Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ניתוח התכווצות האוטומטי של רקמת לב Engineered האנוש להקרנת בטיחות תרופת לב

Published: April 15, 2017 doi: 10.3791/55461
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Experimental Pharmacology and Toxicology, Cardiovascular Research Center, University Medical Center Hamburg-Eppendorf and DZHK (German Center for Cardiovascular Research)

Summary

כאן, אנו מציגים את הדור של רקמת לב מהונדסים אנושי מתאי גזע מושרים (hiPSC) -derived cardiomyocytes. אנו מציגים שיטה לנתח בכוח התכווצות ושינוי למופת של דפוס כיווץ ידי מעכב ערוץ hERG E-4031. שיטה זו מציגה רמה גבוהה של חוסן ויכולת התאמת הקרנת סמי לב.

Abstract

הנדסת רקמות לב מתארת ​​טכניקות להוות שלוש רקמות מהונדסות מניב כוח ממדים. לשם יישום הנהלים אלה במחקר בסיסי ופיתוח תרופות פרה-קליני, חשוב לפתח פרוטוקולים עבור דור אוטומטי וניתוחים בתנאים סטנדרטיים. כאן, אנו מציגים טכניקה ליצירת רקמת לב Engineered (EHT) מ cardiomyocytes של מינים שונים (חולדה, עכבר, אדם). הטכניקה מתבססת על מכלול של א-ג'ל הפיברין המכיל cardiomyocytes ניתק בין polydimethylsiloxane אלסטי (PDMS) הודעות בפורמט 24-היטב. שלוש ממדי, מניב כוח EHTs מהווה בתוך שבועות אחרי הליהוק. הליך זה מאפשר לדור של כמה מאות EHTs בשבוע מוגבל מבחינה טכנית רק על ידי הזמינות של שריר הלב (0.4-1.0 x 10 6 / EHT). הערכת התכווצויות שרירי auxotonic מתבצעת בתא דגירה שונה עם mechanמשתלב iCal עבור צלחות 24-היטב ומצלמה ממוקמת על גבי תא זה. תוכנה שולטת במצלמה עבר על מערכת צירים XYZ לכל EHT. התכווצויות EHT מזוהות על ידי אלגוריתם זיהוי דמות אוטומטי, וכוח מחושב על בסיס קיצור של EHT ואת הנטייה אלסטי וגיאומטריה של הודעות PDMS. הליך זה מאפשר ניתוח אוטומטי של מספרים גבוהים של EHT בתנאים סטנדרטיים סטרילי. זיהוי האמין של שפעות תרופה על התכווצות cardiomyocyte הוא קריטי להתפתחות ופרמקולוגיה בטיחות תרופת לב. אנו מדגימים, עם הדוגמא של E-4031 מעכב ערוץ hERG, שמערכת EHT האנושית משכפלת תגובות תרופה על קינטיקה התכווצות של הלב האנושי, המציין שזה יהיה כלי מבטיח עבור הקרנת בטיחות תרופת לב.

Introduction

תופעות לוואי לב כגון תסמונת QT-induced סמים הארוכה הובילו משייכות שוק לאורך השנים האחרונות. הסטטיסטיקה מצביעה על כך כ -45% מכלל משיכות הן בשל השפעות לא רצויות על מערכת הלב וכלי הדם 1. כישלון התרופה הזו לאחר התהליך ואישור התפתחותי היקר הוא התרחיש הגרוע ביותר עבור חברות תרופות. מחלקות מחקר ופיתוח ולפיכך להתמקד זיהוי של תופעות קרדיווסקולריות רצויות כגון מוקדם. אם יש לך חששות כלכליים ואתיים, המאמצים לצמצום ניסויים בבעלי החיים ולהחליפם מבחני מיון חדשים במבחנה נמשכת.

סט של מבחנים הוקמו כלולים מנהל המזון והתרופות בארה"ב (FDA) סוכנות תרופות האירופית (EMA) הנחיות להערכת פרה-קלינית של שפעות תרופת proarrhythmic 2. הטכנולוגיה של תכנות מחדש תאים סומטיים ואחריו בידול שלתאי גזע אנושיים מושרים (hiPSC) שפרו שדה מחקר זה 3. כעת הוא מציע את האפשרות לסנן מועמדי תרופה חדשים על שריר לב אנושי במבחנה ונמנע בעיות עם הבדלים-מיני שאר. פרוטוקולי בידול לב אחרונים 4, 5 לספק היצע בלתי מוגבל של שריר לב בלי חשש אתי. עם זאת, המדידה של כוח ההתכווצות, החשוב ביותר המאופיין ביותר בפרמטר vivo של שריר לב, אינה מבוססת דיו. זה קשור הבגרות היחסית 6 של שריר לב הנגזרות תא גזע מושר האנושי (hiPSC-CM) בהשוואת cardiomyocyte המבוגר. התקדמות אפשרית היא להנדס רקמת לב 3 ממדים ממשפחות חד תאי 7 (רקמה לב מהונדס, EHT). פרוטוקול EHT מבוסס על הטבעה בעכברים יחידים או שריר לב אנושי 8 sup>, 9, 10 ב הידרוג'ל הפיברין בין שני polydimethylsiloxane הגמיש (PDMS) הודעות 11 בפורמט 24-היטב. תוך כמה ימים cardiomyocytes להתחיל להתכווץ באופן ספונטני כמו תאים בודדים ולהתחיל להקים רשתות סלולריות. לאחר 7-10 ימים, התכווצויות מקרוסקופית של הרקמה כולה גלויות. במהלך תהליך זה מטריקס היא שופצה, אשר מובילה לירידה של קוטר ואורך. קיצור של תוצאות EHT כיפוף של PDMS לפרסם אפילו במנוחה, העמדת cardiomyocytes בתוך EHT בפיתוח עומס מתמשך. EHTs ממשיך לבצע התכווצויות שרירי auxotonic פני מספר שבועות. EHTs האדם להראות תגובות לגירויים פיסיולוגיים תרופתיים מציין התאמת הקרנה ומחלות תרופת דוגמנות 7.

בכתב היד הזה אנו מציגים פרוטוקול חזק וקל עבור generatiעל של EHT האנושית, ואת ניתוח התכווצות אוטומטית של שינויים תלויי ריכוז של דפוס כיווץ בנוכחות מעכבי ערוץ hERG.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: השלבים הבאים מתארים פרוטוקול תרבית תאים. אנא לבצע בתנאים סטריליים והשתמש במדיה מחומם מראש.

