Summary
Vi visar en teknik för in vivo levande bioluminiscens och nära infraröda avbildning av optikusneurit och encefalit i experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) modell för multipel skleros i SJL / J-möss.
Abstract
Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) i SJL / J-möss är en modell för relapserande remitterande multipel skleros (RRMS). Kliniska EAE-poäng som beskriver motorfunktions underskott är basiska utläsningar av immunmedierad inflammation av ryggmärgen. Dock inte poäng och kroppsvikt inte möjliggöra en in vivo bedömning av hjärninflammation och optikusneurit. Det senare är en tidig och frekvent manifestation i omkring 2/3 av MS-patienter. Här visar vi metoder för mareld och nära infraröda levande avbildning att bedöma EAE framkallade optikusneurit, hjärninflammation, och blod-hjärnbarriären (BBB) störningar i levande möss med användning av ett in vivo imaging systemet. En självlysande substrat aktiveras av oxidaser visade främst optikusneurit. Signalen var specifik och tillät visualisering av läkemedelseffekter och sjukdomar tidsförlopp, som parallellt de kliniska poängen. Pegylerade fluorescerande nanopartiklar som återstod i vasculature under längre tidsperioder har använts för att bedöma BBB integritet. Nära infraröda imaging visade en BBB läcka på toppen av sjukdomen. Signalen var starkast runt ögonen. En nära-infraröd substrat för matrismetalloproteinaser användes för att bedöma EAE-framkallade inflammation. Auto-fluorescens störde signalen kräver spektral unmixing för kvantifiering. Sammantaget mareld avbildning var en tillförlitlig metod för att bedöma EAE-associerad optikusneurit och medicinering effekter och var överlägsen de nära infraröda tekniker när det gäller signal specificitet, robusthet, enkel kvantifiering och kostnad.
Protocol
1. EAE-induktion i SJL / J möss
- Möss
- Använd 11 veckor gamla kvinnliga SJL / J-möss och låta dem vänja till försöks rum för cirka 7 dagar. Använd n = 10 möss per grupp.
- För bedömning av medicinering effekter, administrera läkemedlet och placebo för kontrollgruppen kontinuerligt via dricksvattnet eller via mat pellets börjar 3 eller 5 dagar efter immunisering (n = 10 per grupp). Under toppen av sjukdomen, administrera läkemedel eller placebo med mjölk eller 3% socker vattniga majsflingor.
- immunisering material
- Använd en EAE-induktion kit bestående av antigen (peptid av proteolipidprotein, PLP139-151, 1 mg / ml emulsion) i en emulsion med komplett Freunds adjuvans (CFA, värmeavdödade Mycobacterium tuberculosis H37 Ra) och 2 flaskor (5 ug vardera) av lyofiliserat pertussistoxin (PTX).
- Upplösa PTX (2 | ig / ml) i 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS; dvs., </ Em> Tillsätt 1,5 ml PBS till varje PTX rör, blanda väl, ta bort med samma pipettspetsen, och lägga till 1 ml PBS i en 50-ml rör); blanda väl.
- Immunisering
- Injicera PLP / CFA subkutant i 2 portioner, varje 100 mikroliter, både vid basen av svansen. Injicera inte på baksidan av halsen, eftersom eventuella immunreaktioner i huden i den övre ryggen eller nacken kommer att störa avbildning av huvudet och ryggmärgen.
- Injicera 100 mikroliter av PTX intraperitonealt (ip), två gånger per mus, den första 1-2 h efter immunisering och den andra vid 24 h.
- För kontrollmössen, injicera CFA utan PLP (2 portioner 100 mikroliter) plus PTX utan PLP.
- Mus hantering efter immunisering
- Väg mössen varannan dag fram till dag 7, och sedan väga dem dagligen.
OBS: Möss förlorar omkring 1 - 2 g kroppsvikt under EAE. Nedgången markerar början av EAE. - Utvärdera kliniska symptom dagligen från dag 7 Accordning till den vanliga poängsystem (dvs Poäng 0: inga uppenbara förändringar i motoriska funktioner, poäng 0,5: distal paralys av svansen, poäng 1: komplett svansförlamning, poäng 1,5: mild pares av en eller båda bakbenen, poäng 2: svår pares av bakbenen, poäng 2,5: fullständig förlamning av ett bakben, poäng 3: fullständig förlamning av båda bakbenen, poäng 3,5. fullständig förlamning av bakbenen och pares av ett framben Euthanize möss med massor av 3,5 eller högre för > 12 h.
