Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att isolera mikroglia från postnatala musungar (dag 1) för in vitro experiment. Denna improviserade metod för isolering genererar både högt utbyte och renhet, en betydande fördel jämfört med alternativa metoder som tillåter brett område experimenterande i syfte att belysa microglial biologi.
Abstract
Mikroglia är de primära responders till centrala nervsystemet förolämpningar; Men mycket är okänd om sin roll i regleringen av neuroinflammation. Mikroglia är mesodermala celler som fungerar på liknande sätt till makrofager i lantmäteri inflammatorisk stress. Den klassiska (M1-typ) och alternativa (M2-typ) aktiveringar av makrofager har också utvidgats till mikroglia i ett försök att bättre förstå den underliggande samspelet dessa fenotyper har i neuroinflammatoriska sjukdomar såsom Parkinsons, Alzheimers och Huntingtons sjukdomar. In vitro experiment använder primära mikroglia erbjuder snabba och tillförlitliga resultat som kan utvidgas till in vivo miljö. Även om detta är en klar fördel gentemot in vivo experiment, isolera mikroglia och samtidigt uppnå tillräcklig avkastning av optimal renhet har varit en utmaning. Vanliga metoder för närvarande är i bruk antingen lider av låg återhämtning, låg renhet, eller bådadera. Häri vi markonstrate en förfining av kolonnen fria CD11b magnetisk separationsmetod som uppnår en hög cellåtervinning och ökad renhet i halv mängden tid. Vi föreslår denna optimerade metod som en mycket användbar modell av primär microglial isolering i syfte att studera neuroinflammation och neurodegeneration.
Introduction
Mikroglia är Myb-oberoende residenta makrofager av mesodermalt ursprung, som skiljer från c-kit + / CD45- erythromyeloid progenitorer i blod öarna i gulesäcken 1, 2. Gång embryologiska mikroglia har koloniserat det centrala nervsystemet (CNS), de går över från en amöboid till en förgrenad formen 3. Dessa vuxna mikroglia klassificeras som surveillant eftersom deras dynamiska förgreningar sondera friska hjärnparenkymet för potentiella förolämpningar 4. Fastän mikroglia bara att bidra till ungefär 10% av CNS-cellpopulationen, deras förmåga att kakel bland varandra säkerställer maximal scanning av parenkymet 4, 5. Fara-associerade molekylära mönster (dämpas), såsom α-synuklein 6, 7 och amyloid-β 8, eller pathogen-associerade molekylära mönster (PAMPs) såsom lipopolysackarid (LPS) 9, klassiskt aktivera mikroglia att främja ett inflammatoriskt svar som kännetecknas av återgång till amöboid aktivt tillstånd och produktionen av kväveoxid, tumörnekrosfaktor-α (TNFa), interleukin 1β (IL-1β), IL-6, IL-12, och kemokinen CC-motivet ligand 2 9, 10, 11. I neuroinflammatoriska tillstånd, såsom Parkinsons sjukdom, i vilka patogena α-synuklein har ackumulerats, är en neurodegenerativ cykel skapas från döden av dopaminerga neuroner, vilka frisätter mer aggregerad α-synuklein, ytterligare främja klassisk aktivering av mikroglia 7. Liknar perifera makrofager, kan mikroglia också ha förmåga att alternativt aktivera i närvaro av de anti-inflammatoriska cytokiner IL-4 och IL-10, vilket ger dem den potentaial främja neurala reparation och dämpning av inflammation 2, 11. Bortsett från deras immunologiska roller i CNS har mikroglia beskrivits som viktiga regulatorer av neuronal kretsar genom beskärning synapser under utveckling. Exempelvis Cx3cr1- KO möss har mindre täta mikroglia och minskad synaptisk beskärning, vilket leder till ett överflöd av Dendritutskotten, omogna synapser och de elektrofysiologiska mönster av en underutvecklad CNS 12. Att förstå dessa fysiologiska komplexitet och de olika funktionella roller mikroglia i homeostasen av CNS är avgörande för sökandet efter läkemedel riktade neurodegenerativa sjukdomar.
