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Bioengineering

Évaluation initiale des anticorps-conjugués modifié avec Peptides viraux dérivés pour accroître l’Accumulation cellulaire et améliorer le ciblage tumoral

Published: March 8, 2018 doi: 10.3791/55440
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Nuclear Medicine and Radiobiology, Université de Sherbrooke, 2Sherbrooke Molecular Imaging Center (CIMS), Université de Sherbrooke, 3Sherbrooke Institute of Pharmacology

Summary

Peptides dérivés d’origine virale, couplées à l’anticorps-conjugués (ACs) est une approche gagne du terrain en raison du risque de fournir des charges moléculaires avec accumulation de cellules de tumeur accrue. Utilisant des méthodes communes pour évaluer la conjugaison de peptide, AC et accumulation intracellulaire de charge utile et le ciblage de la tumeur, ce protocole permet aux chercheurs pendant les phases clés du développement initial.

Abstract

Scientifiques (ACs) modifiées avec des peptides dérivés de virus sont une classe potentiellement puissante d’agents de prestation de cellule de tumeur pour charges moléculaires utilisés dans le traitement du cancer et d’imagerie en raison de l’accumulation cellulaire accrue au cours de l’actuelle ACs. Au cours du début AC in vitro développement, techniques de fluorescence et des dosages radioimmunologiques ne suffisent pas pour déterminer la localisation intracellulaire et l’efficacité de l’accumulation spécificité cellulaire cible. Actuellement, il n’y a pas de consensus sur les méthodes normalisées pour la préparation des cellules pour évaluer la localisation et l’accumulation intracellulaire de l’AC. L’essai initial des ACs modifiés avec des peptides dérivés de virus est critique, surtout si plusieurs candidats ont été construits. Déterminer l’accumulation intracellulaire de fluorescence peut être affectée par le signal de fond de l’ACs à la surface cellulaire et compliquer l’interprétation d’accumulation. Pour des dosages radioimmunologiques, cellules généralement traitées sont fractionnés et mesuré la radioactivité dans des compartiments cellulaires différentes. Cependant, lyse cellulaire varie de cellule en cellule et souvent nucléaires et cytoplasmiques des compartiments ne sont pas suffisamment isolées. Ceci peut produire des données trompeuses sur les propriétés de remise des charges utiles. L’injection intraveineuse de radiomarquées virus dérivés peptide modifié ACs en tumeur portant souris suivies par scintigraphie est une méthode puissante pour la détermination des propriétés de tumeur ciblage et charge utile de livraison lors de la phase in vivo des développement. Toutefois, il s’agit d’un avancement relativement récent et peu de groupes ont évalué virus dérivés des ACs peptide modifié de cette manière. Les auteurs décrivent le traitement des cellules traitées afin d’évaluer plus précisément virus dérivés l’accumulation AC peptide modifié lors de l’utilisation des dosages radioimmunologiques et microscopie confocale. Plus précisément, une méthode pour cellules trypsinisation d’enlever la surface de la cellule liée ACs. Nous fournissons également un procédé d’amélioration de fractionnement cellulaire. Enfin, ce protocole fournit une méthode in vivo à l’aide de la tomographie par émission de positrons (PET) pour l’évaluation de la tumeur primitive ciblant les propriétés chez des souris de tumeur-roulement. Nous utilisons le radio-isotope 64Cu (t1/2 = h 12,7) comme une charge d’exemple dans le présent protocole.

Introduction

Scientifiques (ACs) sont des produits biopharmaceutiques qui arrivent à échéance dans une classe transformatrice des médicaments efficaces pour l’amélioration des traitements contre le cancer et pour la détection des tumeurs. Composé d’un anticorps monoclonal (ACM), conjugué à des charges utiles moléculaires comme radio-isotopes, les petites molécules et toxines biologiques, ACs sont en mesure de livrer ces charges utiles aux cellules cancéreuses avec exquis cible l’antigène affinité et spécificité. Ainsi ACs peuvent considérablement réduire la toxicité non spécifique et augmenter l’activité de la charge utile sur le site de la tumeur. Thérapeutiquement, ACs transport cytotoxiques petites molécules (communément appelé conjugués anticorps-médicament) ont été approuvés pour le traitement des patients atteints de cancer du sein et le lymphome de Hodgkin qui n’ont pas les traitements conventionnels 1, 2. en outre, ACs transport radio-isotopes (communément appelé radioimmunoconjugates) sont également en développement. Une AC transportant un radio-isotope pour l’imagerie est approuvé pour l’identification des métastases de cancer de la prostate 3. Avec beaucoup plus thérapeutique ACs soumis pour approbation 4, optimisme est élevé pour l’avenir de l’ACs pour améliorer les soins de cancer 5.

Néanmoins, lors de la remise des agents chimiothérapeutiques ou radio-isotopes, ACs peinent à accumuler efficacement ces charges à l’intérieur des cellules cibles. Cet aspect contribue de manière significative dans de nombreux cas dans l’incapacité de l’ACs pour fournir la survie sans maladie de longue durée ou une tumeur de contraste élevé d’imagerie 6,7. En général, une fois que l’ACs lier leur antigène cible ils sont internalisées par un processus appelé endocytose. L’ACs sont ensuite pris au piège à l’intérieur des endosomes et victimes de la traite vers les lysosomes pour dégradation et charge utile de sortie 8. Le processus de trafic intracellulaire pose des défis pour les pays candidats d’atteindre une spécificité élevée de charge utile et l’efficacité contre cibler les cellules cancéreuses. Par exemple, de nombreux antigènes comme Her2 (cible pour l’AC thérapeutique Trastuzumab-emtasine) peut recycler jusqu'à 85 % des anticorps fixés dans le premier 30 min 9. En outre, une fois que la dégradation se produit, agents chimiothérapeutiques libéré et radio-isotopes activement exportables par augmentation de l’expression ou l’activité de transport de membrane associée protéines 10,11. Dégradation du lysosome empêche également la livraison de nouvelles charges biologiques tels que des enzymes thérapeutiques et oligonucléotides qui peuvent être désactivé 12,13. En substance, la cellule cancéreuse est très efficace pour abroger la nécessaire accumulation intracellulaire de charges utiles par ACs.

Ce protocole décrit comment implémenter le concept de ACs-couplée à des peptides dérivés de virus, spécifiquement pour échapper endosome provocation policière et localisation pour le noyau de la cellule. Avec une telle sophistication pour manipuler les systèmes de cellules hôtes, il n’est pas surprenant que le développement des virus dérivés de protéines et de peptides comme potentiel biopharmaceuticals a longtemps été enraciné dans la recherche thérapeutique 14. Des millions d’années, les virus ont évolué pour acquérir une collection exceptionnelle de protéines capables d’exploiter efficacement les systèmes cellulaires de mammifères physiologiques normales afin d’entrer dans les cellules de l’hôte. Pour les virus qui sont internalisés par endocytose, elles sont également contestées s’enfuient trafic vers les lysosomes où l’assaut d’une concentration localisée de protéases peut s’avérer problématique pour la survie. Un peptide viral dérivé bien caractérisé utilisé drug delivery pour échapper endosome provocation policière est le virus de l’immunodéficience humaine de transactivateur de transcription (Tat) protéine 15. Tat est en mesure d’échapper endosome provocation policière en détectant à quel point les changements de conformation de protéines produisent Tat propice pour s’en insérer et perturber le de membrane endosomale 16pH faible. Il en résulte des conjugués de Tat-charge utile peuvent accéder le cytoplasme. Le deuxième élément de manipulation virale lié au présent protocole est l’approche utilisée pour livrer des gènes thérapeutiques et médicaments au noyau 17. Les virus ont évolué pour manipuler avec succès des machines de cellule hôte pour progresser au-delà de la membrane nucléaire en passant par le complexe du pore nucléaire (NPC). Macromolécules cellulaires contiennent (ou se lier aux protéines qui contiennent) des signaux de localisation nucléaire (sln) nécessaires pour la liaison nucléaire à transportent protéines (p. ex. karyophérines α et β), qui fournissent les mouvements requis par le biais de la NPC. Les virus ont mis au point des protéines pour contenir des séquences NLS qui leur fournissent la possibilité d’utiliser des protéines de transport de cellules hôtes pour faire la navette dans le noyau de 18.

