Abstract
تقييم عمل المضادات الحيوية مع تطوير العقاقير الجديدة الموجهة نحو البكتيريا اللاهوائية أمر صعب ومطالب من الناحية الفنية. للحصول على نظرة ثاقبة وزارة الزراعة ممكن، والتغيرات المورفولوجية المرتبطة التعرض للمضادات الحيوية يمكن تصور باستخدام المجهر الإلكتروني المسح (سيم). دمج التصوير سيم مع منحنيات قتل التقليدية قد تحسن رؤيتنا في العمل المخدرات والمضي قدما في عملية تطوير المخدرات. لاختبار هذه الفرضية، وقتل منحنيات ودراسات سيم أجريت باستخدام المخدرات مع وزارة الزراعة المعروفة ولكن مختلفة (فانكومايسين وميترونيدازول). خلايا C. صعب (R20291) نمت مع أو بدون وجود المضادات الحيوية لمدة تصل إلى 48 ساعة. على مدى فترة 48 ساعة، تم جمع الخلايا في نقاط زمنية متعددة لتحديد فعالية المضادات الحيوية والتصوير على سيم. وتمشيا مع التقارير السابقة، كان فانكومايسين وميترونيدازول نشاطا كبيرا للجراثيم بعد 24 ساعة من العلاج على النحو الذي تقاسه وحدة تشكيل مستعمرة (كفو) كونتينغ. باستخدام التصوير سيم، وجدنا أن ميترونيدازول له آثار كبيرة على طول الخلية (> 50٪ تخفيض في طول الخلية لكل المضادات الحيوية؛ P <0.05) مقارنة مع الضوابط والفانكومايسين. في حين لم يتم توثيق الاستجابة المظهري للعلاج من تعاطي المخدرات سابقا بهذه الطريقة، فإنها تتفق مع وزارة الزراعة المخدرات التي تبين تنوع وموثوقية التصوير والقياسات وتطبيق هذه التقنية للمركبات التجريبية الأخرى.
Introduction
كلوستريديوم ديفيسيل عبارة عن جرثومية إيجابية تشكل البكتريا التي تسبب الجراثيم، مما تسبب في حوالي 500،000 إصابة سنويا في الولايات المتحدة، ويعتبر هذا المرض ممرضا عاجلا على مستوى التهديد من قبل مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها، وهو أعلى مستوى من المخاطر. 1 شهد العقد الماضي تطورا كبيرا في العقاقير المضادة للميكروبات مع النشاط ضد C. صعب . 2 ، 3 في المختبر الدراسات هي عنصر ضروري من عملية تطوير المخدرات. 4 تقليديا، في المختبر وقابلية الوقت وقتل الدراسات تستخدم للتحقق من صحة الحيوان في المستقبل وغيرها من الدراسات في الجسم الحي .
في حين أن هذه الأساليب تخدم دورا هاما لتقييم عمل القتل، فإنها لا تعبر عن استجابة الخلايا الظاهرية للعلاج الدوائي. من خلال دمج المسح المجهري الإلكتروني (سيم) مع القياسيهد قتل الدراسات الحركية، توصيف أكثر دقة من المضادات الحيوية الآثار المباشرة هو ممكن. 5 ، 6 ، 7 هنا، نقدم طريقة حيث سيم يستخدم كوسيلة للتعرف على فعالية العلاج بالمضادات الحيوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. عزل C. صعب من مختلف المصادر البيئية أو السريرية
- العزلات البيئية: باستخدام مقياس القطن المعقم مسبقا (مبللة طفيفة مع 0.85٪ كلوريد الصوديوم)، مسحة سطح أي مجال من مجالات الاهتمام (الكلمة، الباب، مقبض، الرف، الخ ). 8 تأكد من ارتداء قفازات معقمة ووضع مسحة في أنبوب معقمة بعد الانتهاء.
- العزلات السريرية (البراز): لوحة 10 إلى 100 ملغ من عينات البراز السريري على أجار السيفوكسيتين سيكلوسيرين - الفركتوز (كفا) باستخدام حلقة التلقيح واحتضان تحت ظروف اللاهوائية صارمة لمدة 48 - 72 ساعة. مخزن المستعمرات المعزولة من C. صعب الأسهم في كريوفيالز في -80 درجة مئوية لمزيد من التحليلات. 7 ، 9 ، 10
- إثراء عينات مسحة البيئية في الدماغ ضخ القلب (بهي) مرق مع 0.05٪ توروشولات الصوديوم ومكان في غرفة اللاهوائية عند 37 درجة مئويةلمدة 5 أيام. الطرد المركزي 1 مل من الثقافة في 10،000 x ج و ريسوسبيند بيليه في 100 ميكرولتر من الإيثانول.