I området för neuroimmunologi, in vitro-experiment är mycket önskvärda på grund av den större genomförbarhet för mekanistiska studier, de lägre underhållskostnader, och för att vara mindre tids- och arbetskrävande. Furthermore, är förmågan att isolera cellpopulationer kritiskt att beskriva funktionaliteten hos dessa målceller under föreskrivna betingelser. Talrika mikrogliala isoleringsmetoder finns, men de är begränsade genom sin förmåga att erhålla relativt höga antal och renhet för bred försöks 13, 14, 15. Till exempel, är ett kluster av differentiering 11b (CD11b) en gemensam ytmarkör av monocyter, makrofager och mikroglia 16. Genom att utnyttja CD11b, var en metod för magnetisk separation först beskrevs som en kolumn baserat tillvägagångssätt som gav ~ 99,5% renhet och ~ 1,6 x 10 6 mikroglia per neonatal hjärna 17. Vårt laboratorium nyligen utvecklat en kolonn fritt CD11b magnetisk separationsmetoden 15, som vi utfört i ett polystyrenrör genom att märka CD11b med en monoklonal antikropp konjugerad till fykoerytrin (PE). En bispecifik secondary antikropp till PE och dextran komplex med PE. En gång bundna, är dextran-belagda magnetiska partiklar införs, som binder till dextran änden av antikroppskomplexet. Slutligen är polystyrenrör placerades i en magnet för microglial isolering. Detta tillvägagångssätt fördubblade utbytet till ~ 3,2 x 10 6 mikroglia per neonatal hjärna men till priset av att minska renheten till ~ 97%.
Häri, visar vi en snabb och raffinerad kolonn fria CD11b magnetisk separation protokollet (figur 1). Detta förbättrade förfarande förblir lika genomförbart som vår ursprungliga kolonn-fri metod eftersom priset av CD11b magnetisk separation kit är densamma. Slutförtiden minskas i halv, vilket kan vara avgörande för att maximera cellöverlevnad och utbyte. Notably, renheten uppnås från denna optimerade metod är ~> 99%, en markant förbättring jämfört med renheten uppnås från den ursprungliga kolonnen fria metod som utvecklats av vårt laboratorium 15. Viktigast CD11b-PEutnyttjas inte, vilket eliminerar behovet att inkubera borta från ljus och medger användning av den röda kanalen för fluorescensmikroskopi. Slutligen, som i den ursprungliga CD11b metoden, är en astrocytisk fraktion av högt utbyte och renhet erhålles med denna förbättrade metod. Astrocyter är de mest talrika gliaceller i CNS, vilket leder till tanken att deras homeostatiska funktioner är oumbärliga i förhållande till patofysiologi 18. Dessa gliaceller spela en roll i olika fysiologiska funktioner såsom formning av blod-hjärnbarriären, som ger näringsämne stöd, upprätthålla signalsubstans homeostas, bildar gliala ärr som svar på skada, neuroskydd, inlärning och minne, och neuroinflammation, exemplifierar deras utrednings potential i glia biologi 19. Morfologi och funktionaliteten hos mikroglia och astrocyter har konstaterats via konfokalmikroskopi, Western blotting, kvantitativ realtids-Polymerase Chain Reaction (QRT-PCR), GRiess nitritanalysen, och Luminex multiplex cytokin analys. Förfining som tillhandahålls av detta protokoll erbjuder ökat förtroende avseende microglial eller astrocytisk renhet, bredare tillämpning av fluorescensmikroskopi med tillgängligheten av den röda kanalen, och sparar tid, som alla är viktiga för in vitro-experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Användning av djur och protokollprocedurer godkändes och övervakas av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Iowa State University (Ames, IA, USA)
1. Odling av blandade Glial kulturer
- Decapitate 1- 2 dagar gamla ungar snabbt med 5,5 tum löpande sax, och placera huvudena omedelbart i en 50 ml rör på is. Observera att detta halshuggningen är läget för dödshjälp.