1. בידול הלב של hiPSC

  1. לטפח את hiPSC
    1. מעיל צלחות 6-היטב (1 מ"ל / טוב) או T75 צלוחיות (7 מ"ל / בקבוק) עם מטריצה קרום במרתף גורם צמיחה מופחתת (למשל geltrex, 1: 200; ראו טבלה של חומרים) מדולל בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) עבור 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הכן בינוני FTDA 12 על ידי ערבוב DMEM בסיסי / F-12 בינוני עם 2 מ"מ L- גלוטמין, 0.5% פניצילין / סטרפטומיצין, 5 מ"ג / transferrin L, 5 מיקרוגרם / ליטר סלניום, 0.1% אלבומין אנושי, 1x-תערובת שומנים, 5 מ"ג / L אינסולין, 50 ננומטר dorsomorphin, 2.5 ננוגרם / מ"ל ​​Activin א ', 0.5 ng / mL אנושי TGFß1 ו 30 ng / mL FGF2.
    2. HiPSC Seed (~ 3 x 10 5/10 סמ"ר) במדיום ותרבות FTDA ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, 21% O 2 עם שינוי המדיום יומי (איור 1A). בשעה 80% confluency, מעבר (1: 2-1: 6) עם חומצה tetraacetic diamine אתילן (EDTA; 0.5 מ"מ; הדגירה זמן ~ 4 דקות).
  2. הקמת גופים embryoid (EB)
    1. טפח hiPSC ב T75 צלוחיות צפיפות גבוהה.
      1. לשטוף צלוחיות עם תאים ומחוברות פעמיים עם בופר פוספט ללא סידן ומגנזיום (PBS) דגירה 0.5 EDTA מ"מ ~ 10 דק '. ודא תאים לא להתנתק התחתון של הבקבוק.
      2. הסר EDTA עם טפטפת זכוכית, לשטוף את התאים עם 10 מ"ל PBS, צלוחיות ברז בבית הספסל לנתק תאים.
        הערה: מגרד תא השתמש במידת הצורך.
      3. איסוף התאים ב 50 צינור חרוטי מ"ל, להוסיף ¼ נפח (למשל 10 מ"ל RMPI כדי 40 מ"ל תרחיף תאים) RPMI בינוני 1640 (או בכל מדיום סטנדרטיים אחרים המכילים סידן 1.8 מ"מ) צנטריפוגות ב 250 XG במשך 5 דקות.
    2. גלולה תא גלולה במדיום FTDA בתוספת 4 מ"ג / מ"ל ​​פוליוויניל אלכוהול (PVA) ו10 מיקרומטר Y27632 ולספור את התאים בתא נויבאואר.
    3. למלא את הבקבוק טווה עם ההשעיה תא (30 x 10 6 תאים / 100 מ"ל בינוני FTDA בתוספת PVA ו- Y-27,632; ראה שלב 1.2.2) וליזום EB היווצרות צלוחיות טווה (להתאים את מהירות הרוטור של בוחש מגנטי 40 סל"ד ) בחממת תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס, CO 2 5%, 5% O 2) במשך הלילה.
  3. בידול mesodermal
    1. במהלך היווצרות EB, תרבית תאים מעיל צלוחיות מתאים לתרבות ההשעיה עם פעילי שטח בלתי יוניים (14 מ"ל / T175) מעל בלילה 37 מעלות צלזיוס.
    2. למחרת בבוקר, לשטוף צלוחיות מצופות-סורפקטנט פעמים עם PBS (30 מיליליטר / T175). להוסיף PBS שוב ולשמור בחממה עד הצורך.
    3. הסר את הבקבוק טווה מן החממה.
      הערה: השעית תא צריכה להיות ברורה עם EBS הגלוי macroscopically הקטן (איור 1B).
    4. העבר 50 מ"ל השעיה אל גיגית חרוטי 50 מ"לEBS דואר ולתת להסתפק 5-20 דקות.
    5. הסר את supernatant לשטוף את הכדור עם 7 מ"ל של RPMI 1640 בתוספת PVA 2% ו 10 מיקרומטר Y-27,632. להעביר את ההשעיה עד נפח EB הצינור חרוטי 15 מ"ל סיים אומדן (~ 50-100 μL).
    6. העבר תוכן צלוחיות טווה צלוחיות T175 ללא ציפוי ולהשאיר זו על מתלה בצורת V עבור שקיעה עד 20 דקות. הסר supernatant לשטוף גופים embryoid כאמור לעיל. אין למלא את הבקבוק T175 עם יותר מ 200 מ"ל כגון שקיעה ייקח יותר מדי זמן. אם נפח בקבוק טווה ראשוני עולה 200 מיליליטר, לפצל השעית EB לכמה צלוחיות T175 ולשלב EBS שוב לאחר כביסה.
    7. הסר בינוני כביסה גלולה במדיום לבידול mesodermal, כי הוא RPMI השלימו עם 4 מ"ג / מ"ל ​​PVA, 0.5% פניצילין / סטרפטומיצין, 10 מ"מ 4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic (HEPES), 0.05% בסרום אדם אלבומין, 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​transferrin, 5 ng / mL סלניט נתרן, תערובת שומנים 0.1%, 250 מיקרומטר-ascorbate phospho, 10 מיקרומטר Y-27,632, 10 ng / morphogenic העצם מ"ל חלבון-4 (BMP-4), ו 3 ng / A Activin מ"ל, 5 ng / mL FGF2 יציבה.
    8. הסר PBS צלוחיות T175 מצופים פעילי שטח ולמלא עם ההשעיה תא (200 μL EBS ב 40 מ"ל). השתמש בקבוקונים קטנים עבור נפח קטן EB.
    9. טפחו את EBS ב השעיה למשך שלושה ימים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, 5% O 2). המרת 50% של המדיום (באותו הרכב כמו בשלב 1.3.7) כל יום (שימוש בצורת V מתלה שקיעה). כן בינוני טרי כל יום לפני ההאכלה.
  4. בידול לב
    1. הכן כלי חדש מצופים פעילי שטח יום לפני ולטפל כאמור לעיל (1.3.2).
    2. אחרי שלושה ימים של אינדוקציה mesodermal, בואו EBS להסתפק עד 5 דק 'על מתלה שקיעה. הסר ביותר של המדיום ולשטוף עם RPMI 1640 בתוספת 0.5% פניצילין / סטרפטומיצין ו 10 HEPES מ"מ.
    3. העברת 10 מ"ל של השעיה EB כדי בוגר15 מ"ל צינור ואומדן נפח EB אחרי שקיעה.
    4. גלולה EBS בזהירות במדיום בידול הלב המורכב RPMI 1640 בתוספת 0.5% פניצילין / סטרפטומיצין, 10 HEPES מ"מ, 0.05% אלבומין אנושי, 5 מיקרוגרם / transferrin מ"ל, 5 ng / סלניט נתרן מ"ל, תערובת שומנים 0.1%, 250 phospho מיקרומטר -ascorbate, 1 מיקרומטר Y-27,632, 100 ננומטר Wnt-מעכב DS-I-7 13.
    5. העבר EBS צלוחיות תרבית תאים חדשים מצופים פעילי שטח (~ 200 μL EBS ב 46 מ"ל / T175).
    6. דגירה במשך שלושה ימים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, 21% O 2) עם שינוי בינוני 50% (הרכב בינוני ראה שלב 1.4.4) ביום השני והשלישי. אין לשנות את המדיום בתוך 48 h הראשון.
    7. דגירה במדיום המורכב RPMI 1640 בתוספת 500 מיקרומטר 1-Thioglycerol, 10 HEPES מ"מ, 0.5% פניצילין / סטרפטומיצין, 1 מיקרומטר Y-27,632, 2% תוספת תרבית תאים עצביים סרום ללא (B27 למשל) עם אינסולין, 100 ננומטר Wnt -inhibitor DS-I-7 עם חליפין יומיים של מדיום 50% בארבעה הימים הקרובים. EBS צריך להתחיל להכות בתוך תקופה זו.
    8. בתום שבוע של בידול הלב, לעבור לאותו מדיום ללא Wnt עיכוב ועם תוספת תרבית תאים עצביים סרום ללא. שנת 50% של המדיום כל יום, למעט יום ראשון.
  5. דיסוציאציה של שריר הלב האנושי
    הערה: לאחר שבועות של פרוטוקול בידול, EBS צריך להראות התכווצויות ספונטניות (איור 1C). אם כן, להתחיל ניתוק ולהכין תמיסת collagenase.
    1. הכן פתרון collagenase ידי שקילת ופתרון 200 U / mL תמיסת מלח מאוזן סידן חופשי הנקס ללא סידן / מגנזיום (HBSS) ולהוסיף 1 HEPES מ"מ, 10 מיקרומטר Y-27,632, 30 מיקרומטר sulphonamide N-בנזיל-p-טולואן ( BTS). לעקר ידי סינון (מסנן 0.2 מיקרומטר) ו aliquots חנות ב -20 מעלות צלזיוס. הפשרת aliquots ב 4 ° C במשך הלילה.
    2. Settle EBS על מתלה שקיעה,לשאוב בינוני ולהחליף מ"ל 20-25 מחומם מראש HBSS. חזור על שלב זה כביסה שוב.
    3. לשאוב HBSS ולהחליף עם פתרון collagenase מחומם מראש (15 מ"ל / T175). דגירה של 4 שעות ב חממת תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% 2 CO, 21% O 2).
    4. הכן חיץ חסימת עם DMEM בתוספת 1% פניצילין / סטרפטומיצין ו DNase (12 מיקרוגרם / מ"ל).
    5. הקש צלוחיות תרבית תאים על הספסל, ניתק EBS צריך להתפרק ו להתפרק (אם לא, להגדיל את זמן הדגירה). השעית תא triturate בעדינות ולהעביר צינור 50 מיליליטר חרוטים. לשטוף צלוחיות עם חסימת חיץ (15 מ"ל / T175) ולהעביר את הצינור.
    6. צנטריפוגה 10 דקות ב g 100 x. Resuspend התאים DMEM, triturate חמה לספור תאים.