- Väg mössen varannan dag fram till dag 7, och sedan väga dem dagligen.
- EAE kurs och tid för avbildning
- Utför första avbildning i början av sjukdomen, när mössen når poäng> 1, som kommer att uppstå runt dag 10-12 efter immunisering.
- Utför andra avbildning på topp, vilket kommer att nås 1 eller 2 dagar efter de första symtomen utvecklas och kommer att pågå i 1 - 3 dagar.
OBS: Därefter kommer mössen återhämta sig helt inom 7 till 10 dagar. Imaging under pauserna kan fortfarande visa vaskulära läckor,men inflammation indikatorer bör vara negativ.
2. Bioluminescent och nära infraröda avbildning av optikusneurit och hjärninflammation
- Inställning av avbildningssystemet
- Utför in vivo imaging med all utrustning som möjliggör analys av mareld och nära infraröda signaler.
- Håll möss under 2-2,5% isofluran anestesi under alla avbildningsförfaranden.
- Position en eller två möss bredvid varandra i apparaten med hjälp av mellan gasleveranserna. Placera den övre ryggraden i centrum.
- Använd två möss samtidigt, en per grupp, för utvärdering av läkemedelseffekter att jämföra par. Detta är viktigt för självlysande avbildning.
- Skydda platsen för immunisering med svart tyg och ta ett fotografi och baslinje bilden för att bedöma den korrekta positioneringen av mus / möss. Använd B-fokus med en 6,5-cm avstånd till kameran för alla bilder.
- Injektion och avbildning av självlysande inflammation sond
- Använd vivo systeminställningar avbildning i: Epi-BLI, Em filtrera öppen, Ex filterblocket, fStop 1 binning 8, fokus B = 6,5 cm, ad exponering 120 s; ta en baslinje bild.
- Injicera 100 pl ip av den färdiganvända kemiluminiscerande reagens (40 mg / ml). Blanda väl innan du fyller sprutan.
- Fånga bioluminescence bilder 5, 10 och 15 min efter injektion. Tidsförloppet av den självlysande topp skiljer sig mellan djur.
OBS! Topp kommer att ske 5-10 minuter efter injektion; en nedgång på 15 minuter visar att inga ytterligare bilder behövs. Använd musen par kontroll- och behandlingsgrupper för att eliminera mindre fördomar på grund av olika tidsförlopp. - Fyll i beskrivning som är relevanta för experimentet. Observera en dialogruta dyker upp automatiskt; det innehåller information, såsom mus-stammar, kön, tid, tidpunkt för sond injektion, grupp etc. Spara filerna allt i one mapp; de kommer att ha tid taggar och alla beskrivningar.
- Injektion och avbildning av nära infraröda fluorescerande nanopartiklar för BBB integritet
- Använd nära infraröda epifluorescence avbildning i B-fokus (avstånd: 6,5 cm). Excitation / emissionsmaxima av pegylerade fluorescerande nanopartiklar är 675/690 nm. Fånga två bilder med olika våglängder, vid Ex640 / Em700 och Ex675 / Em720; Använd en 2-exponering, binning 8 och fStop 2. Ta en baslinje bild.
- Injicera 70 mikroliter av pegylerade fluorescerande infraröda nanopartiklar iv genom svansvenen och föreställa sig mössen 3 h och 24 h efter injektion med hjälp av ovanstående inställningar. Blanda lösningen väl innan du fyller sprutan.
- Injicera 0,9% natriumklorid i kontrollmöss, som kommer att behövas för att bedöma specificiteten av signalen.
- Injektion och avbildning av det nära infraröda fluorescerande sond för MMP-aktivitet
- Raka eller Vaxning varar huvudet och upper ryggraden regionen försiktigt en dag innan baslinjen bilden. Huden får inte skadas.
- Använd nära infraröda epifluorescence avbildning i B-fokus (avstånd: 6,5 cm). Excitation / emission maxima av MMP aktiverbara sonden är 680/700 nm. Fånga två bilder med olika våglängder, vid Ex640 / Em700 och Ex675 / Em720; använda en 1-exponering, binning 8 och fStop 2. Ta en baslinje bild.
- Tillsätt 200 | il av 1 x PBS till 1,5-ml rör av det färdiga att använda lösning (20 nmol / 1,5 ml i 1 x PBS) så att det kommer att vara tillräckligt för 10 möss; blanda väl innan du fyller sprutan.