- I ett laminärt luftflöde huva, göra ett litet snitt i skallen och hjärnhinnorna använder 4,5 tum raka mikro dissekera sax. Börjar såga från den kaudala änden till den rostrala änden (näsan). Få under huden med hjälp av öppningen som bildas av halshuggning.
- Efter snittet, skala en av de halvkloten åt sidan. Använd sedan ett par böjda eller krökta pincett för att ta bort hela hjärnan.
- Doppa hjärnan (er) i ett nytt 50 ml rör innehållande 0,25% trypsin-ethylenediaminetetraacetåt syra (EDTA) under 15 min i en 37 ° C vattenbad. Använda 2 ml av trypsin-EDTA per hjärna.
- Tvätta hjärnan (er) med färskt tillväxtmedium (10% FBS, DMEM / F12, 1% penicillin / streptomycin, 1% L-glutamin, 1% natriumpyruvat, och en% icke-essentiella aminosyror) genom att lägga till och ta bort media. Upprepa detta 4x.
- För varje hjärna, plattan två T-75 kolvar innehållande tillväxtmedia. Därför, tillsätt 2 ml av tillväxtmedia per hjärna till röret. Sålunda kommer det att vara en ekvivalent av en ml homogeniserad hjärn med 8-9 ml tillväxtmedium per T-75-kolv.
- Homogenisera genom triturering hjärnan (er) med pipetter med olika öppningsstorlekar, i ordning från största till minsta. När det syns att hjärnvävnaden inte blir mindre, övergång till nästa pipett. Vid slutet av finfördelning bör suspensionen vara tydlig, utan synliga bitar.
- Använda en 25 ml pipett, 5 ml pipett, och sedan en 10 ml pipett sekventiellt.
- Passera varje homogenous hjärnan suspensionen genom ett 70 | im cellfilter för att göra det till en enda cellkultur.
- För varje homogeniserad hjärn, platt två T-75-kolvar innehållande tillväxtmedier, som beskrivs i steg 1,5 (1 ml homogeniserad hjärn med 8-9 ml tillväxtmedium per T-75-kolv).
- Ändra tillväxtmedier efter 6 d och växa tills isolering på 16: e dagen.
2. Isolering av mikrogliaceller
- Efter 16 dagar, avlägsna tillväxtmediet från kolven och placera den i ett färskt 50 ml rör. Lägg 3 ml 0,25% trypsin-EDTA till varje T-75 kolv. Skaka kolvarna för 5 min vid RT på en orbital skakanordning.
- Centrifugera bort tillväxtmedia vid 0,4 xg under 5 min och använda för att stoppa trypsin-EDTA reaktion i efterföljande steg.
- Efter skakning under 5 minuter, tillsätt ett minimum av 4 ml tillväxtmedium (färska eller den använda media från 2.1.1) för att stoppa trypsin-EDTA reaktion.
- Finfördela att säkerställa att alla calnar har lossnat.
- Efter triturering, passerar cellerna genom en 70 | im cellfilter för att göra det till en enda cellkultur, utför en cellräkning, och sedan spinn ner cellerna vid 0,4 xg under 5 min.
- För varje 100 x 10 6 celler (ungefär 15 x T-75 kolvar), använda 1 ml Recommended Media (2% FBS, DPBS (kalcium- och magnesiumklorid-fri), 1 mM EDTA) för att resuspendera cellpelleten.
OBS: Samtliga följande steg är skräddarsydda för en 1 ml separation. - Ta ett 5 ml polystyrenrör, tillsätt 1 ml Recommended Media, och markera menisken. Lägg Rekommenderad media upp till 2,5 ml och markera detta. Kassera Recommended Media och överföra de återsuspenderade celler till 5 ml polystyrenrör.
- Tillsätt 50 pl av råttserum för varje 1 ml av suspenderade celler. Inkubera i 5 min vid RT.
- Förbereda urval cocktail genom att blanda 25 | il av komponent A och 25 mikroliter av komponent B. Dessa komponenter är patentskyddade.
- Tillsätt 501; L av urvals cocktail till cellerna. Inkubera i 5 min vid RT.