2. דור של רקמת לב ההנדסי (EHT)

  1. חיטוי זמין מסחרי מתלה PDMS ו polytetrafluorethylene (PTFE) מפרידים (ראה חומריםגיליון אלקטרוני ציוד; 2 איור) ולהכין את הפתרונות הבאים בתנאים סטריליים, יום אחד לפני דור EHT.
    1. כן 2% agarose ידי שקילה והמסה בנפח המתאים של PBS, חיטוי, לאחסן מייד 60 ° C.
    2. הכן aprotinin (33 מ"ג / מ"ל) על ידי שקילת והמסה בנפח המתאים iniectabilia מודעה אקווה, לסנן סטרילי (פילטר 0.22 מיקרומטר), aliquot ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
    3. הכן פיברינוגן (200 מ"ג / מ"ל) על ידי המסת פיברינוגן סטרילית בנפח המתאים של 0.9% NaCl סטרילי (פושרים), aliquot ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
    4. הכן תרומבין (100 U / mL) על ידי המסת תרומבין סטרילי בשלושה חלקים סטרילית חלקים PBS ו 2 iniectabilia מודעה אקווה, מנות aliquot של 3 μL צינורות קטנים ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
    5. הכן 10x DMEM ידי המסת 670 מ"ג 10x אבקת DMEM ב 5 iniectabilia מודעה אקווה מ"ל, לסנן סטרילי ולאחסן ב 4 °.
    6. כן 2x DMEMעל ידי ערבוב 2 מ"ל 10x DMEM עם 2 סרום סוס מ"ל חום מומת, 0.2 פניצילין מ"ל / סטרפטומיצין 5.8 iniectabilia מודעה אקווה מ"ל, לסנן סטרילי ולאחסן ב 4 °.
    7. כן בינוני EHT-יציקה (ECM) על ידי ערבוב DMEM עם 10% נסיוב עגל העוברי מומת חום, 1% פניצילין / סטרפטומיצין ו 1% L- גלוטמין (200 מ"מ), חנות ב 4 °.
  2. הכן תבניות יציקה צלחות 24-היטב על ידי pipetting 1.6 מ"ל agarose חם (2%, PBS), הטלת spacer PTFE (איור 2 א) לתוך בארות.
    הערה: spacer מקום מיד לאחר pipetting לתוך למקסימום של 8 בארות - agarose מבצרת מהר מאוד. אל תשאיר את agarose בטמפרטורת החדר למשך זמן רב יותר מאשר 5 דקות.
  3. לאחר מיצוק agarose (~ 10 דקות, agarose יהפוך אטום), להסיר את מפרידי PTFE (איור 2C) והמקום מתלים PDMS (2B איור) לתוך תבניות יציקה כך זוגות ההודעות PDMS להגיע אל כל עובש (2D איור).
    4. 6 תאים / מ"ל.
  4. הכן 110% מנפח מוערך של תערובת הכינון מחדש בתוך שפופרת 15 מ"ל תחתית עגולה על EHTs 24 ice.For, פיפטה תערובת הכינון מחדש המפורטים בטבלה 1 עבור האדם, cardiomyocytes עכברוש או העכבר, בהתאמה (10% תוספת כלול).
    הערה: ריכוז Cell של תמהיל הכינון שונה עבור האדם (10 x 10 6 תאים / מ"ל), חולדה (4.1 x 10 6 תאים / מ"ל) ועכבר (6.8 x 10 6 תאים / מ"ל) EHTs. תלוי בריכוז של תרחיף תאים, להוסיף ECM נוספות לנפח סופי של 2640 μL. יש Fibrinogen להיות פושרים במשך בפיפטה. לאט לאט למלא את קצה pipet ואל תיגע במשטח של תמהיל הכינון קר עם pipet המכילים פיברינוגן בעת ​​הוספת פיברינוגן לתערובת הכינון מחדש - את הצמיגות של פיברינוגן ב קצה פיפטה יגדיל באופן מיידי.
  5. Triturate תמהיל הכינון 10 - 15 פעמים עם טפטפת סרולוגיות עד קריש פיברינוגן נמס. בדוק את תמהיל הכינון מחדש ב פיפטה עבור הומוגניות.
  6. עבור כל תערובת הכינון מחדש EHT, pipet 100 μL ב aliquot תרומבין אחד (3 μL ב 200 צינור μL), לערבב pipet את התערובת לתוך החריצים-agarose מהר ככל האפשר (איור 2E). השתמש טיפ מסנן חדש עבור כל EHT. Resuspend תמהיל הכינון (טחינה דקה עם פעמים 5-10 פיפטה סרולוגיות) אחרי כל 8 EHTs.
  7. לאחר כל המשבצות מלאות תערובת כינון מחדש, לסגור את המכסה של צלחת תרבית תאי דגירה על 37 מעלות צלזיוס, 7% CO 2 עבור 2 h.
  8. הסר את צלחת מן החממה מקום מתחת למכסה המנוע סטרילית. מכסים היטב עם כל כמות קטנה של המדיום (למשל DMEM, כ -200 - 500 μL), לנער את הצלחת בעדינות דגירה שוב 37 מעלות צלזיוס למשך דקות 10 לפחות. הוספת DMEM תקל על הסרת מן ג'לים הפיברין מ תבניות יציקה agarose. כן צלחת 24-היטב חדשה עם 1.5 מיליליטר EHT-בינוני לכל היטב מורכב DMEM בתוספת 10% בסרום סוס חום מומת, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, 10 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, 33 מיקרוגרם / מיליליטר aprotinin.
  9. מוציאים בזהירות את מדפי PDMS מן תבניות יציקה agarose ולהעביר אותם לצלחת בינוני-מלא 24-היטב (איור 2F). מניחים את המנה בחזרה בחממה (37 ° C, 7% CO 2, 40% O 2 עבור EHTs האדם חולדה, 21% O 2 עבור EHTs העכבר) והעדכון שני, רביעי ושישי עם-בינוני EHT מוכן טרי. EHTs צריך להראות התכווצויות ספונטניות להסיט את הבליטות שעל מדפי PDMS 7-10 ימים לאחר השלכת (איור 1D, 2G).
    1. לעכבר EHTs להוסיף 25 מיקרוגרם / מ"ל ​​של βDarabinofuranoside 5-ציטוזין עד בינוני תרבות עבור 48 שעות כדי להגביל התפשטות פיברובלסטים.