- لوحة الخلايا معلق (50 ميكرولتر) على سيكلوسيرينسيفوكسيتين أجار الفركتوز (كفا) لوحات واحتضان في غرفة اللاهوائية عند 37 درجة مئوية لمدة 40 - 48 ساعة. مخزن المستعمرات المعزولة من C. صعب الأسهم في كريوفيالز في -80 درجة مئوية لمزيد من التحليلات.
- اختبار يشتبه C. المستعمرات صعب باستخدام كاشف تراص اللاتكس أو ير.
2. زراعة C. صعب وقتل الإجراءات الحركية
- تنمو تنقيته البيئية أو السريرية C. السلالات صعب على لوحات أجار الدم في غرفة اللاهوائية عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
- تأخذ مستعمرة واحدة معزولة مع حلقة التلقيح، ونقله إلى 5 مل بهي المتوسطة في أنبوب 15 مل، وتنمو لمدة 24 ساعة في غرفة اللاهوائية عند 37 درجة مئوية.
- تمييع ما قبل الثقافات 1: 100 إلى ما يقرب من 10 6 وحدة تشكيل مستعمرة(كفو) / مل في الطازجة قبل تخفيض بهيس (بهي زائد 5 جرام / لتر استخراج الخميرة و 1٪ L- السيستين) تستكمل مع 0.1٪ توروشولات الصوديوم والتركيز المناسب للمضادات الحيوية (T0).
- جمع عينة 1 مل مع ماصة في كل نقطة زمنية (T0، T6، T24، T48) لوحة / انتشار قسامة صغيرة (100 ميكرولتر في التخفيفات المسلسل) على لوحة أجار الدم. السماح للخلايا تنمو على لوحة أجار الدم لمدة 48 ساعة في غرفة اللاهوائية عند 37 درجة مئوية، وعدد عدد الناتجة من المستعمرات لتحديد كفو.
3. إعداد عينات لمسح المجهر الإلكتروني
- جمع 1 مل من الخلايا من كل نقطة زمنية في أنابيب ميكروسنتريفوج وأجهزة الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف وغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني.
- الطرد المركزي العينات في 10،000 x ج لمدة 10 دقيقة مرة أخرى وتجاهل طاف. إعادة تمييع الخلايا في 1 مل من بارافورمالدهيد 4٪ واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- عينات الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 10 دقيقة في 10،000 زغ وتجاهل طاف. غسل الخلايا مرتين مع الماء المقطر وإعادة تعيين في 100 ميكرولتر من الماء المقطر. ضبط حجم اعتمادا على تعكر الحل.
ملاحظة: جعل التخفيفات التسلسلية متعددة هي فكرة جيدة. - تسمية كوفرسليبس وإضافة 40 ميكرولتر من العينة على ذلك. احتضان لمدة 15 دقيقة في غطاء محرك السيارة لتدفق السائل والسماح للخلايا على التمسك ساترة. إذا كان السائل لا يزال موجودا، استخدم منفاخ لإزالة السائل.
- مكان كوفرسليبس المسمى مع الخلايا في آلة الاخرق مكتب وشريط أسفل. تأمين الذهب الخالص في آلة الاخرق. بدوره على الجهاز والبدء الاخرق في الضغط المنخفض (50 متور). خلايا معطف لمدة 30 ثانية في 80 مللي أمبير، والذي يترجم إلى 20 نانومتر من طلاء الذهب.
- نقل الخلايا المغلفة إلى المجهر الإلكتروني الماسح الضوئي.
4. التصوير C. صعب الخلايا على المجهر الإلكتروني المسح الضوئي
- تنفيس المجهر الإلكتروني الماسح (سيم) بشكل صحيح من قبل العلاقات العامةإسينغ زر تنفيس على برامج الكمبيوتر.
- باستخدام الشريط الكربون، وتأمين كوفرسليبس المغلفة على المرحلة المعدنية. بمجرد تنفيس سيم، يجب فتح الباب بسهولة. قفل المرحلة المعدنية في غرفة سيم عن طريق شد عليه في.
