Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll Mikroglia aus postnataler Maus Welpen (Tag 1) für in - vitro - Experimente zu isolieren. Diese improvisierte Isolierungsmethode erzeugt sowohl hohe Ausbeute und Reinheit, einen bedeutenden Vorteil gegenüber alternativen Methoden, die für die Zwecke der Erläuterung Mikroglia biology breites Spektrum Experimente ermöglicht.
Abstract
Mikroglia sind die primären Responder auf Zentralnervensystem Beschimpfungen; bleibt jedoch viel Unbekanntes über ihre Rolle bei der Regulierung der neuroinflammation. Mikroglia sind mesodermalen Zellen, die in der Vermessung entzündliche Stress ähnlich wie Makrophagen funktionieren. Der klassische (M1-Typ) und alternativer (M2-Typ) Aktivierungen von Makrophagen haben auch Mikroglia in dem Bemühen, erweitern das darunter liegende Zusammenspiel dieser Phänotypen haben in neuroinflammatorische Bedingungen wie Parkinson, Alzheimer und Huntington-Erkrankungen besser zu verstehen. In - vitro - Experimente unter Verwendung von primären Mikroglia bieten schnelle und zuverlässige Ergebnisse , die auf die in - vivo - Umgebung erweitert werden können. Obwohl dies ein klarer Vorteil gegenüber in vivo Experimenten Mikroglia zu isolieren , während eine adäquate Ausbeuten optimale Reinheit zu erreichen eine Herausforderung gewesen. Gängige Methoden zur Zeit in Gebrauch entweder leiden unter niedriger Erholung, geringe Reinheit, oder beides. Wir berichten hier über DMonstrate eine Verfeinerung der säulenfreien CD11b magnetischen Trennverfahren, die eine hohe Zellgewinnung und eine verbesserte Reinheit in der Hälfte der Menge an Zeit erreicht. Wir schlagen vor, diese optimierte Methode als sehr nützliches Modell der primären Mikroglia-Isolierung für die Zwecke der neuroinflammation und Neurodegeneration zu studieren.
Introduction
Mikroglia sind Myb unabhängige Makrophagen mesodermalen Ursprungs, die von c-kit + / CD45- unterscheiden erythromyeloid Vorläufern in den Blutinseln des Dottersacks 1, 2. Sobald embryologischen Mikroglia das zentrale Nervensystem (ZNS) kolonisiert haben, Übergangs- sie von einer zu einer verästelten amoeboid Form 3. Diese Erwachsenen Mikroglia als surveillant klassifiziert , da ihre dynamische Verzweigungen das gesunde Hirnparenchyms für mögliche Beleidigungen Sonde 4. Obwohl nur Mikroglia auf etwa 10% der Bevölkerung CNS Zelle beitragen, ihre Fähigkeit , untereinander zu tile gewährleistet maximaler Abtastung des Parenchyms 4, 5. Gefahren-associated molecular patterns (DAMPS), wie beispielsweise α-Synuclein 6, 7 und Amyloid-β 8 oder pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) , wie beispielsweise Lipopolysaccharid (LPS) 9, aktiviert klassisch Mikroglia eine entzündliche Reaktion durch Reversion zum amoeboid aktiven Zustand und die Produktion von Stickstoffmonoxid, Tumornekrosefaktor-α (TNF & agr;), Interleukin 1β gekennzeichnet Förderung (IL-1β), IL-6, IL-12 und das Chemokin CC motif Ligand 2 9, 10, 11. In neuroinflammatorischen Erkrankungen wie Parkinson-Krankheit, in denen pathogene α-Synuclein angesammelt hat, ist eine neurodegenerative Zyklus von dem Tod von dopaminergen Neuronen geschaffen, die mehr aggregierte α-Synuclein lösen, weitere klassische Aktivierung der Mikroglia 7 zu fördern. Ähnlich wie bei peripheren Makrophagen, Mikroglia kann auch die Fähigkeit hat, alternativ in der Gegenwart des anti-inflammatorischen Zytokine IL-4 und IL-10 aktiviert, so dass ihnen die potenten gebenial neuronaler Reparatur zu fördern und zu dämpfen Entzündungen 2, 11. Abgesehen von ihren immunologischen Funktionen im ZNS, Mikroglia wurden als vital Regulator der neuronalen Schaltkreise beschrieben von Synapsen während der Entwicklung Beschneiden. Zum Beispiel haben Cx3cr1- KO - Mäuse weniger dichte Mikroglia und reduziert synaptic pruning, was zu einer Überfülle von dendritischen Dornen führt, unreife Synapsen, und die elektrophysiologischen Muster eines unterentwickelten CNS 12. diese physiologische Komplexität und die vielfältigen funktionalen Rollen des Mikroglia in der Homöostase des ZNS zu verstehen, ist für Therapeutika Targeting neurodegenerativen Erkrankungen zur Suche kritisch.
