Summary
هنا، نقدم بروتوكول لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة من الجراء الماوس بعد الولادة (يوم 1) لسنة المختبر التجريب. هذه الطريقة المرتجلة من العزلة يولد على حد سواء عالية الغلة والنقاء، وهي ميزة كبيرة على الطرق البديلة التي تسمح التجريب نطاق واسع لأغراض توضيح البيولوجيا دبقية.
Abstract
الخلايا الدبقية الصغيرة هي المستجيبين الأولية للإهانات الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك، لا يزال هناك الكثير غير معروف حول دورهم في تنظيم neuroinflammation. الخلايا الدبقية الصغيرة هي خلايا أرومية متوسطة التي تعمل على نحو مماثل لالضامة في المسح الإجهاد التهابات. كما تم تمديد الكلاسيكية (M1 من نوع) والبديل (M2 من نوع) التنشيط الضامة إلى الخلايا الدبقية الصغيرة في محاولة لفهم أفضل للتفاعل الكامنة وراء هذه الظواهر لها في ظروف neuroinflammatory مثل الشلل الرعاش والزهايمر، وأمراض هنتنغتون. في التجارب في المختبر الاستفادة الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية العروض نتائج سريعة وموثوق بها التي يمكن أن تمتد إلى البيئة في الجسم الحي. ورغم أن هذا هو ميزة واضحة على الجسم الحي في التجريب، وعزل الخلايا الدبقية الصغيرة مع تحقيق عوائد كافية من النقاء الأمثل قد يشكل تحديا. الطرق الشائعة المستخدمة حاليا إما يعانون من الانتعاش، وانخفاض النقاء، أو كليهما. هنا، نحن ماركاonstrate صقل للCD11b طريقة الفصل المغناطيسي خالية من العمود الذي يحقق الانتعاش خلية عالية وتعزيز نقاء في نصف مقدار الوقت. ونحن نقترح هذا الأسلوب الأمثل نموذجا مفيدا للغاية من العزلة دبقية الأولية لأغراض دراسة neuroinflammation والتنكس العصبي.
Introduction
الخلايا الدبقية الصغيرة هي الضامة المقيمين MYB مستقلة من أصل أرومية متوسطة، والتي تفرق من ج طقم + / CD45- erythromyeloid الأسلاف في الجزر الدم من الكيس المحي 1 و 2. مرة واحدة الخلايا الدبقية الصغيرة الجنينية قد استعمرت الجهاز العصبي المركزي (CNS)، والانتقال من أميبية إلى شكل متشعب 3. وتصنف هذه الخلايا الدبقية الصغيرة الكبار كما surveillant منذ تشعباتها ديناميكية التحقيق لحمة الدماغ صحية للإهانات المحتملة 4. على الرغم من أن الخلايا الدبقية الصغيرة تساهم فقط إلى ما يقرب من 10٪ من سكان الخلية CNS، وقدرتهم على البلاط بين بعضها البعض وتضمن المسح القصوى من لحمة 4 و 5. أنماط الخطر المصاحب الجزيئية (DAMPs)، مثل α-synuclein 6 و 7 و 8 اميلويد β، أو عathogen المصاحب أنماط الجزيئية (PAMPs) مثل lipopolysaccharide في (LPS) 9، وتفعيل كلاسيكي الخلايا الدبقية الصغيرة لتعزيز استجابة التهابية تتميز العودة إلى الدولة أميبية نشطة وإنتاج أكسيد النيتريك، عامل نخر الورم α (TNFα)، انترلوكين 1β (IL-1β)، IL-6، IL-12، وchemokine CC عزر يجند 2 9 و 10 و 11. في ظروف neuroinflammatory مثل مرض باركنسون، والتي تراكمت لديها الإمراض α-synuclein، يتم إنشاء دورة الاعصاب من موت الخلايا العصبية الدوبامين، التي تطلق أكثر مجمعة α-synuclein، زيادة تعزيز تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة الكلاسيكية من 7. على غرار الضامة الطرفية، قد يكون الخلايا الدبقية الصغيرة أيضا القدرة على تفعيل بدلا من ذلك في وجود السيتوكينات المضادة للالتهابات IL-4 و IL-10، مما يتيح لهم قويةالاتحاد العالمي للتعليم لتعزيز إصلاح العصبي وتخفيف التهاب 2، 11. وبصرف النظر عن الأدوار المناعية في الجهاز العصبي المركزي، وقد وصفت الخلايا الدبقية الصغيرة كمنظمات حيوية من الدوائر العصبية التي كتبها تشذيب نقاط الاشتباك العصبي خلال التنمية. على سبيل المثال، الفئران Cx3cr1- KO لها الخلايا الدبقية الصغيرة أقل كثافة وخفض التقليم متشابك، الأمر الذي يؤدي إلى فرط العمود الفقري شجيري، نقاط الاشتباك العصبي غير ناضجة، وأنماط الكهربية من متخلف CNS 12. فهم هذه التعقيدات الفسيولوجية والأدوار الوظيفية متنوعة من الخلايا الدبقية الصغيرة في التوازن للجهاز العصبي المركزي أمر بالغ الأهمية للبحث عن علاجات تستهدف الاضطرابات العصبية.
