Summary
Hälsotillståndet hos lungan reflekteras av typen och antalet immunceller som finns i bronkioler i lungan. Vi beskriver en bronkoalveolär skölj teknik som tillåter isoleringen och studie av icke-adherenta celler och lösliga faktorer från de nedre luftvägarna hos möss.
Abstract
Bronkoalveolär sköljning (BAL) är en experimentell procedur som används för att undersöka den cellulära och acellulära innehållet i lunglumen ex vivo för att få insikt i en pågående sjukdomstillstånd.
Här är en enkel och effektiv metod som beskrivs för att utföra BAL på murina lungor utan behov av speciella verktyg eller utrustning. BAL-vätskan isoleras genom införande av en kateter i luftstrupen av terminalt sövda möss, genom vilka en saltlösning instilleras in i bronkiolerna. Den instillerade fluiden försiktigt tillbaka för att maximera BAL-vätskan hämtning och för att minimera skjuvkrafter. Denna teknik tillåter viabiliteten, funktion och struktur av celler i luftvägarna och BAL-vätskan som skall konserveras.
Många tekniker kan tillämpas för att få ytterligare förståelse för sjukdomstillståndet hos lungan. Här, är en ofta använd teknik för identifiering och räkning av olika typer av immuncellerBeskrivet, där flödescytometri kombineras med en selektionspanel av fluorescensmärkta cellytspecifika markörer. BAL-proceduren som presenteras här kan också användas för att analysera smittämnen, vätskekomponenter eller inandade partiklar i murina lungor.
Introduction
Luftvägarna möter många förolämpningar, vilket kan leda till inflammation, patogen invasion eller malign transformation. Epitelceller som kantar lung lumen bildar ett av de största hindren i däggdjurskroppen. Tillsammans med alveolära makrofager, de förhindrar miljöhot från att få tillträde till den systemiska systemet via luftvägarna. Exempel på sådana hot innefattar organiska och oorganiska kemikalier, bakterier och virus. På samma sätt kan specifika vaccinationer eller terapeutiska ingrepp utformas för att rikta lungorna. I alla dessa fall är en utarbetad analys av den framkallade svaret viktigt att förstå, ingripa eller förebygga biologiska processer som sker inom andningsorganen.
Bronkoalveolär lavage (BAL) är ett ovärderligt metod för att analysera sådana svar, som de resulterande proverna innehåller viktig information om de inflammatoriska svar, immunmekanismer, och infektiös sjukdomsprogressionSom kan uppstå i lungluftvägarna 1 , 2 . Genom att använda BAL är det möjligt att studera de infiltrerande cellerna. Detta kontrasterar med uppmätta lungor, som ger en "smutsigare" cellpopulation, med många döda och klibbiga celler. BAL utförs genom att införa en saltlösning i terminalbronkolerna och därefter återvinna denna lösning. Den upptagna lösningen kan sedan användas för att kvantifiera och fenotypiskt analysera invändig lung och infiltrera inflammatoriska celler. Denna metod används ofta för att studera celltillströmning i sjukdomsmodeller av luftvägarna, såsom astma, kronisk obstruktiv lungsjukdom (COPD) och infektionssjukdomsmodeller. Bortsett från den cellulära kompositionen, reflekteras även den pulmonella luftvägarnas molekylära sammansättning i BAL-vätskan. För att analysera detta kan enzym-länkad immunosorbentanalys (ELISA), immunoblot och samtidig analys av multipla cytokiner av en cytokinpärla-grupp varaUtförs för att bedöma närvaron av cytokiner och kemokiner.
BAL är en väletablerad metod för att studera inflödet av inflammatoriska celler i inflammatoriska respiratoriska sjukdomsmodeller. Observationen av en förändrad cellulär tillströmning ( t.ex. ökade nivåer av lymfocyter, eosinofiler eller neutrofiler) kan leda till bättre insikt i sjukdomen och kan vara en objektiv parameter för att bedöma prestationen av en terapeutisk ingrepp.
Den exakta och reproducerbara tolkningen av BAL-cellanalys kräver att BAL utförs korrekt och att den uppsamlade vätskan hanteras och behandlas ordentligt. Begreppet "bronkialsköljning" introducerades för mer än 80 år sedan av Stitt 3 . År 1961 erhöll Myrvik alveolära makrofager från sköljvätskan av kaninlungor 3 . BAL är nu en vanlig metod för att analysera och övervaka lungorna i musmodellen, men ändåre är fortfarande ingen rapport om ett standardiserat BAL förfarande i den vetenskapliga litteraturen 4, 5. Dessutom finns det förmodligen lika många sätt att utföra BAL som det finns forskningslaboratorier som använder den teknik 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11. Det är viktigt att de uppgifter som erhålls från BAL representerar hela mus lunga och inte bara en del av lungan. Denna typ av variation försvårar tolkning och jämförelse av resultaten mellan olika studier.
