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Medicine

Bioluminescenza e vicino infrarosso Imaging di neurite ottica e cervello infiammazione nel modello EAE della sclerosi multipla nei topi

Published: March 1, 2017 doi: 10.3791/55321
Automatic Translation
1, 1
1Institute of Clinical Pharmacology, University Hospital Frankfurt

Summary

Mostriamo una tecnica per bioluminescenza vivo in vivo e vicino infrarosso per immagini di neurite ottica ed encefalite nel modello di encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) per la sclerosi multipla in topi SJL / J.

Abstract

Encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) in SJL / J topi è un modello per la sclerosi multipla recidivante-remittente (RRMS). punteggi EAE clinici che descrivono i deficit delle funzioni motorie sono letture di base della infiammazione immuno-mediata del midollo spinale. Tuttavia, i punteggi e il peso corporeo non permettono una valutazione in vivo di infiammazione del cervello e neurite ottica. Quest'ultima è una manifestazione precoce e frequente in circa 2/3 dei pazienti con SM. Qui vi mostriamo i metodi per bioluminescenza e vicino infrarosso immagini dal vivo per valutare EAE evocato neurite ottica, infiammazione del cervello, e la barriera emato-encefalica interruzione (BBB) nei topi che vivono con un sistema di imaging in vivo in. Un substrato bioluminescente attivato da ossidasi soprattutto ha mostrato neurite ottica. Il segnale era specifico e ha permesso la visualizzazione degli effetti di farmaci e gli andamenti temporali di malattia, che in parallelo i punteggi clinici. nanoparticelle fluorescenti pegilato che sono rimasti all'interno del vasculature per lunghi periodi di tempo sono stati utilizzati per valutare l'integrità BBB. Vicino infrarosso di imaging rivelato una perdita BBB al picco della malattia. Il segnale era più forte intorno agli occhi. Un substrato vicino infrarosso per metalloproteinasi della matrice è stato utilizzato per valutare l'infiammazione EAE-evocato. Auto-fluorescenza interferiva con il segnale, che richiede unmixing spettrale per la quantificazione. Nel complesso, imaging bioluminescenza è un metodo affidabile per valutare neurite ottica e farmaci effetti EAE-associata e era superiore alle tecniche vicino infrarosso in termini di specificità del segnale, robustezza, facilità di quantificazione, e costo.

Protocol

1. EAE induzione in SJL / J topi

  1. Topi
    1. Utilizzare 11 settimane di età femminile SJL / J topi e consentire loro di abituano alla sala sperimentale per circa 7 giorni. Utilizzare n = 10 topi per gruppo.
    2. Per la valutazione degli effetti di farmaci, somministrare il farmaco e placebo per il gruppo di controllo in continuo tramite l'acqua potabile o tramite pellet cibo a partire 3 o 5 giorni dopo l'immunizzazione (n = 10 per gruppo). Durante il picco della malattia, somministrare farmaci o placebo con latte o 3% corn flakes acqua zucchero-imbevuti.
  2. materiale Immunizzazione
    1. Utilizzare un kit di induzione EAE costituito da antigene (peptide di proteine ​​proteolipid, PLP139-151, 1 mg / emulsione ml) in una emulsione con adiuvante completo di Freund (CFA, ucciso al calore Mycobacterium tuberculosis H37 Ra) e 2 flaconi (5 mcg ciascuna) di liofilizzato tossina della pertosse (PTX).
    2. Sciogliere il PTX (2 mg / ml) in 1x PBS (PBS, cioè, </ Em> aggiungere 1,5 ml di PBS in ogni provetta PTX, mescolare bene, togliere con la stessa punta della pipetta, e aggiungere 1 ml di PBS in un tubo da 50 ml); mescolare bene.
  3. Immunizzazione
    1. Iniettare PLP / CFA sottocutanea in 2 porzioni, ciascuna di 100 microlitri, sia alla base della coda. Non iniettare nella parte posteriore del collo, in quanto eventuali reazioni immunitarie della pelle nella parte superiore della schiena o al collo disturberanno l'imaging della testa e del midollo spinale.
    2. Iniettare 100 ml di PTX per via intraperitoneale (ip), due volte al mouse, il primo 1 - 2 ore dopo la vaccinazione e il secondo a 24 ore.
    3. Per i topi di controllo, iniettare CFA senza PLP (2 porzioni di 100 ml) più PTX senza PLP.
  4. La gestione del mouse dopo la vaccinazione
    1. Pesare il mouse ogni altro giorno fino al giorno 7, si pesa quotidianamente.
      NOTA: I topi perdono circa 1 - 2 g di peso corporeo durante EAE. Il declino segna l'inizio della EAE.
    2. Valutare i sintomi clinici giorno tutti i giorni dalle 7 accordozione ai sistemi di valutazione standard (ad esempio, Score 0: nessuna modifica evidenti funzioni motorie; segnare 0,5: la paralisi distale della coda; segnare 1: paralisi completa della coda; segnare 1.5: paresi lieve di una o entrambe le zampe posteriori; punteggio 2: grave paralisi delle zampe posteriori; segnare 2,5: completa paralisi di una gamba posteriore; segnare 3: paralisi completa di entrambe le zampe posteriori; segnare 3,5:. paralisi completa delle zampe posteriori e la paresi di una gamba anteriore euthanize topi con i punteggi di 3.5 o superiore per > 12 h.
  5. Naturalmente e ora di imaging EAE
    1. Eseguire la prima di imaging al momento della comparsa della malattia, quando i topi raggiungono punteggi> 1, che avverrà intorno al giorno 10 - 12 dopo la vaccinazione.
    2. Eseguire il secondo di imaging al picco, che sarà raggiunto 1 o 2 giorni dopo i sintomi iniziali sviluppano e durerà per 1 - 3 giorni.
      NOTA: In seguito, i topi recuperare completamente entro 7 a 10 giorni. Imaging durante gli intervalli può ancora mostrare perdite vascolari,ma gli indicatori di infiammazione dovrebbe essere negativo.