ACs nombreux ont précédemment été fonctionnalisés avec des peptides dérivés Tat - et NLS et testés pour leur capacité à s’accumuler à l’intérieur des cellules cancéreuses et pour cibler les tumeurs 19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30 (tableau 1). Études offrant des charges utiles cytotoxiques ont démontré que les ACs modifiés avec des peptides dérivés de virus sont capables d’augmenter considérablement l’accumulation cellulaire, la cytotoxicité et tumeur tuant plus non modifié ACs 22,26. Une caractéristique commune pour cette nouvelle classe d’AC est leur construction. En général, les peptides contiennent une cystéine terminale fournissant un groupe sulfhydryle libre. MAbs sont tout d’abord réagis avec un noncleavable de reticulation bifonctionnels contenant N- hydroxysuccinimide (NHS) et maléimide groupes aux extrémités opposées. Les esters de NHS réagissent avec des amines primaires sur le mAb forment des liaisons amide. Le CCG ont réagi avec groupes maléimide gratuit puis réagit avec les groupes sulfhydryles sur les peptides pour former une liaison thioester et reliant ainsi le peptide et mAb. Bien que les agents réticulants homobifunctional ont été utilisés 28, hétérobifonctionnel RETICULATION sont plus couramment utilisés dans la construction des virus dérivés peptide-ACs 22,23,26, 31,32. Ce protocole utilise spécifiquement la RETICULATION sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-CCAP) pour sa facilité d’utilisation et parce qu’il est utilisé dans le conjugués anticorps-médicament approuvé Trastuzumab-emtasine et dans de nombreux peptide-ACs virus dérivés 8,22,23,26,31,32. Sur gel de polyacrylamide de sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) est la principale méthode pour déterminer initialement efficacité de conjugaison et semi de quantifier le nombre de peptides par mAb. Microscopie confocale utilisant un anticorps secondaire marqué fluorescent spécifique à la mAb est généralement la méthode d’évaluation au départ des propriétés de distribution intracellulaire de virus dérivés peptide modifié ACs. Jusqu'à présent, les radioisotopes sont charges du primaires envoyées par virus dérivés peptide modifié ACs. Radioisotopes sont avantageux car la radioactivité dans les cellules est facilement quantifiée en comptant les gamma. En outre, ACs qui sont traduites dans des modèles murins de cancers humains fournir aux chercheurs la possibilité d’évaluer le ciblage tumoral en utilisant des modalités d’imagerie moléculaires telles que d’émission monophotonique calculé tomographie par émission de positrons (TEP) 23 , 32 , 33. en général, la construction et la validation méthodes principalement utilisé par les chercheurs offrent une très bonne évaluation des ACs modifiés avec des peptides dérivés de virus pendant la phase de développement initial d’entrer et de distribuer de manière efficace la charge utile à l’intérieur de cellules cibles et aux tumeurs de la cible.

Tat et NLS-modifié ACs ont illuminé les domaines clés pour améliorer encore la livraison de la charge utile à l’intérieur des cellules cancéreuses et tumeurs. En ce qui concerne la NLS-modifié ACs, l’efficacité dans l’accumulation intracellulaire peut être modeste 23,31,,34. Inefficace accumulation intracellulaire est causée par la provocation policière endosomale continue. In vivo ciblage tumoral peut également être diminué avec les deux Tat et NLS-modifié ACs. Les séquences actives de Tat et NLS contiennent plusieurs résidus chargés positives. Lorsqu’il est attaché à l’ACM, la charge globale cationique peut être significativement accru de 35. En conséquence, le Tat et NLS-modifiés ACs ont augmenté l’absorption dans les tissus sains et a augmenté la clairance sanguine rapide.

Notre groupe a développé un composé composite comprenant de l’acide cholique lié à NLS (ChAcNLS ; La figure 1). ACs ChAcNLS modifiés sont capables d’augmenter l’accumulation intracellulaire de radio-isotopes livrés et améliorer le ciblage tumoral par rapport aux traditionnels et NLS-modifié ACs 33,34. Le mécanisme derrière l’acide cholique est inspiré par la capacité de certains virus nus qui ne peut s’appuyer sur la fusion membranaire d’utiliser de l’acide cholique pour déclencher l’endosome évasion par le biais de la formation de céramide. Par exemple, virus entériques porcine recrute l’acide cholique qui active la sphingomyélinase, qui catalyse l’hydrolyse de la sphingomyéline en céramide 36,37,38. Cela déstabilise la membrane endosomale et permet pour l’évacuation de virus. Ainsi, l’acide cholique est un autre composant dérivé de virus qui complète NLS.

Comme ce champ se déplace vers l’avant et l’avenir avancements se produisent dans la livraison de la charge utile par ACs modifiés avec des peptides dérivés de virus, il est opportun de faire la démonstration visuelle de leurs caractéristiques biochimiques et fonctionnelles au cours du développement initial. Nous décrivons ici notre protocole pour l’évaluation initiale du virus dérivé ACs peptide modifié pour la détermination simple mais efficace d’accumulation intracellulaire et ciblage tumoral au cours du développement de la scène. Nous utilisons le mAbs commercialement disponible 7 3 et A14 comme systèmes modèles exemple. Procédure 1 décrit l’utilisation de SDS-PAGE, comme une méthode qui permet de « go/no go » des décisions pour ACs construite. Procédure 2 décrit une méthode utilisant la trypsinisation permettant une meilleure visualisation de la distribution intracellulaire de AC et accumulation. Procédure 3 décrit une méthode pour améliorer fractionnement intracellulaire à déterminer avec précision la localisation nucléaire. Dans cette procédure, nous utilisons la charge utile 64Cu (t1/2 = h 12,7) parce qu’il est vulnérable à l’efflux cellulaire et est un émetteur de positrons 10. Ainsi, la procédure 4 décrit en vivo tumeur ciblant la caractérisation par PET imaging pour visualiser la captation de la tumeur par rapport au fond (c'est-à-dire les tissus sains) et de déterminer si l’exemple AC peut précisément et efficacement tumeurs de la cible. Ces méthodes ne suffisent pas pour développer ACs modifiés avec des peptides dérivés de virus pour identifier des candidats plus de promotion pour les enquêteurs.

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Protocol

En vivo animaux expériences décrites ont été effectuées selon un protocole approuvé et dans les directives éthiques du Comité d’éthique du Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke pour l’expérimentation animale.

1. anticorps Peptide conjugaison

Remarque : ChAcNLS peut être synthétisé à tout fabricant de peptide commercial ou de la plate-forme de service de synthèse peptidique affilié à l’Université. La synthèse de ChAcNLS se trouvent dans la référence 34. Pour les procédures 1et 2 utiliser le mAb 7 3, qui est spécifique pour l’antigène de la leucémie IL-3Rα 39.