Här, är en grundläggande, billig och reproducerbar BAL förfarandet beskrivet som tillåter insamling av den cellulära och lösliga fraktionen närvarande i luftvägslumen hos musen. Kort sagt, är en kateter placerad i den exponerade luftstrupen ofa terminalt sövd mus. En spruta är ansluten till katetern, och en buffrad saltlösning, som innehöll etylendiamintetraättiksyra (EDTA) införs i lungorna. De lunglumen samplas genom försiktig upprepad spolning av saltlösningen med användning av kolven. Det negativa trycket appliceras under detta steg är minimal för att förhindra luftvägskollaps. Efter insamling, bör den erhållna BAL behandlas ytterligare för att räkna upp och identifiera cellerna genom flödescytometri.
Protocol
Alla djurförsök som beskrivs i denna studie utfördes enligt nationell (belgisk lag 14/08/1986 och 22/12/2003, belgiska kungliga dekretet 06/04/2010) och europeisk lagstiftning (EU-direktiv 2010/63 / EU och 86 / 609 / EEC). Alla experiment på möss och alla djurprotokoll godkändes av etiska kommittén för Ghent University (tillståndsnummer LA1400091 och EC2016-027).
1. Framställning
- Lavage vätska
- Förbered en balanserad saltlösning med 100 μM etylendiamintetraättiksyra (EDTA).
OBS! För att mäta proteinhalter i BAL-vätskan rekommenderas att man tillsätter proteashämmare för att förhindra proteasaktivitet i BAL-vätskan.
- Förbered en balanserad saltlösning med 100 μM etylendiamintetraättiksyra (EDTA).
- Kateter
- Gör en kateter genom att sätta in en 23 G nål i transparent plastpolyeten 21 G slang (innerdiameter: 0,58 mm, ytterdiameter: 0,965 mm och längd: 0,5 cm). Premade katetrar kan också användas.
- AnesthETICS
- Förbereda en terminal anestetikum, företrädesvis en som orsakar andningsstillestånd (t.ex. en barbiturat som natriumpentobarbital (> 100 mg / kg) lösning i fosfatbuffrad saltlösning (PBS)).
OBS: Det rekommenderas att använda injiceras anestesi istället för inhalerad narkos, som inandas anestesi kan ha en inverkan på BAL vätska innehåll. CO 2, till exempel har en inverkan på pH-värdet i blodet och följaktligen på omfördelning av olika föreningar 12.
- Förbereda en terminal anestetikum, företrädesvis en som orsakar andningsstillestånd (t.ex. en barbiturat som natriumpentobarbital (> 100 mg / kg) lösning i fosfatbuffrad saltlösning (PBS)).
- Ammonium-klorid-kalium (ACK) för röda blodkroppar lyseringsbuffert
- Förbereda en ACK-lysbuffert genom upplösning 8,29 g NH4CI och 1 g KHCO3 i en L av H 2 O med 100 | iM EDTA; röda blodkroppar lyseringsbuffert kan också köpas från en extern källa.
2. Utföra Bronkoalveolär Lavage (BAL)
- Införande av katetern i luftstrupen
- Euthanera musen genom intraperitoneal injektion av en dödlig dos av en kortverkande barbituratbedövning med en 26 G nål. För att bekräfta korrekt dödlig bedövning, klämma den bakre potten med musen för att kontrollera fotreflexen.
- Placera djuret på ryggen på en kirurgisk tallrik och fixa musen genom att klämma ned benen.
- Spruta 70% etanol på nacken för att desinficera. Gör ett snitt i nackskinnet nära luftröret med en skalpell.
- Öppna huden för att exponera spyttkörtlarna. Separera spytkörtlarna genom att använda pincers för att exponera sternohyoidmuskel. Inse muskeln runt luftstrupen med pincers för att exponera luftröret.
- Placera en bomullstråd under luftröret med hjälp av pincers.
- Peka försiktigt mitt i det exponerade luftröret mellan två broskringar med en 26 G nål. Var försiktig så att du inte skadar luftröret längre.
- Sätt in katetern ca 0,5 cm i luftröret. Se till att kattenTer är inte införd för långt ner i luftröret, eftersom detta kan leda till skador på lungstrukturen.
- Stabilisera katetern genom att binda luftröret runt katetern med hjälp av bomullstråden placerad i steg 2.1.5. Om katetern inte är bundet tillräckligt kan den injicerade balanserade saltlösningen strömma mot övre delen av luftvägarna i stället för ner i lungorna.
- Samla spolvätskan
- Ladda en 1 ml spruta med 1 ml sterilbalanserad saltlösning med 100 μM EDTA.
- Anslut 1 ml sprutan till katetern och försiktigt injicera salt / EDTA-lösningen i lungan.
- Aspirera lösningen försiktigt under massering av muskeln. Om aspiratvätskan inte syns i sprutan, sätt försiktigt katetern lite längre ner eller uppåt i luftröret.