3. ניתוח התכווצות

הערה: ניתוח ההתכווצות מבוסס עלוידאו-אופטי הקלטת מכשיר לניתוח EHT זמין מסחרי (ראה טבלה של חומרים). היחידה המרכזית של מכשיר זה הוא תא הדגירה (איור 3A). התוכנה המסופקת עם המכשיר מחשבת בכוח התכווצות מבוסס על סטיה של הודעות PDMS עם מודולוס אלסטיות ידוע וגיאומטריה 11 (משלים איור 1).

  1. הפעל את מכשיר החימום של h מכונה 2 לפני המדידה. הפעל אספקת גז אספקה ​​אלקטרונית של מערכת הצירים מייד לפני ניתוח ההתכווצות.
  2. להקלטת הבסיס (נקודת התייחסות בניתוח), למקם את 24-היטב צלחת עם EHTs ב EHT-בינוני לתוך מכשיר לניתוח EHT ולהתחיל את תוכנת ניתוח התכווצות בהתאם למדריך הספק.
    1. לחץ על כרטיסיית "הפרוטוקול" בלוח התקין ולהזין מידע רלוונטי לגבי שם מחקר, משתמשים, מינים, CEסוג ll, גיל, אורך ההקלטה והערות נוספות.
    2. לחץ על כרטיסיית "מצלמת הנוף" בלוח השמאלי ולהתחיל מצב מצלמה חי עם מצב זיהוי דמות אוטומטי. לחץ על הכרטיסייה "הגדרות" בלוח תקין andadjust למיקום המצלמה עם XYZ קואורדינטות לכל היטב צלחת 24-היטב. ודא EHT הוא במרכז החלון בפוקוס של המצלמה.
      1. ודא את המכסה של צלחת תרבית תאים אינה מעורפלת כמו זה יפגע הכרת דמות וניתוח התכווצות.
        הערה: אלגוריתם זיהוי הדמות מבוסס על זיהוי אזורי ניגודיות גבוהים וניטור שינוי עמדתם. בשנת התוכנה באזורים אלה של הכרת דמות יסומנו צלב כחול שזז עם ההתכווצויות של EHT.
      2. ודא כי העמדות של הצלבים הכחולים נמצאות שניהם הקצוות העליונים ותחתונים של EHTs והתזוזה רק אנכי התאמת ההתכווצויות של EHTs (איור 3B). Sעמדות התקנת Ave של כל אחד גם על ידי לחיצה על הכפתור "עמדה בסדר".
    3. לאחר מכן, לחץ על הכרטיסייה "פרמטרים" בלוח השמאלי. הפרמטרים המוצגים כאן להגדיר את הקריטריונים שלפיהם התוכנה מזהה לשיא להתכווצות ומסמנת אותו עם ריבוע ירוק. ערכים אלה חשובים מאוד עבור זיהוי נכון של פסגות התכווצות (איור 3 ג) ואין נקודות נתונים כוזבים (איור 3E-F).
      הערה: רשימה של פרמטרי מינים תלויים ודוגמאות מתוארות באיור 3H. לפרטים נוספים, נא עיין במדריך התוכנה.
    4. לחץ על הכרטיסייה "האוטומטית" בלוח התקין וליזום את הניתוח על ידי הפעלת הכפתור "התחל". התוכנה תעבור ברצף מן היטב אחד את התכווצויות EHT הבאות, שיא ולחשב בכוח במהלך ההקלטה (מוצג בלשונית "בזמן האמת" על הלוח השמאלי). בתום הניתוח, דו"ח pdf summariזיע התוצאות יופק באופן אוטומטי.
  3. שמור ולנתח את דו"ח PDF המערכת יוצרת לסכם את התוצאות.
  4. מעקב אחר פרמטרי ההתכווצות ידי מדידה חוזרת על פני כמה ימים. EHT יגדל ב כוח כיווץ עד שהוא הגיע רמה (בדרך כלל סביב יום 15 של התרבות).
  5. הקרנת סמים
    1. הכן פתרון Tyrode בחינם חלבון יום אחד לפני מדידה לאזן צלחות 24-היטב (2 מ"ל / גם) בחממה תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס, 7% CO 2, 40% O 2) במשך הלילה: 120 מ"מ NaCl, 5.4 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgCl 2, 0.1-5 מ"מ CaCl 2, 0.4 מ"מ לאא 2 PO 4, 22.6 מ"מ NaHCO 3, 5 גלוקוז מ"מ, 0.05 מ"מ Na 2 EDTA, 25 HEPES מ"מ. להוסיף עד סידן 1.8 מ"מ או נקבע בעבר [EC 50] לחקור תופעות אינוטרופיות חיוביות.
    2. לשקול לפרק את התרופה ב DMSO ולסנן סטרילי, במידת הצורך.כן 6 פתרונות 1000x-תת-מניות שונות (DMSO) של ריכוז העבודה (למשל 0.3, 1, 3, 10, 30, 100 מיקרומטר עבור מגוון nanomolar בהתאמה).
    3. לדלל את המניות בהתאמה הצלחות Tyrode (2 μL בכל 2 מ"ל היטב) ומערבבים היטב. מניחים את הצלחות בחזרה בחממה עד הצורך.
    4. התחל את המדידה הבסיסית ידי לקיחת Tyrode המלאה 24-היטב הצלחת הראשונה תחת אלקטרודות ברדס ואת מיקום פחמן סטרילי בתוך הבארות. העברת מתלים PDMS עם EHTs להציב על גבי אלקטרודות פחמן, לסגור את המכסה, לשים את הצלחת בחזרה בחממה ולהמתין לתקופה איזון של ~ 30 דק '.
    5. העברת EHTs מן החממה עד משתלבים במכשיר ניתוח EHT. סגור את המכשיר ולהקליט התכווצות בסיס ספונטנית (20 s / EHT).
    6. חברו את האלקטרודות פחמן לכבל צעדה ולהתחיל גירוי חשמלי של EHTs (2.5 V, משך הדחף 4 ms, אדם: ~ 1 הרץ, עכברוש: ​​~ 2רץ, עכבר: ~ 4 רץ). רשום את הבסיס "בקצב" (10 s / EHT). ודא שכל EHTs גדושה כראוי. תדירות מתח גירוי עלולה להשתנות מן שורת תא קו תא.
    7. לאחר הקלטת בסיס, להסיר את EHTs מהמכשיר ולהעביר את האלקטרודות עם מתלי PDMS על גבי, אל 24-היטב הצלחת עם ריכוז התרופה הראשון. העברת EHTs חזרה אל המשתלבים של מכשיר ניתוח EHT מייד לדגור שם (דקות 20 למשל זמן דגירת תרופה סטנדרטית).
    8. חבר מחדש כבלי צעדה, להתאים הכרת דמות ולהקליט התכווצויות EHT להגיב ריכוז התרופה הראשון.
    9. עבור ריכוזי התרופה הבאים, לחזור על שלב 3.5.7 ו 3.5.8 עם המכילות צלחות 24-היטב ריכוז תרופה גבוהה.
    10. שמור את כל הקלטות pdf. בדוק כל הקלטה להכרת דמות, מיקום נכון של ריבועים ירוקים זיהוי פסגות להתכווצות וממצאים (ראה 3.2.1 והאיור 3
    11. ביצוע ניתוח מחובר נוספות במידת הצורך.
      1. בחר בטווח בהתאמה ממסד הנתונים "פועל" על הלוח השמאלי על ידי לחיצה על "ריצה בוחרת". בלשונית "פרמטר" בצד שמאל, לשנות פרמטר לניתוח התכווצות. עכשיו לבחור "ניתוח לא מקוון" בלשונית "המנותקת" בלוח הזכות לנתח מחדש את קטעי הווידאו.
      2. כדי להתאים הכרת דמות ולכן להקליט קובץ וידאו חדש, לבחור "סקירה לדוגמא" לאחר התאמת הכרת הדמות בלשונית "בזמן האמת". הערה: סקירה לדוגמא יכולה רק ולנתח מחדש גם אחד בכל פעם, ואילו ניתוח מחובר יכול להחיל פרמטר חדש עבור כל הבארות ידי לחיצה על "הפרמטר השתמש על כל הבארות" כפתור בלוח "הפרמטר" בצד השמאל. שני הסוגים של ניתוחים מחוברים ייצרו קבצי נתונים חדשים באופן אוטומטי pdf מוצגים התוצאות.
    12. לנתח את הניסוי על ידי שילוב התוצאות של biological משכפל ולסכם את הנתונים עקומים תגובת ריכוז עבור תדר, כוח התכווצות, זמן התכווצות זמן הרפיה (איור 5D) ו / או תצוגה גרפית של פסגות להתכווצות ממוצעות (איור 5 ג).
      הערה: מתלים PDMS ו spacer PTFE ניתן להשתמש שוב ושוב (PDMS עמדות מקסימום 5 פעמים, ו PTFE spacer בלי סוף.). לאחר השימוש, לנקות אותם באופן ידני עם מים, להרתיח פעמיים במים demineralized החיטוי. להיות מודע לתופעות שנשארו לו פוטנציאל, כאשר מחדש באמצעות המתלים, כמו תרופות עלולות להיספג על ידי PDMS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בידול לב הכנת EHT