OBS: För renare kulturer, upprepa steg 2,9 (rekommenderas men inte obligatoriskt). - Vortex mikrosfärer i 45 s. Lägga 80 mikroliter av mikrosfärer per 1 ml av provet. Inkubera i 3 min vid RT.
- Bringa volymen till 2,5 ml i polystyrenrör genom tillsats av den Recommended Media.
- Sätta röret i magnet för 3 min vid rumstemperatur. Justera inkubation för att öka renheten. Långsamt hälla ut Recommended Media in i ett 15 ml rör med magneten fortfarande i polystyrenrör.
- Upprepa steg 2,12 tre gånger. Ytterligare magnetiska inkubationer kan utföras för att öka renheten.
- Tillsätt 3 ml tillväxtmedium och räkna antalet celler med användning av en cellräknare.
- Plattceller i enlighet därmed i Poly-D-lysin (PDL) belagda plattor för behandlingar. Behandla cellerna 48 h efter ympning inPDL-belagda plattor. Detta gör att cellerna att återhämta sig från stressen i separation.
OBS: Check renheten av kulturen med användning av immuncytokemi såsom beskrivits tidigare 15. - Plätera den negativa fraktionen (samlas upp i ett 15 ml rör), som till största delen innehåller astrocyter, i T-75-kolvar i tillväxtmediet.
- Efter åtminstone 6 h inkubering i 37 ° C inkubator, ändra mediet och låta det växa O / N. Split astrocyterna nästa dag för behandlingar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikroglia isolerades med användning CD11b Positiv Selection kit II har hög renhet
Primära mus mikroglia isolerades med användning av ovan nämnda protokoll och ströks ut på poly-D-lysin-belagda täckglas för att kontrollera renheten av isolering. Tiotusen celler ströks per brunn och immuncytokemisk analys utfördes med joniserad kalciumbindande adaptormolekylen 1 (Iba1) som en markör för mikroglia och glia fibrillärt surt protein (GFAP) som en markör för astrocyter för att kontrollera med avseende på renheten hos den isolerade mikroglia . Den isolerade kulturen uttrycks endast Iba1 utan GFAP-uttryck (figur 2A), vilket tyder på att kulturen isolerades var rena mikroglia. Till skillnad från andra tidigare publicerade metoder för primär microglial separation, som uppnås ~ 97% renhet, med användning av denna metod vi erhållits ~> 99% renhet på halva tiden. Att ytterligare validera renheten av th är kultur, körde vi en Western blot 20 för Iba1 och GFAP. Immunoblotanalys visade vidare att denna isolering från de blandade gliaceller kulturer var en nästan ren microglial kultur (figur 2B).
Det modifierade isoleringsförfarandet inte har någon automatisk fluorescens från magnetiska pärlor
Den röda kanalen kan inte användas för immunocytokemi (ICC) vid användning av den föregående CD11b isoleringskit för microglial separation som nämnts av Gordon et al. 15 på grund av användningen av PE märkning under separation. Med hjälp av denna nya PE-fri isoleringskit, kan vi använda den röda kanalen för immunocytokemisk analys (Figur 3). Från denna ICC, är det uppenbart att denna nya metod gör det möjligt att använda alla kanaler för flödescytometri eller andra fluorescerande imaging studier.