OBS: Det angivna volymen tar inte hänsyn till att en del volym förloras under sprutfyllnings och injektion. - Injicera 150 | il av sonden iv genom svansvenen 24 timmarna innan avbildning. Injicera PBS endast i kontrolldjur för att bedöma specificiteten av signalen.
- Vid 24 timmar efter injektion, ta Epi-FL bilder åtminstone vid två våglängder, Ex640 / Em700 och Ex 675 / EM720, med inställningar som förklaras ovan (1-exponering, fokus B, binning 8 och fStop 2).
OBS: Användning av två våglängder möjliggör spektral unmixing genom att subtrahera den ospecifika signalen.
3. Bild Analyser
- Bioluminescence analys (BLI)
- Dubbelklicka på programvara för att öppna den.
- I den övre menyraden klicka på ikonen filhanterare gå till katalogen i mappen av experimentet, och välj det; detta kommer att öppna alla filer i mappen i en tabell.
- Konfigurera kolumnerna visar beskrivningarna som är relevanta för experimentet.
- För kvalitetskontroll, dubbelklicka på en fil av en icke-svarare mus utan symptom på EAE och / eller en naiv mus för att kontrollera specificiteten hos EAE-signaler.
OBS: Det bör finnas någon signal i naiva möss och minimal signal i icke-responder möss.- Kontrollera baslinjen bilden före injektionen av den provara för varje mus som ytterligare kontroll av specificiteten hos signalen; det bör vara negativ.
- För att välja en bild, dubbelklicka på den första filen i den första EAE musen och kontrollera självlysande intensitet (LUT bar intervall) och lokalisering. Kontrollera alla bilder en efter en. Stäng filen med den lägsta intensiteten för varje mus (dvs. hålla två av tre bilder för varje mus).
- Bildjustering och export
- Dubbelklicka på den första filen som ska kvantifieras. Observera ett nytt fönster dyker upp. Under "alternativ" (övre meny), anpassa etiketter som ska visas i varje bild.
- I den högra verktygspaletten, gå till "bildjustering." Som standard är lägsta och högsta stödnivåer inställd på "auto" och visas i regnbåge pseudo. Välj "manuellt" för att ändra inställningarna om det behövs.
OBS: Till exempel, kan alla exporterade bilder har samma LUT stänger (identisk minima och maxima) för att vara lätt att jämföra.Justeringen av minima och maxima har ingen inverkan på de kvantitativa resultaten. - Klicka på bilden export väljer png, katalogen, och en bildnamn
- Kvantifiering av regioner av intresse (ROI)
- Gå till "ROI" verktyg i verktygspaletten. Välj ROI-metoden (cirkel, rektangulär, auto eller fri hand) och antalet ROI. Observera ROI fönster dyker upp i bildfönstret.
- Med hjälp av musen, justera storlek och position. Använd samma trösklar ROI för alla bilder om auto-ROI verktyg används. Använd identiska områden för alla bilder om ROI storlekar och positioner definieras manuellt (t.ex. cirkulära ROI).
- Klicka på "mäta RO.I. Observera ett nytt fönster dyker upp. Anpassa kolumnerna (t.ex. filnamn, djur nummer, grupp, experiment, område, totalt räknar genomsnittliga räknas, SD räknar, min och max räknas, område, tid , tidpunkt för sond injektion etc.). Spara anpassade inställningar. När ready, välj alla (Ctrl + A) och kopiera och klistra in tabellen i ett kalkylblad.
- Exportera bilden som en png med ROI på plats. Spara och stäng bildfilen.
- Upprepa proceduren (steg 3.1.6 - 3.1.7) för alla bildfiler som måste kvantifieras. Kopiera alla ROI kvantifieringar i kalkylbladet.
OBS: Här kan resultat sorteras efter grupp, tidpunkt, etc. och analyseras statistiskt. Använd de totala räkningarna av mareld signaler i ROI för statistiska analyser.
- Near-Infrared (NIR) analys av fluorescerande nanopartiklar
- Med hjälp av kontrollerna i programmet, justera tröskeln till bilden.
OBS: Detta har ingen inverkan på den kvantitativa resultat. - Visuellt jämföra bilder som tagits vid Ex / Em 675/720 och Ex / Em 640/700 för att bedöma specificiteten av signalen.
- Använd bilder som tagits vid Ex / Em 675/720 för kvantitativ analys (excitation max: 680 nm). Definiera ROI, för vilken den automatiska ROI verktyg kan användas. Justera tröskeln automatiskt ROI och använda det för alla bilder. Kvantifiera den totala strålningsutbytet i ROI (se steg 3,1).