HiPSC הורחב על מטריצה ​​הממברנה במרתף מופחת צמיחת גורם, ניתק עם EDTA וגופי Embryoid (EBS) נוצרו צלוחיות טווים לילה. לאחר אינדוקצית mesodermal במשך שלושה ימים, בידול לב החל עם מעכב Wnt. לאחר ~ 17 ימים של פרוטוקול בידול, EBS מכים היו ניתק לתוך תאים בודדים עם סוג collagenase II (איור 1). EHTs הוכנו מ cardiomyocytes טרי מבודד עם 1.0 x 10 6 תאים לכל 100 רקמות μL מיד לאחר ניתוק EB (איור 2). עבור הכנת מתאי קפוא (ספקים מסחריים למשל), התאים היו מופשרים ידי resuspension טיפה חכם במדיום והשעיה ב ECM לאחר צנטריפוגה. בתוך 48 שעות, פועם ספונטני של תאים בודדים נצפה מיקרוסקופי של EHT. במהלך הימים הקרובים, cardiomyocytes פרוש אורכית לאורך קווי הכח של הרקמה, מצמיד ויצר EHT פועם באופן קוהרנטי. הסטיות הגלויות macroscopically של הודעות PDMS נמדדו עם מכשיר ניתוח EHT.

ניתוח התכווצות

ניתוח של התכווצות EHT התבסס על הקלטת וידאו-אופטי (איור 3). בתוך המערכת, את הצלחת 24-היטב עם EHTs הוצבה הגז קאמרי חממת טמפרטורה המבוקרת עם גג זכוכית. מצלמה המחוברת ציר XYZ ממונע הוצבה מעל יחידה זו, ועל XYZ קואורדינטות הוגדרו עבור כל EHT עם תוכנה. ניתוח של כל EHT התבסס על הכרת דמות בקצוות העליונים ותחתונים של הרקמה. אלגוריתם תוכנה אוטומטי נתחו את התכווצויות EHT צולמו ופיתוח כוח מחושב המבוססים על סטיית פוסט ואלההגיאומטריה sticity / של הודעות PDMS (איור 1 משלים) 11. לאחר קביעת שיאים פי קריטריונים מוגדרים מראש, דו"ח pdf סיכם פרמטרים של התכווצות לכל EHTs (איור 2 משלים).

יציבות מדידה לטווח ארוך

מדידה לטווח ארוך של EHTs בוצעה במצב מתמשך עם מדידה חוזרת אוטומטית בכל 20 דקות. ניתוח התכווצות לא הראו שינויים תלויי-זמן (מבחן פוסט עבור מגמה לינארית לא משמעותי) בתוקף התכווצות, פועם בתדר, T1 והתכווצות זמן או T2 בזמן רגיעה עד 20 h, מה שמעיד על רמה גבוהה של יציבות (איור 4). למרות כבכל מדגם ביולוגי, EHTs להראות רמה מסוימת של השתנות, כצפוי ביולוגי משכפלים. הווריאציה מקדמת לתחילה וסיום של צפחות ​​לטווח ארוכותrement היו 7/13% עבור כוח, 12/6% עבור התדר, 4/3% בזמן התכווצות 4/3% זמן הרפיה, בהתאמה (n = 4). השתנות זו בין משכפל הביולוגי אינה פועל יוצא של הכרת דמות או ניתוח כמו התוצאות עבור כל EHT יחיד לשחזור ויש השתנות נמוכה (איור 2 משלים).

הקרנת סמים

הקרנת סמים בוצעה בתמיסה של Tyrode סרום ללא. עקומות תגובת ריכוז המצטבר נוצרו עם ריכוז רכב DMSO מקסימלית של 0.1%. ניתוח התכווצות Baseline הראה סדירות מעט מאוד להכות דפוס השתנות נמוכה מאוד בין המשכפל. חשיפה ל E4031 חוסם ערוץ hERG הביאה הארכה משמעותית של זמן ההרפיה (T2) בשעת 10 ננומטר דפוס פועם סדיר בריכוזים גבוהים יותר (איור 5). עבור frequencניתוח התכווצות y נשלט, מדידות בוצעו אופציונלי עם גירוי חשמלי באמצעות אלקטרודות פחמן.

