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Bioengineering

कार्डिएक औषधि सुरक्षा स्क्रीनिंग के लिए मानव इंजीनियर हृदय के ऊतकों की स्वचालित संकुचन विश्लेषण

Published: April 15, 2017 doi: 10.3791/55461
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Experimental Pharmacology and Toxicology, Cardiovascular Research Center, University Medical Center Hamburg-Eppendorf and DZHK (German Center for Cardiovascular Research)

Summary

यहाँ, हम मानव इंजीनियर हृदय के ऊतकों की पीढ़ी को दिखाने प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSC) cardiomyocytes व्युत्पन्न से। हम hERG चैनल अवरोध करनेवाला ई 4031 से संकुचन बल और संकुचन पैटर्न का अनुकरणीय परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। इस विधि मजबूती और हृदय दवा स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्तता के उच्च स्तर को दर्शाता है।

Abstract

कार्डिएक ऊतक इंजीनियरिंग तकनीक का वर्णन तीन आयामी बल पैदा करने के लिए इंजीनियर के ऊतकों का गठन करने के। बुनियादी अनुसंधान और पूर्व नैदानिक ​​दवा के विकास में इन प्रक्रियाओं के कार्यान्वयन के लिए, यह मानकीकृत परिस्थितियों में स्वचालित पीढ़ी और विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है। यहाँ, हम एक तकनीक पेश विभिन्न प्रजातियों (चूहा, माउस, मानव) के cardiomyocytes से इंजीनियर हृदय के ऊतकों (EHT) उत्पन्न करने के लिए। तकनीक एक फाइब्रिन-जेल में एक 24 अच्छी तरह प्रारूप में लोचदार polydimethylsiloxane (PDMS) पोस्ट के बीच अलग cardiomyocytes युक्त की विधानसभा पर निर्भर करता है। तीन आयामी, बल पैदा करने EHTs डालने के बाद दो सप्ताह के भीतर का गठन। (0.4-1.0 x 10 6 / EHT) यह प्रक्रिया प्रति सप्ताह कई सौ EHTs की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है और तकनीकी रूप से cardiomyocytes की उपलब्धता के आधार पर ही सीमित है। auxotonic मांसपेशी संकुचन का मूल्यांकन एक mechan के साथ एक संशोधित ऊष्मायन कक्ष में किया जाता है24-अच्छी तरह से प्लेटों के लिए iCal आलिंगन और एक कैमरा इस कक्ष के शीर्ष पर रखा। एक सॉफ्टवेयर को नियंत्रित करता है एक कैमरा प्रत्येक EHT के लिए एक XYZ अक्ष सिस्टम पर ले जाया गया। EHT संकुचन एक स्वचालित आंकड़ा मान्यता एल्गोरिथ्म द्वारा पता लगाया जाता है, और बल EHT की कमी और लोचदार प्रवृत्ति और PDMS पदों की ज्यामिति के आधार पर गणना की जाती है। यह प्रक्रिया मानकीकृत और बाँझ शर्तों के तहत EHT की अत्यधिक संख्या के स्वचालित विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। cardiomyocyte संकुचन पर दवा प्रभाव के विश्वसनीय पता लगाने हृदय दवा के विकास और सुरक्षा के औषध विज्ञान के लिए महत्वपूर्ण है। हम hERG चैनल अवरोध करनेवाला ई 4031 के उदाहरण के साथ, प्रदर्शित, कि मानव EHT प्रणाली मानव हृदय के संकुचन गतिकी पर दवा प्रतिक्रियाओं प्रतिकृति, जो यह दर्शाता है कि यह हृदय दवा सुरक्षा जांच के लिए एक आशाजनक उपकरण होने के लिए।

Introduction

इस तरह के दवा प्रेरित लंबे क्यूटी सिंड्रोम के रूप में कार्डिएक दुष्प्रभाव पिछले वर्षों में बाजार निकासी हुई है। सांख्यिकी संकेत मिलता है कि सभी निकासी का लगभग 45% हृदय प्रणाली 1 पर अवांछित प्रभाव की वजह से कर रहे हैं। महंगा विकास की प्रक्रिया और अनुमोदन के बाद यह दवा विफलता दवा कंपनियों के लिए बुरी से बुरी हालत है। अनुसंधान और विकास विभागों इसलिए जल्दी पर इस तरह के अवांछित हृदय प्रभाव का पता लगाने पर ध्यान केंद्रित। आर्थिक और नैतिक चिंताओं, पशु प्रयोगों को कम करने और उन्हें नए इन विट्रो स्क्रीनिंग assays के साथ बदलने के प्रयासों के लिए चल रही है।