- Med hjälp av kontrollerna i programmet, justera tröskeln till bilden.
- Near-Infrared (NIR) analys av proteas känsliga sond
- Med hjälp av programvarureglage justerar tröskeln till bilden.
OBS: Detta har ingen inverkan på den kvantitativa resultat. Utför spektral unmixing av auto-fluorescens. Den unmixing verktyget är implementerad i Living Image. Auto-unmixing använder Ex / Em 640/700 som den specifika och 675/720 som auto-fluorescerande bild. - Välja den oblandade bilden och definiera ROI, såsom beskrivits ovan. Använd den totala strålningsutbytet i ROI för kvantitativa och statistiska analyser.
- Med hjälp av programvarureglage justerar tröskeln till bilden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tidsförloppet för Bioluminescence av opticusneurit
Den bioluminescence signal av inflammations sonden var den starkaste runt ögonen och inträffade endast i EAE-möss med optikusneurit. En signal inträffade i varken icke-EAE-möss eller möss som inte injicerats med inflammation sonden. Signalen försvann när mössen återhämtade sig. Därför är signalen specifik för opticusneurit, och toppen av signalen parallellt med toppen av de kliniska EAE poängen. Figur 1 visar två exempel på SJL / J-möss avbildas vid dag 10 och 14 efter EAE-induktion. Den självlysande signal var den högsta på dag 10 och försvann när mössen började återhämta sig. Tidsförloppen för de kliniska poängen matchade försvinnandet av självlysande signal (exempel-1) eller föregås (exempel-2) minskningen av poängen.
Figur 1. Tidsförlopp för optikusneurit och kliniska poäng i EAS-SJL / J-möss. Bioluminescenta bilder av optisk neurit fångades 10 min efter injektionen av inflammationen sonden (100 | il ip) under en st utflytning av sjukdomen i två SJL / J-möss vid olika tidpunkter efter immunisering. De självlysande bilder (till vänster) fångades 10 och 14 dagar efter immunisering och presenteras som regnbåge Pseudo fotografera överlägg. LUT barer sträcker sig från blå (låg) till röd (high-bioluminescens). Skala bar: 1 cm. Den högra panelen visar stapeldiagram för de enskilda totala mareld räknas i ROI (medelvärde ± SD av 3 bilder vardera) och tidsförloppen för de kliniska EAE poängen. De röda pilarna markerar bild dagar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bedömning av behandlingens effektivitet
inflammation sond
Effekterna av medicinering (R-flurbiprofen 5 mg / kg / d) 5 visas i figur 2. Fem exempel på självlysande bilder i varje grupp presenteras. Poängen i bilen och behandlingsgruppen var heterogena, men i alla möss, den självlysande signalen i ögat visar inflammation i synnerven var lägre i läkemedelsgruppen (Figur 2A). Kvantifieringen av den totala självlysande räknas i ROI bekräftade signifikant effekt behandling (Figur 2B, med lådagram av det totala antalet självlysande räknas, oparade 2-tailed t-test, P <0,05). Avbildnings resultat överens med den terapeutiska effektens av medicinen i form av kliniska poäng och histopatologiska manifestationer av EAE i ryggmärgen och synnerven 5.
Figur 2. Effekt av medicinering i EAE-SJL / J möss Använda Bioluminescent Imaging. SJL / J-möss fick vehikel eller läkemedel (R-flurbiprofen 5 mg / kg / d) från dag 5 efter immunisering. Bilder fångades efter injektion av inflammationen sonden (100 | il ip) vid 1 st EAE topp, n = 10 per grupp. EAE utvecklades 7/10 i båda grupperna, och EAE icke-responders var utan signal. A) Bioluminescence bilder i levande möss fångade 5-15 min efter ip-injektion av 100 mikroliter av inflammationen sonden presenteras som regnbåge Pseudo fotograf överlägg. LUT barer sträcker sig från blå (låg) till röd (hög intensitet). Skala bar: 1 cm. Den individuella toppav den totala självlysande räknas i ROI användes för kvantifiering. ROI var begränsade till huvudet. PLP injektionsställena var skyddade med svart tyg. B) Boxdiagram visar kvantifiering av de totala räknas i ROI. Boxen representerar kvartilavståndet, linjen är medianen och hårkristallerna visar den lägsta till högsta. De totala räkningar skilde sig signifikant mellan grupperna (2-sidig oparat t-test, P <0,05), vilket visar en minskning av optisk neurit och encefalit hos möss som fick medicinering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Pegylerade fluorescerande nanopartiklar
Epifluorescence bilder av nära infraröda nanopartiklar visade vaskulära läckage runt ögonen och i hjärnan i både behandling groups (Figur 3A, 2 exempel). Partiklarna distribuera mycket långsamt från blodet till mellanrummet, med undantag för inflammationsställen, där färgämnet ackumuleras, vilket möjliggör en bedömning av BBB integritet. Läckaget var uppenbar vid 3 h och 24 h efter injektionen av de nanopartiklar, men det var starkare vid den senare tidpunkt. Det fanns ingen specifik signal i icke-EAE-möss eller möss som inte injicerats med nanopartiklar (högra panelen). Hence, signalen var specifik. Kvantitativ analys av strålningsutbytet i ROI (figur 3B) visade inte signifikanta skillnader mellan behandlingsgrupper (n = 3 per grupp, oparat två-tailed t-test, P <0,05).