في مجال علم المناعة العصبية، في التجارب المختبرية ومرغوب فيه للغاية بسبب إمكانية أكبر للدراسات الميكانيكية، وانخفاض تكاليف الصيانة، ولكونها أقل زمنيا وكثيفة العمالة. Furthermoإعادة، والقدرة على عزل السكان الخلية أمر بالغ الأهمية لتحديد وظائف هذه الخلايا المستهدفة تحت الشروط المنصوص عليها. توجد طرق عديدة العزلة دبقية صغيرة، لكنها محدودة بسبب قدرتها على الحصول على أعداد كبيرة نسبيا ونقاء للتجريب واسعة 13 و 14 و 15. على سبيل المثال، مجموعة من 11B التمايز (CD11b) هي علامة السطح مشتركة من وحيدات، الضامة، والخلايا الدبقية الصغيرة 16. من خلال استغلال CD11b، وصفت طريقة الفصل المغناطيسي أولا باعتباره النهج القائم على العمود الذي أسفرت ~ 99.5٪ النقاء و~ 1.6 × 10 6 الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ حديثي الولادة 17. وضعت مختبرنا مؤخرا CD11b طريقة الفصل المغناطيسي خالية من الأعمدة 15، والتي أجرينا في أنبوب البوليسترين عن طريق وضع علامات CD11b مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة مترافق إلى فيكوإيريترين (PE). A SECONDA bispecificراي أجسام مضادة لPE والمجمعات ديكستران مع PE. مرة واحدة ملزمة، يتم إدخال الجزيئات المغناطيسية المغلفة ديكستران، الذي ربط نهاية ديكستران من مجمع الأضداد. وأخيرا، يتم وضع أنبوب البوليسترين في جذب للعزلة دبقية صغيرة. تضاعف هذا النهج العائد إلى ~ 3.2 × 10 6 الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ حديثي الولادة ولكن على حساب الحد النقاء إلى ~ 97٪.
هنا، علينا أن نظهر خالية من الأعمدة CD11b بروتوكول الفصل المغناطيسي السريع والمكرر (الشكل 1). لا تزال هذه الطريقة تحسن ممكنا كما لدينا وسيلة خالية من الأعمدة الأصلي لأن سعر الطقم الفصل المغناطيسي CD11b هو نفسه. يتم تقليل وقت الانتهاء منه في النصف، والتي يمكن أن تكون حاسمة لتعظيم بقاء الخلية والعائد. تجدر الإشارة إلى أن نقاء تحقق من هذا الأسلوب الأمثل هو ~> 99٪، تحسنا ملحوظا على مدى نقاء يتحقق من طريقة خالية من الأعمدة الأصلية التي وضعتها مختبرنا 15. الأهم من ذلك، CD11b-PEلا يستخدم، مما يلغي الحاجة لاحتضان بعيدا عن الضوء والسماح باستخدام القناة الحمراء للفحص المجهري مضان. وأخيرا، كما هو الحال في طريقة CD11b الأصلي، ويتم الحصول على جزء نجمي الخلايا من ارتفاع العائد والنقاء مع هذا الأسلوب محسن. الخلايا النجمية هي الخلايا الدبقية الأكثر عددا في الجهاز العصبي المركزي، مما يؤدي إلى فكرة أن مهامهم التماثل الساكن لا غنى عنها في ما يتعلق الفيزيولوجيا المرضية 18. هذه الخلايا الدبقية يلعب دورا في الوظائف الفسيولوجية المختلفة مثل تشكيل حاجز الدم في الدماغ، وتقديم الدعم المغذيات، والحفاظ على ناقل عصبي التوازن، وتشكيل الندوب الدبقية ردا على إصابة، العصبية والتعلم والذاكرة، وneuroinflammation، لاثبات