  1. Dans un tube de microcentrifuge de 1,7 mL, préparez un 10 mg/mL solution (anticorps total ~ 1 mg) 3 de 7 dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,6.
  2. Dissoudre la sulfo-CCAP dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) à une concentration de 5-10 mM. Vortex la solution fonctionne bien mieux afin d’obtenir une dissolution complète.
  3. Ajouter dans le tube contenant 7 3 la solution sulfo-CCAP dissous (en général entre 5-20 μL selon le rapport molaire des sulfo-CCAP - 7 3 désiré). Sulfo-CCAP - 7 3 rapports de 10, 25 et 50 pour 1 les tests sont recommandés. Incuber à température ambiante pendant 1 h.
  4. Purifier et concentrer le 3 7 maléimide-dérivatisés grâce à un échange de périphérique et de la mémoire tampon d’ultrafiltration dans du PBS, pH 7,0. Centrifuger à 8 000 x g pendant environ 5 min. jetez accréditives et remplissez-le de PBS, pH 7,0 et centrifuger à nouveau.
    1. Effectuer ce 7 - 8 fois d’échanger complètement la mémoire tampon. Récupérer le 3 7 concentré protéique en plaçant le dispositif de filtration à l’envers dans un tube de microcentrifuge propre. Centrifuger pendant 2 min à 1 000 x g. volume de reprise doit être environ 0,3 mL
  5. Dans le tube contenant le 3 7 maléimide activé, ajoutez 2 fois excès molaire de ChAcNLS par rapport à la sulfo-CCAP - 7 3 ratio utilisé dans l’étape précédente et incuber une nuit à 4 ° C. Par exemple, si un ratio de sulfo-CCAP - 7 3 10-to-1 a été utilisée, puis utiliser un ratio de ChAcNLS à 7 3 20 à 1. Volume total ne devrait pas être sensiblement modifié.
    Remarque : Bien que ChAcNLS ne provoque pas de précipitations au cours du processus de conjugaison, c’est une possibilité qui pourrait se produire avec d’autres peptides. Observer le tube au cours de la réaction des signes des précipitations, ce qui sont très probablement causée quand les peptides sont hydrophobes. Dans ces cas, il peut être revoir le peptide d’intérêt afin de concevoir des changements pour fournir une augmentation hydrophilicité.
  6. Concentrer les 7G 3-ChAcNLS utilisant un dispositif d’ultrafiltration d’échange souhaité de concentration et de mémoire tampon dans le tampon au phosphate pH 7.4 (Voir l’étape 1.4). Le rendement de récupération de protéine totale doit être ≥ 75 % de la matière première originale.
  7. Effectuer le SDS-PAGE, afin d’évaluer les candidats de 3-ChAcNLS 7G construit à l’aide d’un gel de polyacrylamide de 12 % (prévoit une séparation suffisante de la ChAcNLS conjugués lourd et chaînes de donnée chaînes légères). Mix 10 μg de 7G 3-ChAcNLS dans le chargement de la PAGE de la mémoire tampon contenant 2 μL β-mercaptoéthanol et charger dans le puits.
  8. Régler la tension appropriée (120 V pendant 1 h pour un gel de 12 %) et exécutez l’électrophorèse. Arrêter l’électrophorèse lorsque l’avant du colorant bleu de Coomassie atteint l’extrémité du gel.
    Remarque : Ne laissez pas l’avant du colorant bleu de Coomassie couler le gel.
  9. Enlever appareil d’électrophorèse de gel et rincer avec solution contenant 10 % v/v de méthanol à l’acide acétique glacial et 20 % v/v de décoloration.
  10. Prendre une photo du gel et avec une règle et mesurez la distance (cm) a migré pour les normes et 7 3 conjugués. Calculer la valeur du facteur (Rf) maintien en poste, qui est la distance migré divisée par la longueur du gel (d’où protéine est chargé sur le front de migration de bleu de Coomassie). Tracer la masse moléculaire (mm) dans le journal par rapport aux valeurs de Rf de chaque protéine étalon et extrapoler la taille des 3 7 conjugués.
  11. Calculer le nombre de peptides par anticorps en divisant la différence de MW 7 3 conjugués et non modifié 7 3 1768.5 g/mol (MW de ChAcNLS).
  12. Prendre des images numériques du gel teinté bleu de Coomassie et effectuer une analyse de la densitométrie. À ce stade, sélection d’un candidat de plomb peut reposer sur l’AC avec le nombre maximum de molécules ChAcNLS qui ne contient-elle pas des espèces d’agrégats.

2. confocal Microscopy pour l’évaluation de l’Accumulation intracellulaire

Remarque : Il est important de tester la sélectivité de la cellule de l’accumulation intracellulaire des mAbs peptide modifié avant l’élaboration de formulations avec une charge d’intérêt. Parce que Tat a également été établi ont une propension à la pénétration cellulaire non spécifique, il convient de première analyse intracellulaire accumulation et cellule sélectivité avant les étapes de développement coûteux engagement avec les charges utiles chers. Pour cette raison, 1 procédure devrait également modifier isotype contrôle sans pertinence spécifique mAbs. Pour le reste du protocole, nous travaillerons avec ACs modifié avec 10 ChAcNLS molécules par anticorps. Une représentation schématique, y compris les étapes clés pour les procédures 2 et 3 est décrite à la Figure 2.

ATTENTION : Cette étape du protocole implique la manipulation et la manipulation de paraformaldéhyde. Veuillez suivre les instructions de fabricant lors de la manipulation.

  1. Traiter les cellules cibles TF-1 a avec 200 nM de 7G 3-ChAcNLS y compris modifiée contrôle mAbs. Incuber 5 x 106 cellules d’antigène positives avec les conjugués pendant 1 h à 37 ° C.
  2. Après 1 h, éliminer le surnageant et laver avec 1 mL 3 fois dans du PBS glacée. Ajouter les supports neufs et incuber pendant une heure à 37 ° C.
  3. Après l’heure supplémentaire, éliminer le surnageant et laver 3 fois dans 1 mL de PBS glacée. Ajouter 0,5 mL de PBS contenant 0,25 % acide de trypsine et tétraacétique (EDTA) à 37 ° C pendant 3 jusqu'à 30 min.
    Remarque : Au cours de la première mise à l’essai, il est recommandé de ne trypsinize pas les cellules afin de déterminer les différences dans l’accumulation intracellulaire d’AC. Ce protocole favorise l’utilisation de trypsine et nous démontrons comment cela améliore l’évaluation de l’efficacité des différents candidats AC accumulation intracellulaire.
    1. Tester les différents horaires pour l’incubation en vérifiant visuellement toutes les cellules étant détachés. En outre, incuber les aliquotes de la cellule avec la viabilité des solutions de souillure et d’effectuer la cytométrie comme décrit précédemment 40.
    2. Neutraliser la trypsine avec 1,5 mL de culture cellulaire RPMI 1640 media/10% sérum de veau fœtal. Centrifuger les cellules à 500 g pendant 5 min, retirez le surnageant et laver 3 x dans 0,5 mL de PBS glacée.
  4. Fix cellules dans 0,5 mL de PBS contenant paraformaldéhyde à 1 % et 1 % de saccharose sur la glace pour 30 min. laver les cellules 3 x dans 0,5 mL de PBS glacée et centrifuger à 250 x g pendant 5 min Permeabilize cellules dans 0,5 mL de PBS contenant 0,15 % Triton X-100 pendant 5 min sur la glace. Laver les cellules dans du PBS glacée et répétez la centrifugation.
  5. Suspendre les cellules dans 0,1 mL de PBS contenant 2 μg/mL (ou le fabricant concentration recommandée) d’un anti-murin (isotypes spécifiques) Fc des anticorps polyclonaux secondaire conjugué à l’AlexaFluor 647 pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité.
    1. Centrifuger à 250 x g pendant 5 min et laver les cellules 3 x dans 0,5 mL de PBS glacée. Suspendre les cellules dans 0,5 mL de PBS.
      PAUSE : Les cellules peuvent être stockés dans le réfrigérateur.
      Remarque : Il est essentiel de choisir un anticorps secondaire qui identifie l’isotype correcte de la mAb d’intérêt. AF647 est sélectionné en raison de son émission d’infrarouge lointain, qui n’interfère pas avec (PI) de l’iodure de propidium du noyau.
  6. Ajouter PI à une concentration de 10 µg/mL pour le conteneur avec les cellules. Monter ensuite, 1 x 105 cellules sur des lames de verre à l’aide de supports de montage et couvrir avec une lamelle de verre.
  7. Examinez les cellules avec un objectif à immersion à huile Plan Apo 60 X 1,42 NA sur un microscope confocal à balayage laser inversé. Détecter la fluorescence de PI en utilisant le laser à argon 488 nm et le prisme d’analyse spectral pour 600-650 nm. Pour la fluorescence AF647 utiliser le laser à hélium-néon de 633 nm et le prisme de balayage spectral pour 650 à 700 nm. Recueillir les émissions de fluorescence des PI et AF647 séquentiellement.
    Remarque : Utilisez le même réglage tout au long de l’évaluation et la comparaison des cellules. Toutefois, vous devrez ajuster les réglages de trypsinisés cellules par rapport aux cellules non-trypsinisées.
  8. Logiciel de microscope permet d’acquérir des images. Recueillir les images à l’aide de horizontales optiques sériées de 1 024 x 1 024 pixels avec 2 X ligne moyenne prises à 0,5 μm intervalle tout au long de l’épaisseur de la cellule entière. Présenter les images comme empilées z-projections de quatre coupes consécutives à l’intensité de la fluorescence maximale.
  9. Analyser les cellules avec le logiciel de microscope. Enregistrer le modèle de distribution cellulaire des conjugués. Plus précisément, évaluer si la fluorescence intracellulaire dans le cytoplasme est groupé et près du capteur de surface ou diffus et homogène. Évaluent également l’intensité relative de fluorescence par cellule.