Figur 3. Bedömning av blod-hjärnbarriären Avbrott med pegylerat Lysrör Nanopartiklar. SJL / J-möss fick vehikel eller läkemedel (R-flurbiprofsv 5 mg / kg / d) från dag 5 efter immunisering. Bilder fångades 3 h och 24 h efter injektionen av nära-IR-märkt nanopartiklar (70 mikroliter iv) under 1st EAE topp, n = 3 per grupp. EAE icke-responders var utan signal. Auto-ROI verktyg användes för kvantifiering av strålningsutbytet. De ROI var begränsade till huvudet. PLP injektionsställena var skyddade. A) Exempel på epifluorescence bilder av levande möss, fångade 3 timmar och 24 timmar efter injektion av nanopartiklar. Bilder från möss utan EAE eller utan injektion av nanopartiklar användes som avbildnings kontroller. Skala bar: 1 cm. LUT barer sträcker sig från mörkrött (låg-) till gult (hög intensitet). B) Stapeldiagram som visar kvantifieringen av strålningsutbytet i ROI (medelvärde ± SD). Behandlingsgrupperna skilde sig inte signifikant (2-sidig oparat t-test). Klicka här för att v isa b en större version av denna siffra.
Matrismetalloproteinas känslig prob
Efter subtraktion av auto-fluorescens, bilder av proteas-aktiverbara MMP proben avslöjade inflammation i hjärnan och ryggmärgen i EAE-möss (figur 4A, exempel av 4 möss per grupp). Det fanns ingen signal i möss inte injicerats med sonden, och en svag signal inträffade i en EAE mus utan kliniska symtom (icke-svarare). Bilder i Figur 4 visar signalen vid Ex / Em 640/700 dras av bilden på Ex / Em 675/720. Skillnader mellan behandlingarna uppenbarades först efter den kvantitativa analysen av strålningsutbytet i auto ROI efter spektral unmixing (Figur 4B, oparat två-tailed t-test, n = 6 och 4, P <0,05).
iles / ftp_upload / 55321 / 55321fig4.jpg "/>
Figur 4. Bedömning av metalloproteinas aktivitet med nära infraröd MMP-känsliga avbildningssonden. SJL / J-möss fick vehikel eller läkemedel (R-flurbiprofen 5 mg / kg / d) från dag 5 efter immunisering. Bilder fångades 24 timmar efter injektion av sonden (150 mikroliter iv) vid 1 EAE topp, n = 6 och 4. PLP injektionsställena var skyddade. EAE-icke-responders och möss utan MMP prob injektioner användes som kontroller. Varje 2 bilder fångades på Ex / Em 640/700 nm (specifik signal) och 675/720 nm (auto-fluorescens). Använda den spektrala unmixing verktyget, var auto-fluorescens subtraheras och därefter var för automatisk ROI verktyg som används för att identifiera de områden av specifik MMP-aktivitet. Den totala strålningsutbytet användes för kvantifiering. A) Exempel på epifluorescence bilder i levande möss fångade 24 timmar efter sond injektion. Bilderna är resultatet av spektral unmixing (UMX). Skala bar: 1 cm. LUT bars sträcker sig från mörkrött (låg-) till gult (hög intensitet). B) Boxdiagram som visar kvantifieringen av den totala strålningsutbytet i ROI. Boxen representerar kvartilavståndet, linjen är medianen och hårkristallerna visar den lägsta till högsta. Asterisken anger en signifikant skillnad mellan grupperna (2-sidig oparat t-test, P <0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Föreliggande video visar tekniker för mareld och nära infraröda fluorescens in vivo avbildning av EAE i SJL / J-möss. Vi visar att mareld avbildning med en inflammation känslig sond visar huvudsakligen optikusneurit och kvantifiering instämmer med den kliniska utvärderingen av EAE svårighetsgrad och effekterna av medicinering. Emellertid bioluminescens avbildningsmetod kunde inte detektera inflammation i ryggradens ryggmärgen, som är ett primärt ställe av EAE manifestation 17, sannolikt på grund av att signalen absorberas av ryggraden.