- انقر فوق الزر بومب في برنامج الكمبيوتر. سوف سيم تكون صالحة للاستخدام عندما يقرأ النظام "فاك موافق".
- انقر على كاشف سي تحت علامة التبويب كاشفات. بدوره على شعاع من خلال النقر على الزر الذي يعرض الجهد. بدء التصوير في الجهد المنخفض (5 كيلو فولت) قبل زيادة الجهد (تصل إلى 15 كيلو فولت). ستظهر صورة بعد تشغيل الحزمة.
- باستخدام وظيفة تتبع، والعثور على منطقة على كوفرسليبس المغلفة إلى الصورة. التكبير في المنطقة والعثور على هياكل على شكل قضيب. هذه هي كلوستريديوم صعب .
- التكبير والتركيز على الصورة لمعايرة النظام. وينبغي أن يتم ذلك على مسافات عمل متعددة: 15 و 9 و 5 مم. صورة على مسافة عمل 5 مم.
- قم بتشغيل uلترا عالية الدقة وضع التصوير والبدء في التركيز وتحسين الاستجماتيزم.
- بدء التركيز في التكبير عالية. استخدام التركيز الخشنة وغرامة تبديل لهذا الغرض. ضبط الاستجماتيزم وكذلك للحصول على صورة أوضح.
- ضبط الاستجماتيزم في التكبير عالية. للقيام بذلك، وضبط الصيغ الاستجماتيزم (أنها تبدو مشابهة للتبديل التركيز غرامة / الخشنة) والتحقق من الصورة عن وضوح عن طريق التكبير رقميا على برامج الكمبيوتر.
- سي وظيفة المسح البطيء لجمع صورة ذات جودة عالية. حفظ الصورة التي تم جمعها كملف .TIFF، والتي سيتم استخدامها للتحليل. تأكد من تحديد شريط البيانات إذا تم إجراء القياسات أثناء التحليل.
- جمع الصور في زوايا مختلفة (تصل إلى 52 درجة عن طريق تحويل زاوية مباشرة على سيم.الزاوية الصور تميل إلى الكشف عن مزيد من المعلومات العمق.
- تغيير شعاع الجهد اعتمادا على الخلايا التي يتم تصويرها. الحفاظ على هذا في الغالب بين 5-15 كيلوفولت لجميع التجارب. بعد اكتمال التصوير، قم بإيقاف تشغيل الحزمة ورفع مسافة العمل إلى 20 مم. ويمكن بعد ذلك تنفيس الغرفة ويمكن إزالة المرحلة. نسخ جميع الصور على محرك الأقراص لمزيد من التحليل.
5. معالجة الصور وتحليلها
- تحميل وتثبيت البرمجيات المتاحة بحرية، فيجي (http://fiji.sc)، على جهاز الكمبيوتر.
- افتح ملف الصورة في فيجي.
- باستخدام وظيفة الخط، تتبع بدقة شريط مقياس.
- انقر فوق علامة التبويب تحليل في برنامج فيجي وأخيرا حدد وظيفة تحديد مقياس. ستظهر نافذة ستتطلب تحديد المسافة المعروفة استنادا إلى شريط المقياس. تغيير وحدة طول وكذلك انقر فوق موافق.