ve_step" fo: keep-together.within-page = "1"> Isolerade mikroglia kulturer funktionellt svara på LPS stimulusFör att verifiera att den isolerade mikroglia är funktionellt aktiva, behandlade vi cellerna med LPS, en allmänt använd stimulanten 9 för att aktivera mikroglia, under 24 h innan sondering av olika pro-inflammatoriska faktorer. Klassisk microglial aktivering åtföljs av frisättningen av nitrit och olika pro-inflammatoriska cytokiner i mediet. Därför använde vi flera kompletterande analyser för att bekräfta den funktionella aktiviteten av vår isolerade mikroglia. Första använde vi Griess-analysen för att visa att LPS dramatiskt inducerad nitrit utsöndring från den isolerade mikroglia (figur 4A). För att ytterligare validera aktiviteten hos isolerat mikroglia, använde vi QRT-PCR för att visa (budbärar-ribonukleinsyra) mRNA-nivåer av NOS2, ett annat kännetecken för microglial inflammation, signifikant ökad with LPS-behandling (figur 4B). Nästa, använde vi en vulst baserad multiplex analys, Luminex 21, för att verifiera att LPS-stimulerade signifikant utsöndring av pro-inflammatoriska cytokiner från microglial kulturen (figur 5A). Vidare verifierade vi via QRT-PCR-analys att LPS behandling förbättrat den gen expressionsnivåer av flera pro-inflammatoriska cytokiner inklusive IL-1β och TNFa (figur 5B). Alla dessa data tyder tillsammans att primära mikroglia isolerades med användning av denna nyligen raffinerad metod är funktionellt aktiva och visar en liknande aktiveringsprofil som primära mikroglia isolerades med användning av tidigare publicerade metoder.
Isolerade mikroglia kan användas för att signalera studier
Med hjälp av tidigare metoder för microglial isolering, kör västerländska blot för signalerings studier var svår och omöjlig på grund av lågt utbyte och renhet. Tidigare, har vi visat att Fyn, en Src-familjen kinas, är involverat i en pro-inflammatorisk signalering kaskad i mikrogliaceller 9. Här vi pläterade en miljon mikrogliaceller i en 12-brunnars platta och efter 48 h, uppsamlades vi cellerna för att köra Western blöts för nativt Fyn och Src-kinaser fosforylerad vid tyrosinresten 416 (p-Src-Y416). Vi har kunnat detektera både Fyn och p-Src-Y416-nivåer i våra isolerade mikrogliaceller (figur 6), som visar att denna metod är tillämpbar på Western blotting-tekniker för signalering studier.
Den negativa fraktionen från microglial separationen innehåller astrocyter som kan användas för att signalera studier
Astrocyter är viktiga aktörer inom neuroinflammation, och förstå signal mekanismerna bakom astrocytic inflammation och neuron-astrocyternas överhörning är viktigt 19. Här visar vi att den negativa fraktionen från microglial separationen innehåller GFAP-positiva astrocytiska celler (figur 7A). Även vår Western blot-analys för Fyn och p-Src-Y416 (figur 7B) visade att båda dessa proteiner kan detekteras i den negativa fraktionen samt. Dessa resultat visar tillsammans att den negativa fraktionen är en idealisk förberedelse för astrocytiska studier som syftar till att identifiera proteiner som är viktiga för inflammatoriska signaleringskaskader.
Figur 1: Schematisk bild av Isolering av mikrogliaceller från 1-2 Dagar-postnatala Ungar. Klicka här för att se en större versionav denna figur.
Figur 2: mikroglia isoleras med hjälp av CD11b-positiv selektion Kit II har hög renhet. (A) Immuncytokemi av isolerad microglial kultur sondering för GFAP i röda kanalen och IBA1 i gröna kanalen. (B) Immunblot av isolerad microglial kultur sondering för GFAP (~ 51 kDa), IBA1 (~ 15 kDa) och β-aktin (~ 42 kDa). Scale bar = 20 | im. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Den modifierade isoleringsförfarandet inte har någon automatisk fluorescens från magnetiska pärlor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: LPS stimulering Ökad Nitrit Produktionen i mikrogliaceller kultur. (A) Isolerade mikrogliaceller behandlades med 1 ug / ml LPS under 24 timmar och behandlingsmediet uppsamlades för att bestämma nitrit frisättning genom Griess-analys. (B) q-RT-PCR för NOS2 från isolerad mikroglia behandlades med LPS under 24 timmar. Siffrorna representerar medelvärdet ± SE från 2 eller flera oberoende experiment. Data analyserades med användning av Students t-test (* p0; 0,05, ** p <0,01, *** p <0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: LPS-inducerad Pro-inflammatorisk cytokinfrisättning från mikrogliaceller. (A) Luminex multiplex analys utfördes på behandlingsmedium uppsamlades från isolerade mikrogliaceller behandlade med ett mikrogram / ml LPS under 24 h. (B) q-RT-PCR för IL-1βand TNFa från isolerad mikroglia behandlades med LPS under 24 timmar. Siffrorna representerar medelvärdet ± SE från 2 eller flera oberoende experiment. Data analyserades med användning av Students t-test (* p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001). Klicka här för att för en större version av denna figur.