स्थापित assays का एक सेट संयुक्त राज्य अमेरिका के खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) और यूरोपीय औषधि एजेंसी (EMA) proarrhythmic दवा प्रभाव 2 के पूर्व नैदानिक मूल्यांकन के लिए दिशा-निर्देशों में शामिल हैं। दैहिक कोशिकाओं प्रोग्रामिंग की तकनीक के भेदभाव के बादमानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSC) इस शोध क्षेत्र 3 बढ़ाया। अब यह इन विट्रो में मानव cardiomyocytes पर नई दवा उम्मीदवारों स्क्रीन करने के लिए संभावना प्रदान करता है और अंतर-प्रजाति अंतर के साथ मुद्दों से बचा जाता। हाल ही हृदय भेदभाव प्रोटोकॉल 4, 5 नैतिक चिंता के बिना cardiomyocytes की असीमित की आपूर्ति प्रदान करते हैं। हालांकि, सिकुड़ा बल, सबसे महत्वपूर्ण और सबसे अच्छा cardiomyocytes के विवो पैरामीटर में विशेषता के माप, अच्छी तरह से स्थापित नहीं है। यह के रूप में वयस्क cardiomyocyte की तुलना में मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न cardiomyocytes (hiPSC-मुख्यमंत्री) के रिश्तेदार अपरिपक्वता 6 से संबंधित है। एक संभावित उन्नति एकल कोशिकाओं 7 (इंजीनियर हृदय के ऊतकों, EHT) से 3 आयामी हृदय के ऊतकों के निर्माण के लिए है। EHT प्रोटोकॉल एक murine या मानव cardiomyocytes 8 embedding पर आधारित है sup>, 9, 10 दो लचीला polydimethylsiloxane (PDMS) पदों 24-अच्छी तरह प्रारूप में 11 के बीच फाइब्रिन हाइड्रोजेल में। कुछ ही दिनों बाद cardiomyocytes एकल कोशिकाओं के रूप में अनायास अनुबंध करने के लिए शुरू करते हैं और सेलुलर नेटवर्क बनाने के लिए शुरू करते हैं। 7-10 दिनों के बाद, पूरे ऊतक के स्थूल संकुचन दिखाई दे रहे हैं। इस प्रक्रिया के दौरान बाह्य मैट्रिक्स पुन: बनाया जाता है, जो व्यास और लंबाई की कमी हो जाती है। PDMS के झुकने में EHT परिणाम की कमी बाकी के दौरान भी पोस्ट, निरंतर लोड करने के लिए विकसित करने EHT में cardiomyocytes विषय। EHTs कई हफ्तों से अधिक auxotonic मांसपेशी संकुचन प्रदर्शन जारी। मानव EHTs दवा स्क्रीनिंग और रोग मॉडलिंग 7 के लिए उनकी उपयुक्तता का संकेत शारीरिक और औषधीय उत्तेजना के लिए प्रतिक्रियाओं दिखा।

इस पांडुलिपि में हम generati के लिए एक मजबूत और आसान प्रोटोकॉल पेशमानव EHT, और hERG चैनल अवरोधकों की उपस्थिति में संकुचन पैटर्न की एकाग्रता निर्भर परिवर्तन की स्वचालित सिकुड़ना विश्लेषण के पर।

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Protocol

ध्यान दें: निम्न चरणों के एक सेल संस्कृति प्रोटोकॉल का वर्णन। कृपया बाँझ शर्तों के तहत प्रदर्शन करने और पूर्व गर्म मीडिया का उपयोग करें।