2. Bioluminescent Imaging e vicino infrarosso di neurite ottica e cervello Infiammazione

  1. Impostazione del sistema di imaging
    1. Eseguire imaging in vivo con qualsiasi apparecchiatura che consente l'analisi della bioluminescenza e segnali ad infrarossi.
    2. Mantenere i topi sotto 2-2,5% isoflurano anestesia durante tutte le procedure di imaging.
    3. Posizionare una o due topi accanto all'altra nell'apparato utilizzando le forniture di gas di mezzo. Posizionare il rachide superiore al centro.
    4. Usare due mouse contemporaneamente, uno per gruppo, per la valutazione degli effetti di farmaci per confrontare coppie. Questo è importante per l'imaging bioluminescente.
    5. Schermare il sito dell'immunizzazione con panno nero e prendere un'immagine di fotografia e basale per valutare il corretto posizionamento dei mouse / mice. Utilizzare il B-fuoco con una distanza di 6,5 cm per la macchina fotografica per tutte le immagini.
  2. Iniezione e di imaging di sonda infiammazione bioluminescente
    1. Utilizzare le impostazioni del sistema di imaging in vivo in: Epi-BLI, Em filtro aperto, blocco di filtro Ex, fstop 1, binning 8, concentrarsi B = 6,5 cm, annunci di esposizione 120 s; prendere una immagine di base.
    2. Iniettare 100 microlitri ip del reagente chemiluminescente ready-to-use (40 mg / mL). Mescolare bene prima di riempire la siringa.
    3. Catturare immagini bioluminescenza 5, 10, e 15 minuti dopo l'iniezione. L'andamento temporale del picco bioluminescente differisce tra gli animali.
      NOTA: Il picco si verificherà 5 - 10 minuti dopo l'iniezione; un calo a 15 min indica che ulteriori immagini sono necessarie. Utilizzare coppie murini di controllo e di trattamento gruppi per eliminare distorsioni minori a causa di diversi corsi di tempo.
    4. Compilare descrizioni rilevanti per l'esperimento. Osservare una finestra di dialogo pop-up automatico; include informazioni come ceppo di topi, sesso, punto di tempo, il tempo di iniezione sonda, gruppo, ecc. Salvare i file in tutto ocartella ne; avranno i tag di tempo e tutte le descrizioni.
  3. Iniezione e di imaging di nanoparticelle fluorescenti vicino infrarosso per l'integrità BBB
    1. Utilizzare l'imaging epifluorescenza vicino infrarosso nel B-focus (distanza: 6.5 cm). I massimi di eccitazione / emissione di nanoparticelle fluorescenti pegilati sono 675/690 nm. Catturare due immagini a diverse lunghezze d'onda, a Ex640 / Em700 e Ex675 / Em720; utilizzare un 2-s esposizione, binning 8, e fstop 2. Prendere una immagine di base.
    2. Iniettare 70 ml di nanoparticelle fluorescenti infrarossi pegilati iv attraverso la vena della coda e immaginare il mouse 3 ore e 24 ore dopo l'iniezione utilizzando le impostazioni di cui sopra. Mescolare il pozzo soluzione prima di riempire la siringa.
    3. Iniettare cloruro di sodio allo 0,9% in topi di controllo, che saranno necessarie per valutare la specificità del segnale.
  4. Iniezione e immagini della sonda vicino infrarosso fluorescente per l'attività MMP
    1. La barba o depilare la testa e uregione della colonna vertebrale pper cautamente un giorno prima di prendere l'immagine di base. La pelle non deve essere ferito.
    2. Utilizzare l'imaging epifluorescenza vicino infrarosso nel B-focus (distanza: 6.5 cm). I massimi di eccitazione / emissione della sonda attivabile MMP sono 680/700 nm. Catturare due immagini a diverse lunghezze d'onda, a Ex640 / Em700 e Ex675 / Em720; utilizzare un 1-s esposizione, binning 8, e fstop 2. Prendere una immagine di base.
    3. Aggiungere 200 ml di PBS 1x al tubo 1,5 ml della soluzione pronta per l'uso (20 nmol / 1,5 ml in PBS 1x) in modo che sia sufficiente per 10 topi; mescolare bene prima di riempire la siringa.
      NOTA: Il volume disponibile non tiene conto del fatto che alcune volume perso durante il riempimento della siringa e iniezione.
    4. Iniettare 150 ml di iv sonda attraverso la vena della coda 24 ore prima di imaging. Iniettare PBS solo in animali di controllo per valutare la specificità del segnale.
    5. A 24 ore dopo l'iniezione, prendere immagini Epi-FL almeno a due lunghezze d'onda, Ex640 / Em700 e Ex 675 / EM720, con le impostazioni spiegato in precedenza (1-s di esposizione, messa a fuoco B, binning 8, e fstop 2).
      NOTA: L'uso di due lunghezze d'onda permette unmixing spettrale sottraendo il segnale aspecifico.