Figur 6: Isolerad Mikroglia kan användas för Signalering Studies. Western blot-analys visar att Fyn och p-Src-Y416 kan detekteras från mikroglia som isolerats med vår nyligen raffinerad metod.
Figur 7: Den negativa Fraktion från microglial Separation Innehåller Astrocyter som kan användas för Signalering Studies. (A) Western blotting visar att den negativa fraktionen innehåller GFAP-positiva celler. (B) Western blot-analys visar att Fyn och p-Src-Y416 kan detekteras från de GFAP-positiva celler.target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| parametrar | nuvarande metoden | modifierad metod | |
| Kosta | $ 620 | $ 620 | |
| Tid | 55 min | 25 min | |
| Fluorescens | Ja (röd kanal) | Nej | |
| Renhet | ~ 97% | ~ 99% | |
Tabell 1: Jämförande analys mellan Raffinerad microglial Isolering Metod och den ursprungliga metoden för isolering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Äldre microglial isoleringsmetoder ha begränsade återvinningar som inte är lämpliga för olika proteinanalyser genom Western blöt och RNA-analyser av QRT-PCR. Differential vidhäftning och milda trypsinbehandling metoder är två vanliga metoder med låga microglial utbyten 13, 14, 15. Kolonnen baserade CD11b tillvägagångssätt har också låg återhämtning, men uppnår större renhet än differentiell vidhäftning och mild trypsinisering 13, 14, 15, 16, 17. Vår ursprungliga kolumnen fritt CD11b tillvägagångssätt förbättrats kraftigt de isolerade utbytena, vilket gör den lämplig för protein och RNA-analyser, såsom Western blotting och QRT-PCR, men till priset av minskad renhet 15.
Vår nyligen modifierad metod bibehållerutbytena av den ursprungliga metoden och ökar renheten något från ~ 95-97% till ~> 99%, men i halv fullbordan tid, vilket är kritiskt för cellöverlevnad. Avgörande steg inom protokollet kan försäkra optimal microglial isolering. Medan decapitating valparna bör försiktighet iakttas för att hålla huvudena på is och att dissekera i ett laminärt luftflöde kammare inom 5-10 min. Förlängda hjärnan excision tider kommer att göra det svårt att få hela hjärnan, eftersom det börjar förlora sin fasthet vid omgivningstemperaturer, äventyra mikrogliaceller avkastning. I synnerhet, om steg 2,9 upprepas åtminstone en gång, finns det en observerbar ökning i renhet och livsduglighet. Om utbytet från separationen är låg, kan separationen upprepas med färre kolvar per ml av rekommenderade medier, eller genom att öka volymen av separation (> 1 ml). Minskande cell trängsel i allmänhet kommer att förbättra renhet, viabilitet och utbyte. Den magnetiska inkubationstid kan förlängas i steg 2,12 öka renheten. Detta kansäkerställa korrekt magnetisk bindning av mikrosfärerna som är knutna till de mikroglia. Vidare kan ytterligare magnetiska inkubationer utföras i steg 2,9 för den skull öka renhet och utbyte.
Genomförbarheten av protokollet är ekvivalent med eller bättre än den ursprungliga CD11b metoden; dock den nya metoden raffinerade och kortare. En annan signifikant fördel som vunnits från denna raffinerad metod är möjligheten att utnyttja den röda kanalen för fluorescensmikroskopi, som är ockuperat av PE i den ursprungliga metoden (tabell 1) 15. Även om vi får högt utbyte och renhet av mikroglia med metoden, är den astrocytisk erhållna utbytet från denna separation mindre ren eftersom den behåller vissa fibroblaster. Såsom beskrivs i steg 2,17, efter utstrykning av astrocyter och inkubering under 6 h, tillväxtmediet bör ersättas med färskt medium. Astrocyter är den första att fästa till kolven, medan en stor del av de fibroblaster kvar i suspension. Utbyte av media i allmänhet kommer att ta bort de flesta av de kontaminerande fibroblaster. Även om denna teknik säkerställer en hög renhet av astrocyter, är en sekundär reningsmetod för att uppnå renare kulturer motiverad.