Det nära infraröda avbildning är mer känsliga, men på bekostnad av hög interferens med auto-fluorescens, som inte förekommer med bioluminescens. Exponeringstiden för NIR är mycket kortare (1 - 2 s) jämfört med BLI (2-5 min), vilket gör NIR den lämpligaste metoden för tidsserier med snabbt föränderliga signalnivåer.
Kritiska steg medi protokollet och begränsningar av tekniken
Signaler från immunisering platsen störa ryggmärgen avbildning i EAE, men detta kan kringgås genom att placera de båda injektionsstället vid svansroten, som inte var sämre än de rekommenderade injektionsställen (nacke och svansroten). Icke desto mindre är det nödvändigt att skydda injektionsställe för svart tyg.
För mareld avbildning, är det viktigt att fånga en tidsserie av bilder, eftersom kinetiken skiljer sig mellan djur. För att undvika fördomar som orsakas av kinetik, är avbildning av par av kontroll (t.ex. fordon eller vildtyp) och verum (t.ex. läkemedel eller transgena) möss fördelaktig. Enligt tillverkaren bör signal vara stabil under 30 min. Men i EAE, observerade vi snabbare och mer övergående kinetik, med toppar som förekommer vid 5 - 10 min och en kraftig nedgång på 15 minuter.
För nära infraröd avbildning, den manufacturer rekommenderar inställningen Ex / Em för en specifik prob. Ändå var det lämpligt att köra ett filter serie initialt och att alltid ta bilder på minst två kombinationer excitation / emissions, som nära matchar rapporterade Ex / Em maxima och kan senare användas för spektral unmixing av ospecifika signaler.
Det är viktigt att använda vita möss, som SJL / J, eftersom ljus och fluorescens är mycket absorberas av svart päls. Svarta möss måste försiktigt rakat på huvudet och tillbaka en dag före avbildning. Hudskador måste undvikas, eftersom de kommer att visas som inflammatoriska fläckar och störa avbildning av hjärnan eller ryggmärgen. För NIR imaging, rekommenderar tillverkaren hårborttagning av alla möss, även vita möss. Även efter rakning, huvud och rygg resulterar i svarta möss var mindre övertygande än med vita möss (ej visad). För den primära-progressiv EAE-modellen i C57BL6 möss, kan vita C57BL6 möss, som är kommersiellt tillgängliga, vara ett alterinföding. Hårlösa, immun SKH1 möss är användbara för nära infraröd avbildning, men inte EAE, eftersom dessa möss har en albino genetisk bakgrund och inte på ett tillförlitligt sätt utveckla EAE (maximal poäng: 0,5 - 1). Självlysande avbildning med inflammation sonden i dessa möss avslöjade flera inflammatoriska fläckar i huden (ej visad), där hårsäckar går förlorade.
NIR avbildning av proteasaktivitet avslöjade hjärnan och ryggmärgen inflammation, men signaler överlagrade av auto-fluorescens, som kräver spektral unmixing före kvantitativ analys. Därför, NIR imaging var mindre robust än mareld bildbehandling och var dyrare. Emellertid kan användningen av proteas aktiverbara sonder vara användbar för bedömningen av läkemedel som specifikt riktar matrismetalloproteinaser.
Fördelar och nackdelar
De olika avbildningstekniker är gratis och behandla specifika frågor. Fördelarna med Bioluminescent avbildning är överkomliga (ca 20 Euro / mus); en brist på auto-bioluminescens, vilket skulle störa signalen; hög specificitet; bekvämt ip injektion och bildanalys; och robusthet och tillförlitlighet. Nackdelar är långa exponeringstider och signal absorption av svart päls och ben.