- Ta bort sprutan från nålen och överför den återvunna spolvätskan till ett 15 ml rör placerat på is. Normalt är 700 - 900 &# 181; L av BAL utvinns från 1 ml injicerad lösning.
- Upprepa steg 2.2.1 - 2.2.4 två gånger mer.
OBS! Om syftet är att analysera det icke-cellulära innehållet, rekommenderas att koncentrera de sammanslagna proverna när det finns problem med känslighet.
3. Samla de cellulära och icke-cellulära komponenterna i BAL-vätskan
- Centrifugera spolvätskan i 7 minuter vid 400 xg och 4 ° C.
- Samla supernatanten och använd den omedelbart för vidare analys ( t.ex. ELISA) eller frys vid -80 ° C. Förvara cellpelleten för att analysera den cellulära tillströmningen i lungorna.
- Resuspendera cellpelleten i 200 pl ACK-lyseringsbuffert.
OBS: Detta steg säkerställer lysytan av erytrocyterna samtidigt som de vita blodkropparna hålls intakta. - Inkubera i 2 minuter vid RT.
ANMÄRKNING: För att minska variationen som orsakas av lysröd från röda celler, bör detta steg inte utföras längre än 2 minuter. Tillsätt 1 ml kall PBS för att späda ACK-lyseringsbufferten. - Centrifugera i 7 minuter vid 400 xg och 4 ° C. Kassera supernatanten och suspendera cellerna i en tillräcklig mängd PBS för nedströmsanalys (se nedan).
OBS: Volymen av PBS beror på den nedströmsstudie som ska utföras.
4. Analys av de olika celltyperna i BAL-fluiden genom flödescytometri
OBS: En möjlighet är att analysera den absoluta och relativa cellulära kompositionen av BAL-vätskan genom att utföra flödescytometri. Målet med detta dokument är att utarbeta tekniken för BAL. Flödescytometri är en specialiserad teknik på egen hand. Det rekommenderas att läsa specialpapper på flödescytometritekniken 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Antikroppar kopplade till en fluorofor thatt känner igen ytantigener (se tabell 1) som är specifika för en speciell celltyp (er) används. Genom användning av en grindningsstrategi, är det möjligt att identifiera T-celler, makrofager, dendritiska celler, B-celler, eosinofiler och neutrofiler i cellfraktionen av BAL.
| Antigen | celltyp |
| Kluster av differentiering 3 (CD3) | Uttryckt på T-celler |
| Kluster av differentiering 11c (CD11c) | Hög uttryck på de flesta dendritiska celler, utan även på monocyter, makrofager, neutrofiler och vissa B-celler. |
| Kluster av differentiering 11b (CD11b) | Uttrycks på ytan av många leukocyter inklusive monocyter, neutrofiler, naturliga mördarceller, granulocyter och makrofager. |
| SiglecF | enlveolar makrofager och eosinofiler. |
| MHCII | hittas normalt endast på antigenpresenterande celler, såsom dendritiska celler, mononukleära fagocyter och B-celler. |
| CD19 | B-lymfocytantigen |
| Ly-6G | En markör för monocyter, granulocyter och neutrofiler |
Tabell 1: Val av Immun cellytantigener. Den här tabellen innehåller en lista över ytepitoperna som används för att karakterisera olika celltyper. Kombinationer av flera markörer kommer att krävas för att på ett tillförlitligt sätt definiera en specifik celltyp.
| prover | ||||
| Rör | Antigen-fluoroforen som skall tillsättas till celler Antikroppar lager koncentration (mg / ml) | Antikroppspädning | Total volym (μL) | |
| Fixbar bärbarhet | 0,2 | 1/1000 | 50 | |
| CD11c | 0,2 | 1/800 | 50 | |
| SiglecF | 0,2 | 1/100 | 50 | |
| Prov X | MHCII | 0,2 | 1/200 | 50 |
| CD3 | 0,2 | 1/200 | 50 | |
| CD19 | 0,2 | 1/200 | 50 | |
| CD11b | 0,2 | 1/200 | 50 | |
| Ly6G | 0,2 | 1/200 | 50 | |
| Spänningsreglering | ||||
| Rör | Antigen-fluoroforen som skall tillsättas till celler | Antikroppförrådskoncentration (mg / ml) | antikroppsutspädning | Total volym (| al) |
| ofärgade celler | / | / | / | 50 |
| Enkel färgade celler | Fixerbar viabilitetsfärgämnet | 0,2 | 1/1000 | 50 |
| Enkel färgade celler | CD11c | 0,2 | 1/800 | 50 |
| Enkel färgade celler | SiglecF | 0,2 | 1/100 | 50 |
| Enkel färgade celler | MHCII | 0,2 | 1/200 | 50 |
| Enkel färgade celler | CD3 | 00,2 | 1/200 | 50 |
| Enkel färgade celler | CD19 | 0,2 | 1/200 | 50 |
| Enkel färgade celler | CD11b | 0,2 | 1/200 | 50 |
| Enkel färgade celler | Ly6G | 0,2 | 1/200 | 50 |
| kompensations kontroller | ||||
| Rör | Antigen-fluoroforen som skall tillsättas till pärlor | Antikroppförrådskoncentration (mg / ml) | antikroppsutspädning | Total volym (| al) |
| ofärgade pärlor | / | / | / | 200 |
| Enkel färgade pärlor | CD11c | 0,2 | 1/2000 | 200 |
| Singelfärgade pärlor | SiglecF | 0,2 | 1/2000 | 200 |
| Singelfärgade pärlor | MHCII | 0,2 | 1/200 | 200 |
| Singelfärgade pärlor | CD3 | 0,2 | 1/2000 | 200 |
| Singelfärgade pärlor | CD19 | 0,2 | 1/2000 | 200 |
| Singelfärgade pärlor | CD11b | 0,2 | 1/400 | 200 |
| Singelfärgade pärlor | Ly6G | 0,2 | 1/200 | 200 |
Tabell 2. Förteckning över kontroller som ska ingå. Tabellen visar alla nödvändiga kontroller för korrekt tolkning av de erhållna resultaten.