3. radiomarqué AC Construction et fractionnement cellulaire pour l’évaluation de l’efficacité de la délivrance intracellulaire Cu 64

ATTENTION : Les méthodes 3 et 4 impliquent la manipulation et la manipulation de la radioactivité. Avant d’effectuer ces étapes, les chercheurs auraient dû approuvés formation sécurité et protocoles approuvés de l’autorité de sécurité pour le rayonnement de leur établissement d’origine.

Remarque : Pour les procédures 3 et 4 nous utilisons le mAb A14, qui est spécifique pour l’antigène de cancer de vessie IL-5Rα41. En outre, toutes les expériences sont temps sensible en raison de la courte demi-vie de 64Cu. En général, il est préférable de ne pas attendre 1 semaine pour effectuer des expériences in vitro et pas plus de 72 h pour des études in vivo .

  1. Dans un tube de 1,7 mL suspendre l’acide 2,2'-(7-(2-((2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy)-2-oxoethyl)-1,4,7-triazonane-1,4-diyl)diacetic (NOTA-NHS) dans le DMSO à une concentration de 10 mM.
  2. Réagissent 50 fois excès molaire de NOTA-NHS avec A14 (2 mg de matière première) de bicarbonate de sodium 0,1 M à pH 8,6 pendant 1 h à température ambiante dans un volume ≤ 0,5 mL (le volume final de NOTA-NHS ne doit pas dépasser 2 % v/v du volume total).
  3. Purifier et tampon-échange NOTA-A14 à l’aide d’un dispositif d’ultrafiltration dans du PBS, pH 7,6 (Voir l’étape 1.4).
  4. Pour la fixation ultérieure de ChAcNLS, suivez les étapes 1,2 à 1,6.
  5. Réagir NOTA-A14-ChAcNLS (lots de 250 μg) avec 100 Mégabecquerel (MBq) de 64CuCl2 en bicarbonate de sodium 0,1 M, pH 5,5 pendant 1 h à 37 ° C ≤ 0,1 mL. 64 Cu est produite sur le cyclotron TR-PET à la CIMS 42.
  6. Concentré de 64Cu-A14-ChAcNLS dans le tampon au phosphate pH 7.4 à l’aide d’un dispositif d’ultrafiltration à la concentration désirée (Voir l’étape 1.4).
  7. Déterminer l’efficacité radiolabeling des bandes 64Cu-A14-ChAcNLS par instantanée en couche mince (technologique) à l’aide de la chromatographie et 0,1 M, pH 5,5 citrate de sodium (technologique éluant) comme solvant. Appliquer 0,5 μL partie aliquote de la solution de réaction à la bande de technologique. Effectuer un autoradiogramme de la bande et d’obtenir une image numérique.
    1. Effectuer la densitométrie pour obtenir la proportion de lié et libre 64Cu. Si libre 64Cu contenu est > 5 %, retournez à l’étape précédente et effectuer une purification supplémentaire.
    2. En outre, effectuer des SDS-PAGE avec le bleu de Coomassie souillure pour évaluer des agrégations. Effectuer une deuxième SDS-PAGE suivie d’une autoradiogramme du gel pour déterminer s’il y a des espèces agrégées radiomarquées.
  8. Affinité de liaison de point de contrôle de qualité : incuber 64Cu-A14 conjugués à l’augmentation des concentrations (0-100 nM) en double avec 1 x 106 cellules de cible / mL. Pour estimer la liaison non spécifique, mélanger les échantillons en double de 64Cu-A14 conjugués avec des cellules en présence de 100 fois les excès molaire de A14 sans étiquette.
    1. Après 1 h d’incubation sur la glace, laver les cellules et compter les échantillons anticorps lié total et total non spécifique anticorps lié dans un compteur gamma. Graphique de liaison spécifique (anticorps lié total - non spécifique lié anticorps) contre réactive gratuit 64Cu-A14 (nM) utilisé dans le test. Déterminer la constante de dissociation (Kd) par régression non linéaire à l’aide de logiciels graphiques.
  9. Pour les études d’accumulation cellulaire Cu 64: traiter les cellules avec 100 nM du 64marqués au Cu A14 conjugue pendant 1 h, 6 h et 24 h à 37 ° C comme décrit plus haut33. Inclure des paramètres supplémentaires telles que le traitement en présence de non modifiées A14 vers des sites de bloc IL-5Rα et à 4 ° C pour bloquer l’internalisation médiée par les récepteurs.
  10. À l’heure définie points, comme précédemment décrit dans étape 2.3 - 2.3.2, ajouter 0,5 mL de trypsine de 0,25 % contenant PBS et EDTA à 37 ° C suivie de neutralisation et de lavage.
  11. Incuber les cellules dans le tampon de lyse de la membrane plasmique contenant 1 % NP-40, 10 mM Tris pH 7,5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 tampon sur la glace pendant 10 min. centrifuger les cellules lysées à la membrane plasmique à 90 x g pendant 5 min.
  12. Enlever le surnageant et le place dans le nouveau tube. Il s’agit de la fraction cytoplasmique. Laver les noyaux 3 x dans du PBS glacée et ajouter des lavages à la fraction cytoplasmique.
  13. S’assurer que les flacons contenant les fractions nucléaires et cytoplasmiques sont scellés. Ensuite, placez-les dans un gamma compteur calibré pour 64Cu afin de convertir les chiffres bruts en MBq.
  14. Déterminer la qualité de l’isolement des noyaux en effectuant l’analyse par Western blot pour Lamin a/c, une protéine nucléaire limitée et Rab7, une protéine cytoplasmique abondante sur l’ensemble de cellules fractions lysats, nucléaires et cytoplasmiques.
    1. Régal de 5 x 106 cellules avec 500 μL de tampon de radio-immunoprécipitation (RIPA) et le tampon de lyse de la membrane plasmique dans étape 3,12 contenant 1 %, 2 % et 4 % NP-40. En outre, traiter les noyaux isolés chez 500 μL de tampon RIPA pour obtenir des protéines nucléaires isolées.
    2. Précipiter les protéines des cellules isolées de nucléaire et cytoplasmique ensemble utilisant 4 x le volume de l’échantillon d’acétone froid pendant 60 min à-20 ° C. Centrifuger à 13 000 x g pendant 10 min et décanter le surnageant en veillant à ne pas déloger la pastille de protéine. Ajouter 100 μl de PBS pour dissoudre les protéines.
    3. Charge 10 μg de protéines dans chaque puits d’un gel SDS-PAGE de 10 %. Apportez l’électrophorèse comme indiqué dans 1,7 à 1,9. Effectuer des transferts de Western Blot comme décrit précédemment dans la refeference 43.
    4. Identifier l’échelle marqueurs qui mieux correspondent à un MW de ~ 40 kDa. Couper la membrane en deux à ce marqueur. Sonde le blot contenant les protéines MW plus élevés avec des anticorps spécifiques Lamin A/C. Sonde de la membrane avec les protéines MW inférieurs avec les anticorps spécifiques 7 de Rab. Western blot est une technique bien connue et non décrites dans le présent protocole.