Im Bereich der Neuroimmunologie, sind in - vitro - Experimente sehr wünschenswert , wegen der größeren Machbarkeit für mechanistische Studien, die geringer Wartungskosten, und für weniger zeit- und arbeitsintensiv. FurthermoRe, ist die Fähigkeit, Zellpopulationen zu isolieren, kritisch, um die Funktionalität dieser Zielzellen unter vorgeschriebenen Bedingungen zu beschreiben. Zahlreiche Mikroglia - Isolierungsmethoden existieren, aber sie sind durch ihre Fähigkeit begrenzt relativ hohe Zahlen und Reinheit für breites Experimentieren 13, 14, 15 zu erhalten. Zum Beispiel ist ein Cluster der Differenzierung 11b (CD11b) ein gemeinsamer Oberflächenmarker von Monozyten, Makrophagen und Mikroglia 16. Durch Ausnutzen CD11b wurde ein Verfahren zur magnetischen Trennung zunächst als säulenbasierte Ansatz beschrieben , dass ~ 99,5% Reinheit ergab und ~ 1,6 × 10 6 pro Mikrogliazellen neonatalen Gehirn 17. Unser Labor vor kurzem entwickelte eine säulenfreien CD11b magnetischen Trennverfahren 15, die wir mit Tagging CD11b mit einem monoklonalen Antikörper in einem Polystyrol - Röhrchen durchgeführt , konjugiert an Phycoerythrin (PE). Ein bispezifischer secondary Antikörper an PE und Dextran-Komplexe mit dem PE. Einmal gebunden, Dextran-beschichtete magnetische Partikel eingebracht, die an das Dextran Ende des Antikörper-Komplex binden. Schließlich wird die Polystyrol-Röhrchen in einem Magnet für Mikroglia-Isolierung angeordnet. Dieser Ansatz verdoppelte sich die Ausbeute auf ~ 3,2 x 10 6 Mikroglia pro neonatalen Gehirn , sondern auf Kosten der Reinheit reduziert auf ~ 97%.
Hier zeigen wir , eine schnelles und verfeinertes säulenfreien CD11b magnetische Trennung Protokoll (Abbildung 1). Diese verbesserte Methode bleibt wie möglich als unsere ursprüngliche säulenfreie Methode, da der Preis des CD11b magnetische Trennung Satzes gleich ist. Die Ausführungszeit wird in die Hälfte reduziert, was zur Maximierung der Ausbeute und das Überleben der Zellen von entscheidender Bedeutung sein kann. Bemerkenswerterweise ist die Reinheit von diesen optimierten Verfahren erreicht ~> 99%, eine deutliche Verbesserung gegenüber der Reinheit von dem ursprünglichen säulenfreien Verfahren durch unser Labor 15 entwickelt erreicht. Am wichtigsten ist, CD11b-PEnicht verwendet wird, von der Licht entfällt die Notwendigkeit, und die Verwendung des roten Kanal für die Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht inkubieren entfernt. Schließlich ist, wie in dem ursprünglichen CD11b-Verfahren, eine astrozytären Fraktion von hohen Ausbeute und Reinheit mit diesem verbesserten Verfahren erhalten. Astrozyten sind die zahlreichen Gliazellen im ZNS, die Idee führt , dass ihre homöostatischen Funktionen 18 in Bezug auf Pathophysiologie unverzichtbar sind. Diese gliale Zellen spielen eine Rolle bei verschiedenen physiologischen Funktionen wie die Blut-Hirn-Schranke bilden, nährstoff Unterstützung, Neurotransmitter Aufrechterhaltung der Homöostase, bilden glial Narben in Reaktion auf eine Verletzung, Neuroprotektion, Lernen und Gedächtnis, und Neuroinflammation, beispielhaft ihre investigatory Potential in glial Biologie 19. Morphologie und Funktionalität von Mikroglia und Astrozyten wurden durch konfokale Mikroskopie, Western-Blot, quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR), G ermitteltRiess Nitrit-Test und der Multiplex-Zytokin-Assay Luminex. Die Verfeinerung dieses Protokoll zur Verfügung gestellt bietet mehr Vertrauen zu Mikroglia oder Astrozyten Reinheit, eine breitere Anwendung der Fluoreszenzmikroskopie mit der Verfügbarkeit des roten Kanals betreffen, und spart Zeit, die alle für die in - vitro - Experimente wichtig sind.