- Cellfärgning
OBS: Det är impoRtant att inkludera alla kritiska kontroller för flödescytometri analysen. Tre uppsättningar rör behövs (se tabell 2 ): (1) rör som innehåller proven; (2) rör med BAL-celler för varje antikropp-fluorofor för att göra enkla fläckar; Detta möjliggör bestämning av spänningarna för varje kanal på flödescytometern; Och (3) rör med pärlor för varje antikropp-fluorofor för att göra enkla fläckar; Det här är att bestämma kompensationsmatrisen.- Gör en blandning av antikropparna och Fc-blocket (anti-CD16 / CD32) i PBS vid lämpliga utspädningar (se tabell 2 ). Det är nödvändigt att bestämma den optimala arbetsutspädningen för varje antikropp före experimentet.
- Resuspendera cellerna i 50 | il av antikroppsmixen för provet och tillsätt 50 | il av den lämpligt utspädda antikroppen mot de kritiska kontrollerna.
OBS! Färgningen kan utföras i en 96-brunn u-formad platta. Detta gör det möjligt att enkelt minska fläckvolymen and köra stora mängder prover. - Inkubera under 30 min i mörker vid 4 ° C.
- Centrifugera i 7 min vid 400 xg och 4 ° C. Kassera supernatanten.
- Återsuspendera cellerna i PBS till en slutlig volym av 200 | il.
OBS: Denna slutliga volymen beror på den minimala volymen flödescytometern kan komma åt. Detta kan skilja sig något mellan maskiner. Dessutom avläsningsvolym beror på antalet celler och / eller tid provet kommer att ta för att köra i flödescytometern. - Använd prover och kontroller för flödescytometrisk analys.
OBS: För att bestämma det absoluta cellantalet av de olika cellpopulationerna, bör räkna pärlor tillsättas. Lägga till samma antal pärlor (± 25.000 pärlor) till varje prov strax före mätning. Genom användning av framåt- och sidospridning, räknar pärlor kan identifieras genom flödescytometri (se Figur 1). Därefter kan det absoluta antalet celler i provet beräknas genom att jämföra the-tal av pärla händelser till cellhändelser. Följande formel kan användas:
- Flödescytometrisk analys
OBS: flödescytometrisk analys ska göras omedelbart efter slutförandet av färgningsprotokollet. En flödescytometer med lämpliga lasrar och filter för signaldetektering måste användas. Tabell 3 ger en översikt av de lasrar och filter som behövs för studien beskriven i detta manuskript. För mer information om flödescytometrisk analys, se Adan et al. 18.- Inrätta de primära portarna baserade på framåt och sidospridning, exklusive skräp och dubletter (se figur 1).
- Justera spänningen och kompensation för spektral överlappning med hjälp av de enkelsträn färgade celler och pärlor.
OBS: Dessa inställningar är olika för varje flödescytometer och behöver kontrolleras före varje experiment. FEller korrekt flödesanalys är spolningen framåt och sidospridning kritisk. En korrekt fram- och sidospridning kan hjälpa till vid identifiering och bekräftelse av identiteten hos de analyserade cellerna. För att bestämma dessa spänningar bör ett ostämpat prov köras först. - Ställ in fluorescensportar för ytantigenet (se Figur 1 ) och analysera proven.
| Lasertyp | Filtreringsinställningar | |
| 505 LP | 525/50 | |
| Blå (488 nm) | 550 LP | 575/26 |
| 100 mW | 670 LP | 685/35 |
| 750 LP | 780/60 | |
| Violett 405 nm | 450/50 | |
| 100 mW | ||
| röd 633 nm | 660/20 | |
| 70 mW | 750 LP | 780/60 |
Tabell 3: Översikt över lasrar och filter i flödescytometern användes i denna studie.