Övergripande, genererar denna modifierade CD11b isoleringsmetoden högrena primära mikrogliaceller och astrocyter i en kort tid. Ju kortare isolering tiden förbättras generellt cell överlevnad. Den tillhandahåller ett användbart modellsystem för att belysa de signalmekanismer som ligger bakom både microglial och astroglial biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) Grants: NS088206 och ES026892. W. Eugene och Linda Lloyd Begåvad ordförande att AGK och Deans professur till AK är också erkänt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EasySep CD11b Separation Kit II | StemCell Technologies | 18970 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1x) | Life Technologies | 11330057 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| MEM Non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-Glutamine (100x) | Life Technologies | 25030081 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | 13H469 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Technologies | 25200 | |
| Dulbecco's PBS (DPBS) | Gibco by Life Technologies | 14190250 |
References
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: from origin to neuropsychiatric disease. Nat Rev Neurosci. 15 (5), 300-312 (2014).
- Alliot, F., Godin, I., Pessac, B. Microglia derive from progenitors, originating from the yolk sac, and which proliferate in the brain. Brain Res Dev Brain Res. 117 (2), 145-152 (1999).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
- Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. Microglia: new roles for the synaptic stripper. Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).
- Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease. Neurobiol Aging. 29 (11), 1690-1701 (2008).
- Dzamko, N., Geczy, C. L., Halliday, G. M. Inflammation is genetically implicated in Parkinson's disease. Neuroscience. 302, 89-102 (2015).
- Xing, B., Bachstetter, A. D., Van Eldik, L. J. Microglial p38alpha MAPK is critical for LPS-induced neuron degeneration, through a mechanism involving TNFalpha. Mol Neurodegener. 6, 84 (2011).
- Panicker, N., et al. Fyn Kinase Regulates Microglial Neuroinflammatory Responses in Cell Culture and Animal Models of Parkinson's Disease. J Neurosci. 35 (27), 10058-10077 (2015).
- Moehle, M. S., West, A. B. M1 and M2 immune activation in Parkinson's Disease: Foe and ally? Neuroscience. 302, 59-73 (2015).
- Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nat Rev Immunol. 11 (11), 775-787 (2011).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
- Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. J Neurosci Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
- Saura, J., Tusell, J. M., Serratosa, J. High-yield isolation of murine microglia by mild trypsinization. Glia. 44 (3), 183-189 (2003).
- Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J Neurosci Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
- Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).
- Marek, R., Caruso, M., Rostami, A., Grinspan, J. B., Das Sarma,, J, Magnetic cell sorting: a fast and effective method of concurrent isolation of high purity viable astrocytes and microglia from neonatal mouse brain tissue. J Neurosci Methods. 175 (1), 108-118 (2008).
- Hasko, G., Pacher, P., Vizi, E. S., Illes, P. Adenosine receptor signaling in the brain immune system. Trends Pharmacol Sci. 26 (10), 511-516 (2005).
- Radulovic, M., Yoon, H., Wu, J., Mustafa, K., Scarisbrick, I. A. Targeting the thrombin receptor modulates inflammation and astrogliosis to improve recovery after spinal cord injury. Neurobiol Dis. 93, 226-242 (2016).
- Ay, M., et al. Molecular cloning, epigenetic regulation, and functional characterization of Prkd1 gene promoter in dopaminergic cell culture models of Parkinson's disease. J Neurochem. 135 (2), 402-415 (2015).
- Gordon, R., et al. Protein kinase Cdelta upregulation in microglia drives neuroinflammatory responses and dopaminergic neurodegeneration in experimental models of Parkinson's disease. Neurobiol Dis. 93, 96-114 (2016).