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Protocol
Die Verwendung der Tiere und Protokollverfahren genehmigt und überwacht von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Iowa State University (Ames, IA, USA)
1. Anbau von Mixed Gliakulturen
- Köpfen 1- 2 Tage alten Welpen schnell mit 5,5-Zoll-Betriebs Schere, und legen die Köpfe sofort in ein 50 ml Röhrchen auf Eis. Beachten Sie, dass diese Enthauptung der Modus der Euthanasie ist.
- In einer laminaren Luftstrom Haube, macht einen kleinen Schnitt in dem Schädel und Hirnhaut mit 4,5 Zoll gerade Mikro-Dissektionsscheren. Beginnen vom Schwanzende zum rostralen Ende Schneiden (Nase). Holen Sie unter der Haut durch die Öffnung durch die Enthauptung gebildet werden.
- Nach der Inzision abschälen einer der Halbkugeln an der Seite. Dann mit einem Paar von gekrümmten bzw. Haken Pinzette das gesamte Gehirn zu entfernen.
- Tauchen Gehirn (s) in einem neuen 50-ml-Röhrchen, das 0,25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetaß Säure (EDTA) für 15 min in einem 37 C-Wasserbad °. Verwenden Sie 2 ml Trypsin-EDTA pro Gehirn.
- Waschen Sie das Gehirn (s) mit frischem Wachstumsmedium (10% FBS, DMEM / F12, 1% Penicillin / Streptomycin, 1% L-Glutamin, 1% Natriumpyruvat und 1% nicht-essentielle Aminosäuren) durch Hinzufügen und Entfernen der Medien. Wiederholen Sie diesen 4x.
- Für jedes Gehirn, die Platte zwei T-75-Kolben Wachstumsmedien enthalten. Daher fügen Sie 2 ml Wachstumsmedium pro Gehirn auf das Rohr. So wird es ein Äquivalent von 1 ml der homogenisierten Gehirn mit 8-9 ml Wachstumsmedium pro T-75-Kolben sein.
- Homogenisieren durch Verreiben des Gehirns (n) mit Pipetten von Größen Öffnung unterscheiden, um vom größten bis zum kleinsten. Wenn es sichtbar ist , dass das Hirngewebe nicht immer kleiner, Übergang zur nächsten Pipette. Am Ende des Verreiben sollte die Suspension klar sein, ohne sichtbare Klumpen.
- Verwenden einer 25-ml-Pipette wurden 5 ml-Pipette und dann eine 10 ml-Pipette sequentiell.
- Übergeben Sie jede homogenous Gehirnsuspension durch ein 70 & mgr; m Zellsieb es in einer einzigen Zellkultur zu machen.
- Für jedes homogenisierte Gehirn Platte zwei T-75-Kolben, enthaltendes Wachstumsmedium, wie in Schritt 1.5 (1 ml homogenisiert Gehirn mit 8-9 ml Wachstumsmedium pro T-75 Kolben) beschrieben.
- Ändern Nährmedien nach 6 d und wachsen , bis Isolation am 16. Tag.
2. Isolierung von Mikroglia-Zellen
- Nach 16 Tagen, das Wachstumsmedium aus dem Kolben entfernen und sie in einer frischen 50 - ml - Röhre platzieren. 3 ml 0,25% Trypsin-EDTA zu jedem T-75 - Kolben. Schütteln Sie die Kolben für 5 min bei RT auf einem Schüttler.
- Zentrifuge entfernt das Wachstumsmedium bei 0,4 × g für 5 min und verwendet, um die Trypsin-EDTA-Reaktion in dem nachfolgenden Schritt zu stoppen.
- Nach Schütteln für 5 Minuten, ein Minimum von 4 ml Wachstumsmedium (frisch oder den verwendeten Medien aus 2.1.1) in die Trypsin-EDTA-Reaktion zu stoppen.
