजेक्शन के बाद 24 घंटे कब्जा कर लिया गया, एन = 6 और 4 पीएलपी इंजेक्शन साइटों परिरक्षित किया गया। EAE गैर responders और एमएमपी जांच इंजेक्शन के बिना चूहों नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया। प्रत्येक 2 छवियों पूर्व / एम 640/700 एनएम (विशिष्ट संकेत) और 675/720 एनएम (ऑटो प्रतिदीप्ति) पर कब्जा कर लिया गया। वर्णक्रमीय unmixing उपकरण का उपयोग, ऑटो प्रतिदीप्ति घटाया गया था और बाद में, ऑटो उपकरण रॉय विशिष्ट एमएमपी गतिविधि की साइटों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। कुल उज्ज्वल दक्षता मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया गया था। ए) के रहने वाले चूहों में अनुकरणीय epifluorescence छवियों जांच इंजेक्शन के बाद 24 घंटे के लिए कब्जा कर लिया। छवियों वर्णक्रमीय unmixing (UMX) का परिणाम है। स्केल पट्टी: 1 सेमी। LUT बारगहरे लाल (कम) पीले (उच्च तीव्रता) से रेंज। बी) ROIs में कुल उज्ज्वल दक्षता की मात्रा का ठहराव दिखा बॉक्स भूखंडों। बॉक्स, अन्तःचतुर्थक श्रेणी का प्रतिनिधित्व लाइन मंझला है, और मूंछ अधिकतम करने के लिए कम से कम दिखा। तारांकित (2 तरफा unpaired टी परीक्षण, पी <0.05) समूह के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर को दर्शाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

वर्तमान वीडियो bioluminescence और SJL / जम्मू चूहों में EAE के vivo इमेजिंग में लगभग अवरक्त प्रतिदीप्ति के लिए तकनीक का पता चलता है। हम जानते हैं कि bioluminescence एक सूजन के प्रति संवेदनशील जांच का उपयोग मुख्य रूप से इमेजिंग ऑप्टिक न्युरैटिस पता चलता है, और मात्रा का ठहराव EAE गंभीरता के नैदानिक ​​मूल्यांकन और दवा के प्रभाव के साथ सहमत हैं दिखा। हालांकि, bioluminescence इमेजिंग विधि क्योंकि संकेत रीढ़ द्वारा अवशोषित कर लेता है काठ का रीढ़ की हड्डी है, जो EAE अभिव्यक्ति 17 के एक प्राथमिक साइट है की सूजन का पता लगाने की संभावना नहीं पा रहा था।

लगभग अवरक्त इमेजिंग अधिक संवेदनशील है, लेकिन ऑटो प्रतिदीप्ति, जो bioluminescence के साथ घटित नहीं करता है के साथ उच्च हस्तक्षेप की कीमत पर। (- 2 एस 1) BLI की तुलना में (2 - 5 मिनट) है, जो तेजी से बदलते संकेत तीव्रता के साथ समय श्रृंखला के लिए NIR पसंदीदा तरीका बनाता NIR के जोखिम समय बहुत कम है।

साथ महत्वपूर्ण कदमप्रोटोकॉल और तकनीक की सीमाओं में

टीकाकरण साइट के संकेतों EAE में रीढ़ की हड्डी इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप है, लेकिन इस पूंछ, जो सिफारिश इंजेक्शन साइटों (गर्दन और पूंछ के आधार) को नीचा नहीं था के आधार पर दोनों इंजेक्शन साइटों लगाने के द्वारा धोखा दिया जा सकता है। फिर भी, यह काले कपड़े से इंजेक्शन साइटों को बचाने के लिए आवश्यक है।

bioluminescence इमेजिंग के लिए, यह छवियों का एक समय श्रृंखला पर कब्जा करने के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि कैनेटीक्स पशुओं के बीच मतभेद है। कैनेटीक्स की वजह से पूर्वाग्रहों से बचने के लिए, नियंत्रण (जैसे, वाहन या जंगली प्रकार) और Verum (जैसे, दवा या ट्रांसजेनिक) चूहों के जोड़े की इमेजिंग फायदेमंद है। निर्माता के अनुसार, सिग्नल 30 मिनट के लिए स्थिर होना चाहिए। हालांकि, EAE में, हम तेजी से और अधिक क्षणिक कैनेटीक्स मनाया, 5 में होने वाली चोटियों के साथ - 10 मिनट और 15 मिनट पर एक पर्याप्त गिरावट आई है।