Fördelar med NIR är bredare tillgängligheten av NIR-märkta sönder, enkel anpassade NIR märkning, kort exponeringstid, och hög känslighet. Nackdelar är höga kostnader (50-100 Euro / mus), absorption av päls, stark interferens med auto-fluorescens, och behovet av spektral unmixing och bildbehandling före analys.
Ett antal sönder finns att upptäcka ställen för inflammation, eftersom de aktiveras av pro-inflammatoriska enzymer som uppregleras vid inflammationsställen (t.ex., peroxidaser eller metalloproteinaser) på grund av infiltration av immunceller. Vissa av dessa prober detekterar även cancers visar immunceller infiltration i tumören mikro eller frisättningen av enzymer av själva tumören (t.ex. MMP). Prober som ackumuleras i vävnaden på grund av kapillär läckage kommer att detektera störningar i BBB, utan även på andra ställen för inflammation och cancer.
Betydelsen av tekniken med avseende på befintliga / alternativa metoder
Kombinationen av "imaging plus kliniska sår" var överlägsen "bara poängen" för bedömning av sjukdomsstatus och detektion av medicinering effekter. Den mareld signal runt ögonen håller också med tidigare histopatologiska studier som visar myelin förstörelse och immunceller infiltrat i synnerven 5. Om 2/3 av MS-patienter utvecklar episoder av opticusneurit. Hittills finns det inga tillförlitliga, icke-invasiva metoder för att kvantifiera opticusneurit i levande möss utom diffusion magnetisk resonanstomografi (MRT) och optiska koherenstomografi (oktober), som är tekniskt krävande 18. Oktober har införts i EAE som en metod som visar retinala förändringar och atrofi under EAE, vilket antyder en autoimmun reaktion i synnerven 19.
Jämfört med den metod som beskrivs i detta manuskript, är oktober en högre stressfaktor för mössen, eftersom det kräver djup anestesi. Avläsningen är inte en direkt visualisering av synnerven 19.
Nära infraröda avbildning av fluorescerande nanopartiklar var nyttigt att visualisera störningar av BBB, vilket är ett annat kännetecken för EAE och MS. Förutom MRI 20, 21, finns det ingen icke-invasiv metod för in vivo övervakning av BBB integritet. Detta skulle vara mycket användbart, eftersom experimentella läkemedel och fytosanitära mediciner specifikt agera genom att dra barriären 22, 23, som normalt hindrar överdriven lymfocyter rekrytering i CNS 24. Förhindra leukocyter fäste eller trans genom BBB och minska dess läckage är en effektiv strategi i MS-behandling 25, och nanopartiklar avbildning kan hjälpa till att bedöma effekten av läkemedelskandidater. Hittills partiklarna är dyra. Intravital mikroskopi är en annan teknik som används för att visualisera BBB integritet 26, men det normalt kräver långvarig, djup anestesi (t.ex. med ketamin och xylazin) på grund av kraniotomi och förbjuder åter uppvaknande mössen, därmed förhindra tidsförloppet analyser. Men ger intravital mikroskopi högupplösta bilder på cellulär till subcellulära nivåer, vilket inte kan uppnås med in vivo imaging.
Framtida Program eller Vägbeskrivning efter Mastering Technique
Sammanfattningsvis avbildnings techniques presenteras i detta video hjälp för att bedöma individuell kurs av sjukdomen och att övervaka effekterna av läkemedel, som var delvis inte avslöjas av kliniska poäng ensam. Teknikerna håller med 3 "R" principer för ersättning, begränsning och förfining i djurförsök och är användbara add-on verktyg inom läkemedelsforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC1039 A3) och forskningsmedel programmet "Landesoffensive Zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) i delstaten Hessen, Research Center för Translational Medicine och farmakologi TMP och Else Kröner-Fresenius Foundation (EKFS), Research Training Group Translational Research Innovation - Pharma (TRIP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AngioSpark-680 | Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA | NEV10149 | Imaging probe, pegylated nanoparticles, useful for imaging of blood brain barrier integrity |
| MMP-sense 680 | Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA | NEV10126 | Imaging probe, activatable by matrix metalloproteinases, useful for imaging of inflammation |
| XenoLight RediJect Inflammation Probe | Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA | 760535 | Imaging probe, activatable by oxidases, useful for imaging of inflammation |
| PLP139-151/CFA emulsion | Hooke Labs, St Lawrence, MA | EK-0123 | EAE induction kit |
| Pertussis Toxin | Hooke Labs, St Lawrence, MA | EK-0123 | EAE induction kit |
| IVIS Lumina Spectrum | Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA | Bioluminescence and Infrared Imaging System | |
| LivingImage 4.5 software | Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA | CLS136334 | IVIS analysis software |
| Isoflurane | Abbott Labs, Illinois, USA | 26675-46-7 | Anaesthetic |
References
- Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
- Dunn, J. Impact of mobility impairment on the burden of caregiving in individuals with multiple sclerosis. Expert Rev Pharmacoecon Outcomes Res. 10 (4), 433-440 (2010).