- Man reibt, um sicherzustellen, dass alle cells haben abgenommen worden ist.
- Nach Digerieren, um die Zellen durch einen 70 & mgr; m Zellsieb passieren sie in eine einzige Zellkultur zu machen, eine Zellzählung durchzuführen, und dann dreht die Zellen bei 0,4 × g für 5 min nach unten.
- Für jede 100 x 10 6 Zellen (etwa 15 x 75 T-flasks) Verwenden 1 ml Empfohlene Medien (2% FBS, DPBS (Calcium und Magnesiumchlorid-frei), 1 mM EDTA) , um das Zellpellet resuspendieren.
HINWEIS: Alle folgenden Schritte für eine 1-ml-Trennung zugeschnitten sind. - Nehmen Sie ein 5 ml Polystyrolröhrchen, 1 mL Empfohlene Medien und den Meniskus markieren. In Empfohlene Medien bis zu 2,5 ml und markieren Sie diese auch. Verwerfen Sie den Empfohlene Materialien und übertragen die resuspendierten Zellen in den 5 ml Polystyrolröhrchen.
- Zugeben von 50 & mgr; l Rattenserum für je 1 ml suspendierter Zellen. Inkubieren für 5 min bei RT.
- Bereiten Auswahl-Cocktail durch 25 & mgr; l der Komponente A gemischt und 25 & mgr; l der Komponente B. Diese Komponenten proprietär sind.
- In 501; L des Auswahl Cocktail an die Zellen. Inkubieren für 5 min bei RT.
HINWEIS: Bei reinen Kulturen, wiederholen Sie den Schritt 2.9 (empfohlen, aber nicht zwingend). - Vortex-Mikrokugeln für 45 s. In 80 & mgr; l Mikrokügelchen pro 1 ml Probe. Inkubieren für 3 min bei RT.
- Bringen Sie das Volumen auf 2,5 ml in Polystyrolröhrchen durch die Zugabe von Empfohlene Materialien.
- Setzen Sie den Schlauch in den Magneten für 3 min bei Raumtemperatur. Stellen Sie die Inkubation Reinheit zu erhöhen. ausgießen langsam Empfohlene Medien in ein 15-ml-Röhrchen mit dem Magneten noch in den Polystyrol-Röhrchen.
- Wiederholen Sie Schritt 2.12 drei weitere Male. Zusätzliche magnetische Inkubationen können zu erhöhen Reinheit durchgeführt werden.
- In 3 ml Nährmedien und zählen die Anzahl der Zellen einen Zellzähler verwendet wird.
- Platten Zellen entsprechend in Poly-D-lysin (PDL) -beschichtete Platten für die Behandlungen. Man behandelt die Zellen 48 h nach inPDL beschichteten Platten Säen. Auf diese Weise können die Zellen aus dem Stress der Trennung erholen.
HINWEIS: Check die Reinheit der Kultur unter Verwendung von Immuncytochemie wie zuvor beschrieben 15. - Plattieren der negativen Fraktion (in einem 15 ml-Röhrchen gesammelt), die meist Astrozyten, in T-75-Kolben in dem Wachstumsmedium enthält.
- Nach mindestens 6 h Inkubation bei 37 ° C-Inkubator, um das Medium zu ändern und läßt es O / N wachsen. Teilen Sie die Astrozyten am nächsten Tag für Behandlungen.
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Representative Results
Mikroglia isoliert CD11b Positive Selection Kit II hohe Reinheit
Primäre Maus Mikroglia wurden unter Verwendung des oben genannten Protokolls isoliert und ausplattiert auf Poly-D-Lysin-beschichtete Deckgläser, die Reinheit der Isolation zu prüfen. Zehntausend Zellen wurden pro Napf und immunzytochemische Analyse ausplattiert wurde mit ionisiertem Calcium bindende Adaptormolekül 1 durchgeführt (Iba1) als Marker für Mikroglia und gliales fibrilläres saures Protein (GFAP) als Marker für Astrocyten für die Reinheit des isolierten Mikroglia überprüfen . Die isolierte Kultur exprimiert nur Iba1 ohne GFAP Ausdruck (2A), was darauf hindeutet , dass die Kultur isoliert war reines Mikroglia. Im Gegensatz zu anderen veröffentlichten Verfahren zuvor für die primäre Mikroglia-Trennung, die ~ 97% Reinheit erreicht, unter Verwendung dieses Verfahrens erhielten wir ~> 99% Reinheit in der Hälfte der Zeit. Um die Reinheit des th zu validieren Kultur ist, liefen wir eine Western - Blot - 20 für Iba1 und GFAP. Immunoblot - Analyse zeigte ferner , dass diese Isolation aus den gemischten Gliakulturen war eine nahezu reine Mikroglia Kultur (2B).