4. PET Imaging évaluation du ciblage tumoral

Remarque : Les techniques d’implantation de cellules tumorales chez les souris pour générer des xénogreffes hétérotopiques sont bien connus et la plupart des laboratoires ont des protocoles internes adaptés pour leur système de tumeur. Ainsi, ce n’est pas couvert par le protocole. Le modèle de xénogreffe sera non obèses diabétiques/sévère combinée (NOD/SCID) des souris immunodéficientes porteurs de tumeurs de vessie positifs IL-5Rα HT-1376 et HT-B9. Cellules de tumeur de vessie IL-5Rα-positifs comprennent > 66 % de cellules totales dans les xénogreffes. En revanche, ~ 11 % seulement des cellules positifs IL-5Rα HT-B9 figurent aux xénogreffes développés41. Ainsi, ce modèle offre un excellent exemple d’évaluation AC ciblage tumoral dans les deux tumeurs qui représentent l’hétérogénéité tumorale patient prévisible.

  1. Groupes contenant ≥ 4 souris (NOD/SCID), injecter des 20-30 μg (6-9 MBq) de 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14-NLS et 64Cu-A14 dans la veine caudale.
  2. Le même jour, placez un fantôme cylindrique (24,8 mL) contenant 5 MBq de 64Cu pour convertir les comtes radioactives par seconde dose injectée par gramme de tissu (%ID/g).
  3. Attendez 48 h et puis anesthésier souris en les plaçant dans une chambre à induction avec 1,5 L/min de débit d’oxygène à l’isoflurane 2 %. Appliquer une pommade ophtalmique stérile aux yeux de la souris après l’induction et avant placement dans PET scanner.
  4. Transférer rapidement la souris à une table PET scanner en décubitus ventral avec un cône de nez pour l’isoflurane headfirst. Position la respiration et des sondes rectales et des taux de température et de la respiration de moniteur pour assurer le maintient de conditions physiologiques au cours de l’expérience comme précédemment décrit 44.
  5. Démarrer l’acquisition de données de PET à l’aide d’un paramètre de mode d’échantillonnage régulier et une fenêtre d’énergie de keV 250-650. En règle générale, une analyse statique de 45 minutes par souris est suffisante pour fournir des événements coïncidant suffisantes pour la reconstruction et de la production d’images de PET de haute qualité.
  6. Après le scan 64Cu-AC, retirer les souris du scanner et placez-le dans la cage. Permettre à la souris récupérer suffisamment avant de retourner à l’animalerie.
  7. Obtenir des images reconstruites en utilisant 20 itérations d’un algorithme de probabilité maximale Expectation Maximization en trois dimensions.
  8. Effectuer région d’analyse de l’intérêt (ROI) de la tumeur et les organes évaluables visuellement en utilisant le logiciel de l’AMIDE.
    1. Tirer les ROIs pour obtenir des données quantitatives %ID/g manuellement à l’aide de la configuration 3D outil dessin à main levée et délimiter avec soin les tumeurs ou le muscle de la cuisse adjacents. Les coups par pixel dans le retour sur investissement seront convertis à %ID/g de l’étape précédente 4.2.
  9. Comparer 64Cu-A14, 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14-NLS images contraste de la tumeur et quantitative ROI % ID/g, et les ratios de tumeur-de-fond.

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Representative Results

Pour la procédure 1, la construction de 7 3 modifié avec ChAcNLS à l’aide de sulfo-CCAP comme une RETICULATION est très fiable. En règle générale, lorsque chargées sur un gel de 12 % et analysés par SDS-PAGE, il en résulte une augmentation progressive distinguables proportionnelle à l’augmentation des ratios de sulfo-CCAP - 7 3 MW utilisée et permet pour les chaînes lourdes et légères être évaluée individuellement pour ChAcNLS conjugaison (Figure 3). 7G 3 a réagi à 10, 20, 25-et 50 pour 1 sulfo-CCAP - 7 3 rapports suivis de mesure Rf et MW extrapolation des résultats à 3, 7, 10 et 20 ChAcNLS molécules par 7 3. Par densitométrie, l’espèce de monomère pourcentage est > 90 % pour 7 3 modifié avec ChAcNLS 3-10. Pour 7G 3-ChAcNLS20 l’espèce global est de 45 %. Cela démontre QUE SDS-PAGE est simple mais efficace pour la sélection d’un 7G 3-ChAcNLS conjugué à la poursuite du développement. Bien que, enduisant légère de chaînes d’anticorps peut survenir dues anticorps glycosylation cela n’interfère pas avec l’identification des espèces agrégées.

Pour la procédure 2, les données représentatives illustre les différences entre l’utilisation de la trypsine et aucun trypsine lors de l’évaluation des dérivés de virus peptide modifié ACs pour l’accumulation intracellulaire de l’efficacité. Dans cet exemple, la capacité de 7G 3-ChAcNLS d’augmenter son accumulation intracellulaire peut être évaluée dans les cellules traitées avec et sans la trypsine (Figure 4). Cependant, l’importance de la trypsinisation est évident lors de l’interprétation de l’accumulation des conjugués utilisé pour la comparaison pour déterminer la sélectivité et l’efficacité de l’AC. La trypsinisation permet pour le niveau de fluorescence intracellulaire de référence à établir tel qu’observé avec non modifié 7 3. On peut détailler que 7 3 est limitée vers le cytoplasme dans petits foyers. En revanche, les cellules qui ne sont pas trypsinisées, la fluorescence spécifique 3 de 7G se limite à la surface de la cellule en raison de la surexpression de IL-3Rα sur la surface de la cellule. Il est donc difficile d’enquêter sur la distribution et l’accumulation intracellulaire car la fluorescence à la surface cellulaire domine et bloque donc la fluorescence intracellulaire de visualisé. Trypsinisation des cellules est également important lorsqu’on évalue la spécificité comme preuve avec IgG-ChAcNLS. Nous pouvons voir qu’il y est une fluorescence non spécifiques de la surface cellulaire, mais ne serait pas en mesure de déterminer le niveau d’accumulation intracellulaire causée par le peptide si les cellules n’étaient pas trypsinisées. Enfin, sans la trypsinisation on pourrait interpréter faussement qu’un AC nouvellement mis au point ne s’accumule pas à l’intérieur des cellules cibles. Comme on le voit avec 7G 3-NLS, cellules qui ne sont pas trypsinisées la majorité de la fluorescence est de nouveau de la surface cellulaire. Après trypsinisation, on peut observer que 7G 3-NLS ne s’accumule, quoique limitée, à l’intérieur des cellules cibles.