איור 1
איור 1: בידול לב. (א) אדם מושרה בתאי גזע פלוריפוטנטיים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (ב) גופים Embryoid בתחילת בידול mesodermal. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (ג) גופי embryoid מתקשר בסוף בידול לב. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (ד) אדם רקמות מהונדסות בלב. בר סולם = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: דור של Enginרקמת לב eered (EHT). (א) spacer PTFE. (ב) מתל PDMS. A, (B) בר סולם = 1 ס"מ (ג) צפה למעלה על באר של 24-היטב צלחת עם הליהוק עובש agarose לאחר הסרת spacer PTFE. (ד) צמד עמודים מהמדף PDMS מיקומו עובש הליהוק. (E) כינון תמהיל pipetted לתוך תבנית הליהוק וברחבי הודעות PDMS. (F) טרי שנוצר EHT ביום 0, הועבר צלחת תרבות חדשה עם המדיום. (G) שופץ EHT במדיום ביום 15. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: ניתוח התכווצות של רקמת לב הנדסי (EHT). (א) EHTמכשיר לניתוח עם מצלמה מבוקרת מחשב מעל הגז קאמרי דגירת בקרת טמפרטורה עם EHTs בצלחת 24-היטב בתרבות על גבי פנל LED. (ב) תצוגה בזמן אמת של EHT במהלך ניתוח עם תוכנת ניתוח התכווצות אוטומטית. (ג) דפוס כיווץ למופת מוצגות בכוח התכווצות לאורך זמן נמדד עם 100 פריימים שיא התכווצות סכמטי השני מוגדל, מוצגות הכוח פרמטר ניתוח, זמן הכיווץ (T1), זמן הרפיה (T2), מהירות הכיווץ (CV), מהירות הרפיה ( RV; דמות זו כבר נדפס מ 7 ו 27). ד"ה: פרמטרים לניתוח התכווצות. (ד) דוגמאות לרמות סינון שונות (קו מסונן כחול) המשפיעות על הכרת הדמות. משמאל: רמת סינון = 0. הערה ששום קו מסונן כחול גלוי, אבל רק את העקבות המקוריות האדומות. תיכון: רמת סינון = 3, מציין של ה הכרה / ניתוח אידיאליפסגות להתכווצות דואר. הערת רמת סינון = 20. כי הקווים הכחולים המסוננים הם הרבה יותר קטנים מאשר העקבות המקוריות מעיד ניתוח שיא התכווצות ירוד: נכון. (E) דוגמא של התכווצויות EHT בקצב לא סדירות נתחו עם סף כוח גבוה מדי (משמאל) סף כוח נמוך (מימין) עם כל הפסגות מוכרות. (F) דוגמאות עקבות של EHTs חשופים אגוניסט ערוץ נתרן ATX-II וכתוצאה מכך זמן רגיעה ממושכת עם מוקדם לאחר התכווצויות. שים לב שיא ההתכווצות הרביעי בלוח עזב אינו מוכר (לא ריבוע ירוק) בשל גורם מינימום נמוך מדי. (G) דוגמאות של פסגות כיווץ עם (פאנל מימין) וללא (פאנל מימין) עקומת ורוד (הנגזרת הראשונה של עקומת התכווצות, כיווץ והרפיה ומהירות). (H) סיכום המלצות פרמטר עבור בעכברים ו EHTs האנושי. שים לב הפרמטרים הללו עשויים להזדקק התאמה כשינויי דפוס כיווץ במהלך חשיפה לסמים (ראה E,F). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: בקרת זמן במהלך ארוכת טווח המדידה של מכות ספונטניות רקמה לב Engineered האנוש (EHT). בקרת זמן במהלך המדידה לטווח ארוך של להכות ספונטני רקמת לב מהונדסים האנושי (EHT). EHTs הוצב מכשיר ניתוח EHT וטופח במשך תקופה של 20 שעות. ניתוחים התכווצות אוטומטית בוצעו כל 20 דק 'עם פוסט-מבחן משמעותי ולא מגמה ליניארית (n = 4; נתונים מייצגים ממוצע + סטיית תקן). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

t = "איור 5" src = "/ files / ftp_upload / 55,461 / 55461fig5.jpg" />
איור 5: השפעת E4031 hERG ערוץ חוסם על רקמת לב Engineered אנוש (EHT).
(א) דפוס כיווץ למופת בתחילת המחקר. (ב) דפוס כיווץ למופת לאחר הדגירה ב 300 ננומטר E4031. (ג) השיא להתכווצות ממוצע (n = 4) של EHTs גירוי חשמלי בתחילת המחקר (שחור) ואחרי הדגירה 30 דקות ב 100 ננומטר E4031 (אדום). ניתוח עם 100 פריימים לשניים. (ד) עקומות תגובת ריכוז עבור E4031 להכות EHTs אדם ספונטני. הערה גודל האפקט קטן הארכה T2 ב EHTs גירוי חשמלי (C) לעומת EHTs פועם באופן ספונטני (D). One-way ANOVA, מדידות חוזרות עם שלאחר הבדיקה של Dunnett לעומת הבסיס; * P <0.05; n = 4. גורם "Z 25 עבור הארכה T2 ב E4031 300 ננומטר הוא 0.75."Target = 'pg _ blank'> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

בן אנוש עכברוש עכבר
תאים 26.4x10 6 10.8x10 6 18.0x10 6
2xDMEM [μL] 147 147 147
מטריקס קרום מרתף [μL] 264 - 264
Y-27,632 [μL] 2.6 - -
Fibrinogen [μL] 66.8 66.8 66.8
ECM [μL] מודעה 2640 מודעה 2640 מודעה 2640

טבלה 1: pipetting Scheme עבור P פיצוי של הכינון Mix עבור 24 אנוש, EHTs חולדה ועכבר. ריכוז Fibrinogen הוא 5 מ"ג / מ"ל ​​לכל EHTs. שים לב ריכוז התא שונה עבור כל זן. עבור EHTs אדם, להוסיף מטריצת קרום במרתף (למשל matrigel, ראה טבלת חומרים) ו Rho-kinase inhibitor Y-27,632 לתערובת. עבור EHTs עכבר, להוסיף מטריצת קרום במרתף. תלוי בריכוז ההתחלתי של תרחיף התאים, להוסיף ECM נוספת כדי להגיע בנפח כולל של תערובת כינון 2640 μL.

איור 1 משלים
איור 1 משלים: נוסחת החישוב עבור התכווצות חיל בהתבסס על הודעה הסטה 26. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

נַעֲרָה = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> איור 2 משלים
איור 2 משלים: קטע נתונים למופת מדווח ניתוח ההתכווצות של התוכנה.
פסגות התכווצות מעל 20 ימים של הזמן מוקלט עם 100 מסגרות / ים: Top (אדום: כוח כיווץ; ורוד: מהירות כיווץ). למטה: נתח פרמטר להתכווצות מראה מינימום, ממוצע, ערך מקסימאלי ואת סטיית התקן של 18 הפסגות להתכווצות נתחו מסומן עם ריבוע ירוק (עליונה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

רקמת לב מהונדסים מציעה אפשרות רבת ערך בתיבת כלי מחקר לב וכלי דם. EHTs בפורמט 24-היטב הוכיח יקר עבור מודלי מחלה 8, 14, הקרנת בטיחות תרופת 7, 8, 10, 11, 15, או למחקר קרדיו בסיסי 16, 17.