- الآن بعد أن يتم معايرة البرنامج لمسافة، استخدم وظيفة خط لقياس طول الخلية. للحصول على طول، استخدم الدالة خط لتتبع الخلية في مجملها. حدد علامة التبويب تحليل مرة أخرى ثم انقر على قياس. يجب طول التطبيقالأذن في الوحدات المشار إليها سابقا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كلوستريديوم ديفيسيل هو بكتيريا تشكيل بوغ وبالتالي فمن الضروري تحديد الاختلافات التشكل بين الخضري وخلايا بوغ قبل أي تحليل وظيفي. الشكل 1 يوضح الصور التمثيلية للخلايا الخضرية التي تم التقاطها خلال المرحلة الأسية من منحنى النمو وخلايا بوغ. كما هو مبين، والخلايا الخضرية طويلة، على نحو سلس، والهياكل على شكل قضيب في حين أن الجراثيم صغيرة، والهياكل البيضاوية التي لديها الخارجي الخام. وظيفيا، والخلايا الخضرية تنمو وتقسيم بسرعة، وتكون مسؤولة عن الفوعة من التهابات C. صعب عن طريق إفراز السموم، في حين أن الجراثيم هي نائمة عادة مع القليل من النشاط. وبالتالي، المضادات الحيوية هي في الغالب نشطة ضد الخلايا النباتية، في حين أن الجراثيم عادة ما تكون مقاومة للعلاج من تعاطي المخدرات، وذلك بسبب عدة طبقات حماية جوهر مع الحمض النووي، وعدم وجود النشاط الفسيولوجي. وبسبب هذه الحقائق، فإن الأغلبيةمن التحليل المورفولوجي يركز على الخلايا النباتية. 11 ، 12
منحنى قتل المضادات الحيوية هو المنهجية القياسية لإثبات فعالية المضادات الحيوية ضد البكتيريا المتنامية. واستخدمت التركيزات المستخدمة مع سلالة C. صعب R20291 على القيم ميكس، 1 ميكروغرام / مل ل فانكومايسين و 0.51 ميكروغرام / مل ل ميترونيدازول. 10 كما هو مبين في الشكل 2 ، خلايا التحكم تنمو وتصل إلى الهضبة، في حين أن الخلايا المعالجة تنخفض في مجموع وحدات تشكيل مستعمرة (كفو) إلى الحد من الكشف (لود) مما يدل على تأثير مبيد للجراثيم. كما تبين، فانكومايسين ( الشكل 2A ) وميترونيدازول ( الشكل 2B ) فعالة في قتل C. صعب في تركيزات سوباراميك (4xMIC). يمكن للمرء أن يلاحظ أن منحنيات قتل المضادات الحيوية تبدو مشابهة، ولكن الأدوية لديها آليات مختلفة من أس(فانكوميسين يمنع تخليق جدار الخلية بينما ميترونيدازول يؤثر على تكرار الحمض النووي). ولذلك، فإننا نقترح أن منحنيات قتل المضادات الحيوية قد لا يكون كافيا من السلطة التمييزية لتوفير الاختلافات التفصيلية بين هذه المضادات الحيوية. استخدمنا المجهري لتوفير المزيد من التمييز.
بسبب حجمها المجهري، C. صعب ليس من الممكن أن الصورة دون تكبير عالية. وقد وفرت هذه الفرصة لاستخدام المجهر الإلكتروني المسح (سيم)، وهي طريقة التصوير التي يمكن الحصول على قرار على نطاق نانومتر، لتقييم الآثار التفصيلية للعلاج بالمضادات الحيوية مباشرة على الخلايا. لإثبات فائدة هذا النهج، تم تصوير الخلايا قبل وبعد العلاج من تعاطي المخدرات لتحديد كيفية تغير التشكل ( الشكل 3A ). كما تبين، بعض جدران الخلايا قد تأثرت، كما هو الحال في فانكومايسين، وبعض الخلايا كانت أصغر في الحجم،كما كان الحال بالنسبة للميترونيدازول. لاختبار ما إذا كان حجم الخلية قد تأثرت، قمنا بتحليل طول الخلية باستخدام برنامج فيجي. الخضري حجم الخلية يمكن أن تختلف بعض في حالة التحكم، ولكن معظمها تقريبا 6 ميكرون في الطول ( الشكل 3B ). عند النظر في العديد من الخلايا من السيطرة والمعالجة الإعدادات، يمكن للمرء أن تلاحظ بسرعة أن طول الخلية يتأثر بشكل تفضيلي في ميترونيدازول ولكن لا يتأثر العلاج فانكومايسين ( الشكل 3C ).