Pour 3 de la procédure, les données représentatives montrent de contrôle de la qualité de construction, affinité et in vitro l’efficacité en livraison de charge utile et la spécificité pour le radio-isotope 64Cu avec A14-ChAcNLS. Ostéodensitométrie effectuée sur des images radiographiques prises de 12 % sur gel de polyacrylamide contenant 64Cu-A14, 64Cu-A14-NLS, ou 64Cu-A14-ChAcNLS montrent que les conjugués radiomarqués sont 100 % des espèces de monomère (Figure 5 a). 64 Cu-A14-ChAcNLS montre une affinité nanomolar pour IL-5Rα. A14-ChAcNLS en fonction des concentrations croissantes de 64Cu-A14-ChAcNLS révélé saturation de liaison spécifique s’est approché à des concentrations de 3 à 5 nM en HT-1376 et cellules HT-B9 (Figure 5 b). Le Kd pour 64Cu-A14-ChAcNLS HT-1376 et cellules HT-B9 était de 6,4 nM ± 1,7 et 3,1 ± 0,8 nM, respectivement. ChAcNLS conjugaison réduit l’affinité de l’A14 environ 2,5 pour IL-5Rα HT-1376 et cellules HT-B9. Gamma comptage révèle que l’augmentation de la radioactivité dans le noyau et le cytoplasme envoyée par 64Cu-A14-ChAcNLS est spécifique et augmente au fil du temps (Figure 6). Gamma comptant montre généralement environ > 6 fois augmentation accumulation nucléaire et intracellulaire dans les cellules traitées avec 64Cu-A14-ChAcNLS par rapport au traitement avec 64Cu-A14-ChAcNLS en présence d’excès A14 non modifié ou lorsque les études de traitement sont effectuées à 4 ° C (Figure 6 a). Il y a aussi un ≥ 3 fois augmenter dans le nucléaire et l’accumulation intracellulaire de 64Cu relative aux cellules traitées avec 64Cu-A14 et 64Cu-IgG-ChAcNLS à tous les points dans le temps mis à l’essai (Figure 6 b).

La figure 7 illustre l’importance du protocole de fractionnement cellulaire. HT-1376 et HT-B9 de cellules ont été incubées avec tampon de lyse de la membrane plasmique contenant 1 %, 2 % ou 4 % NP-40. Doivent contenir exclusivement des noyaux isolés Lamin a/c. en conséquence, fractions cytoplasmiques devraient être exclusives pour Rab7. Comme contrôle, cellules lysées avec tampon RIPA devraient être positifs pour Lamin a/c dans les deux fractions. Ce protocole indique que lors de l’évaluation de la fraction nucléaire des cellules HT-1376 lysées, il n’y a aucun Rab7 présents. En outre, il n’y a aucun Lamin a/c présents dans la fraction cytoplasmique. Cependant, il y a une quantité réduite de Rab7 dans le cytoplasme de cellules lysées avec 4 % NP-40 (Figure 7 a). Il semble donc très probablement que ce tampon de lyse NP-40 4 % perturbe la membrane nucléaire en plus de la membrane plasmique. Cela se traduit par le mélange de protéines nucléaires avec des protéines cytoplasmiques et dilue ainsi la concentration de Rab 7. C’est ce qui explique la quantité réduite de Rab 7 présents. Les cellules HT-B9 sont encore plus sensibles que les cellules HT-1376. Lorsque les traités avec le tampon de lyse de la membrane plasmique contenant 4 % NP-40, Lamin a/c est clairement visible dans la fraction cytoplasmique (Figure 7 b). Il y a une réduction correspondante au montant de Lamin a/c dans la fraction nucléaire. Les cellules HT-B9 sont également sensibles au tampon de lyse NP-40 2 % comme la quantité de Rab7 dans la fraction cytoplasmique est visiblement réduite par rapport à 1 % NP-40. Ainsi, on doit optimiser le fractionnement cellulaire avec des cellules particulières d’intérêt afin que les résultats quantitatifs de l’accumulation de la charge utile dans le noyau et l’espace intracellulaire sont exacts. C’est important pour évaluer l’efficacité de localisation nucléaire d’un roman de AC.

Pour procédure 4, TEP à injection après 48 h de 64Cu-A14, 64Cu-A14-NLS ou 64Cu-A14-ChAcNLS chez les souris portant le HT-1376 et HT-B9 hétérotopiques xénogreffes sur pattes opposées permet la visualisation de la tumeur ciblage des propriétés (Figure 8). Comme dans notre exemple, l’inspection visuelle des images PET révèle le HT-1376 et les capacités de ciblage de tumeur HT-B9 de 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14 et 64Cu-A14-NLS (Figure 8 a). Toutefois, dans les cas où inspection visuelle l'est difficile comme avec les tumeurs HT-B9, analyse ROI peut être utilisée pour déterminer les ratios de tumeur-à-musculaire (Figure 8 b).

Figure 1
Figure 1 : mAbs modifiés ChAcNLS. Les résidus NLS de SV-40 grand antigène T (KKKRKV) sont pris en sandwich entre résidus entretoise coiffées par une cystéine N-terminale. L’acide cholique (support vert) est couplé à la cystéine comme décrit précédemment 34. Après la construction et la purification de ChAcNLS, le groupe sulfhydryle de cystéine est utilisé comme conjugaison via sulfo-CCAP (support rouge ; déjà montré attaché à la mAb). NOTE : mAb (150 kDa) et ChAcNLS (1,8 kDa) ne sont ne pas à l’échelle. Adapté et réimprimé avec la permission de Paquette, M. et coll. NLS-cholique acide conjugaison à IL-5Rαspecific anticorps améliore l’accumulation cellulaire et propriétés de ciblage de tumeurs in vivo dans un modèle de cancer de la vessie. Chimie Bioconjugate. doi:10.102/ACS.bioconjchem.8b00077. (2018).
-

Figure 2
Figure 2: schématique de cellule AC approche de traitement et de traitement ultérieur pour analyse en microscopie confocale et analyse de la qualité du fractionnement cellulaire. Flèches rouges correspondent aux étapes essentielles, 2.2, 2.3, 3.15 et 3.15.4. Adapté et réimprimée avec permission de Beaudoin, S. et al. ChAcNLS, un roman Modification-scientifiques permettant cible spécificité cellulaire Endosomal échapper, la localisation pour le noyau et l’Accumulation intracellulaire Total amélioré. Moléculaire Pharmaceutics. 13 (6), 1915-1926, doi:10.1021/acs.molpharmaceut.6b00075 (2016).

Figure 3
Figure 3 : analyse du mAbs modifiés ChAcNLS. Un réducteur SDS-PAGE montrant l’échelle en cours d’exécution (L) avec des poids moléculaires correspondants aux kilodaltons (kDa) et non modifié 7 3 chaînes lourdes et légères comme des références. Les voies suivantes sont les bandes de migration des chaînes lourdes et légères de 7 3 modifié avec 3, 7, 10 et 20 ChAcNLS.

Figure 4
Figure 4 : analyse du mAb Distribution intracellulaire et l’Accumulation de. Images de microscopie confocale illustrant les 3 7 intracellulaire distribution et accumulation de fluorescence relative dans des cellules de leucémie de IL-3Rα-positives traitées avec 7 3, 7 G 3-ChAcNLS, IgG et IgG-ChAcNLS. Les cellules ont été trypsinisées ou pas trypsinisées avant la fixation. Les noyaux sont colorés avec l’iodure de propidium (PI ; rouge), anti-murine-Fc-AF647 colorant (mAb ; vert), et PI/mAb fusionné. L’échelle est de 50 μm. Au sein de la trypsine et aucun groupe de trypsine, les images ont été acquises avec les paramètres de l’instrument identique entre l’AEC différents montré. La portion de la trypsine de la Figure 4 est une adaptation de refefence 34 avec permission. Adapté et réimprimé avec la permission de Beaudoin, s. et al. ChAcNLS, une nouvelle Modification scientifiques permettant cible spécificité cellulaire Endosomal Escape, localisation pour le noyau et l’Accumulation intracellulaire Total améliorée. Moléculaire Pharmaceutics. 13 (6), 1915-1926, doi:10.1021/acs.molpharmaceut.6b00075 (2016).