שינויים פוטנציאליים של פרוטוקולי EHT הבסיסיים כוללים מחקרים על אינטראקציה הסלולר עם תערובות מוגדרות של שריר לב ו-שריר לב לא 18 ושיפור afterload 14. היבטים חשובים לפתרון בעיות כוללים את איכות אוכלוסיית תא קלט ואיכות פיברינוגן. אם היווצרות הקריש הראשונית היא לא סדירה או לא קומפקטית מספיק כדי לדבוק to הודעות PDMS, או אם הג'ל הוא הידרדר במהירות תוך מספר ימים לאחר הטלת בשל ריכוז aprotinin נמוך, דור EHTs לא יהיה מוצלח.

המגבלות הבאות צריכות להיחשב. (ט) התפוקה בפורמט 24-היטב אינה מתאימה גם עבור התקנת הקרנה עיקרית, אבל הוא מספיק עבור מסך אישור משני. (Ii) על הצג המשולב של כוח, קינטיקה התכווצות ויש קצב סגולי נמוך, אשר מקשה לקשר לשינויים בכוח כדי מנגנונים מולקולריים ספציפיים. (Iii) בעוד פורמט תרבות 3D והמתיחה שהטילה הודעות PDMS מכופפות לשפר היבטים מורפולוגיים ופונקציונליים של התבגרות, חוסר דיסקי intercalated נכון, פועם ספונטני, ונמוך תגובות נורמליות אדרנרגיים עולה כי התבגרות לב מלאה אינה מושגת אך עם פרוטוקול זה. (iv) PDMS הוכח לספוג תרופות שונות שונים להאריך 19 ואת תרכיזי בפועל יעיליםיון על EHTs עשוי להשתנות. הטיה זו יכולה להיות בולטת יותר רעיל כרונית לומד 15 מאלה חוקרים תופעות סמים חריפות 7, 8 ו תלוי בבירור על התרופה בהישג היד. כתוצאה מכך, כל מתלת PDMS החשופה לסמים אמורה להיות מושלכת לאחר שימוש ואת ספיגת הפוטנציאל של תרופות שונות תצטרך להילקח בחשבון בעת ​​ניתוח הנתונים. (נ) בהתחשב בעובדה 1x10 6 hiPSCs נדרשים לכל EHT העלויות לכל נקודת נתונים גבוהות.

המשמעות של פרוטוקול זה לעומת ניתוח התכווצות vivo לשעבר לב היא הפוטנציאל לעבוד במערכת אנושית, חוסר מוזנח ניסיוני, ואת הייצור מתוקננת של EHTs המאפשר הקמת מחקרים גדולים על רקע גנטי ספציפי (דוגמנות מחלה למשל ). לשם השוואה למערכות בדיקת hiPSC אחרות (מערך אלקטרודות רב, עכבה), מערכת זו לנתחכוח של ההתכווצות כפרמטר הפיזיולוגי החשוב ביותר של שריר לב במבנה תלת ממדים ומאפשר טיפוח תחת עומס מוגדר. EHTs חוזה בקביעות לעבר כוח, תדר וקצב יציבים לאורך שעות רבות ושבועות, המאפשרים מדידות לטווח ארוכות והערכת הרעילות כרונית. ניתוח EHT יכול להתבצע תחת גירוי חשמלי אשר חשוב לגבי יחסי כוח בתדר של התכווצות שרירים והשפעה פוטנציאלית על שפעות תרופה. באשר למעמד בשלה של hiPSC-CM, גירוי חשמלי יש פוטנציאל לדחוף את התאים לקראת הפנוטיפ בוגרת יותר 20, 21 ו יכול להיכלל תחזוקה EHT. בנוסף, מערכת בדיקת EHT מספקת הודעה תכולה גבוהה כוללת כל הפרמטרים היסטולוגית הסטנדרטיים וכן ביוכימיה (RNA, DNA, בידוד חלבון) 11. יישומים עתידיים אפשריים כוללים היבטים של פיתוח התרופה (אימות היעד, פרמקולוגיה בטיחות) ו דוגמנות המחלה בפרט בשילוב עם קריספר / דור בתיווך Cas9 של בקרות isogenic.

במהלך התחזוקה של EHTs והביצועים של עקומות ריכוז התגובה, חשוב לעקוב אחרי ההוראות בקפידה עבור פרוצדורות תרבית תאים סטריליים כדי למנוע זיהומים פטרייתיים במהלך העברת מתלים PDMS בין צלחות 24-היטב. השלב הקריטי ביותר עם EHT אם כי, הוא פרוטוקול בידול cardiomyocyte. עבור EHTs ליצירת רצועות להכות שריר באופן קוהרנטי, אוכלוסיית הקלט חייבת להכיל לפחות 60% cardiomyocytes. למרבה המזל, פרוטוקולי הבידול הפכו יותר חזקים ויעילים לאורך השנים ואת שריר לב הוא זמין מסחרי על ידי חברה. תפקידיו של מיוציטים הלא בהתפתחות רקמת לב מהונדסת נגזרות hiPSC לא מובן לחלוטין, עדיין. ניסויים עם hiPSC-CM של טוהר גבוה הובילו EHT הטוב באופן מפתיעהתחת = "Xref"> 7, אבל השילוב של סוגי תאים אחרים לתוך הרקמה הוכח לשפר תפקוד רקמות ועלול לדחוף את הפנוטיפ לקראת פיזיולוגיה בוגרת 22, 23, 24. כפי ברקמות נוצרות בתוך בפורמט 24-היטב עם ממיליון תאים לכל רקמה, פלטפורמה זו עדיין די יקרה. ומקטינים לפורמט 96 היטב הוא שאף, אבל כל כך רחוק החוסן outbalances זה חיסרון. הפרוטוקול המובא בכתב היד הזה מבחינה טכנית מאוד חזק עם השתנות קטנה בין המשכפל. השתנות תוך יצווה הן נמוכות מאוד עבור קינטיקה (כלומר מקדמים שונים = 5%), גדולה וקצת עבור התדר הפועם הספונטני (כלומר מקדמים שונה 10%) וכוח ההתכווצות (כלומר מקדמים 17% וריאציה). הטכניקה היא מאוד חזקה. מעבר נסיינים שונים, היעיל לייצר להכות EHTs הוא> 90% של הידרוג'ל casted.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

IM, TE ו AH הם מהמייסדים של GmbH טכנולוגיות EHT, גרמניה.