الشكل 1: التفريق بين أنواع الخلايا عن طريق المسح الضوئي المجهر الإلكتروني. تظهر هي صور تمثيلية من كلوستريديوم ديفيسيل الخضري وخلايا بوغ. الخلايا النباتية هي هياكل قضيب التي هي طويلة و فلاجلاتد. في المقابل، خلايا بوغ صغيرة ولها معطف الخام وعرة. الجراثيم هي اللون الزائفة الحمراء ل بوربو الصورةسيس فقط. يتم عرض أشرطة مقياس على الصور. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: المضادات الحيوية الوقت اقتل المنحنيات. تم تنفيذ منحنيات قتل سوباراميك لأربعة مضادات حيوية مختلفة: فانكومايسين (A) ، ميترونيدازول (B) . وكانت هذه المضادات الحيوية عمل قتل كبير ضد C. صعب سلالة R20291 واقترب من الحد من الكشف (لود) لحساب وحدات تشكيل مستعمرة (كفو). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: فحص الآثار الدوائية للعلاج بالمضادات الحيوية. تم أخذ صور من الخلايا المعالجة وغير المعالجة في نقاط زمنية متعددة في جميع أنحاء الدراسات الحركية قتل (A) . يظهر هو مثال تمثيلي للخلية السيطرة الخلية التي تم قياسها لطول (B) . تم قياس الخلايا المعالجة وغير المعالجة ومقارنتها (C) . أجريت التجارب على الأقل على الأقل و 17> خلية تم قياسها لكل مجموعة. * P <0.05 مقارنة بمجموعة السيطرة وفانكومايسين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وكان الهدف من الدراسة الحالية لخلق طريقة عالية الإنتاجية لعزل C. صعب واختبار الحساسية للمضادات الحيوية باستخدام المجهر الإلكتروني المسح (سيم) كوسيلة لتوصيف أكثر دقة من العمل الدوائي للمضادات الحيوية. باستخدام البروتوكولات المبينة هنا، أثبتنا أن التصوير استجابة الظواهر الخلية للعلاج بالمضادات الحيوية يمكن أن تكشف عن نظرة ثاقبة في العمل الدوائي للدواء. في المجموع، الجزء التصوير من هذا البروتوكول يستغرق ما يقرب من 2 ساعة في مدة بعد جمع الخلايا، ولكن يمكن أن يكون أكثر تمييزية من القتل نموذجي الدراسات الحركية وحدها. في حين تعلم كيفية استخدام سيم يمكن أن تكون صعبة من الناحية الفنية، وإعداد عينات بسيطة نسبيا وسريعة. ونحن نعتقد أن هذه البروتوكولات المبينة هنا ستوفر نهجا موضوعيا لتقييم العمل الدوائي من العلاج بالمضادات الحيوية.
وبالنظر إلى أوجه الشبه بين tانه منحنيات قتل المضادات الحيوية ( الشكل 2 )، سعينا لتحديد ما إذا كانت هناك اختلافات بين استجابة الخلية للعلاج الدوائي. باستخدام سيم، قررنا أن ميترونيدازول كان له آثار على طول الخلية في تركيزات سوباراميك من المخدرات. في حين لم يتم الإبلاغ عن هذه الظواهر في وقت سابق، فإنها تتفق مع آليات المضادات الحيوية "الإجراءات واقتراح تأثير على استقلاب الخلية والنمو. في المقابل، كان فانكومايسين آثار كبيرة على جدار الخلية، وهو ما يتفق أيضا مع آلية عملها. 13 في حين أن هناك أوجه تشابه بين حركية القتل بين هذه المضادات الحيوية، فمن الواضح من الصور سيم أن هناك اختلافات ظاهرية كبيرة. وإنشاء مكتبة النمط الظاهري للمضادات الحيوية تسمح لتوصيف أكثر دقة من الأدوية التي قد لا يكون لها آلية واضحة للعمل المحددة، كما هو الحال في ريدينيلازول.
Becausه هذا الأسلوب هو من الناحية الفنية تحديا، قد تحتاج إلى إجراء تعديلات من أجل معالجة المسألة العلمية بما في ذلك إعداد خلية متسقة والتعديلات في الاخرق من طلاء الذهب. الكثير من الطلاء قد طمس أي آثار على السطح الخارجي للخلايا، ولكن لا يكفي طلاء يمكن أن يؤدي إلى شحن شعاع وتشويه الصور. لتجنب ذلك، وإعداد عينات مع كميات مختلفة من طلاء الذهب لتحسين الوقت الاخرق. وأخيرا، فإن منهجية متسقة بين الدراسات تسمح المقارنات بين التجارب التجريبية.
الحد من استخدام سيم هو أنه يقتصر على مراقبة التغيرات مورفولوجيا الخلية. ولذلك، فإن الدراسات الوظيفية ضرورية لتأكيد أي رد مشتبه به. وبسبب هذا، ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول التصوير يمكن استخدامها كوسيلة لتوجيه الدراسات الوظيفية. على الرغم من هذا التحديد، يمكن أن يتم وضع العلامات المناعية باستخدام سيم لتأكيد أي تغييرات يشتبه في الاتجار بالبروتين أو التجميع.ومع ذلك، لم نقم بعد بإجراء هذه التجارب.