लगभग अवरक्त इमेजिंग के लिए, manufacturer एक विशेष जांच के लिए पूर्व / एम सेटिंग की सिफारिश की। फिर भी, यह शुरू में एक फिल्टर श्रृंखला चलाने के लिए उपयोगी था और हमेशा दो / उत्तेजना उत्सर्जन संयोजन में कम से कम छवियों पर कब्जा करने के लिए है, जो बारीकी से सूचना पूर्व / एम Maxima मैच और बाद में unspecific संकेतों के वर्णक्रमीय unmixing के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

यह सफेद चूहों, SJL / जम्मू की तरह उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि प्रकाश और प्रतिदीप्ति अत्यधिक काले फर द्वारा अवशोषित कर रहे है। काले चूहों सावधानी से सिर पर बाल काटे जा करने के लिए और इमेजिंग से पहले एक दिन वापस की जरूरत है। त्वचा के घावों, बचा जाना चाहिए, क्योंकि वे भड़काऊ धब्बे के रूप में दिखाई देगा और मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी की इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप। NIR इमेजिंग के लिए, निर्माता सभी चूहों, यहां तक ​​कि सफेद चूहों के बाल उड़ाना की सिफारिश की। यहाँ तक कि दाढ़ी बनाने के बाद, काले चूहों में सिर और पीठ परिणाम सफेद चूहों (नहीं दिखाया गया है) के साथ की तुलना में कम कायल थे। C57BL6 चूहों में प्राथमिक-प्रगतिशील EAE मॉडल के लिए, सफेद C57BL6 चूहों, जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, एक बदल हो सकता हैदेशी। गंजा, असुरक्षित SKH1 चूहों, नहीं लगभग अवरक्त इमेजिंग के लिए उपयोगी है, लेकिन EAE रहे हैं, क्योंकि इन चूहों एक सूरजमुखी मनुष्य आनुवंशिक पृष्ठभूमि है और मज़बूती से EAE विकसित नहीं है (अधिकतम स्कोर: 0.5 - 1)। इन चूहों में सूजन जांच का उपयोग bioluminescent इमेजिंग त्वचा में कई भड़काऊ स्पॉट () नहीं दिखाया जहां बालों के रोम खो रहे हैं पता चला।

प्रोटीज गतिविधि के NIR इमेजिंग मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में सूजन का पता चला है, लेकिन संकेत है, ऑटो प्रतिदीप्ति द्वारा आरोपित किए गए मात्रात्मक विश्लेषण से पहले वर्णक्रमीय unmixing की जरूरत पड़ेगी। इसलिए, NIR इमेजिंग bioluminescence इमेजिंग से कम मजबूत था और अधिक महंगा था। हालांकि, प्रोटीज सक्रिय जांच के उपयोग दवाओं है कि विशेष रूप से मैट्रिक्स metalloproteinases लक्ष्य के आकलन के लिए उपयोगी हो सकता है।

फायदे और नुकसान

विभिन्न इमेजिंग तकनीक के पूरक हैं और विशिष्ट सवालों को संबोधित। biolumin के फायदेescent इमेजिंग सामर्थ्य हैं (लगभग 20 यूरो / माउस); ऑटो bioluminescence, जो संकेत के साथ हस्तक्षेप करेगा की कमी; उच्च विशिष्टता; सुविधाजनक आईपी इंजेक्शन और छवि विश्लेषण; और मजबूती और विश्वसनीयता। नुकसान लंबे समय जोखिम समय और संकेत अवशोषण काले फर और हड्डी से कर रहे हैं।