1. hiPSC की कार्डिएक विभेदन

  1. hiPSC खेती
    1. कोट 6 अच्छी तरह से प्लेटों (1 एमएल / अच्छी तरह से) या T75 बोतल (7 एमएल / कुप्पी) कम वृद्धि कारक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ (जैसे geltrex, 1: 200, सामग्री की तालिका देखें) Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम में पतला (DMEM) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट। मिश्रण से FTDA मध्यम 12 तैयार बुनियादी DMEM / F-12 2 मिमी एल Glutamine, 0.5% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 5 मिलीग्राम / एल transferrin, 5 माइक्रोग्राम / एल सेलेनियम, 0.1% मानव सीरम albumin, 1x लिपिड मिश्रण, 5 के साथ मध्यम मिलीग्राम / एल इंसुलिन, 50 एनएम dorsomorphin, 2.5 एनजी / एमएल activin ए, 0.5 एनजी / एमएल मानव TGFß1 30 एनजी / एमएल FGF2।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, दैनिक मध्यम परिवर्तन के साथ 21% हे 2 (पर बीज hiPSC (~ 3 x 10 5/10 सेमी ²) FTDA मध्यम और संस्कृति मेंचित्रा 1 ए)। (: 2-1: 6 1) (; 0.5 मिमी, ऊष्मायन समय ~ 4 मिनट EDTA) इथाइलीन diamine tetraacetic एसिड के साथ 80% confluency, पारित होने पर।
  2. Embryoid निकायों का गठन (ईबी)
    1. उच्च घनत्व के T75 बोतल में hiPSC खेती।
      1. कैल्शियम और मैग्नीशियम (पीबीएस) के बिना फॉस्फेट खारा बफर के साथ दो बार संगामी कोशिकाओं के साथ बोतल धो लें और ~ के लिए 10 मिनट में 0.5 मिमी EDTA में सेते हैं। यकीन है कि कोशिकाओं कुप्पी के नीचे से अलग नहीं करते हैं।
      2. कांच विंदुक के साथ EDTA निकालें, कोशिकाओं को अलग करने के लिए बेंच पर 10 एमएल पीबीएस के साथ कोशिकाओं, नल बोतल बंद फ्लश।
        ध्यान दें: उपयोग सेल स्क्रेपर यदि आवश्यक हो तो।
      3. 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा मात्रा का ¼ जोड़ने (जैसे 10 एमएल RMPI 40 एमएल सेल निलंबन के लिए) 1640 RPMI मध्यम (या किसी अन्य मानक माध्यम 1.8 मिमी कैल्शियम युक्त) 5 मिनट के लिए 250 XG पर और अपकेंद्रित्र।
    2. FTDA माध्यम में Resuspend सेल गोली 4 मिलीग्राम / एमएल polyvinyl शराब (PVA) के साथ पूरक और10 माइक्रोन Y27632 और एक Neubauer कक्ष में कोशिकाओं गिनती।
    3. सेल निलंबन के साथ स्पिनर कुप्पी भरें (30 x 10 6 कोशिकाओं / 100 एमएल FTDA मध्यम PVA और वाई 27,632 के साथ पूरक, कदम 1.2.2 देखें) और स्पिनर बोतल में ईबी गठन आरंभ (40 आरपीएम के लिए चुंबकीय उत्तेजक के रोटर गति को समायोजित ) सेल संस्कृति इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 5% हे 2) रात में में।
  3. mesodermal भेदभाव
    1. ईबी गठन के दौरान, कोट सेल संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस पर गैर ईओण पृष्ठसक्रियकारक (14 एमएल / T175) रात में साथ निलंबन संस्कृति के लिए उपयुक्त बोतल।
    2. अगली सुबह, पृष्ठसक्रियकारक में लिपटे बोतल पीबीएस (30 एमएल / T175) के साथ दो बार धोएं। पीबीएस फिर से जोड़ें और जब तक जरूरत इनक्यूबेटर में रखने के लिए।
    3. इनक्यूबेटर से स्पिनर कुप्पी निकालें।
      नोट: सेल निलंबन छोटे macroscopically दिखाई ईबीएस (चित्रा 1 बी) के साथ स्पष्ट किया जाना चाहिए।
    4. एक 50 एमएल शंक्वाकार टब के लिए 50 एमएल निलंबन स्थानांतरणई और जाने ईबीएस 5-20 मिनट के लिए समझौता।
    5. तैरनेवाला निकालें और RPMI 1640 के 7 एमएल 2% PVA और 10 माइक्रोन वाई 27,632 के साथ पूरक के साथ गोली धोने। एक स्नातक की उपाधि प्राप्त 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब और अनुमान ईबी मात्रा (~ 50-100 μL) करने के लिए स्थानांतरण निलंबन।