Representative Results
Efter att ha utfört BAL med 3x 1 ml buffrad saltlösning, bör en volym mellan 2 och 3 ml utvinnas. Denna BAL vätska kan analyseras ytterligare för att karakterisera cellulära och ickecellulära innehåll. För att undersöka närvaron av cytokiner och kemokiner, ELISA 19, immunoblot 20, och den samtidiga analysen av multipla cytokiner genom en cytokin vulst array 21 kan utföras. Dessutom kan albuminet och totalt proteininnehåll av denna vätska bestämmas 22.
Som ett exempel, beskriver detta manuskript hur man analyserar den cellulära halten av BAL-vätskan genom flödescytometri. Den analyserade BAL-vätskan uppsamlades från Balb / cAnNCrl möss (ålder: 7 veckor) 24 h efter att de intratrakealt ingjutit med lipopolysackarid. Följande antikroppar, som är kopplad till en fluorofor, wAnvändes för att identifiera de olika celltyperna: CD11c, SiglecF, MHCII, CD3ε, CD19, Ly6g och CD11b (se tabell 1 och tabell över material ). Den fixerbara bärbarhetsfärgen användes också. Genom att använda en gatingstrategi baserad på differentialuttrycket av antigener på de olika cellpopulationernas ytor ( Figur 1 ) var det möjligt att identifiera makrofager, dendritiska celler, B-celler, T-celler, neutrofiler och eosinofiler.
Först släpptes skräp och dubbletter ut baserat på fram- och sidospridningsparametrar. Ett livskraftigt färgämne underlättade gating på levande celler. Därefter identifierades CD11c-högceller och CD11c-lågceller. I den CD11c-höga populationen identifierades makrofager och dendritiska celler baserade på MHCII respektive SiglecF-uttryck. I CD11c-låg populationen identifierades T-celler och B-celler baserade på CD3e respektive CD19-uttryck. I the återstående cellpopulations, neutrofiler och eosinofiler identifierades baserat på CD11b och Ly-6G markör uttryck, respektive.
Räkna pärlor tillsattes för att bestämma de absoluta cellantalen av de olika cellpopulationerna genom att jämföra förhållandet av pärla till händelser i cellhändelser 23. Dessa räknings pärlor identifierades baserat på deras framåt och sidospridningsegenskaper (Figur 1). Tabell 4 ger en översikt av de absoluta cellantalen av de olika cellpopulationer i BAL-vätskan av en naiv mus och en mus som var stimulerade under 24 h med 5 ^ g av lipopolysackarid.
Figur 1: Gating Strategi för flödescytometrisk detektion av makrofager, dendritiska celler, T-celler, B-celler, neutrofiler och eosinofiler iN BAL-vätska. BAL-celler isolerades med användning av det beskrivna BAL-protokollet. Celler isolerades från möss 24 h efter intratracheal instillation av lipopolysackarid. Räkna pärlor och celler identifierades baserat på fram- och sidospridningsegenskaper. I cellgrinden identifierades enkla celler med användning av framåt och sidospridning. I denna sista population identifierades celler som levde. CD11c-högceller och CD11c-lågceller identifierades sedan. I den CD11c- höga populationen identifierades makrofager och dendritiska celler baserade på MHCII respektive SiglecF-uttryck. I CD11c- låg populationen identifierades T-celler och B-celler baserade på CD3e respektive CD19-uttryck. I återstående cellpopulation identifierades neutrofiler och eosinofiler baserat på CD11b respektive Ly-6G-uttryck. Vänligen klicka här för att se enStörre version av denna figur.
| Cellpopulationen | Absolut antal celler i naiva möss | Absolut antal celler i LPS-stimulerade möss |
| makrofager | 79.612 | 25.439 |
| Dendritiska celler | 495 | 671 |
| T-celler | 45.271 | 28.089 |
| B-celler | 4164 | 2926 |
| neutrofiler | 632 | 566.716 |
| eosinofiler | 3483 | 4332 |
Tabell 4: RepresenteraTativa resultat av flödescytometrianalysen på BAL-vätskan av naiva och LPS-stimulerade möss.
Discussion
BAL är en användbar teknik för att få cytologisk och biokemisk information som svar på infektioner eller droger. Inledningsvis var BAL används för att hantera den överdrivna slem produktion i humana patienter som lider av fosgen toxicitet 3. Numera är den teknik som används på människor för att undersöka lung patogenes, diagnos och terapeutisk behandling av sjukdomar 3, 24. I laboratoriedjur, är BAL vanligen används för att övervaka inflammatoriska svar, immunmekanismer, och infektiösa sjukdomsprocesser som sker i de pulmonella luftvägarna 1, 2.