- Dutta, R., Trapp, B. D. Mechanisms of neuronal dysfunction and degeneration in multiple sclerosis. Prog Neurobiol. 93 (1), 1-12 (2011).
- Sawcer, S., et al. Genetic risk and a primary role for cell-mediated immune mechanisms in multiple sclerosis. Nature. 476 (7359), 214-219 (2011).
- Schmitz, K., et al. R-flurbiprofen attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. EMBO Mol Med. 6 (11), 1398-1422 (2014).
- Balls, M. The origins and early days of the Three Rs concept. Altern Lab Anim. 37 (3), 255-265 (2009).
- Barthelmes, J., et al. Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues. J Vis Exp. (111), (2016).
- Leahy, A. A., et al. Analysis of the trajectory of osteoarthritis development in a mouse model by serial near-infrared fluorescence imaging of matrix metalloproteinase activities. Arthritis Rheumatol. 67 (2), 442-453 (2015).
- Scales, H. E., et al. Assessment of murine collagen-induced arthritis by longitudinal non-invasive duplexed molecular optical imaging. Rheumatology (Oxford). 55 (3), 564-572 (2016).
- Nahrendorf, M., et al. Dual channel optical tomographic imaging of leukocyte recruitment and protease activity in the healing myocardial infarct. Circ Res. 100 (8), 1218-1225 (2007).
- Eaton, V. L., et al. Optical tomographic imaging of near infrared imaging agents quantifies disease severity and immunomodulation of experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo. J Neuroinflammation. 10, (2013).
- Kandagaddala, L. D., Kang, M. J., Chung, B. C., Patterson, T. A., Kwon, O. S. Expression and activation of matrix metalloproteinase-9 and NADPH oxidase in tissues and plasma of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. Exp Toxicol Pathol. 64 (1-2), 109-114 (2012).
- Wang, C., et al. In situ fluorescence imaging of myelination. J Histochem Cytochem. 58 (7), 611-621 (2010).
- Wang, C., et al. Longitudinal near-infrared imaging of myelination. J Neurosci. 31 (7), 2382-2390 (2011).
- Engelhardt, B. Molecular mechanisms involved in T cell migration across the blood-brain barrier. J Neural Transm. 113 (4), 477-485 (2006).
- Badawi, A. H., et al. Suppression of EAE and prevention of blood-brain barrier breakdown after vaccination with novel bifunctional peptide inhibitor. Neuropharmacology. 62 (4), 1874-1881 (2012).
- Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends in immunology. 34 (8), 410-422 (2013).
- Lin, T. H., et al. Diffusion fMRI detects white-matter dysfunction in mice with acute optic neuritis. Neurobiol Dis. 67, 1-8 (2014).
- Knier, B., et al. Neutralizing IL-17 protects the optic nerve from autoimmune pathology and prevents retinal nerve fiber layer atrophy during experimental autoimmune encephalomyelitis. J Autoimmun. 56, 34-44 (2015).
- Schellenberg, A. E., Buist, R., Yong, V. W., Del Bigio, M. R., Peeling, J. Magnetic resonance imaging of blood-spinal cord barrier disruption in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Magn Reson Med. 58 (2), 298-305 (2007).
- Mori, Y., et al. Early pathological alterations of lower lumbar cords detected by ultrahigh-field MRI in a mouse multiple sclerosis model. Int Immunol. 26 (2), 93-101 (2014).
- Bittner, S., et al. Endothelial TWIK-related potassium channel-1 (TREK1) regulates immune-cell trafficking into the CNS. Nat Med. 19 (9), 1161-1165 (2013).
- Theien, B. E., et al. Differential effects of treatment with a small-molecule VLA-4 antagonist before and after onset of relapsing EAE. Blood. 102 (13), 4464-4471 (2003).
- Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
- Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis. J Immunol. 182 (10), 5909-5913 (2009).
- Andresen, V., et al.
- Bukilica, M., et al. Stress-induced suppression of experimental allergic encephalomyelitis in the rat. Int J Neurosci. 59 (1-3), 167-175 (1991).