Das modifizierte Isolierungsverfahren hat keine Autofluoreszenz von magnetischen Beads
Der rote Kanal kann nicht für die Immuncytochemie (ICC) verwendet werden , wenn die vorherige CD11b Isolation Kit für Mikroglia - Trennung unter Verwendung eines von Gordon et al erwähnt. 15 wegen der Verwendung von PE - Kennzeichnung während der Trennung. Mit diesem neuen PE-Free - Isolierungskits, können wir den roten Kanal für die immunzytochemische Analyse (Abbildung 3) verwenden. Von diesem ICC ist es offensichtlich, dass diese neue Methode uns alle Kanäle für die Durchflusszytometrie oder andere Fluoreszenz-Imaging-Studien nutzen kann.
ve_step“fo: keep-together.within-page = "1"> isoliert Mikroglia Kulturen reagieren funktionell zu LPS StimulusUm sicherzustellen , dass die isolierte Mikroglia funktionell aktiv sind, behandelt man die Zellen mit LPS, ein weit verbreitetes Stimulans 9 bis Mikroglia zu aktivieren, für 24 Stunden vor der für verschiedene proinflammatorische Faktoren Sondieren. Klassische Mikrogliaaktivierung wird durch die Freisetzung von Nitrit und verschiedene proinflammatorische Zytokine in den Medien begleitet. Daher haben wir mehrere komplementäre Assays, die die funktionelle Aktivität der isolierten Mikroglia zu bestätigen. Zuerst haben wir die Griess - Assay zu zeigen , daß LPS dramatisch Nitrit Sekretion aus der isolierten Mikroglia (4A) induziert. Um die Aktivität von isolierten Mikroglia zu bestätigen, verwendeten wir qRT-PCR zu zeigen (Boten - Ribonukleinsäure) mRNA - Spiegel von NOS2, ein weiteres Markenzeichen der Mikroglia - Entzündung, deutlich verbessert with LPS - Behandlung (4B). Als nächstes haben wir eine bead-basierten Multiplex - Assays, 21 Luminex, zu verifizieren , dass LPS signifikant die Sekretion von proinflammatorischen Cytokinen aus der Mikroglia - Kultur (5A) stimuliert. Darüber hinaus überprüften wir über qRT-PCR - Analyse , dass LPS - Behandlung die Genexpressionsniveaus mehrere proinflammatorischer Zytokine einschließlich IL-1β und TNF & agr; (5B) erhöht. All diese Daten zusammen legen nahe, dass die primären Mikroglia isolierten diese neu verfeinerte Methode sind funktionell aktiv und zeigen eine ähnliche Aktivierungsprofil als primäres Mikroglia isoliert zuvor veröffentlichten Methoden.
Isolierte Mikroglia kann für die Signalisierung Studien verwendet werden
Mit den bisherigen Methoden der Mikroglia-Isolation, läuft West blot für die Signalisierung Studien war schwierig und undurchführbar aufgrund der niedrigen Ausbeute und Reinheit. Bisher haben wir gezeigt , dass Fyn, eine Src - Familie - Kinase in einer pro-inflammatorischen Signalkaskade in Mikroglia - Zellen 9 beteiligt ist. Hier überzogen wir eine Million Mikroglia-Zellen in einer 12-Well-Platte und nach 48 h, sammelten wir die Zellen Western-Blots für native Fyn und Src-Kinasen phosphoryliert bei Tyrosinrest 416 (p-Src-Y416) zu laufen. Wir konnten sowohl Fyn und p-Src-Y416 Niveaus in unseren isolierten Mikroglia - Zellen (Figur 6) erkennen, was zeigt , dass dieses Verfahren für die Signalisierung Studien Western - Blotting - Techniken anwendbar ist.