För att studera den inflammatoriska cellulärt mönster i respiratoriska sjukdomsmodeller, bör BAL följas av absolut och differentiell cellräkning. I tillägg till det absoluta cellantalet, de relativa cellantalet är också av intresse. Till exempel, reparation och cancermodeller visar vEry liten eller inget BAL cellantal ökar. I denna modell är bedömningen av cellkompositionen användbar. Genom att använda cellfärgning i kombination med ljusmikroskopi kan olika celltyper, såsom eosinofiler, neutrofiler, makrofager och lymfocyter identifieras baserat på morfologi 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 . Flödescytometri kan användas för specifika bedömningar, såsom att identifiera olika T-cellfenotyper 7 , 31 . Förutom identifieringen av de olika infiltrerande cellpopulationerna kan lungens icke-cellulära komposition undersökas med användning av BAL. Metoder såsom ELISA, immunoblott, cytokinpärramatris, immunohistokemi och kvantitativ polymeraskedjereaktion utförs på BAL-fluid för bestämning av cytokiner, tillväxtfaktorer och andra inflammatoriska komponenter. För att bestämma lungskador, kan totala protein- och laktatdehydrogenas nivåer i BAL-vätskan också mätas 32, 33.
Med utvecklingen av nya diagnostiska verktyg, kommer iska och proteomik karakterisering av BAL komponenter vara möjligt inom en snar framtid. Kombinationen av expanderande beräkningskapacitet och hög genomströmning genuttryck teknik kommer att göra det möjligt att definiera specifika gen-expressionsprofiler för olika sjukdomstillstånd. Utföra dessa tekniker på BAL-vätskan kan ge gen- och proteinuttrycksmönster för att identifiera de viktiga molekyler som är involverade i de olika faserna av lungsjukdomar.
Den största begränsningen av data erhållna från BAL-vätskan är bristen på jämförbarhet mellan olika forskningsförsök 3, 9. Det finns en hög grad avVariabilitet i spolteknik och efterföljande bearbetning av BAL-fluid. För att kunna jämföra varje BAL-försök är det nödvändigt att standardisera typen av avloppsvätska som instilleras, instillationsstället och den fraktion som ska analyseras för cellulär och icke-cellulär komposition. Det finns signifikanta skillnader i antalet bränslefraktioner mellan olika försök, varierande från en till 14 gånger 34 , 35 , 36 . Denna skillnad kan påverka det uppskattade totala antalet cellnummer i lungorna. Det är viktigt att veta vilken BAL-fluidfraktion som innehåller de flesta cellerna. Song et al. Visade att cirka 70% av det totala antalet celler hämtades i fraktion ett till tre 22 . Andra rapporter föreslog dock att den andra spolen innehöll fler celler än den första 37 , 38
Den ickecellulära sammansättning BAL vätskan innehåller värdefull information om hälsotillståndet hos lungan 33, 39, 40. Variationer i utspädningen av BAL-vätskan bidrar till skillnaden i kvantifieringen av den lösliga fraktionen och, följaktligen, till skillnader i resultat mellan studierna. Låten et al. jämfört proteinet och laktatdehydrogenas nivåer av varje sköljfraktionen och drog slutsatsen att den första sköljnings fraktionen innehöll två till tre gånger mer än den andra fraktionen.
För att hämta ett representativt BAL prov för analys, några tekniska överväganden är avgörande. En av dem är att utföra rätt bedövning. Det är mycket viktigt att kontrollera foten refLex av musen för att säkerställa terminal sedering. Detta är inte bara viktigt av etiska skäl, men också för att det är svårt att placera och behålla katetern i rätt läge om musen inte är ordentligt bedövad.
En andra viktig teknisk överväganden är kateterets position i luftröret. När kateteret sätts in för djupt kan det skada lungstrukturen. Kateterets distala ände bör inte nå lungorna under BAL-proceduren. Katetern bör också stabiliseras och binds med en bomullstråd. Om kateteret inte stabiliseras kan den injicerade saltlösningen strömma uppåt i näshålan istället för ner i lungorna. Under injektion och aspiration av saltlösningen är det viktigt att hålla katetern stadigt.
De data som erhållits från BAL-vätskan måste representera hela den murina lungen. Därför är det viktigt att införa en tillräcklig mängd saltlösningbuffert ( dvs.3 ml, uppdelade i 3 alikvoter av 1 ml vardera). Det finns inget linjärt samband mellan cellutbytet och BAL-vätskan utbyte. Det är viktigt att samla lösningen försiktigt medan massera bröstkorgen på musen. Om skjuvkrafter är för starka, kan viabiliteten, funktion och struktur av celler i luftvägarna och BAL-vätskan äventyras. Om aspire vätskan inte syns i sprutan, försiktigt flytta katetern djupare eller högre i luftstrupen.
Särskild anmälan bör ges till specifika aspekter av BAL bearbetning och analys. Detta kommer att maximera informationen behålls från BAL-prover. Efter BAL är cellerna i ett näringsfattigt koksaltmedium. Det är därför mycket viktigt att behandla proverna inom en timme efter BAL provtagning. Om långvarig lagring är nödvändig, krävs användningen av ett näringsämne-kompletterat medium.