قدراتهم التحقيق في الدبقية علم الأحياء 19. وقد تم التأكد من التشكل وظائف الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر، غرب النشاف، الكمي في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR-QRT)، Gفحص النتريت ريس، وLuminex متعدد خلوى الفحص. صقل المنصوص عليها في هذا البروتوكول يقدم زيادة الثقة المتعلقة نقاء دبقية أو نجمي الخلايا، وتطبيق أوسع المجهر مضان مع توافر القناة الحمراء، ويوفر الوقت، والتي تعتبر مهمة لفي المختبر التجريب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على استخدام الحيوانات وإجراءات البروتوكول وتشرف عليها لجنة الحيوان الرعاية المؤسسية والاستخدام (IACUC) في جامعة ولاية ايوا (أميس، IA، الولايات المتحدة الأمريكية)
1. زراعة الثقافات الدبقية المختلطة
- قطع رأس 1- الجراء عمر يوم 2 بسرعة مع مقص التشغيل 5.5 بوصة، ووضع رؤساء الفور في أنبوب 50 مل على الجليد. لاحظ أن هذا قطع الرأس هو طريقة القتل الرحيم.
- في الصفحي تدفق الهواء غطاء محرك السيارة، وجعل شق صغير في الجمجمة والسحايا باستخدام 4.5 بوصة على التوالي مقص تشريح الصغيرة. تبدأ خفض من نهاية الذيلية إلى نهاية منقاري (الأنف). الحصول على تحت الجلد باستخدام افتتاح شكلتها قطع الرأس.
- بعد شق، قشرة واحدة من نصفي الكرة إلى الجانب. ثم استخدام زوج من ملاقط منحنية أو مدمن مخدرات لإزالة المخ بأكمله.
- تزج الدماغ (ق) في أنبوب 50 مل جديد يحتوي 0.25٪ التربسين- ethylenediaminetetraacetأكل حامض (EDTA) لمدة 15 دقيقة في 37 ° C حمام الماء. استخدام 2 مل من التربسين-EDTA في الدماغ.
- غسل الدماغ (s) مع وسائل الاعلام الطازج نمو (10٪ FBS، DMEM / F12، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين، 1٪ L-الجلوتامين، 1٪ البيروفات الصوديوم، و 1٪ من الأحماض الأمينية غير الأساسية) وذلك بإضافة وإزالة وسائل الإعلام. كرر هذه 4X.
- لكل الدماغ، لوحة اثنين T-75 قوارير تحتوي على وسائط النمو. لذلك، إضافة 2 مل من وسائط النمو في الدماغ إلى الأنبوب. وبالتالي، سيكون ما يعادل 1 مل من الدماغ المتجانس مع 8-9 مل من وسائط النمو في T-75 قارورة.
- التجانس بواسطة الطحن الدماغ (s) مع ماصات من أحجام مختلفة الفتحة، بالترتيب من الأكبر إلى الأصغر. عندما كان مرئيا أن أنسجة المخ لا يصغر، والانتقال إلى ماصة المقبلة. في نهاية سحن، يجب أن يكون تعليق واضح، مع عدم وجود قطع مرئية.
- استخدام مل ماصة 25، 5 مل ماصة، ثم 10 مل ماصة بالتتابع.
- تمرير كل homogتعليق الدماغ enous من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر لجعله ثقافة خلية واحدة.
- لكل الدماغ المتجانس، لوحة اثنين T-75 قوارير تحتوي على وسائط النمو، كما هو موضح في الخطوة 1.5 (1 مل من الدماغ المتجانس مع 8-9 مل من وسائط النمو في T-75 قارورة).
- تغيير وسائط النمو بعد 6 د وتنمو حتى العزلة في اليوم ال 16.