Die negative Fraktion aus der Mikroglia-Trennung enthält Astrozyten, der zum Signalisieren Studie verwendet werden kann,
Astrozyten sind wichtige Akteure in neuroinflammation, und das Verständnis der Signalmechanismen hinter astrocytic Entzündung und Neuron-Astrozyten Übersprechen ist wichtig , 19. Hier zeigen wir , dass die negative Fraktion aus der Mikroglia - Trennung enthält GFAP-positive Astrozyten - Zellen (7A). Auch unsere Western - Blot - Analyse für Fyn und p-Src-Y416 (7B) zeigte , dass beide diese Proteine als auch in der negativen Fraktion nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen zusammen, dass die negative Fraktion ist eine ideale Vorbereitung für Astrozyten Studien zur Protein wichtig für entzündliche Signalkaskaden zu identifizieren.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Isolierung von Mikroglia - Zellen 1 bis 2 Tage postnatalen-Welpen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version zu sehendiese Figur.
Abbildung 2: Mikroglia Isolierte mit CD11b-positive Selection Kit II hohe Reinheit aufweisen. (A) Immunocytochemistry isolierter Mikroglia Kultur für GFAP in rotem Kanal und Iba1 im grünen Kanal Sondierung. (B) Immunoblot von isolierter Mikroglia Kultur Sondieren für GFAP (~ 51 kDa), Iba1 (~ 15 kDa) und β-Actin (~ 42 kDa). Maßstabsbalken = 20 um. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Die Modified Isolierungsverfahren hat keine Auto-Fluoreszenz von Magnetic Beads. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: LPS Stimulation erhöhte Nitritproduktion in Mikroglia - Kultur. (A) Isolieren Mikroglia - Zellen für 24 h mit 1 & mgr; g / ml LPS behandelt , und das Behandlungsmedium gesammelt wurde Nitritfreisetzung durch Griess - Assay zu bestimmen. (B) q-RT-PCR für NOS2 aus isolierten Mikroglia mit LPS behandelt für 24 h. Die Zahlen stellen den Mittelwert ± SE von 2 oder mehr unabhängigen Experimenten. Die Daten wurden analysiert Student-t-Test (p *0; 0,05, ** p <0,01 *** p <0,001). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: LPS-induzierte Pro-inflammatorische Zytokin - Freisetzung aus Mikroglia - Zellen. (A) Luminex Multiplex - Assay wurde auf Behandlungsmedium durchgeführt , aus isolierten Mikroglia - Zellen für 24 h mit 1 & mgr; g / ml LPS behandelt gesammelt. (B) q-RT-PCR für IL-1βand TNFa aus isolierten Mikroglia mit LPS behandelt für 24 h. Die Zahlen stellen den Mittelwert ± SE von 2 oder mehr unabhängigen Experimenten. Die Daten wurden unter Verwendung des Student-t-Test analysiert (* p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001). Bitte klicken Sie hier , um die sieht eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Getrennte Mikroglia kann für Signalstudien verwendet werden. Western-Blot-Analyse zeigt, dass Fyn und p-Src-Y416 aus Mikroglia isoliert mit unserem neu raffinierten Verfahren nachgewiesen werden.
Abbildung 7: Die Negativ - Fraktion aus der Mikroglia Trennung Enthält Astrozyten , die für die Signalstudien verwendet werden können. (A) Western - Blot zeigt , dass die negative Fraktion enthält GFAP-positive Zellen. (B) Western - Blot - Analyse zeigt , dass Fyn und p-Src-Y416 kann aus den GFAP-positiven Zellen detektiert werden.target = „_ blank“> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Parameter | aktuelle Verfahren | Modifiziertes Verfahren | |
| Kosten | $ 620 | $ 620 | |
| Zeit | 55 min | 25 min | |
| Fluoreszenz | Ja (roter Kanal) | Nein | |
| Reinheit | ~ 97% | ~ 99% | |
Tabelle 1: Vergleichende Analyse zwischen der Refined Microglial Isolationsmethode und der ursprünglichen Methode der Isolation.
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Discussion
Ältere Mikroglia-Isolationsmethoden haben begrenzte Wiederherstellungen, die nicht geeignet sind für verschiedenes Protein durch Western-Blot-Analysen und RNA-Analysen durch qRT-PCR. Die differentielle Adhärenz und milde Trypsinisierung Methoden sind zwei gemeinsame Ansätze mit niedrigeren Ausbeuten Mikroglia 13, 14, 15. Die Säule basierte CD11b Ansatz hat auch eine geringe Erholung, aber erreicht eine höhere Reinheit als differentielle Adhärenz und mild Trypsinisierung 13, 14, 15, 16, 17. Unsere ursprüngliche säulenfreien CD11b Ansatz verbessert erheblich die isolierten Ausbeuten, es geeignet für die Proteinherstellung und RNA - Analysen wie Western Blotting und qRT-PCR, aber auf Kosten einer verringerten Reinheit 15.