Att bevara cellviabilitet, undvika rör som främjar cellvidhäftning till ytan. Undvik centrifugation av cellsuspensioner vid hastigheter som sannolikt kommer att äventyra cellulär integritet eller för att förhindra jämn resuspension av de hämtade BAL-celler. BAL-vätskan innehållande celler bör centrifugeras vid 400 xg och 4 ° C under 7 min. Det är viktigt att hålla i minnet att cellsuspensioner bör hållas vid 4 ° C under bearbetningen.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
LVH är forskningsassistent vid Institutionen för biomedicinsk molekylärbiologi vid Ghent University. ERJ stöds av UniVacFlu, bevilja nummer 607690. KR stöds av EC-FP7-projektet FLUNIVAC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14175-129 | |
| ethyleendiaminetetra acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6511 | irritating |
| 23 G x 1 1/4 needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | size: 0.60 x 30 mm |
| 26 G x 1/2 needle | Henke Sass Wolf | 4710004512 | size: 0.45 x 12 mm |
| plastic tubing | BD medical technology | 427411 | Polyethylene Tubing, I.D. 0.58 mm (0.023") O.D. 0.965 mm (0.38") 30.5 m (100') |
| sodium pentobarbital | Kela NV | 514 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | PBS without Ca2+ Mg2+ or phenol red; sterile filtered |
| 1 mL syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | nonpyrogenic and nontoxic |
| Forceps | Fine Science Tools GmbH | 91197-00 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH | 91460-11 | |
| centrifuge tube 50 mL | TH.Geyer | 7696705 | Free from Rnase/Dnase/endotoxin |
| centrifuge tube 15 mL | TH.Geyer | 7696702 | Free from Rnase/Dnase/endotoxin |
| microcentrifuge tube 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 0030 120.094 | polypropylene |
| Microcentrifuge | Sigma-Aldrich | 5415R | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer | Lonza | 10-548E | sterile-filtered |
| live/dead - efluor 506 | ebioscience | 65-0866-18 | fixable viability dye |
| CD11c-PE-cy7 | eBiosciences | 25-0114-81 | |
| SiglecF-PE | BD Pharmingen | 552126 | |
| MHCII-APCefluor780 | Biolegend | 107628 | |
| CD3-PE-cy5 | VWR | 55-0031-U100 | |
| CD19-PE-cy5 | eBiosciences | 15-0193-83 | |
| CD11b-V450 | BD Pharmingen | 560455 | |
| Ly6G-AF700 | Biolegend | 127621 | |
| Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
| anti-CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| 96-well 340 µl storage plate plate | Falcon | 353263 | V-bottom, natural polypropylene |
| flow cytometer | BD Biosciences | ||
| catheter | BD Biosciences | 393202 |
References
- Stankunas, K., et al. Conditional protein alleles using knockin mice and a chemical inducer of dimerization. Mol Cell. 12 (6), 1615-1624 (2003).
- Hunninghake, G. W., Gadek, J. E., Kawanami, O., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. Inflammatory and immune processes in the human lung in health and disease: evaluation by bronchoalveolar lavage. Am J Pathol. 97 (1), 149-206 (1979).
- Gee, J. B., Fick, R. B.
- Tornling, G., et al. Hyaluronic acid in bronchoalveolar lavage in rats exposed to quartz. Br J Ind Med. 44 (7), 443-445 (1987).
- Henderson, R. F. Use of bronchoalveolar lavage to detect respiratory tract toxicity of inhaled material. Exp Toxicol Pathol. 57, Suppl 1. 155-159 (2005).
- Morris, A., et al. Longitudinal analysis of the lung microbiota of cynomolgous macaques during long-term SHIV infection. Microbiome. 4 (1), 38 (2016).
- Naessens, T., et al. GM-CSF treatment prevents respiratory syncytial virus-induced pulmonary exacerbation responses in postallergic mice by stimulating alveolar macrophage maturation. J Allergy Clin Immunol. 137 (3), 700-709 (2016).
- Chockalingam, A., Duraiswamy, R., Jagadeesan, M. Bronchoalveolar lavage cellular analyses in conjunction with high-resolution computed tomography imaging as a diagnostic intervention for patients with suspected interstitial lung disease. Lung India. 33 (3), 287-291 (2016).
- Crystal, R. G., Reynolds, H. Y., Kalica, A. R. Bronchoalveolar lavage. The report of an international conference. Chest. 90 (1), 122-131 (1986).
- Baughman, R. P.
- Singletary, M. L., et al. Modification of a common BAL technique to enhance sample diagnostic value. J Am Assoc Lab Anim Sci. 47 (5), 47-51 (2008).
- Angus, D. W., Baker, J. A., Mason, R., Martin, I. J. The potential influence of CO2, as an agent for euthanasia, on the pharmacokinetics of basic compounds in rodents. Drug Metab Dispos. 36 (2), 375-379 (2008).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. J Vis Exp. (97), (2015).