NIR के लाभ NIR लेबल जांच, कस्टम NIR लेबलिंग, कम जोखिम के समय, और उच्च संवेदनशीलता की आसानी के व्यापक उपलब्धता रहे हैं। (- 100 यूरो / माउस 50), फर से अवशोषण, ऑटो प्रतिदीप्ति के साथ मजबूत हस्तक्षेप, और वर्णक्रमीय unmixing और विश्लेषण से पहले छवि प्रसंस्करण के लिए आवश्यकता के नुकसान उच्च लागत रहे हैं।

जांच की एक संख्या है कि सूजन की साइटों का पता लगाने, क्योंकि वे समर्थक भड़काऊ एंजाइमों कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं की घुसपैठ के कारण सूजन (जैसे, पराक्सिडेजों या metalloproteinases) के स्थलों पर upregulated कर रहे हैं द्वारा सक्रिय कर रहे हैं उपलब्ध हैं। इन जांच से कुछ भी Cance का पता लगाने जाएगारुपये ट्यूमर microenvironment या ट्यूमर अपने आप में एंजाइमों की रिहाई (जैसे, एमएमपी) में प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ का प्रदर्शन है। जांच केशिका रिसाव के कारण है कि ऊतक में जमा बीबीबी में अवरोधों का पता लगाने जाएगा, लेकिन यह भी सूजन और कैंसर के अन्य स्थलों पर।

मौजूदा / वैकल्पिक तरीके के लिए सम्मान के साथ तकनीक का महत्व

"इमेजिंग प्लस नैदानिक ​​घावों" के संयोजन बेहतर था करने के लिए रोग की स्थिति के आकलन और दवा प्रभाव का पता लगाने के लिए "केवल स्कोर"। आंखों के आसपास bioluminescence संकेत भी पिछले histopathological ऑप्टिक तंत्रिका 5 में माइलिन विनाश और प्रतिरक्षा सेल पैठ दिखाने के अध्ययन के साथ सहमत हैं। के बारे में एमएस रोगियों का 2/3 ऑप्टिक न्युरैटिस के प्रकरणों का विकास। अब तक, वहाँ कोई विश्वसनीय, गैर इनवेसिव प्रसार चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) और सेशन को छोड़कर रहने वाले चूहों में ऑप्टिक न्युरैटिस यों तो तरीके हैंराजनैतिक जुटना टोमोग्राफी (अक्टूबर) है, जो तकनीकी रूप से 18 की मांग कर रहे हैं। अक्टूबर में एक विधि EAE दौरान रेटिना परिवर्तन और शोष दिखाने के रूप में EAE में पेश किया गया है, ऑप्टिक तंत्रिका 19 में एक autoimmune प्रतिक्रिया का सुझाव दे।

विधि इस पांडुलिपि में वर्णित की तुलना में, अक्टूबर, क्योंकि यह गहरी संज्ञाहरण की आवश्यकता है, चूहों के लिए एक उच्च तनाव है। Readout ऑप्टिक तंत्रिका 19 की एक प्रत्यक्ष दृश्य नहीं है।