Unsere neu modifizierten Methode behältDie Ausbeuten der ursprünglichen Methode und erhöht die Reinheit leicht von ~ 95-97% auf ~> 99%, aber in der Hälfte der Zeit bis zur Fertigstellung, die für das Überleben der Zelle kritisch ist. Entscheidende Schritte innerhalb des Protokolls können optimal Mikroglia Isolation gewährleisten. Während die Welpen enthaupten, sollte darauf die Köpfe auf Eis zu halten genommen und in einer laminaren Luftstrom Kammer innerhalb von 5-10 min zu sezieren. Längere Gehirn Exzision Zeiten werden es schwierig, das volle Gehirn zu erhalten, weil es seine Festigkeit bei Umgebungstemperaturen zu verlieren beginnt, die Mikroglia-Ausbeuten zu beeinträchtigen. Bemerkenswert ist, 2.9 Wenn Schritt mindestens einmal wiederholt wird, gibt es eine beobachtbare Zunahme der Reinheit und der Lebensfähigkeit. Wenn die Ausbeute der Trennung gering ist, kann die Trennung weniger Flaschen pro ml empfohlenen Medien oder durch Erhöhung des Volumens der Trennung (> 1 ml) unter Verwendung werden wiederholt. Abnehmende Zelle crowding wird im allgemeinen Reinheit, die Lebensfähigkeit und die Ausbeute verbessern. Die magnetische Inkubationszeit kann 2,12 in Schritt erweitert werden Reinheit zu erhöhen. Das kannversichern richtige magnetische Bindung der Mikrokugeln, die auf die Mikroglia befestigt sind. Ferner können zusätzliche magnetische Inkubationen in Schritt ausgeführt 2.9 zum Zwecke der Erhöhung der Reinheit und Ausbeute werden kann.
Die Durchführbarkeit des Protokolls ist gleich oder besser als das ursprüngliche CD11b-Verfahren; jedoch ist die neue Methode verfeinert und kürzer. Ein weiterer wesentlicher Vorteil von dieser verfeinerten Methode gewonnen wird , ist die Möglichkeit , den roten Kanal für die Fluoreszenzmikroskopie verwendet wird , die von PE in der ursprünglichen Methode (Tabelle 1) 15 belegt ist. Obwohl wir hohe Ausbeute und Reinheit des Mikroglia mit dem Verfahren zu erhalten, ist die Astrozyten Ausbeute aus dieser Trennung erhielt weniger rein, da es einige Fibroblasten behält. Wie 2.17 in Schritt beschrieben, nachdem die Astrozyten Plattierung und 6 h Inkubation sollte das Wachstumsmedium durch frische Medien ersetzt werden. Astrozyten sind die ersten, in den Kolben zu befestigen, während ein Großteil der Fibroblasten in susp bleibenension. Der Ersatz der Medien wird in der Regel die Mehrheit des kontaminierenden Fibroblasten entfernen. Obwohl diese Technik eine hohe Reinheit von Astrozyten sichert, ein sekundäres Reinigungsverfahren zu reineren Kulturen zu erreichen gerechtfertigt ist.
Insgesamt erzeugt diese modifizierte CD11b Isolationsverfahren hochreinen primären Mikroglia und Astrozyten in einer kurzen Zeit. Die kürzere Isolationszeit verbessert im Allgemeinen Raten des Überlebens der Zelle. Es stellt ein nützliches Modellsystem für die Signalmechanismen Aufklären sowohl Mikroglia und Astroglia Biologie zugrunde liegen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
NS088206 und ES026892: Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health (NIH) Grants unterstützt. Die W. Eugene und Linda Lloyd Stiftungslehrstuhl an AGK und Deans Professur AK werden hiermit anerkannt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EasySep CD11b Separation Kit II | StemCell Technologies | 18970 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1x) | Life Technologies | 11330057 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| MEM Non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-Glutamine (100x) | Life Technologies | 25030081 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | 13H469 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Technologies | 25200 | |
| Dulbecco's PBS (DPBS) | Gibco by Life Technologies | 14190250 |
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