2. عزل خلايا دبقية
- بعد 16 يوما، وإزالة وسائط النمو من القارورة ووضعه في أنبوب جديد 50 مل. إضافة 3 مل 0.25٪ التربسين-EDTA لكل T-75 قارورة. يهز قوارير لمدة 5 دقائق على RT على شاكر المداري.
- أجهزة الطرد المركزي في وسائط النمو إزالتها عند 0.4 x ج لمدة 5 دقائق واستخدامها لوقف تفاعل التربسين إدتا في خطوة لاحقة.
- بعد ان اطمأن لمدة 5 دقائق، إضافة ما لا يقل عن 4 مل من وسائط النمو (الطازجة أو الوسائط المستخدمة من 2.1.1) لوقف تفاعل التربسين إدتا.
- يسحن لضمان أن جميع جتم فصل ملتعلمي اللغة اإلنكليزية.
- بعد سحن، وتمرير الخلايا من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر لجعله ثقافة خلية واحدة، إجراء تعداد خلايا، ومن ثم تدور باستمرار الخلايا عند 0.4 x ج لمدة 5 دقائق.
- مقابل كل 100 × 10 6 خلايا (تقريبا 15 × T-75 قوارير)، استخدم 1 مل من الموصى بها وسائل الإعلام (2٪ FBS، DPBS (الكالسيوم والمغنيسيوم خالية من كلوريد)، 1 ملم EDTA) لإعادة تعليق بيليه الخلية.
ملاحظة: مصممة جميع الخطوات التالية لفصل مل 1. - خذ أنبوب البوليسترين 5 مل، إضافة 1 مل من الموصى بها وسائل الإعلام، وبمناسبة الغضروف المفصلي. إضافة الموصى به وسائل الإعلام ما يصل الى 2.5 مل وبمناسبة هذا أيضا. تجاهل الموصى بها وسائل الإعلام ونقل الخلايا مع وقف التنفيذ إعادة إلى أنبوب البوليسترين 5 مل.
- إضافة 50 ميكرولتر من مصل الفئران لكل 1 مل من الخلايا مع وقف التنفيذ. احتضان لمدة 5 دقائق في RT.
- إعداد اختيار كوكتيل عن طريق خلط 25 ميكرولتر من مكون A و 25 ميكرولتر من عنصر B. هذه المكونات هي الملكية.
- إضافة 501؛ L من كوكتيل التحديد إلى الخلايا. احتضان لمدة 5 دقائق في RT.
ملاحظة: للحصول على الثقافات أنقى، كرر الخطوة 2.9 (أوصت لكن ليس إلزاميا). - المجهرية دوامة لمدة 45 ثانية. إضافة 80 ميكرولتر من المجهرية لكل 1 مل من العينة. احتضان لمدة 3 دقائق على RT.
- تبرزي حجم 2.5 مل في أنبوب البوليسترين بإضافة الموصى بها وسائل الإعلام.
- وضع أنبوب في المغناطيس لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ضبط الحضانة لزيادة نقاء. صب ببطء للخروج الموصى به وسائل الإعلام في أنبوب 15 مل مع المغناطيس لا تزال في أنبوب البوليسترين.
- كرر الخطوة 2.12 ثلاث مرات أكثر. ويمكن تنفيذ حضانات المغناطيسية إضافية لزيادة نقاء.
- إضافة 3 مل من وسائط النمو وحساب عدد الخلايا باستخدام عداد الخلية.
- لوحة الخلايا تبعا لذلك في بولي-D-ليسين (PDL) لوحات المغلفة للعلاج. علاج الخلايا بعد 48 ساعة البذر لوحات مغلفة inPDL. وهذا يسمح للخلايا للتعافي من الإجهاد الانفصال.
ملاحظة: تشيCK نقاء الثقافة باستخدام مناعية كما هو موضح سابقا (15). - لوحة الكسر السلبي (التي تم جمعها في أنبوب 15 مل)، والتي في معظمها يحتوي على الخلايا النجمية، في T-75 قوارير في وسط النمو.