Figure 5
Figure 5 : 64Cu-A14-ChAcNLS pureté et affinité. (A) la pureté radiochimique de 64marqués au Cu A14, A14-NLS, A14-ChAcNLS ont été vérifiés par SDS-PAGE, suivie par autoradiographie. (B) les courbes de liaison spécifique pour 64Cu-A14 et 64Cu-A14-ChAcNLS sur les cellules HT-1376 et HT-B9. Barres d’erreur indiquent écart d’expérience effectuée à répliquer. Adapté et réimprimé avec la permission de Paquette, M. et al. Conjugaison acide cholique-NLS à anticorps spécifique du IL-5Rα améliore l’accumulation cellulaire et propriétés de ciblage de tumeurs in vivo dans un modèle de cancer de la vessie. Chimie Bioconjugate. doi:10.102/ACS.bioconjchem.8b00077. (2018).

Figure 6
Figure 6 : 64Cu nucléaire et intracellulaire Accumulation. Un exemple représentatif du traitement de la cellule effectué en trois exemplaires (barres d’erreur indiquent écart-type) pour démontrer la spécificité (A) et (B) amélioration de l’accumulation de 64Cu-A14-ChAcNLS. L’accumulation de % est présentée dans le noyau (panneaux de gauche) et l’espace intracellulaire total (panneaux de droite) par rapport à la quantité totale de radioactivité utilisée pendant le traitement des cellules de cancer vessie IL-5Rα-positives. Barres d’erreur indiquent écart d’expérience effectuée à répliquer. * indique p ≤ 0,05.

Figure 7
Figure 7 : analyse de la procédure de fractionnement cellulaire. Tache occidentale des fractions (A) nucléaires et cytoplasmiques (B) pour Lamin a/c (taches haut ; flèches rouges) et Rab 7 (taches de fond ; flèches noires) provenant du traitement des HT-1376 et cellules HT-B9 dans un tampon de lyse de la membrane plasmique contenant soit 1 %, 2 %, soit 4 % NP-40. Cellules lysées avec tampon RIPA a été utilisé comme témoin positif pour Lamin a/c et Rab7 dans les deux fractions. Normes en cours d’exécution (L) sont représentés uniquement dans les transferts haut de la page. Trois flèches sont affichées pour Lamin a/c en raison de ses multiples isoformes. Adapté et réimprimée avec permission de Paquette, M. et al. Conjugaison acide cholique-NLS à anticorps spécifique du IL-5Rα améliore l’accumulation cellulaire et propriétés de ciblage de tumeurs in vivo dans un modèle de cancer de la vessie. Chimie Bioconjugate. doi:10.102/ACS.bioconjchem.8b00077. (2018).

Figure 8
Figure 8 : In Vivo analyse du ciblage tumoral par TEP et analyse du retour sur investissement. Images de PET (A) après l’injection de souris NOD/SCID portant le HT-1376 (flèches rouges) et les tumeurs de HT-B9 (flèches bleues) injectés par voie intraveineuse avec 64Cu-A14, 64Cu-A14-NLS et 64Cu-A14-ChAcNLS 48 h. Flèche verte est l’absorption du foie. Dessin de ROI de muscle avec cercle magenta. (B) ROI HT-1376 et HT-B9 ratios de tumeur-à-musculaires de l’AEC après l’injection 48 h. Barres d’erreur indiquent écart d’expérience à n = 10 ROIs par souris (n = 5). * indique p 0,05.

Tat
CGGQVCFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGS 20
CFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQ 30
CGISYGRKKRRQRRR 29
GRKKRRQRRRPPQGYC 22,25
TRQARRNRRRRWRERQRGC 26
NLS
CGYGPKKKRKVGG 21,23,24,27
L’acide cholique-CGYGPKKKRKVGG 34

Tableau 1 : Liste de Tat et SV-40 grand antigène T Peptides dérivés utilisés dans les Modifications de l’AC.

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Discussion

Principaux objectifs de délivrance systémique d’agents anticancéreux doivent accroître l’accumulation sur le site de la tumeur et l’absorption dans les cellules cancéreuses et diminuer les effets secondaires indésirables dans les tissus sains. Livraison de AC ciblée de charges utiles moléculaires de cellules tumorales est une approche très prometteuse pour traiter et de détecter des tumeurs. Toutefois, le manque d’efficacité causée par piégeage de l’endosome et vers le bas de dégradation lysosomale des flux reste un défi important. Alors que ce protocole utilise le peptide ChAcNLS à titre d’exemple pour la construction de la prochaine génération ACs, les procédures décrites sont adaptables à n’importe quel C.A. peptide modifié en cours d’élaboration dans le but d’augmenter la quantité de charge livré intracellulaire pour cible les cellules cancéreuses.

Les étapes plus critiques dans le présent protocole sont : 1) identification et limitation haute MW agrègent des espèces ; 2) la trypsinisation des cellules avant l’analyse pour la détermination de l’accumulation intracellulaire ; 3) exécution d’assurance de la qualité des procédures de fractionnement cellulaire ; et 4) effectuant PET imaging pour évaluer la tumeur ciblage in vivo.

Il est important que la conjugaison des peptides dérivés de virus à mAbs n’entraîne pas d’espèces agrégées MW qui sont probablement dû à une réticulation intramoléculaire entre mAbs. C’est la préoccupation initiale et doit être traitée avant de progresser davantage. Aller de l’avant avec ACs peptide modifié qui contiennent des granulats indésirables pourrait donner des résultats qui fournissent de fausses preuves sur des aspects tels que les profils de livraison charge utile intracellulaires et in vivo . Réactif maléimides sur mAbs est ce qui est très probablement responsable de l’agrégation covalente. Une solution consiste à réduire le ratio de sulfo-CCAP-à-mAb. Une autre alternative consiste à utiliser les dérivés N-acétylés des acides aminés comme la Cys, Lys, sien, Ser et Thr au cours de la conjugaison de peptide à la mAb maléimide activé 45. Les chaînes latérales nucléophiles sont capables de réagir avec la portion maléimide du CCAP et diminuer la réticulation intra-anticorps. Par ailleurs, la séparation par chromatographie d’exclusion après que conjugaison peut être utilisée pour isoler le monomère espèces 45. Conjugaison in site du peptide à l’anticorps peut également être effectuée. Par exemple, glucides anticorps sont modifiables pour la conjugaison de peptides, qui a fait preuve pour produire efficacement monomère espèces 24.

SDS-PAGE avec 12 % des gels de polyacrylamide est une méthode peu coûteuse et efficace d’obtenir une large perspective de différences de grande taille chez les espèces de l’AC. Si une augmentation en % polyacrylamide est utilisée, séparation des chaînes lourdes et des espèces intramoléculaires seront difficile à distinguer. À l’inverse, si une réduction de % polyacrylamide est utilisé, les chaînes légères sont susceptibles de couler le gel. Gradients gels contenant de 4 à 20 % de polyacrylamide également fournissent bonne rétention se déplace pour les chaînes lourdes et légères sur un gel unique. Parmi les différentes techniques d’analyse disponibles pour analyse biomoléculaire, chromatographie liquide à haute performance et électrophorèse capillaire-SDS sont supérieurs aux SDS-PAGE pour la séparation et la caractérisation de l’ACs, 46. Néanmoins, SDS-PAGE est une méthode rapide et peu coûteuse pour analyser la construction initiale de ces nouveaux agents et ensuite décider de la façon suivante d’action.