نظرا لخط أنابيب نشطة من المضادات الحيوية الجديدة لعلاج C. صعب، تقييم أكثر دقة من العمل المخدرات أمر ضروري. كما قدم هنا، سيم يقدم فريدة من نوعها، عالية الإنتاجية، وموثوق بها فرصة لتوصيف العمل الدوائي. من خلال تصوير العديد من الآثار المضادات الحيوية المختلفة بين سلالات مختلفة من C. صعب ، ونحن سوف تكون قادرة على فهم لماذا بعض المضادات الحيوية هي أكثر فعالية من غيرها ضد سلالات ممرضة محددة مثل سلالة 027 / NAP1 / بي وباء. 14 وعلاوة على ذلك، قد يكون تحليل سيم مفيدة للتمييز بين الآثار المضادات الحيوية بين الأنماط أو السلالات ويمكن استخدامها لدراسة الأنواع البكتيرية الأخرى مما يدل على تطبيقها على نطاق واسع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cotton gauze | Caring | PRM21408C | |
| NaCl | Macron | 7532 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352098 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Criterion | C5141 | |
| L-cysteine | Alfa Aesar | A10389 | |
| yeast extract | Criterion | C741 | |
| sodium taurocholate | Alfa Aesar | A18346 | |
| anaerobic chamber | Coy | vinyl anaerobic chamber | |
| cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates | Anaerobe systems | AS-213 | |
| blood agar plates | Hardy diagnostics | A-10 | |
| latex agglutination reagent | Oxoid | DR1107A | C. diff test kit |
| microcentrifuge tubes | Eppendorf | 222363204 | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | 50-259-98 | |
| microscope slides | J. Melvin freed brand | 7525M | 75 x 25mm |
| flow hood | Labconco | Class II type A2 | biosafety cabinet |
| desk sputtering machine | Denton Vacuum | Desk II | |
| tape | Plastic Core | 05072-AB | SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape |
| gold | Denton Vacuum | TAR001-0158 | 2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil |
| scanning electron microscope | FEI | XL-30 |
References
- Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).
- Vickers, R. J., et al. Ridinilazole: a novel therapy for Clostridium difficile infection. Int J Antimicrob Agents. 48 (2), 137-143 (2016).
- Shah, D., et al. Clostridium difficile infection: update on emerging antibiotic treatment options and antibiotic resistance. Expert Rev Anti Infect Ther. 8 (5), 555-564 (2010).
- Ambrose, P. G., et al. New EMA guideline for antimicrobial development. Lancet Infect Dis. 12 (4), 265-266 (2012).
- Bassères, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
- Endres, B. T., et al. A novel method for imaging the pharmacological effects of antibiotic treatment on Clostridium difficile. Anaerobe. 40, 10-14 (2016).
- Endres, B. T., et al. Evaluating the Effects of Surotomycin Treatment on Clostridium difficile Toxin A and B Production, Immune Response, and Morphological Changes. Antimicrob Agents Chemother. 60 (6), 3519-3523 (2016).
- Alam, M. J., Anu, A., Walk, S. T., Garey, K. W. Investigation of potentially pathogenic Clostridium difficile contamination in household environs. Anaerobe. 27, 31-33 (2014).
- Aitken, S. L., et al. In the Endemic Setting, Clostridium difficile Ribotype 027 Is Virulent But Not Hypervirulent. Infect Control Hosp Epidemiol. , 1-6 (2015).
- Basseres, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
- Walters, B. A., Roberts, R., Stafford, R., Seneviratne, E. Relapse of antibiotic associated colitis: endogenous persistence of Clostridium difficile during vancomycin therapy. Gut. 24 (3), 206-212 (1983).
- Chilton, C. H., et al. Evaluation of the effect of oritavancin on Clostridium difficile spore germination, outgrowth and recovery. J Antimicrob Chemother. 68 (9), 2078-2082 (2013).
- Ofosu, A. Clostridium difficile infection: a review of current and emerging therapies. Ann Gastroenterol. 29 (2), 147-154 (2016).
- McDonald, L. C., et al. An epidemic, toxin gene-variant strain of Clostridium difficile. New Eng J Med. 353 (23), 2433-2441 (2005).