फ्लोरोसेंट नैनोकणों के निकट अवरक्त इमेजिंग बीबीबी, जो EAE और एमएस की एक और बानगी है के विघटन कल्पना करने के लिए उपयोगी था। एमआरआई 20, 21 के अलावा, वहाँ बीबीबी अखंडता के vivo निगरानी के लिए कोई गैर इनवेसिव विधि है। यह काफी उपयोगी हो सकता है क्योंकि प्रयोगात्मक दवाओं और पादप दवाओं विशेष रूप से बाधा 22 कस द्वारा कार्य करेगा, 23 है, जो सामान्य रूप से सीएनएस 24 में अत्यधिक लिम्फोसाइट भर्ती hinders। बीबीबी के माध्यम से ल्युकोसैट लगाव या स्थानांतरगमन की रोकथाम और इसके leakiness को कम करने एमएस उपचार 25, और nanoparticle इमेजिंग में एक प्रभावी रणनीति उम्मीदवार दवाओं की प्रभावकारिता का आकलन करने में मदद मिल सकती है। अब तक, कणों महंगे हैं। Intravital माइक्रोस्कोपी बीबीबी अखंडता 26 कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया एक और तकनीक है, लेकिन यह सामान्य रूप से craniotomy की वजह से लंबे समय से स्थायी, गहरी संज्ञाहरण (जैसे, ketamine और xylazine के साथ) की आवश्यकता है और फिर से जगाना चूहों की अनुमति नहीं देता, इसलिए रोकने समय पाठ्यक्रम का विश्लेषण करती है। हालांकि, intravital माइक्रोस्कोपी subcellular स्तर है, जो vivo इमेजिंग के साथ प्राप्त नहीं है के लिए सेलुलर पर उच्च संकल्प छवियों प्रदान करता है।

भविष्य के अनुप्रयोगों या दिशा-निर्देश तकनीक माहिर के बाद

सारांश में, इमेजिंग तेवर्तमान वीडियो की मदद में प्रस्तुत chniques रोग के अलग-अलग पाठ्यक्रमों का आकलन करने और दवा के प्रभाव है, जो अकेले नैदानिक ​​स्कोर से पता चला नहीं भाग में थे पर नजर रखने के लिए। तकनीक रिप्लेसमेंट, कमी और पशु प्रयोगों में शोधन के 3 'आर' के सिद्धांतों के साथ सहमत हैं और उपयोगी दवा अनुसंधान के क्षेत्र में उपकरण जोड़ने पर कर रहे हैं।

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Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Acknowledgments

इस शोध ड्यूश Forschungsgemeinschaft (CRC1039 ए 3) और अनुसंधान के वित्तपोषण कार्यक्रम हेसन, अनुसंधान ट्रांसलेशनल मेडिसिन और औषध TMP के लिए केंद्र के राज्य के 'Landesoffensive सूर Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz "(LOEWE) और बाकी क्रोनर-फ्रेसेनियस फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया (EKFS), अनुसंधान प्रशिक्षण समूह ट्रांसलेशनल अनुसंधान नवाचार - फार्मा (यात्रा)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AngioSpark-680 Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA NEV10149 Imaging probe, pegylated nanoparticles, useful for imaging of blood brain barrier integrity
MMP-sense 680 Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA NEV10126 Imaging probe, activatable by matrix metalloproteinases, useful for imaging of inflammation
XenoLight RediJect Inflammation Probe Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA 760535 Imaging probe, activatable by oxidases, useful for imaging of inflammation
PLP139-151/CFA emulsion  Hooke Labs, St Lawrence, MA EK-0123 EAE induction kit
Pertussis Toxin Hooke Labs, St Lawrence, MA EK-0123 EAE induction kit
IVIS Lumina Spectrum Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA Bioluminescence and Infrared Imaging System
LivingImage 4.5 software  Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA CLS136334 IVIS analysis software
Isoflurane Abbott Labs, Illinois, USA 26675-46-7 Anaesthetic

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चिकित्सा अंक 121 स्व-प्रतिरक्षित encephalomyelitis एकाधिक काठिन्य ऑप्टिक न्युरैटिस ऑप्टिकल रहते इमेजिंग bioluminescence अवरक्त सूजन
चूहे में मल्टीपल स्केलेरोसिस की EAE मॉडल में ऑप्टिक न्युरैटिस और मस्तिष्क में सूजन के bioluminescence और लगभग अवरक्त इमेजिंग
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Schmitz, K., Tegeder, I.… More

Schmitz, K., Tegeder, I. Bioluminescence and Near-infrared Imaging of Optic Neuritis and Brain Inflammation in the EAE Model of Multiple Sclerosis in Mice. J. Vis. Exp. (121), e55321, doi:10.3791/55321 (2017).

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