L’incubation des cellules dans une solution contenant 0,25 % de trypsine (étape 2.3), qui supprime un nombre maximum de protéines de la surface cellulaire et ACs lié est importante parce qu’il permet une meilleure visualisation et une augmentation relative dans l’accumulation intracellulaire entre anticorps de référence. Les paramètres de la caméra sont réglés pour capturer des images à l’intensité de la fluorescence maximale. C’est à cause de la variation d’une cellule à un montant de AC qui s’accumule. Ainsi, capture d’images à intensité maximale permettant de cellules avec des accumulations de moins AC doit également être évaluée. Cependant, les antigènes du cancer sont généralement fortement exprimées sur les cellules tumorales. Si les cellules n’ont pas subis de digestion par la trypsine, la fluorescence émanant d’AEC à la surface des cellules vont dominer l’image. En outre, sans la trypsinisation développement pourrait être limitée avec ACs avec propriétés d’accumulation intracellulaire subtile mais importante.

Assurer le fractionnement cellulaire de haute qualité est important d’évaluer avec précision l’accumulation de 64Cu dans le noyau et le cytoplasme. La capacité des ChAcNLS à augmenter l’accumulation intracellulaire de ca et de la charge utile est due à la localisation active pour le noyau 34. Comme futurs virus-peptides sont développés, ces peptides peuvent également localiser le noyau dans le cadre de leur mécanisme pour accroître l’efficacité de la charge utile intracellulaire. Ainsi, il est important que le fractionnement cellulaire soit de grande qualité de détailler précisément ce processus. Ce protocole met l’accent sur l’importance d’évaluer les noyaux pour les marqueurs cytoplasmiques et aussi la fraction cytoplasmique pour marqueurs nucléaires. Par exemple, Hu et al., mis au point un AC modifié avec un peptide Tat et exploré nucléaire accumulation d’une charge utile de radio-isotope 24. Analyse par Western blot pour la calpaïne, une protéine cytoplasmique abondante, était présent dans la fraction nucléaire. C’est probablement parce que l’isolement nucléaire commerciale trousses ont été utilisées. Ce protocole a démontré que le HT-1376 et HT-B9 cellules nécessaires à différentes concentrations de NP-40 afin d’isoler les noyaux enrichis à membranes intactes. Lorsque les cellules HT-B9 sont lysées avec tampon contenant 4 % NP-40, Lamin a/c, était présent dans la fraction cytoplasmique indiquant le traitement perturbé les membranes nucléaires et autorisé pour Lamin a/c entrer dans le cytoplasme. Si les fractions nucléaires et cytoplasmiques ne sont pas soigneusement isolées, il pourrait être difficile d’identifier la contribution de localisation nucléaire totale accumulation intracellulaire. On signale de biologique et artificiellement-peptides dérivés visant spécifiquement les autres compartiments intracellulaires tels que le réticulum endoplasmique, appareil de Golgi et mitochondries 47,48,49. Ainsi, l’isolement des compartiments intracellulaires devient de plus en plus pertinent.

Ce protocole se termine par sa description de ciblage de 64Cu-A14-ChAcNLS de HT-1376 et tumeurs HT-B9. Il est évident par l’augmentation de l’inspection visuelle des images PET à la Figure 8, tumeur PET du signal par rapport à des proches réduits entourant le fond 64Cu-A14-ChAcNLS a supérieure de ciblage de tumeurs HT-1376 et HT-B9 (Figure 8 a ). Analyse du retour sur investissement montre également sa capacité à évaluer le ciblage tumoral. Dans notre exemple, nous utilisons les ratios de tumeur-à-muscle ROI pour quantifier le ciblage tumoral et démontrer 64Cu-A14-ChAcNLS est le commandant de bord supérieur (Figure 8 b). L’imagerie PET permet également l’évaluation des AC séquestrant dans les organes sains. Le foie est le principal organe qui métabolise l’anticorps. Figure 8 a montre l’absorption dans le foie est comparable chez les souris injectées avec 64Cu-A14-ChAcNLS et 64Cu-A14. À ce stade de développement précoce, ces données suggèrent que chacnls ne provoque pas de séquestrer non désirés. 64 Cu a une demi-vie de 12,7 h, qui n’est pas idéal pour ACs qui ont des demi-vies de plusieurs jours. Comme décrit précédemment dans le protocole visuel par Mme Zeglis et Lewis, l’utilisation de la longue durée de vie de radio-isotope zirconium-89 (89Zr) est une charge utile dont demi-vie physique est idéal pour mAbs et peut être photographiée par PET 50. Ainsi, pour évaluer les livraison de tumeur sur plusieurs jours, 89Zr est un choix préféré. Cela est particulièrement important si la thérapie est un but où l’absorption haute tumeur est favorable et augmente au fil du temps avec des anticorps 7. Biodistribution doit également être effectuée afin de déterminer l’absorption des organes individuels afin d’étudier le ciblage ou séquestrer des propriétés de nouvellement développé ACs. En outre, les souris peuvent être prédosés avec des anticorps spécifiques non modifié pour bloquer les sites récepteurs sur les cellules tumorales afin d’évaluer la spécificité de ciblage. Néanmoins, 64Cu avec imagerie TEP et analyse du retour sur investissement suffisamment fournissent une évaluation initiale de la tumeur propriétés de la remise de l’AEC développés présentés dans le présent protocole.

Jusqu’ici, ACs modifiés avec des peptides dérivés de virus ont été limités à la fourniture de radio-isotopes. C’est en partie pour des raisons historiques et aussi parce que les radio-isotopes sont facilement quantifiables durant in vitro et in vivo test et peuvent être visualisées à l’aide de modalités d’imagerie non invasives dans tout l’organisme. Naturellement, comme ce champ se développe pour le transport et la livraison de charges autres que les radio-isotopes, comme les agents chimiothérapeutiques, enzymes et oligonucléotides, modifications des techniques décrites dans le présent protocole devra être développé. Par exemple, nouvelles méthodes pour évaluer l’accumulation intracellulaire d’autres charges devra être développé. En outre, les modifications pour in vivo évaluation seront abeille nécessaire que ces charges ne peuvent être copiés facilement et c’est pourquoi il sera difficile d’évaluer l’efficacité d’absorption de biodistribution, la spécificité et la tumeur. Pour ces raisons, charges utiles radionucléide devraient rester comme charges de substitution pour le développement futur avec d’autres cargaisons.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer

Acknowledgments

Ce travail a été financé par the Cancer Research Society (Canada) et le CIMS. Les auteurs remercient Dr Samia Ait-Mohand et Jean-Francois Beaudoin pour assistance. Dr Angel Lopez (University of South Australia) pour mAb A14.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sulfo-SMCC Thermo Scientific 22122 There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from.
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters EMD Millipore UFC505096 There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs.
Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards BioRad 1610375EDU Mulicolor recombinant proteins from 10 - 250 kDa.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Scientific 25200056 100 or 500 mL volumes to choose from.
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate Thermo Scientific A-21235 1 - 10 μg/mL recommended
NOTA-NHS CheMatech C100
Lamin A/C antibody (N-18) Santa Cruz Biotechnology sc-6215
Rab7 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-376362
A14 mAb BD Biosciences 555902
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Thermo Scientific NP0007
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-25ML
TF-1a cells ATCC ATCC CRL-2003
RPMI 1640 medium ATCC ATCC 30-2001
RIPA lysis and extraction buffer Thermo Scientific 89900
AMIDE medical imaging software available at amide.sourceforge.net Completely free download
FluoView FV1000 Confocal Microscope Olympus
Fluoview Software Olympus www.olympus-lifescience.com
ITLC strips Biodex 150-771

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Bio-ingénierie numéro 133 peptides dérivés d’origine virale anticorps-conjugués SDS-PAGE microscopie confocale fractionnement cellulaire cuivre-64 PET imaging
Évaluation initiale des anticorps-conjugués modifié avec Peptides viraux dérivés pour accroître l’Accumulation cellulaire et améliorer le ciblage tumoral
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