- Rubio-Navarro, A., et al. Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry. J Vis Exp. (116), (2016).
- Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J Vis Exp. (53), (2011).
- Noto, A., Ngauv, P., Trautmann, L. Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity. J Vis Exp. (82), e51105 (2013).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol. , 1-14 (2016).
- Database, J. S. E. The ELISA method. J Vis Exp. , (2016).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. J Vis Exp. (16), (2008).
- Wunderlich, M. L., Dodge, M. E., Dhawan, R. K., Shek, W. R. Multiplexed fluorometric immunoassay testing methodology and troubleshooting. J Vis Exp. (58), (2011).
- Song, J. A., et al. Standardization of bronchoalveolar lavage method based on suction frequency number and lavage fraction number using rats. Toxicol Res. 26 (3), 203-208 (2010).
- Seliger, C., et al. A rapid high-precision flow cytometry based technique for total white blood cell counting in chickens. Vet Immunol Immunopathol. 145 (1-2), 86-99 (2012).
- Daniele, R. P., Elias, J. A., Epstein, P. E., Rossman, M. D. Bronchoalveolar lavage: role in the pathogenesis, diagnosis, and management of interstitial lung disease. Ann Intern Med. 102 (1), 93-108 (1985).
- Delayre-Orthez, C., Becker, J., de Blay, F., Frossard, N., Pons, F. Exposure to endotoxins during sensitization prevents further endotoxin-induced exacerbation of airway inflammation in a mouse model of allergic asthma. Int Arch Allergy Immunol. 138 (4), 298-304 (2005).
- Delayre-Orthez, C., et al. PPARalpha downregulates airway inflammation induced by lipopolysaccharide in the mouse. Respir Res. 6, 91 (2005).
- Delayre-Orthez, C., de Blay, F., Frossard, N., Pons, F. Dose-dependent effects of endotoxins on allergen sensitization and challenge in the mouse. Clin Exp Allergy. 34 (11), 1789-1795 (2004).
- Hachet-Haas, M., et al. Small neutralizing molecules to inhibit actions of the chemokine CXCL12. J Biol Chem. 283 (34), 23189-23199 (2008).
- Ble, F. X., et al. Activation of the lung S1P(1) receptor reduces allergen-induced plasma leakage in mice. Br J Pharmacol. 158 (5), 1295-1301 (2009).
- Ble, F. X., et al. Allergen-induced lung inflammation in actively sensitized mice assessed with MR imaging. Radiology. 248 (3), 834-843 (2008).
- Reber, L. L., et al. A dissociated glucocorticoid receptor modulator reduces airway hyperresponsiveness and inflammation in a mouse model of asthma. J Immunol. 188 (7), 3478-3487 (2012).
- Drent, M., Cobben, N. A., Henderson, R. F., Wouters, E. F., van Dieijen-Visser, M. Usefulness of lactate dehydrogenase and its isoenzymes as indicators of lung damage or inflammation. Eur Respir J. 9 (8), 1736-1742 (1996).
- Henderson, R. F. Use of bronchoalveolar lavage to detect lung damage. Environ Health Perspect. 56, 115-129 (1984).
- Forget, G., et al. An adherent cell perifusion technique to study the overall and sequential response of rat alveolar macrophages to toxic substances. Environ Health Perspect. 51, 131-140 (1983).
- Sung, J. H., et al. Recovery from welding-fume-exposure-induced lung fibrosis and pulmonary function changes in sprague dawley rats. Toxicol Sci. 82 (2), 608-613 (2004).
- Majetschak, M., Sorell, L. T., Patricelli, T., Seitz, D. H., Knoferl, M. W. Detection and possible role of proteasomes in the bronchoalveolar space of the injured lung. Physiol Res. 58 (3), 363-372 (2009).
- Rehn, B., Bruch, J., Zou, T., Hobusch, G. Recovery of rat alveolar macrophages by bronchoalveolar lavage under normal and activated conditions. Environ Health Perspect. 97, 11-16 (1992).
- Kelly, C. A., Ward, C., Stenton, S. C., Hendrick, D. J., Walters, E. H. Assessment of pulmonary macrophage and neutrophil function in sequential bronchoalveolar lavage aspirates in sarcoidosis. Thorax. 43 (10), 787-791 (1988).
- Eklund, A., Tornling, G., Blaschke, E., Curstedt, T. Extracellular matrix components in bronchoalveolar lavage fluid in quartz exposed rats. Br J Ind Med. 48 (11), 776-782 (1991).
- Olsen, G. N., Harris, J. O., Castle, J. R., Waldman, R. H., Karmgard, H. J. Alpha-1-antitrypsin content in the serum, alveolar macrophages, and alveolar lavage fluid of smoking and nonsmoking normal subjects. J Clin Invest. 55 (2), 427-430 (1975).