3. Analisi Immagine

  1. Analisi bioluminescenza (BLI)
    1. Fare doppio clic sul software per aprirlo.
    2. Nella barra dei menu in alto, fare clic sull'icona del browser di file, passare alla directory della cartella dell'esperimento, e selezionarlo; questo aprirà tutti i file nella cartella in una tabella.
    3. Configurare le colonne che mostrano le descrizioni rilevanti per l'esperimento.
    4. Per il controllo di qualità, fare doppio clic su un file di un mouse non-responder, senza sintomi di EAE e / o un mouse ingenuo di verificare la specificità dei segnali EAE.
      NOTA: Non ci dovrebbe essere alcun segnale in topi naive e di segnale minima nei topi non-responder.
      1. Controllare l'immagine di base prima che l'iniezione del proa ciascuno mouse come ulteriore controllo della specificità del segnale; dovrebbe essere negativo.
    5. Per selezionare un'immagine, fare doppio clic sul primo file del primo mouse EAE e controllare l'intensità bioluminescente (LUT gamma bar) e la localizzazione. Controllare tutte le immagini una per una. Chiudere il file con l'intensità più basso per ogni mouse (ad esempio, tenere 2 su 3 immagini per ogni mouse).
    6. Regolazione immagine e l'esportazione
      1. Fare doppio clic sul primo file da quantificare. Osservare una nuova finestra pop-up. Sotto "opzioni" (menu in alto), personalizzare le etichette per visualizzare in ogni immagine.
      2. Nella palette strumento giusto, andare a "Regolazione immagine". Per impostazione predefinita, le intensità minime e massime sono impostati su "auto" e visualizzati in arcobaleno pseudocolori. Selezionare "manuale" per modificare le impostazioni, se necessario.
        NOTA: Per esempio, tutte le immagini esportate possono avere barre identici LUT (minimi identici e maxima) per essere facilmente comparabili.La regolazione dei minimi e massimi non ha alcun impatto sui risultati quantitativi.
      3. Clicca su esportazione delle immagini, selezionare png, la directory e un nome di immagine
    7. Quantificazione delle Regioni di interesse (ROI)
      1. Vai allo strumento "ROI" nella palette degli strumenti. Selezionare il metodo di ROI (cerchio, rettangolare, auto, o mano libera) e il numero di ROI. Osservare la finestra ROI pop-up nella finestra dell'immagine.
      2. Utilizzando il mouse, regolare le dimensioni e la posizione. Utilizzare soglie ROI identici per tutte le immagini se si utilizza lo strumento di auto-ROI. Utilizzare aree identiche per tutte le immagini se le dimensioni e le posizioni di ROI sono definite manualmente (ad esempio, ROI circolari).
      3. Clicca su "Misura RO.I. Osservare una nuova finestra pop-up. Personalizzare le colonne (ad esempio, il nome del file, il numero degli animali, il gruppo, esperimento, zona, conteggi totali, conte medie, conteggi SD, min e max conta, zona, tempo punto, il tempo di iniezione della sonda, ecc.) Salvare le impostazioni personalizzate. Quando reAdy, selezionare tutto (Ctrl + A), e copiare e incollare la tabella in un foglio di calcolo.
      4. Esportare l'immagine come png con le ROI in atto. Salvare e chiudere il file di immagine.
    8. Ripetere la procedura (punti 3.1.6 - 3.1.7) per tutti i file di immagini che devono essere quantificati. Copiare tutti quantificazioni ROI nel foglio di calcolo.
      NOTA: Qui, i risultati possono essere ordinati per gruppo, punto di tempo, ecc e analizzati statisticamente. Utilizzare i conteggi totali di segnali bioluminescenza nella ROI per le analisi statistiche.
  2. Near-Infrared (NIR) analisi delle nanoparticelle fluorescenti
    1. Utilizzando i controlli nel software, regolare la soglia dell'immagine.
      NOTA: Ciò non ha alcun impatto sul risultato quantitativo.
    2. confrontare visivamente le immagini catturate a Ex / Em 675/720 e Ex / Em 640/700 per valutare la specificità del segnale.
    3. Utilizzare le immagini catturate a Ex / Em 675/720 per l'analisi quantitativa (massima eccitazione: 680 nm). Definire ROI, per le quali può essere utilizzato lo strumento di auto-ROI. Regolare la soglia di auto-ROI e utilizzarlo per tutte le immagini. Quantificare l'efficienza totale radiante a ROI (vedi punto 3.1).
  3. Near-Infrared (NIR) analisi della sonda proteasi sensibili
    1. Utilizzando controlli software, regolare la soglia dell'immagine.
      NOTA: Ciò non ha alcun impatto sul risultato quantitativo. Eseguire unmixing spettrale della auto-fluorescenza. Lo strumento unmixing è implementato in Living immagine. L'auto-unmixing utilizza l'Ex / Em 640/700 come specifico e 675/720 come l'immagine auto-fluorescente.
    2. Selezionare l'immagine non miscelato e definire le ROI, come descritto sopra. Utilizzare l'efficienza radiante totale nel ROI per le analisi quantitative e statistiche.

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Representative Results

Andamento temporale della bioluminescenza di neurite ottica

Il segnale della sonda bioluminescenza infiammazione era il più forte attorno agli occhi e si è verificato esclusivamente in topi EAE con neurite ottica. Un segnale si è verificato nel né i topi non EAE né i topi non iniettati con la sonda infiammazione. Il segnale è scomparso quando i topi recuperato. Quindi, il segnale è specifico per neurite ottica, e il picco del segnale parallelo il picco dei punteggi clinici EAE. La Figura 1 mostra due esempi di topi SJL / J impressi al giorno 10 e 14 dopo EAE induzione. Il segnale bioluminescente è stato il più alto il giorno 10 e scomparve quando i topi hanno iniziato a recuperare. I corsi di tempo dei punteggi clinici abbinati alla scomparsa del segnale bioluminescente (ad esempio-1) o preceduto (ad esempio-2) il declino dei punteggi.


Figura 1. Andamento temporale di neurite ottica e punteggi clinici in EAS-SJL / J topi. Immagini bioluminescenti di neurite ottica sono stati catturati 10 minuti dopo l'iniezione della sonda infiammazione (100 l ip) durante il 1 ° riacutizzazione della malattia in due SJL / J topi in diversi momenti dopo l'immunizzazione. Le immagini bioluminescenti (pannello di sinistra) sono stati catturati 10 e 14 giorni dopo la vaccinazione e sono presentati come arcobaleno PseudoColor sovrapposizioni fotografia. bar Lut vanno dal blu (basso) al rosso (alto-bioluminescenza). Barra di scala: 1 centimetro. Il pannello di destra mostra grafici a barre dei singoli conteggi totali in bioluminescenza ROI (media ± DS di 3 immagini ciascuno) e relativi tempi dei punteggi EAE clinica. Le frecce rosse indicano le giornate di imaging. Clicca qui per visualizzare un grande version di questa figura.

La valutazione di efficacia del trattamento

sonda infiammazione

Gli effetti del farmaco (R-flurbiprofene 5 mg / kg / d) 5 sono mostrati in Figura 2. Cinque esempi di immagini bioluminescenti in ogni gruppo sono presentati. I punteggi nel gruppo dei veicoli e trattamento sono stati eterogenei, ma in tutti i topi, il segnale bioluminescente negli occhi mostrando infiammazione del nervo ottico era più bassa nel gruppo farmaco (Figura 2A). La quantificazione del totale dei conti bioluminescenti in ROI significativo confermato l'efficacia del trattamento (Figura 2B, con il contenitore di trame dei conteggi totali bioluminescenti, spaiato 2 dalla coda t-test, p <0.05). I risultati di imaging concordati con l'effetto terapeuticos del farmaco in termini di punteggi clinici e manifestazioni istopatologica di EAE nel midollo spinale e nervo ottico 5.

figura 2
Figura 2. L'efficacia del farmaco in EAE-SJL / J topi utilizzando Bioluminescent Imaging. topi SJL / J ricevuto veicolo o farmaci (R-flurbiprofene 5 mg / kg / die) dal giorno 5 dopo l'immunizzazione. Le immagini sono state acquisite dopo l'iniezione della sonda infiammazione (100 microlitri ip) al 1 ° EAE picco, n = 10 per gruppo. EAE sviluppato in 7/10 in entrambi i gruppi, e EAE non responders erano senza segnale. A) le immagini bioluminescenza in topi vivi catturati 5 - 15 minuti dopo l'iniezione ip di 100 ml della sonda infiammazione sono presentati come arcobaleno PseudoColor sovrapposizioni fotografia. bar LUT vanno dal blu (basso) al rosso (alta intensità). Barra di scala: 1 centimetro. Il picco individualedel totale dei conti bioluminescenti in ROI è stato utilizzato per la quantificazione. ROI sono stati limitati alla testa. I siti di iniezione PLP sono stati schermati con un panno nero. B) trame di dialogo che mostra la quantificazione del totale dei conti in ROI. La scatola rappresenta l'intervallo interquartile, la linea è la mediana, e i baffi mostrano il minimo ad un massimo. I conteggi totali differivano significativamente tra i due gruppi (t-test di 2 lati spaiato, P <0,05), con una riduzione di neurite ottica ed encefalite nei topi trattati con il farmaco. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Nanoparticelle fluorescenti pegilati

immagini epifluorescenza di nanoparticelle vicino infrarosso hanno rivelato perdite vascolari intorno agli occhi e nel cervello sia in Grou trattamentops (Figura 3A, 2 esempi). Le particelle distribuiscono molto lentamente dal sangue allo spazio interstiziale, fatta eccezione per i siti di infiammazione, in cui il colorante si accumula, consentendo una valutazione dell'integrità BBB. La perdita era evidente a 3 he 24 h dopo l'iniezione delle nanoparticelle, ma era più forte al punto secondo momento. Non c'era alcun segnale specifico nei topi non-EAE o topi non iniettati con nanoparticelle (pannello di destra). Quindi, il segnale era specifico. L'analisi quantitativa dell'efficienza radiante in ROI (Figura 3B) non ha rivelato differenze significative tra i gruppi di trattamento (n = 3 per gruppo, spaiato 2-tailed t-test, P <0,05).

Figura 3
Figura 3. Valutazione della barriera emato-encefalica Turbativa con interferone pegilato fluorescente nanoparticelle. SJL / J topi hanno ricevuto veicolo o farmaci (R-flurbiprofit 5 mg / kg / die) dal giorno 5 dopo l'immunizzazione. Le immagini sono state catturate 3 ore e 24 ore dopo l'iniezione di vicino-infrarosso marcato nanoparticelle (70 ml iv) durante il picco 1 ° EAE, n = 3 per gruppo. EAE non-responder erano senza segnale. L'attrezzo auto-ROI è stato utilizzato per la quantificazione dell'efficienza radiante. Le ROI sono stati limitati alla testa. I siti di iniezione PLP sono stati schermati. A) le immagini epifluorescenza esemplari di topi vivi, catturati 3 ore e 24 ore dopo l'iniezione di nanoparticelle. Immagini di topi senza EAE o senza l'iniezione di nanoparticelle sono stati usati come controlli di imaging. Barra di scala: 1 centimetro. bar LUT vanno dal rosso scuro (basso) al giallo (alta intensità). B) I grafici a barre che mostrano la quantificazione dell'efficienza radiante a ROI (media ± SD). i gruppi di trattamento non sono molto diverse (2 lati spaiato t-test). Clicca qui per v iew una versione più grande di questa figura.