Acknowledgments

המחברים מודים אלסנדרה מורטי דניס ושאדה עבור תרומה של חומר מסוגם. אנו מכירים את התמיכה הגדולה של קבוצת עבודה שב"ס EHT במחלקה לפרמקולוגיה ניסיוני טוקסיקולוגיה של צעידה נמרצת. עבודתם של המחברים נתמך על ידי תרומות של DZHK (מרכז גרמנית למחקר קרדיו) ומשרד הגרמנית לחינוך ולמחקר (BMBF), קרן המחקר הגרמנית (DFG Es 88 / 12-1, HA 3423 / 5-1 ), המרכז הלאומי הבריטי עבור החלפת חידוד & הפחתת בבעלי חיים למחקר (סדק IT NC3Rs להעניק 35,911-259,146), קרן הלב הבריטית RM / 13 / 30,157, המועצה האירופית למחקר (Advanced Grant IndivuHeart), קרן הלב גרמנית ואת פרייה und Hansestadt המבורג.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EHT analysis intrument EHT Technologies GmbH A0001 Software is included
EHT PDMS rack EHT Technologies GmbH C0001
EHT PTFE spacer EHT Technologies GmbH C0002
EHT electrode EHT Technologies GmbH P0001
EHT pacing adapter/cable EHT Technologies GmbH P0002
24-well-plate Nunc 144530
6 well-cell culture plate Nunc 140675
15 mL falcon tube, graduated  Sarstedt 62,554,502
Cell scraper Sarstedt 831,830
Spinner flask Integra 182 101
Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct  Thermo scientific 70101 Adjust rotor speed to 40 rpm
T175 cell culture flask  Sarstedt  831,812,002
V-shaped sedimentation rack  Custom made at UKE Hamburg na
10× DMEM Gibco 52100
1-Thioglycerol  Sigma Aldrich M6145
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt Sigma Aldrich 49752
Activin-A  R&D systems 338-AC
Agarose  Invitrogen 15510-019
Aprotinin Sigma Aldrich A1153
Aqua ad injectabilia Baxter GmbH 1428
B27 PLUS insulin  Gibco 17504-044
BMP-4 R&D systems 314-BP
Collagenase II  Worthington LS004176
DMEM Biochrom F0415
DMSO  Sigma Aldrich D4540
DNase II, type V (from bovine spleen) Sigma  D8764
Dorsomorphin  abcam ab120843
EDTA  Roth 8043.2
Fetal calf serum Gibco 10437028
FGF2 Miltenyi Biotec 130-104-921
Fibrinogen (bovine) Sigma Aldrich F8630
Geltrex  Gibco A1413302 For coating: 1:200 dilution
HBSS w/o Ca2+/Mg2+  Gibco 14175-053
HEPES  Roth 9105.4
Horse serum Life technologies 26050088
Human serum albumin  Biological Industries 05-720-1B
Insulin, human Sigma Aldrich I9278
L-Glutamin Gibco 25030-024
Lipidmix  Sigma Aldrich L5146
Matrigel BD Biosciences 354234 For EHT reconsitutionmix.
N-Benzyl-p-Toluenesulfonamide TCI B3082-25G
PBS w/o MgCl2/CaCl2 Biochrom 14190
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140
Pluronic F-127  Sigma Aldrich P2443
Polyvinyl alcohol  Sigma Aldrich P8136
RPMI 1640  Gibco 21875
Sodium selenite Sigma Aldrich S5261
TGFß1 Peprotech 100-21
Thrombin Sigma Aldrich T7513
Transferrin  Sigma Aldrich T8158
Y-27632 Biorbyt orb6014
hiPSC Custom made at UKE hamburg na
iCell cardiomyocytes kit Cellular Dynamics International CMC-100-010-001
Pluricyte cardiomyocyte kit Pluriomics PCK-1.5
Cor.4U - HiPSC cardiomyocytes kit Axiogenesis AG Ax-C-HC02-FR3
Cellartis cardiomyocytes Takara Bio USA, Inc. Y10075

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Laverty, H. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines? Br J Pharmacol. 163 (4), 675-693 (2011).
  2. Guidance for Industry S7B Nonclinical Evaluation of the Potential for Delayed Ventricular Repolarization (QT Interval Prolongation) by Human Pharmaceuticals. , U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. Available from: http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm074963.pdf (2005).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  4. Burridge, P. W. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  5. Kempf, H., Kropp, C., Olmer, R., Martin, U., Zweigerdt, R. Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Nat Protoc. 10 (9), 1345-1361 (2015).
  6. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
  7. Mannhardt, I. Human Engineered Heart Tissue: Analysis of Contractile Force. Stem Cell Reports. 7 (1), 29-42 (2016).
  8. Eder, A. Effects of proarrhythmic drugs on relaxation time and beating pattern in rat engineered heart tissue. Bas Res Cardiol. 109 (6), 436 (2014).
  9. Stöhr, A. Contractile abnormalities and altered drug response in engineered heart tissue from Mybpc3-targeted knock-in mice. J Mol Cell Cardiol. 63, 189-198 (2013).
  10. Schaaf, S. Human Engineered Heart Tissue as a Versatile Tool in Basic Research and Preclinical Toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397 (2011).
  11. Hansen, A. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ Res. 107 (1), 35-44 (2010).
  12. Frank, S., Zhang, M., Schöler, H. R., Greber, B. Small molecule-assisted, line-independent maintenance of human pluripotent stem cells in defined conditions. PloS One. 7 (7), e41958 (2012).
  13. Lanier, M. Wnt inhibition correlates with human embryonic stem cell cardiomyogenesis: A structure-activity relationship study based on inhibitors for the Wnt response. J Med Chem. 55 (2), 697-708 (2012).
  14. Hirt, M. N. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: a new in vitro model. Bas Res Cardiol. 107 (6), 307-323 (2012).
  15. Jacob, F. Analysis of Tyrosine Kinase Inhibitor-Mediated Decline in Contractile Force in Rat Engineered Heart Tissue. PLoS One. 11 (2), e0145937 (2016).
  16. Friedrich, F. W. Evidence for FHL1 as a novel disease gene for isolated hypertrophic cardiomyopathy. Hum Mol Genet. 21 (14), 3237-3254 (2012).
  17. Crocini, C. Impact of ANKRD1 mutations associated with hypertrophic cardiomyopathy on contraction parameters of engineered heart tissue. Bas Res Cardiol. 108 (3), 349 (2013).
  18. Fiedler, J. Development of Long Noncoding RNA-Based Strategies to Modulate Tissue Vascularization. J Am Coll Cardiol. 66 (18), 2005-2015 (2015).
  19. van Meer, B. J. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochem Biophysl Res Commun. , (2016).
  20. Godier-Furnémont, A. F. G. Physiologic force-frequency response in engineered heart muscle by electromechanical stimulation. Biomaterials. 60, 82-91 (2015).
  21. Eng, G. Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Commun. 7, 10312 (2016).
  22. Huebsch, N. Miniaturized iPS-Cell-Derived Cardiac Muscles for Physiologically Relevant Drug Response Analyses. Sci Rep. 6 (24726), 1-12 (2016).
  23. Masumoto, H. The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages. Sci Rep. 6 (29933), 1-10 (2016).
  24. Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac Non-myocyte Cells Show Enhanced Pharmacological Function Suggestive of Contractile Maturity in Stem Cell Derived Cardiomyocyte Microtissues. Toxicol Sci. 152 (1), 99-112 (2016).
  25. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenbutg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  26. Vandenburgh, H. Durg-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
  27. EHT Technologies GmbH. , Available from: http://www.eht-technologies.com Forthcoming.

Tags

Bioengineering גיליון 122 רקמת לב מהונדסים שריר הלב הנדסת רקמות בידול לב בטיחות התרופה פרמקולוגיה
ניתוח התכווצות האוטומטי של רקמת לב Engineered האנוש להקרנת בטיחות תרופת לב
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mannhardt, I., Saleem, U., Benzin,… More

Mannhardt, I., Saleem, U., Benzin, A., Schulze, T., Klampe, B., Eschenhagen, T., Hansen, A. Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening. J. Vis. Exp. (122), e55461, doi:10.3791/55461 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter