Summary
Aquí, se presenta un protocolo para aislar microglia de crías de ratón postnatal (día 1) para la experimentación in vitro. Este método improvisada de aislamiento genera tanto alto rendimiento y pureza, una ventaja significativa sobre métodos alternativos que permite amplia experimentación gama para los fines de elucidar la biología microglial.
Abstract
Microglia son los respondedores primarios a los insultos del sistema nervioso central; Sin embargo, aún queda mucho por conocer acerca de su papel en la regulación de la neuroinflamación. La microglía son las células del mesodermo que funcionan de manera similar a los macrófagos en topografía estrés inflamatorio. El (M1-tipo) clásico y (de tipo M2) alternativa activaciones de los macrófagos también se han extendido a la microglía en un esfuerzo por entender mejor la interacción subyacente estos fenotipos tienen en condiciones neuroinflammatory como el Parkinson, el Alzheimer y las enfermedades de Huntington. En la experimentación vitro utilizando microglia primaria proporciona resultados rápidos y fiables que pueden ser extendidas al ambiente en vivo. Aunque esta es una clara ventaja sobre la experimentación in vivo, aislar microglia, mientras que el logro de rendimientos adecuados de pureza óptima ha sido un reto. Los métodos comunes actualmente en uso ya sea sufren de baja recuperación, baja pureza, o ambos. Aquí, nos demtrar un refinamiento del método de separación magnética CD11b libre de columnas que logra una recuperación de células de alta y una mayor pureza en la mitad de la cantidad de tiempo. Proponemos este método optimizado como un modelo muy útil de aislamiento primaria microglial a los efectos de estudiar la neuroinflamación y la neurodegeneración.
Introduction
La microglía son macrófagos residentes Myb-independientes de origen mesodérmico, que diferencian de c-kit + / CD45- erythromyeloid progenitores en las islas de sangre del saco vitelino 1, 2. Una vez microglia embriológicas han colonizado el sistema nervioso central (CNS), en su transición desde una ameboide a una forma ramificada 3. Estos microglia adultos se clasifican como surveillant ya que sus ramificaciones dinámicos para sondear el parénquima cerebral saludable para posibles insultos 4. Aunque microglia sólo contribuyen a aproximadamente el 10% de la población de células del SNC, su capacidad de baldosas entre sí asegura el escaneado máxima del parénquima 4, 5. Patrones de peligro asociado-moleculares (amortigua), tales como α-sinucleína 6, 7 y amiloide-β 8, o ppatrones moleculares athogen asociados-(PAMP), tales como el lipopolisacárido (LPS) 9, clásicamente activan microglia para promover una respuesta inflamatoria caracterizada por la reversión al estado activo ameboide y la producción de óxido nítrico, factor de necrosis tumoral-α (TNF), 1β interleucina ligando (IL-1β), IL-6, IL-12, y el motivo de quimioquinas CC 2 9, 10, 11. En condiciones neuroinflamatorios tales como la enfermedad de Parkinson, en los que patógena α-sinucleína ha acumulado, un ciclo neurodegenerativa se crea a partir de la muerte de las neuronas dopaminérgicas, que liberan más agregado α-sinucleína, promover aún más la activación clásica de la microglia 7. Similar a los macrófagos periféricos, microglia también puede tener la capacidad de activar alternativamente en presencia de las citoquinas antiinflamatorias IL-4 e IL-10, dándoles la potenteial de promover la reparación neural y atenuar la inflamación 2, 11. Aparte de sus papeles inmunológicos en el SNC, microglia se han descrito como reguladores vitales de circuitería neuronal mediante la poda sinapsis durante el desarrollo. Por ejemplo, los ratones KO Cx3cr1- tienen microglia menos densas y la reducción de la poda sináptica, lo que conduce a una sobreabundancia de las espinas dendríticas, las sinapsis inmaduras, y los patrones electrofisiológicas de un CNS subdesarrollado 12. La comprensión de estas complejidades fisiológicos y los diversos papeles funcionales de microglia en la homeostasis del SNC es crítica para la búsqueda de agentes terapéuticos dirigidos trastornos neurodegenerativos.
En el área de Neuroinmunología, los experimentos in vitro son muy deseables debido a la mayor viabilidad para estudios mecanísticos, los menores costes de mantenimiento, y por ser menos tiempo y mano de obra intensiva. Furthermore, la capacidad de aislar poblaciones de células es crítica para delinear la funcionalidad de aquellas células diana en las condiciones prescritas. Existen numerosos métodos de aislamiento microgliales, pero están limitados por su capacidad para obtener un número relativamente alto y de pureza de amplia experimentación 13, 14, 15. Por ejemplo, un grupo de 11b diferenciación (CD11b) es un marcador de superficie común de los monocitos, macrófagos y microglia 16. Mediante la explotación de CD11b, un método de separación magnética fue descrito primero como un enfoque basado en la columna que produjo ~ 99,5% de pureza y ~ 1,6 x 10 6 microglia por cerebro neonatal 17. Nuestro laboratorio ha desarrollado recientemente un método libre de la columna CD11b magnético de separación 15, que se realizó en un tubo de poliestireno mediante el etiquetado de CD11b con un anticuerpo monoclonal conjugado con ficoeritrina (PE). Una seconda biespecíficoanticuerpo ry a PE y complejos de dextrano con la PE. Una vez unido, se introducen partículas magnéticas revestido con dextrano, que se unen al extremo de dextrano del complejo de anticuerpo. Por último, el tubo de poliestireno se coloca en un imán para el aislamiento microglial. Este enfoque se duplicó el rendimiento de ~ 3,2 x 10 6 microglia por cerebral neonatal, pero a costa de reducir la pureza de ~ 97%.
En este documento, se demuestra un protocolo de separación rápida y refinado libre de columnas CD11b magnético (Figura 1). Este método mejorado sigue siendo tan factible como nuestro método libre de columna original ya que el precio del kit de separación magnética CD11b es el mismo. El tiempo de terminación se reduce en un medio, que puede ser crucial para maximizar la supervivencia celular y el rendimiento. Notablemente, la pureza logrado a partir de este método es optimizado ~> 99%, una mejora con respecto a la pureza alcanzado desde el método original libre de columnas desarrollado por nuestro laboratorio 15. Lo más importante, CD11b-PEno se utiliza, eliminando la necesidad de incubar lejos de la luz y permitiendo el uso del canal rojo para microscopía de fluorescencia. Por último, como en el método original CD11b, una fracción de los astrocitos de alto rendimiento y pureza se obtiene con este método mejorado. Los astrocitos son las más numerosas células gliales en el sistema nervioso central, dando lugar a la idea de que sus funciones homeostáticas son indispensables en relación con la fisiopatología 18. Estas células gliales juegan un papel en diversas funciones fisiológicas, tales como la formación de la barrera sangre-cerebro, proporcionando soporte de nutrientes, mantenimiento de la homeostasis de neurotransmisores, formando cicatrices gliales en respuesta a una lesión, la neuroprotección, el aprendizaje y la memoria, y la neuroinflamación, ejemplificando su potencial de investigación en glial biología 19. Morfología y funcionalidad de la microglia y astrocitos se han comprobado a través de microscopía confocal, Western Blot, cuantitativa en tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa (QRT-PCR), Gensayo de nitrito Riess, y el ensayo multiplex de citocinas Luminex. El refinamiento proporcionada por este protocolo ofrece una mayor confianza perteneciente a la pureza de la microglia o los astrocitos, una aplicación más amplia de microscopía de fluorescencia con la disponibilidad del canal rojo, y ahorra tiempo, todos los cuales son importantes para la experimentación in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
El uso de los animales y los procedimientos de protocolo fue aprobado y supervisado por el Comité Institucional Animal Cuidado y Uso (IACUC) de la Universidad Estatal de Iowa (Ames, IA, EE.UU.)
1. Cultivo de mixtos gliales culturas
- Decapitar 1- 2 días de edad, los cachorros rápidamente con unas tijeras que operan 5,5 pulgadas, y colocar las cabezas inmediatamente en un tubo de 50 ml en hielo. Tenga en cuenta que este es el modo de la decapitación de la eutanasia.
- En una campana de flujo de aire laminar, hacer una pequeña incisión en el cráneo y las meninges utilizando 4,5 pulgadas tijeras de disección micro rectas. Iniciar el corte desde el extremo caudal al extremo rostral (nariz). Obtener debajo de la piel mediante el uso de la abertura formada por la decapitación.
- Después de la incisión, la cáscara de uno de los hemisferios a un lado. A continuación, utilice un par de pinzas curvadas o en forma de gancho para eliminar todo el cerebro.
- Sumergir el cerebro (s) en un nuevo tubo de 50 ml que contiene 0,25% de tripsina-ethylenediaminetetraacetácido (EDTA) durante 15 min comió en un baño de agua C 37 °. Utilice 2 ml de tripsina-EDTA por cerebro.
- Lavar el cerebro (s) con medio fresco de crecimiento (10% de FBS, DMEM / F12, 1% de penicilina / estreptomicina, 1% de L-glutamina, piruvato de sodio al 1%, y 1% de aminoácidos no esenciales) mediante la adición y la eliminación de la medios de comunicación. Repita este 4x.
- Para cada cerebro, la placa de dos T-75 matraces que contienen medio de crecimiento. Por lo tanto, añadir 2 ml de medio de crecimiento por cerebro al tubo. Por lo tanto, será un equivalente de 1 ml de cerebro se homogeneizó con 8-9 ml de medio de crecimiento por matraz T-75.
- Homogeneizar triturando el cerebro (s) con pipetas de diferentes tamaños de apertura, en orden de mayor a menor. Cuando se ve que el tejido cerebral no se hace más pequeño, la transición a la siguiente pipeta. Al final de la trituración, la suspensión debe ser clara, sin trozos visibles.
- Utilice una pipeta de 25 ml, 5 ml de la pipeta, y entonces un ml pipeta secuencialmente 10.
- Pase cada homogsuspensión de cerebro enous a través de un filtro de células de 70 m para que sea en un único cultivo celular.
- Para cada cerebro se homogeneizó, placa dos matraces T-75 que contiene medio de crecimiento, como se describe en el paso 1.5 (1 ml de cerebro se homogeneizó con 8-9 ml de medio de crecimiento por matraz T-75).
- Cambio de medio de crecimiento después de 6 d y crecer hasta que el aislamiento de los 16 días.
2. Aislamiento de las células microgliales
- Después de 16 días, eliminar el medio de crecimiento del matraz y colocarlo en un tubo fresco 50 ml. Añadir 3 ml 0,25% de tripsina-EDTA a cada matraz T-75. Agitar los frascos durante 5 min a TA en un agitador orbital.
- Centrifugar el medio de crecimiento se eliminó a 0,4 xg durante 5 min y utilizar para detener la reacción con tripsina-EDTA en la etapa subsiguiente.
- Después de agitar durante 5 min, añadir un mínimo de 4 ml de medio de crecimiento (fresco o los medios de comunicación utilizado a partir de 2.1.1) para detener la reacción con tripsina-EDTA.
- Se tritura para asegurar que toda la cells se hayan separado.
- Después de la trituración, pasar las células a través de un filtro de células de 70 m para que sea en un único cultivo celular, realizar un recuento de células, y después de girar las células a 0,4 x g durante 5 min.
- Para cada 100 x 10 6 células (aproximadamente 15 x matraces T-75), utilizar 1 ml de medio recomendado (2% de FBS, DPBS (calcio y magnesio libre de cloruro), EDTA 1 mM) para resuspender el sedimento celular.
NOTA: Todos los pasos siguientes se adaptan para una separación de 1 ml. - Tomar un tubo de poliestireno de 5 ml, añadir 1 ml de medio recomendado, y marcar el menisco. Añadir recomendado del papel hasta 2,5 ml y marcar esto también. Desechar los medios recomendados y transferir las células resuspendidas al tubo de poliestireno de 5 ml.
- Añadir 50 l de suero de rata para cada 1 ml de células suspendidas. Incubar durante 5 min a TA.
- Preparar cóctel selección mezclando 25! L de componente A y 25 l de componente B. Estos componentes son propietarios.
- Añadir 501; L del cóctel de selección a las células. Incubar durante 5 min a TA.
NOTA: Para los cultivos puros, repita el paso 2.9 (recomendable pero no obligatorio). - microesferas de vórtice durante 45 s. Añadir 80 l de microesferas por 1 ml de muestra. Incubar durante 3 min a TA.
- Llevar el volumen a 2,5 ml en el tubo de poliestireno mediante la adición de los medios recomendados.
- Poner el tubo en el imán durante 3 minutos a temperatura ambiente. Ajuste de la incubación para aumentar la pureza. Verter lentamente a cabo los soportes recomendados en un tubo de 15 ml con el imán todavía en el tubo de poliestireno.
- Repita el paso 2.12 tres veces más. incubaciones magnético adicional se puede realizar para aumentar la pureza.
- Añadir 3 ml de medio de crecimiento y contar el número de células utilizando un contador de células.
- células de la placa en consecuencia en el poli-D-lisina (PDL) placas recubiertas para tratamientos. Tratar las células 48 h después de sembrar placas recubiertas con inPDL. Esto permite que las células se recuperen de la tensión de la separación.
NOTA: Check la pureza del cultivo utilizando inmunocitoquímica como se ha descrito previamente 15. - Placa de la fracción negativa (recogido en un tubo de 15 ml), que en su mayoría contiene astrocitos, en matraces T-75 en el medio de crecimiento.
- Después de al menos 6 h de incubación en 37 ° C incubadora, cambiar el medio y se deja crecer O / N. Dividir los astrocitos al día siguiente para tratamientos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Microglia aislado utilizando el kit de CD11b selección positiva II tienen alta pureza
microglia primarios de ratón se aislaron utilizando el protocolo mencionado anteriormente y se sembraron en cubreobjetos de poli-D-lisina para comprobar la pureza de aislamiento. Diez mil células se sembraron por pocillo y el análisis inmunocitoquímico se realizó usando ionizado molécula adaptadora de unión de calcio-1 (Iba1) como marcador de la microglia y la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) como marcador de astrocitos para comprobar la pureza de la microglia aislado . El cultivo aislado sólo se expresa Iba1 sin expresión GFAP (Figura 2A), sugiriendo que el cultivo aislado fue microglia puros. A diferencia de otros métodos publicados anteriormente para la separación microglial primaria, que alcanzó ~ 97% de pureza, utilizando este método obtuvimos ~> 99% de pureza en la mitad del tiempo. A fin de validar la pureza de º es la cultura, nos encontramos con un Western blot 20 para Iba1 y GFAP. El análisis por inmunotransferencia reveló además que este aislamiento de los cultivos gliales mixtos era una cultura microglial casi puro (Figura 2B).
El procedimiento de aislamiento modificado no tiene auto-fluorescencia de perlas magnéticas
El canal rojo no se puede utilizar para inmunocitoquímica (ICC) utilizando el kit anterior aislamiento CD11b para la separación microglial como se ha mencionado por Gordon et al. 15 debido a la utilización de etiquetado PE durante la separación. El uso de este nuevo kit de aislamiento libre de PE, podemos utilizar el canal rojo para el análisis inmunocitoquímico (Figura 3). De este ICC, es evidente que este nuevo método nos permite utilizar todos los canales para la citometría de flujo u otros estudios de imágenes fluorescentes.
ve_step" fo: keep-together.within-page = "1"> microglial culturas aislados responden funcionalmente a LPS estímuloPara verificar que la microglia aislado son funcionalmente activos, se trataron las células con LPS, un estimulante ampliamente utilizado 9 para activar microglia, durante 24 h antes de sondeo de varios factores pro-inflamatorias. la activación microglial Classical está acompañada por la liberación de nitrito y diversas citoquinas pro-inflamatorias en los medios de comunicación. Por lo tanto, hemos utilizado múltiples ensayos complementarios para confirmar la actividad funcional de nuestro microglia aislado. En primer lugar, se utilizó el ensayo de Griess para mostrar que el LPS indujo dramáticamente la secreción de nitrito de la microglia aislado (Figura 4A). Para validar adicionalmente la actividad de microglia aislado, se utilizó qRT-PCR para mostrar (ácido ribonucleico mensajero) niveles de mRNA de NOS2, otra característica de la inflamación microglial, wi significativamente mejoradatratamiento LPS º (Figura 4B). A continuación, se utilizó un ensayo múltiple basado en perlas, Luminex 21, para verificar que el LPS estimula significativamente la secreción de citocinas pro-inflamatorias de la cultura microglial (Figura 5A). Además, se verificó mediante análisis de QRT-PCR que el tratamiento LPS mejora los niveles de expresión de genes de diversas citoquinas pro-inflamatorias, incluyendo IL-1β y TNF (Figura 5B). Todos estos datos sugieren juntos que microglia primarios aislados utilizando este método recién refinado son funcionalmente activos y muestran un perfil de activación similar a la microglia primarios aislados utilizando métodos publicados anteriormente.
microglia aislados pueden ser utilizados para estudios de señalización
Utilizando los métodos anteriores de aislamiento microglial, corriendo blo occidentalest para los estudios de señalización fue difícil y no factible debido al bajo rendimiento y pureza. Anteriormente, hemos demostrado que Fyn, una quinasa de la familia Src, está involucrada en una cascada de señalización pro-inflamatoria en células de la microglía 9. Aquí chapados un millón de células microgliales en una placa de 12 pocillos y después de 48 h, se recogieron las células para ejecutar transferencias de Western para Fyn nativo y Src quinasas fosforilada en el residuo de tirosina 416 (p-Src-Y416). Hemos sido capaces de detectar niveles tanto Fyn y p-Src-Y416 en nuestras células microgliales aisladas (Figura 6), lo que demuestra que este método es aplicable a técnicas de transferencia Western para los estudios de señalización.
La fracción negativa de la separación microglial contiene astrocitos que se puede utilizar para estudios de señalización
Los astrocitos son actores clave en la neuroinflamación, y la comprensión de los mecanismos de señalización detrás astrla inflamación y ocytic neurona-astrocito diafonía es importante 19. Aquí, se muestra que la fracción negativa de la separación microglial contiene células astrocíticos positivos para GFAP (Figura 7A). Además, nuestro análisis de transferencia de Western para Fyn y p-Src-Y416 (Figura 7B) mostró que ambas de estas proteínas se puede detectar en la fracción negativa también. Estos resultados juntos muestran que la fracción negativa es una preparación ideal para los estudios astrocíticos dirigidas a la identificación de proteínas importantes para cascadas de señalización inflamatorias.
Figura 1: Representación esquemática de Aislamiento de células microgliales de perritos 1-2 días post-natales. Haga clic aquí para ver una versión más grandede esta figura.
Figura 2: La microglía aislado utilizando el kit de selección positiva-CD11b II tienen alta pureza. (A) La inmunocitoquímica de la cultura microglial aislado de sondeo para GFAP en el canal rojo y Iba1 en el canal verde. (B) inmunotransferencia de cultura microglial aislado de sondeo para GFAP (~ 51 kDa), Iba1 (~ 15 kDa) y β-actina (~ 42 kDa). Barra de escala = 20 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: El procedimiento de aislamiento de modificación no tiene ningún Auto-fluorescencia de perlas magnéticas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: LPS estimulación Aumento de la producción de nitrito en Microglial Cultura. (A) las células microgliales aislados tratados con 1 mg / ml de LPS durante 24 h y se recogieron el medio de tratamiento para determinar la liberación de nitrito mediante el ensayo de Griess. (B) q-RT-PCR para NOS2 de microglia aislado tratado con LPS durante 24 h. Las cifras representan la media ± SE de 2 o más experimentos independientes. Los datos se analizaron mediante la prueba t de Student (p *0; 0,05, ** p <0,01, *** p <0,001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: LPS inducida pro-inflamatorias liberación de citoquinas de las células microgliales. Ensayo multiplex (A) Luminex se realizó en medio de tratamiento recogido de las células microgliales aislados tratados con 1 mg / ml de LPS durante 24 h. (B) q-RT-PCR para IL-1βand TNFa de microglia aislado tratado con LPS durante 24 h. Las cifras representan la media ± SE de 2 o más experimentos independientes. Los datos se analizaron utilizando la prueba t de Student (* p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Aislado microglía se puede utilizar para estudios de señalización. El análisis de transferencia Western muestra que Fyn y p-Src-Y416 pueden ser detectados a partir de microglia aisladas con nuestro método recién refinado.
Figura 7: La fracción negativa de la separación Microglial Contiene Los astrocitos que pueden ser utilizados para estudios de señalización. (A) la transferencia Western muestra que la fracción negativo contiene células GFAP positivas. (B) Análisis de transferencia Western muestra que Fyn y p-Src-Y416 pueden ser detectados a partir de las células GFAP positivas.target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| parámetros | método actual | método modificado | |
| Costo | $ 620 | $ 620 | |
| Hora | 55 min | 25 min | |
| Fluorescencia | Sí (canal rojo) | No | |
| Pureza | ~ 97% | ~ 99% | |
Tabla 1: Análisis comparativo entre el método de aislamiento refinado Microglial y el método original de aislamiento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
métodos de aislamiento microgliales mayores tienen recuperaciones limitadas que no son apropiados para diversos análisis de proteína por Western blot y análisis de ARN mediante qRT-PCR. La adherencia diferencial y métodos tripsinización leves son dos enfoques comunes con bajos rendimientos microgliales 13, 14, 15. El enfoque CD11b basado en columnas también tiene una baja recuperación, pero consigue una mayor pureza que la adherencia diferencial y tripsinización suave 13, 14, 15, 16, 17. Nuestro enfoque original CD11b libre de columna mejorado en gran medida los rendimientos aislados, lo que es adecuado para la proteína y el ARN se analiza tal como transferencia de Western y QRT-PCR, pero a costa de la disminución de pureza 15.
Nuestro método recién modificado conservalos rendimientos del método original y aumenta la pureza ligeramente de ~ 95-97% a ~> 99%, pero en la mitad del tiempo de finalización, que es crítica para la supervivencia celular. pasos cruciales en el protocolo pueden asegurar el aislamiento microglial óptima. Mientras decapitar a los cachorros, se debe tener cuidado para mantener las cabezas en hielo y para diseccionar en una cámara de flujo de aire laminar dentro de 5-10 min. tiempos prolongados de escisión cerebro hará que sea difícil obtener el cerebro completo, ya que comienza a perder su solidez a temperatura ambiente, poniendo en peligro los rendimientos de la microglía. En particular, si el paso 2.9 se repite al menos una vez, hay un aumento observable en la pureza y viabilidad. Si el rendimiento de la separación es bajo, la separación se puede repetir utilizando un menor número de matraces por ml de medio recomendado, o aumentando el volumen de separación (> 1 ml). La disminución de apiñamiento celular generalmente será mejorar la pureza, la viabilidad, y el rendimiento. El tiempo de incubación magnética puede ser extendido en el paso 2,12 para aumentar la pureza. Esto puedeasegurar adecuada magnético de unión de las microesferas que se adjuntan a la microglia. Además, las incubaciones magnéticos adicionales pueden llevarse a cabo en la etapa 2.9 en aras de aumentar la pureza y el rendimiento.
La viabilidad del protocolo es equivalente o mejor que el método original CD11b; Sin embargo, el nuevo método es refinada y más corto. Otra ventaja significativa obtenida de este método de refinado es la opción de utilizar el canal rojo para microscopía de fluorescencia, que está ocupada por PE en el método original (Tabla 1) 15. Aunque obtenemos alto rendimiento y pureza de la microglía con el método, el rendimiento de los astrocitos obtenidos a partir de esta separación es menos puro, ya que conserva algunos fibroblastos. Como se describe en el paso 2,17, después de la siembra los astrocitos e incubando durante 6 h, el medio de crecimiento debe ser reemplazado con medio fresco. Los astrocitos son la primera para adjuntar al matraz, mientras que gran parte de los fibroblastos permanecen en suspensión. La sustitución de los medios de comunicación en general, se eliminará la mayoría de los fibroblastos contaminantes. Aunque esta técnica asegura una alta pureza de los astrocitos, se justifica un método de purificación secundaria para lograr las culturas más puros.
En general, este método de aislamiento CD11b modificado genera células microgliales primarios de alta pureza y astrocitos en un corto periodo de tiempo. El tiempo de aislamiento más corto en general mejora las tasas de supervivencia celular. Se proporciona un sistema modelo útil para dilucidar los mecanismos de señalización subyacentes tanto microglial y astroglial biología.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) Subvenciones: NS088206 y ES026892. La W. Eugene y Linda Cátedra Lloyd a AGK y decanos Cátedra de AK también son reconocidas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EasySep CD11b Separation Kit II | StemCell Technologies | 18970 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1x) | Life Technologies | 11330057 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| MEM Non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-Glutamine (100x) | Life Technologies | 25030081 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | 13H469 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Technologies | 25200 | |
| Dulbecco's PBS (DPBS) | Gibco by Life Technologies | 14190250 |
References
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: from origin to neuropsychiatric disease. Nat Rev Neurosci. 15 (5), 300-312 (2014).
- Alliot, F., Godin, I., Pessac, B. Microglia derive from progenitors, originating from the yolk sac, and which proliferate in the brain. Brain Res Dev Brain Res. 117 (2), 145-152 (1999).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
- Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. Microglia: new roles for the synaptic stripper. Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).
- Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease. Neurobiol Aging. 29 (11), 1690-1701 (2008).
- Dzamko, N., Geczy, C. L., Halliday, G. M. Inflammation is genetically implicated in Parkinson's disease. Neuroscience. 302, 89-102 (2015).
- Xing, B., Bachstetter, A. D., Van Eldik, L. J. Microglial p38alpha MAPK is critical for LPS-induced neuron degeneration, through a mechanism involving TNFalpha. Mol Neurodegener. 6, 84 (2011).
- Panicker, N., et al. Fyn Kinase Regulates Microglial Neuroinflammatory Responses in Cell Culture and Animal Models of Parkinson's Disease. J Neurosci. 35 (27), 10058-10077 (2015).
- Moehle, M. S., West, A. B. M1 and M2 immune activation in Parkinson's Disease: Foe and ally? Neuroscience. 302, 59-73 (2015).
- Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nat Rev Immunol. 11 (11), 775-787 (2011).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
- Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. J Neurosci Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
- Saura, J., Tusell, J. M., Serratosa, J. High-yield isolation of murine microglia by mild trypsinization. Glia. 44 (3), 183-189 (2003).
- Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J Neurosci Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
- Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).
- Marek, R., Caruso, M., Rostami, A., Grinspan, J. B., Das Sarma,, J, Magnetic cell sorting: a fast and effective method of concurrent isolation of high purity viable astrocytes and microglia from neonatal mouse brain tissue. J Neurosci Methods. 175 (1), 108-118 (2008).
- Hasko, G., Pacher, P., Vizi, E. S., Illes, P. Adenosine receptor signaling in the brain immune system. Trends Pharmacol Sci. 26 (10), 511-516 (2005).
- Radulovic, M., Yoon, H., Wu, J., Mustafa, K., Scarisbrick, I. A. Targeting the thrombin receptor modulates inflammation and astrogliosis to improve recovery after spinal cord injury. Neurobiol Dis. 93, 226-242 (2016).
- Ay, M., et al. Molecular cloning, epigenetic regulation, and functional characterization of Prkd1 gene promoter in dopaminergic cell culture models of Parkinson's disease. J Neurochem. 135 (2), 402-415 (2015).
- Gordon, R., et al. Protein kinase Cdelta upregulation in microglia drives neuroinflammatory responses and dopaminergic neurodegeneration in experimental models of Parkinson's disease. Neurobiol Dis. 93, 96-114 (2016).