Metalloproteinasi della matrice sensibile sonda

Dopo aver sottratto l'auto-fluorescenza, le immagini della sonda MMP-proteasi attivabili rivelato l'infiammazione nel cervello e il midollo spinale nei topi EAE (Figura 4A, esempi di 4 topi per gruppo). Non c'era alcun segnale nei topi non iniettati con la sonda, e un segnale debole si è verificato in un mouse EAE senza sintomi clinici (non-responder). Immagini in Figura 4 mostrano il segnale Ex / Em 640/700 sottratta dall'immagine a Ex / Em 675/720. Le differenze tra i trattamenti sono stati rivelati solo dopo l'analisi quantitativa dell'efficienza radiante in auto-ROI dopo unmixing spettrale (Figura 4B, spaiato 2-tailed t-test, n = 6 e 4, P <0,05).

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Figura 4. Valutazione della Metalloproteinase attività con vicino infrarosso Imaging Probe MMP-sensibili. topi SJL / J ricevuto veicolo o farmaci (R-flurbiprofene 5 mg / kg / die) dal giorno 5 dopo l'immunizzazione. Le immagini sono state catturate 24 ore dopo l'iniezione della sonda al 1 ° picco EAE (150 ml IV), n = 6 e 4. I siti di iniezione PLP sono stati schermati. EAE non-responder ed i mouse senza iniezioni sonda MMP sono stati utilizzati come controlli. Ogni 2 immagini sono state catturate a Ex / Em 640/700 nm (segnale specifico) e 675/720 nm (auto-fluorescenza). Utilizzando lo strumento unmixing spettrale, l'auto-fluorescenza è stato sottratto e successivamente, lo strumento di auto-ROI è stato utilizzato per identificare i siti di specifica attività di MMP. L'efficienza radiante totale è stato usato per la quantificazione. A) le immagini epifluorescenza esemplare topi vivi catturati 24 ore dopo l'iniezione della sonda. Le immagini sono il risultato di unmixing spettrale (UMX). Barra di scala: 1 centimetro. bar LUTgamma s dal rosso scuro (basso) al giallo (ad alta intensità). B) trame di dialogo che mostra la quantificazione del totale efficienza radiante in ROI. La scatola rappresenta l'intervallo interquartile, la linea è la mediana, e i baffi mostrano il minimo ad un massimo. L'asterisco indica una differenza significativa tra i gruppi (t-test non appaiati 2 lati, P <0,05). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il presente video mostra le tecniche di bioluminescenza e fluorescenza nel vicino infrarosso imaging in vivo di EAE in topi SJL / J. Abbiamo dimostrato che l'imaging bioluminescenza utilizzando una sonda infiammazione sensibile mostra principalmente neurite ottica, e la quantificazione concorda con la valutazione clinica di EAE gravità e gli effetti del farmaco. Tuttavia, il metodo di imaging bioluminescenza non era in grado di rilevare l'infiammazione del midollo spinale lombare, che è un sito primario di EAE manifestazione 17, probabilmente perché il segnale viene assorbito dalla colonna vertebrale.

Imaging vicino infrarosso è più sensibile, ma a spese di elevata interferenza con auto-fluorescenza, che non si verifica con bioluminescenza. Il tempo di esposizione del NIR è molto più breve (1 - 2 s) rispetto al BLI (2 - 5 min), il che rende NIR il metodo preferito per le serie temporali con rapida evoluzione intensità di segnale.

Passaggi critici connel protocollo e limiti della tecnica

Segnali del sito vaccinazione interferiscono con le immagini del midollo spinale in EAE, ma questo può essere aggirate localizzando entrambi i siti di iniezione alla base della coda, che non era inferiore ai siti di iniezione raccomandate (collo e la base della coda). Tuttavia, è necessario proteggere i siti di iniezione con un panno nero.

Per l'imaging bioluminescenza, è fondamentale per acquisire una serie temporale di immagini, perché la cinetica differiscono tra gli animali. Per evitare distorsioni causate da cinetiche, immagini di coppie di controllo (ad es, veicolo o wild type) e verum (ad esempio, droga o transgenici) topi è vantaggioso. Secondo il produttore, il segnale deve essere stabile per 30 min. Tuttavia, in EAE, abbiamo osservato la cinetica più veloce e più transitori, con picchi che si verificano in 5 - 10 minuti e un sostanziale declino a 15 min.

Per l'imaging nel vicino infrarosso, il manufacturer raccomanda l'impostazione Ex / Em per una sonda specifica. Tuttavia, è stato utile per eseguire una serie di filtro inizialmente e per catturare sempre immagini ad almeno due combinazioni di eccitazione / emissione, che corrispondere al meglio alla riportato massimi Ex / Em e può essere utilizzato successivamente per unmixing spettrale di segnali non specifici.

E 'importante utilizzare topi bianchi, come SJL / J, perché la luce e fluorescenza sono molto assorbiti dal pelo nero. topi neri devono essere cautamente rasata in testa e tornare un giorno prima di imaging. Le lesioni cutanee devono essere evitati, perché essi appariranno come macchie infiammatorie e interferire con l'imaging del cervello o del midollo spinale. Per l'imaging NIR, il produttore consiglia la depilazione di tutti i topi, anche topi bianchi. Anche dopo la rasatura, le testa e la schiena risultati nei topi neri erano meno convincenti rispetto a topi bianchi (non mostrato). Per il modello EAE primaria progressiva nei topi C57BL6, topi bianchi C57BL6, che sono disponibili in commercio, possono essere un alternativo. , topi immunocompetenti SKH1 senza peli sono utili per l'imaging nel vicino infrarosso, ma non EAE, perché questi topi hanno un background genetico albino e non affidabile sviluppano EAE (punteggio massimo: 0,5 - 1). Imaging Bioluminescent utilizzando la sonda infiammazione in questi topi rivelato diversi punti infiammatorie della pelle (non mostrati) in cui siano persi follicoli piliferi.

NIR di imaging di attività della proteasi ha rivelato cerebrale e l'infiammazione del midollo spinale, ma i segnali sono stati sovrapposti da auto-fluorescenza, che richiede unmixing spettrale prima analisi quantitativa. Quindi, per immagini NIR è stata meno robusta di quanto l'imaging bioluminescenza ed era più costoso. Tuttavia, l'uso di sonde attivabili proteasi può essere utile per la valutazione di farmaci che specificamente metalloproteinasi della matrice.

Vantaggi e svantaggi

Le diverse tecniche di imaging sono gratuiti e rivolgere domande specifiche. I vantaggi di bioluminl'imaging escent sono economicità (circa 20 Euro / mouse); la mancanza di auto-bioluminescenza, che interferirebbero con il segnale; elevata specificità; comoda ip iniezione e l'analisi delle immagini; e robustezza ed affidabilità. Gli svantaggi sono lunghi tempi di esposizione e l'assorbimento del segnale da pelliccia nera e ossa.

Vantaggi del NIR sono la più ampia disponibilità di sonde NIR-marcate, la facilità di costume etichettatura NIR, breve tempo di esposizione, e ad alta sensibilità. Gli svantaggi sono i costi elevati (50 - 100 euro / mouse), l'assorbimento da pelliccia, forte interferenza con auto-fluorescenza, e la necessità di unmixing spettrale e l'elaborazione delle immagini prima dell'analisi.

Un certo numero di sonde sono disponibili che rileva i siti di infiammazione quanto attivati da enzimi pro-infiammatorie che sovraregolati nei siti di infiammazione (per esempio, perossidasi o metalloproteinasi) causa l'infiltrazione di cellule immunitarie. Alcune di queste sonde saranno anche rilevare cators che dimostrano l'infiltrazione di cellule immunitarie nel microambiente tumorale o il rilascio di enzimi da parte del tumore stesso (ad esempio, MMP). Le sonde che si accumulano nei tessuti a causa di perdite capillare in grado di rilevare interruzioni nella BBB, ma anche in altri siti di infiammazione e cancro.

Importanza della tecnica con rispetto agli attuali metodi alternativi /

La combinazione di "immagine più piaghe clinici" era superiore a "soli punteggi" per la valutazione dello stato di malattia e la rilevazione degli effetti del farmaco. Il segnale di bioluminescenza intorno agli occhi è d'accordo anche con i precedenti studi istopatologici che mostrano la distruzione della mielina e infiltrati di cellule immunitarie nel nervo ottico 5. Circa 2/3 dei pazienti con SM sviluppano episodi di neurite ottica. Finora, non ci sono metodi non invasivi affidabili per quantificare neurite ottica nei topi, eccetto l'imaging di diffusione di risonanza magnetica (MRI) e op viventetical tomografia a coerenza (OCT), che sono tecnicamente impegnativo 18. PTOM è stato introdotto in EAE come metodo mostrando alterazioni retiniche e atrofia durante EAE, suggerendo una reazione autoimmune nel nervo ottico 19.

Rispetto al metodo descritto in questo manoscritto, OCT è un fattore di stress elevato per i topi, perché richiede anestesia profonda. La lettura non è una visualizzazione diretta del nervo ottico 19.

immagini nel vicino infrarosso di nanoparticelle fluorescenti è utile per visualizzare la rottura della BBB, che è un altro segno distintivo di EAE e MS. Inoltre MRI 20, 21, non esiste un metodo non invasivo per il monitoraggio in vivo di integrità BBB. Questo sarebbe molto utile, perché i farmaci sperimentali e fito-farmaci specificamente agiscono serrando la barriera 22, 23, che ostacola normalmente eccessivo reclutamento dei linfociti nel sistema nervoso centrale 24. Prevenire l'attaccamento dei leucociti o trasmigrazione attraverso la BBB e riducendone la permeabilità è una strategia efficace nel trattamento MS 25, e di imaging nanoparticelle può aiutare a valutare l'efficacia dei farmaci candidati. Finora, le particelle sono costosi. Microscopia intravitale è un'altra tecnica utilizzata per visualizzare BBB integrità 26, ma richiede normalmente, anestesia profonda lunga durata (per esempio, con ketamina e xilazina) a causa della craniotomia e non consente risveglio topi, impedendo così analizza decorso temporale. Tuttavia, la microscopia intravitale offre immagini ad alta risoluzione al cellulare a livelli subcellulari, che non è ottenibile con l'imaging in vivo.

Le applicazioni future o Indicazioni Dopo aver imparato la tecnica

In sintesi, la te di imagingrie presentati nel presente video di aiuto per valutare le singole corsi della malattia e per monitorare gli effetti dei farmaci, che erano in parte non rivelato da soli punteggi clinici. Le tecniche sono d'accordo con i principi 3 "R" di sostituzione, riduzione e affinamento in esperimenti su animali e sono utili add-on strumenti di ricerca di droga.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata sostenuta dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC1039 A3) e il programma di finanziamento della ricerca "Landesoffensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) dello Stato di Hessen, Centro di Ricerca per traslazionale Medicina e Farmacologia TMP e la Else Kröner-Fresenius Fondazione (EKFS), Gruppo formazione mediante la ricerca traslazionale Research Innovation - Pharma (TRIP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AngioSpark-680 Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA NEV10149 Imaging probe, pegylated nanoparticles, useful for imaging of blood brain barrier integrity
MMP-sense 680 Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA NEV10126 Imaging probe, activatable by matrix metalloproteinases, useful for imaging of inflammation
XenoLight RediJect Inflammation Probe Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA 760535 Imaging probe, activatable by oxidases, useful for imaging of inflammation
PLP139-151/CFA emulsion  Hooke Labs, St Lawrence, MA EK-0123 EAE induction kit
Pertussis Toxin Hooke Labs, St Lawrence, MA EK-0123 EAE induction kit
IVIS Lumina Spectrum Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA Bioluminescence and Infrared Imaging System
LivingImage 4.5 software  Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA CLS136334 IVIS analysis software
Isoflurane Abbott Labs, Illinois, USA 26675-46-7 Anaesthetic

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References

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Medicina encefalomielite autoimmune la sclerosi multipla neurite ottica ottica immagini dal vivo bioluminescenza a raggi infrarossi infiammazione
Bioluminescenza e vicino infrarosso Imaging di neurite ottica e cervello infiammazione nel modello EAE della sclerosi multipla nei topi
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Schmitz, K., Tegeder, I.… More

Schmitz, K., Tegeder, I. Bioluminescence and Near-infrared Imaging of Optic Neuritis and Brain Inflammation in the EAE Model of Multiple Sclerosis in Mice. J. Vis. Exp. (121), e55321, doi:10.3791/55321 (2017).

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