- بعد لا يقل عن 6 ساعة من الحضانة في الحاضنة 37 درجة مئوية، وتغيير المتوسطة وتركها تنمو O / N. تقسيم الخلايا النجمية في اليوم التالي للعلاج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة من خلال عدة CD11b اختيار إيجابي II ديك نقاء عالية
تم عزل الخلايا الدبقية الصغيرة الماوس الأولية باستخدام البروتوكول المذكور أعلاه ومطلي coverslips على المغلفة بولي-D-يسين للتحقق من نقاء العزلة. كانت مطلية عشرة آلاف خلية لكل جيدا وتحليل immunocytochemical تم تنفيذها باستخدام المتأين ملزم الكالسيوم محول جزيء 1 (Iba1) كعلامة من الخلايا الدبقية الصغيرة وييفي الدبقية البروتين الحمضية (GFAP) كعلامة من الخلايا النجمية للتأكد من نقاء الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة . أعرب ثقافة معزولة فقط Iba1 دون GFAP التعبير (الشكل 2A)، مما يدل على أن ثقافة معزولة والخلايا الدبقية الصغيرة النقية. خلافا لأساليب أخرى منشورة سابقا للانفصال دبقية الأساسي، الذي حقق ~ 97٪ النقاء، وذلك باستخدام هذه الطريقة حصلنا ~> 99٪ النقاء في نصف الوقت. لمزيد من التحقق من صحة نقاء عشر هو ثقافة، ركضنا لطخة غربية (20) لIba1 وGFAP. وكشف تحليل مناعية أيضا أن هذا بمعزل عن الثقافات الدبقية المختلطة كانت ثقافة دبقية صغيرة نقية تقريبا (الشكل 2B).
ليس لدى إجراء العزل تعديل أي لصناعة السيارات في مضان من الخرز المغناطيسي
القناة الحمراء التي لا يمكن استخدامها للمناعية (ICC) عند استخدام CD11b عدة العزلة السابقة للانفصال دبقية كما ذكر غوردون وآخرون. 15 بسبب استخدام العلامات PE خلال الفصل. تستخدم هذه المجموعة الجديدة العزلة خالية من PE، يمكننا استخدام القناة الحمراء لتحليل immunocytochemical (الشكل 3). من هذا ICC، فمن الواضح أن هذا الأسلوب الجديد يتيح لنا استخدام جميع قنوات التدفق الخلوي أو غيرها من الدراسات التصوير الفلورسنت.
ve_step "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> الثقافات دبقية صغيرة معزولة لرد وظيفيا إلى التحفيز LPSللتحقق من أن الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة نشطة وظيفيا، كنا نعامل والخلايا مع LPS، وهو منبه تستخدم على نطاق واسع 9 لتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة، لمدة 24 ساعة قبل التدقيق لمختلف العوامل المؤيدة للالتهابات. ويرافق تفعيل دبقية الكلاسيكي من قبل الافراج عن النتريت ومختلف السيتوكينات الموالية للالتهابات في وسائل الإعلام. ومن هنا، كنا فحوصات متكاملة متعددة لتأكيد النشاط الوظيفي من الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة لدينا. أولا، استخدمنا فحص Griess لإظهار أن LPS الناجم بشكل كبير إفراز النتريت من الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة (الشكل 4A). لمزيد من التحقق من صحة نشاط الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة، كنا QRT-PCR لعرض (رسول النووي الريبي حامض) مستويات مرنا من NOS2، السمة المميزة آخر من التهاب دبقية، واي تعزز إلى حد كبيرالعلاج LPS ال (الشكل 4B). بعد ذلك، كنا مقايسة على أساس حبة متعددة، Luminex 21، للتحقق من LPS حفز بشكل كبير إفراز السيتوكينات الموالية للالتهابات من الثقافة دبقية (الشكل 5A). وعلاوة على ذلك، فإننا التحقق عن طريق تحليل QRT-PCR أن العلاج LPS عززت مستويات التعبير الجيني للعديد من السيتوكينات الموالية للالتهابات بما في ذلك IL-1β وTNFα (الشكل 5B). تشير كل هذه المعطيات معا أن الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية معزولة باستخدام هذا الأسلوب المكرر حديثا ينشط وظيفيا وتظهر الشخصية تفعيل مماثلة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية باستخدام أساليب المنشورة سابقا.
الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة يمكن استخدامها للانزعاج الدراسات
باستخدام الطرق السابقة من العزلة دبقية، تشغيل المفكره الغربيةكان ر للدراسات يشير صعب وغير عملي بسبب انخفاض المحصول والنقاء. سابقا، لقد أظهرنا أنه فين، كيناز عائلة SRC، وتشارك في سلسلة إشارات الموالية للالتهابات في الخلايا الدبقية 9. نحن هنا مطلي مليون خلايا دبقية صغيرة في لوحة ال 12 أيضا وبعد 48 ساعة، وجمعنا الخلايا لتشغيل البقع الغربية لفين الأصلي وSRC تحركات فسفرته في التيروزين بقايا 416 (ع-SRC-Y416). كنا قادرين على كشف المستويين فين و p-SRC-Y416 في خلايانا دبقية صغيرة معزولة (الشكل 6)، وتبين أن هذه الطريقة تنطبق على التقنيات الغربية التنشيف للانزعاج الدراسات.
الكسر السلبي من الفصل دبقية يحتوي على الخلايا النجمية التي يمكن استخدامها للانزعاج الدراسات
الخلايا النجمية من الفعاليات الرئيسية في neuroinflammation، وفهم آليات إشارات وراء astrالتهاب ocytic والخلايا العصبية نجمية عبر الحديث مهم 19. هنا، وتبين لنا أن جزء سلبي من الفصل دبقية يحتوي على خلايا نجمي GFAP إيجابية (الشكل 7A). أيضا، أظهر تحليلنا لطخة غربية لفين وف SRC-Y416 (الشكل 7B) أن كلا من هذه البروتينات يمكن أن يتم الكشف في جزء سلبي أيضا. هذه النتائج تظهر معا أن الكسر السلبي هو إعداد مثالية للدراسات نجمي يهدف إلى تحديد البروتينات مهمة لشلالات إشارات التهابات.
الشكل 1: رسم تخطيطي لعزل الخلايا الدبقية من الجراء 1-2 أيام بعد الولادة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبرمن هذا الرقم.
الشكل 2: الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة باستخدام أدوات التحديد إيجابية CD11b II لديها عالية النقاء. (A) سيتولوجية مناعية الثقافة دبقية صغيرة معزولة التحقيق لGFAP في القناة الحمراء وIBA1 في قناة خضراء. (B) مناعية الثقافة دبقية صغيرة معزولة التحقيق لGFAP (~ 51 كيلو دالتون)، IBA1 (~ 15 كيلو دالتون) وβ-أكتين (~ 42 كيلو دالتون). شريط مقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: إجراء عزل التعديل ليس لديها أي صناعة السيارات في مضان من الخرز المغناطيسي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: LPS تحفيز زيادة الإنتاج النطرون في دبقية الثقافة. (A) خلايا دبقية صغيرة معزولة تعامل مع 1 ميكروغرام / مل LPS لمدة 24 ساعة وجمعت وسيلة العلاج لتحديد الإفراج النتريت التي كتبها Griess الفحص. (B) ف-RT-PCR لNos2 من الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة تعامل مع LPS لمدة 24 ساعة. وتمثل الأرقام متوسط ± SE من 2 أو أكثر مستقلة التجارب. وقد تم تحليل البيانات باستخدام اختبار (ت) للطالب (ع *0؛ 0،05 **، ف <0.01 ***، ف <0.001). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: LPS-يسببها الموالية للالتهابات خلوى بيان من خلايا دبقية. تم تنفيذ (A) Luminex متعدد فحص على متوسطة العلاج التي تم جمعها من خلايا دبقية صغيرة معزولة تعامل مع 1 ميكروغرام / مل LPS لمدة 24 ساعة. (B) ف-RT-PCR لIL-1βand TNFα من الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة تعامل مع LPS لمدة 24 ساعة. وتمثل الأرقام متوسط ± SE من 2 أو أكثر مستقلة التجارب. وقد تم تحليل البيانات باستخدام اختبار (ت) الطالب (* ف <0.05، ** ف <0.01 ***، ف <0.001). الرجاء النقر هنا ل عرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: عزل الخلايا الدبقية الصغيرة يمكن استخدامها للدراسات اشارة. ويظهر تحليل لطخة غربية أن فين و p-SRC-Y416 يمكن الكشف عنها من الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة مع أسلوبنا المكرر حديثا.
الرقم 7: الكسر السلبي من الفصل دبقية يحتوي النجمية التي يمكن استخدامها للدراسات اشارة. (A) يظهر النشاف الغربي الذي الكسر السلبي يحتوي على خلايا GFAP إيجابية. ويوضح (B) تحليل لطخة الغربي الذي فين و p-SRC-Y416 يمكن الكشف عن خلايا GFAP إيجابية.الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| المعلمات | الطريقة الحالية | طريقة التعديل | |
| كلفة | $ 620 | $ 620 | |
| زمن | 55 دقيقة | 25 دقيقة | |
| ضوئي | نعم (القناة الحمراء) | لا | |
| نقاء | ~ 97٪ | ~ 99٪ | |
الجدول 1: تحليل مقارن بين طريقة عزل المكرر دبقية والطريقة الأصلية من العزلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أقدم أساليب العزلة دبقية لها المستردة المحدودة التي ليست مناسبة للبروتين مختلف يحلل طخة غربية وRNA يحلل من قبل QRT-PCR. تمسك التفاضلية وأساليب trypsinization خفيفة نهجان المشتركة مع عوائد منخفضة دبقية 13 و 14 و 15. لديه نهج CD11b القائم على عمود أيضا الانتعاش منخفضة، ولكن يحقق نقاء أكبر من الالتزام التفاضلية وtrypsinization معتدل 13 و 14 و 15 و 16 و 17. نهجنا CD11b خالية من الأعمدة الأصلي إلى تحسن كبير في عائدات معزولة، مما يجعلها مناسبة للبروتين وRNA يحلل مثل غرب النشاف وQRT-PCR، ولكن على حساب انخفاض نقاء 15.
يحتفظ طريقتنا المعدلة حديثاغلة طريقة الأصلي ويزيد من نقاء قليلا من ~ 95-97٪ إلى ~> 99٪، ولكن في نصف الوقت على الانتهاء، وهو أمر حاسم لبقاء الخلية. خطوات حاسمة ضمن بروتوكول يمكن أن أؤكد العزلة دبقية المثلى. في حين قطع رأس الجراء، ينبغي توخي الحذر للحفاظ على رؤساء على الجليد ولتشريح في غرفة الصفحي تدفق الهواء في غضون 5-10 دقيقة. مطولة مرات الختان الدماغ سوف تجعل من الصعب الحصول على الدماغ الكامل لأنه بدأ يفقد صلابته في درجات الحرارة المحيطة، المساس عوائد دبقية صغيرة. والجدير بالذكر، إذا تم تكرار الخطوة 2.9 مرة واحدة على الأقل، أن هناك زيادة ملحوظة في الطهارة وقدرتها على البقاء. إذا كان العائد من فصل منخفضة، وفصل ويمكن تكرار استخدام عدد أقل من قوارير لكل مليلتر من وسائل الاعلام الموصى بها، أو عن طريق زيادة حجم الفصل (> 1 مل). تقليل الازدحام خلية عموما سوف تحسين نقاء، والسلامة، والعائد. يجوز تمديد فترة حضانة المغناطيسي في الخطوة 2.12 لزيادة نقاء. هذا يمكنأؤكد المغناطيسي السليم ملزمة للالمجهرية التي تعلق على الخلايا الدبقية الصغيرة. وعلاوة على ذلك، قد يتم تنفيذ حضانات المغناطيسية إضافية في الخطوة 2.9 من أجل زيادة نقاء والعائد.
جدوى بروتوكول يعادل أو أفضل من طريقة CD11b الأصلي؛ ومع ذلك، فإن الأسلوب الجديد هو المكرر وأقصر. ميزة هامة أخرى اكتسبت من هذا الأسلوب المكرر هو خيار استخدام القناة الحمراء للفحص المجهري مضان، التي تحتلها PE في الأسلوب الأصلي (الجدول 1) 15. على الرغم من أننا الحصول على عائد مرتفع ونقاء الخلايا الدبقية الصغيرة مع أسلوب، والعائد نجمي الخلايا التي تم الحصول عليها من هذا الفصل هو أقل النقي لأنها تحتفظ ببعض الخلايا الليفية. كما هو موضح في الخطوة 2.17، بعد الطلاء والنجمية واحتضان لمدة 6 ساعات، يجب أن يتم استبدال وسائط النمو مع وسائل الإعلام الجديدة. الخلايا النجمية هي أول من نعلق على القارورة، في حين لا تزال الكثير من الخلايا الليفية في المعلension. استبدال وسائل الإعلام عموما سيزيل معظم الخلايا الليفية تلوث. على الرغم من أن هذه التقنية تضمن نقاء عالية من الخلايا النجمية، هناك ما يبرر طريقة تنقية الثانوي لتحقيق الثقافات أنقى.
عموما، هذا تعديل طريقة CD11b العزلة يولد خلايا دبقية الأولية نقية للغاية والخلايا النجمية في فترة قصيرة من الزمن. الساعة العزلة أقصر عموما تحسن معدلات بقاء الخلية. ويوفر نظام نموذجا مفيدا لتوضيح آليات الإشارات الكامنة وراء كل من دبيقي والبيولوجيا astroglial.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) المنح: NS088206 وES026892. وW. يوجين ولليندا لويد هبوا الرئيس على AGK وعمداء الأستاذية إلى AK واعترف أيضا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EasySep CD11b Separation Kit II | StemCell Technologies | 18970 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1x) | Life Technologies | 11330057 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| MEM Non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-Glutamine (100x) | Life Technologies | 25030081 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | 13H469 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Technologies | 25200 | |
| Dulbecco's PBS (DPBS) | Gibco by Life Technologies | 14190250 |
References
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: from origin to neuropsychiatric disease. Nat Rev Neurosci. 15 (5), 300-312 (2014).
- Alliot, F., Godin, I., Pessac, B. Microglia derive from progenitors, originating from the yolk sac, and which proliferate in the brain. Brain Res Dev Brain Res. 117 (2), 145-152 (1999).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
- Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. Microglia: new roles for the synaptic stripper. Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).
- Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease. Neurobiol Aging. 29 (11), 1690-1701 (2008).
- Dzamko, N., Geczy, C. L., Halliday, G. M. Inflammation is genetically implicated in Parkinson's disease. Neuroscience. 302, 89-102 (2015).
- Xing, B., Bachstetter, A. D., Van Eldik, L. J. Microglial p38alpha MAPK is critical for LPS-induced neuron degeneration, through a mechanism involving TNFalpha. Mol Neurodegener. 6, 84 (2011).
- Panicker, N., et al. Fyn Kinase Regulates Microglial Neuroinflammatory Responses in Cell Culture and Animal Models of Parkinson's Disease. J Neurosci. 35 (27), 10058-10077 (2015).
- Moehle, M. S., West, A. B. M1 and M2 immune activation in Parkinson's Disease: Foe and ally? Neuroscience. 302, 59-73 (2015).
- Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nat Rev Immunol. 11 (11), 775-787 (2011).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
- Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. J Neurosci Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
- Saura, J., Tusell, J. M., Serratosa, J. High-yield isolation of murine microglia by mild trypsinization. Glia. 44 (3), 183-189 (2003).
- Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J Neurosci Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
- Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).
- Marek, R., Caruso, M., Rostami, A., Grinspan, J. B., Das Sarma,, J, Magnetic cell sorting: a fast and effective method of concurrent isolation of high purity viable astrocytes and microglia from neonatal mouse brain tissue. J Neurosci Methods. 175 (1), 108-118 (2008).
- Hasko, G., Pacher, P., Vizi, E. S., Illes, P. Adenosine receptor signaling in the brain immune system. Trends Pharmacol Sci. 26 (10), 511-516 (2005).
- Radulovic, M., Yoon, H., Wu, J., Mustafa, K., Scarisbrick, I. A. Targeting the thrombin receptor modulates inflammation and astrogliosis to improve recovery after spinal cord injury. Neurobiol Dis. 93, 226-242 (2016).
- Ay, M., et al. Molecular cloning, epigenetic regulation, and functional characterization of Prkd1 gene promoter in dopaminergic cell culture models of Parkinson's disease. J Neurochem. 135 (2), 402-415 (2015).
- Gordon, R., et al. Protein kinase Cdelta upregulation in microglia drives neuroinflammatory responses and dopaminergic neurodegeneration in experimental models of Parkinson's disease. Neurobiol Dis. 93, 96-114 (2016).