    6. uncoated T175 बोतल के लिए स्पिनर बोतल की सामग्री स्थानांतरण और 20 मिनट के लिए अवसादन के लिए वी के आकार का रैक पर इस छोड़ दें। तैरनेवाला निकालें और के रूप में ऊपर कहा गया है embryoid निकायों धोने। 200 से अधिक एमएल के साथ T175 कुप्पी भर अवसादन के रूप में बहुत लंबा ले जाएगा मत करो। प्रारंभिक स्पिनर कुप्पी मात्रा 200 एमएल से अधिक है, कई T175 बोतल के ईबी निलंबन विभाजित है और धोने के बाद फिर से ईबीएस गठबंधन।
    7. mesodermal भेदभाव के लिए माध्यम में कपड़े धोने की मध्यम और resuspend निकालें, कि RPMI 4 मिलीग्राम / एमएल PVA, 0.5% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 10 मिमी के साथ पूरक है 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES), 0.05% मानव सीरम एल्बुमिन, 5 माइक्रोग्राम / एमएल transferrin, 5 एनजी / एमएल सोडियम Selenite, 0.1% लिपिड मिश्रण, 250 माइक्रोन phospho-एस्कॉर्बेट, 10 माइक्रोन वाई 27,632, 10 एनजी / मल बोन morphogenic प्रोटीन -4 (बीएमपी -4), और 3 एनजी / एमएल activin ए, 5 एनजी / एमएल स्थिर FGF2।
    8. पृष्ठसक्रियकारक में लिपटे T175 बोतल से पीबीएस निकालें और सेल निलंबन (40 एमएल में 200 μL EBS) से भरना। छोटे ईबी मात्रा के लिए छोटे बोतल का उपयोग करें।
    9. तीन दिन (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 5% हे 2) के लिए निलंबन में ईबीएस खेती। एक्सचेंज (कदम 1.3.7 में के रूप में ही रचना) मध्यम के 50% हर दिन (प्रयोग वी के आकार का अवसादन रैक)। मध्यम हर दिन खिला करने से पहले ताजा तैयार करें।
  4. कार्डिएक भेदभाव
    1. नई पृष्ठसक्रियकारक में लिपटे वाहिकाओं दिन से पहले तैयार करें और इसके बाद के संस्करण (1.3.2) ने कहा संभाल।
    2. mesodermal प्रेरण के तीन दिनों के बाद, ईबीएस अवसादन रैक पर अप करने के लिए 5 मिनट के लिए समझौता करते हैं। मध्यम के सबसे निकालें और 1640 RPMI के साथ 0.5% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 10 मिमी HEPES पूरक के साथ धोएं।
    3. स्थानांतरण 10 स्नातक की उपाधि प्राप्त करने के लिए ईबी निलंबन की एमएल15 एमएल ट्यूब और अनुमान ईबी अवसादन के बाद मात्रा।
    4. Resuspend ईबीएस हृदय भेदभाव माध्यम में ध्यान से 1640 RPMI से मिलकर साथ 0.5% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 10 मिमी HEPES, 0.05% मानव सीरम albumin, 5 माइक्रोग्राम / एमएल transferrin, 5 एनजी / एमएल सोडियम Selenite, 0.1% लिपिड मिश्रण, 250 सुक्ष्ममापी phospho पूरक -ascorbate, 1 माइक्रोन वाई 27,632, 100 एनएम Wnt-अवरोध करनेवाला डी एस मैं-7 13।
    5. नई पृष्ठसक्रियकारक में लिपटे सेल संस्कृति बोतल पर स्थानांतरण ईबीएस (~ 46 एमएल / T175 में 200 μL EBS)।
    6. 50% मध्यम परिवर्तन के साथ तीन दिन (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 21% हे 2) के लिए सेते दूसरे और तीसरे दिन पर (मध्यम रचना कदम 1.4.4 देखें)। पहले 48 घंटे के भीतर मध्यम परिवर्तित न करें।
    7. माध्यम में सेते RPMI 1640 500 माइक्रोन 1-Thioglycerol, 10 मिमी HEPES, 0.5% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1 माइक्रोन वाई 27,632, 2% सीरम मुक्त तंत्रिका कोशिका संवर्धन के पूरक (जैसे B27) इंसुलिन के साथ, 100 एनएम Wnt के साथ पूरक से मिलकर -inhibitor डी एस मैंअगले चार दिनों के लिए 50% माध्यम की दैनिक विनिमय के साथ -7। ईबीएस इस अवधि के भीतर पिटाई शुरू कर देना चाहिए।
    8. हृदय भेदभाव के एक सप्ताह के बाद, Wnt निषेध के बिना और सीरम मुक्त तंत्रिका कोशिका संवर्धन पूरक के साथ एक ही माध्यम के लिए स्विच। मध्यम के 50% हर दिन के बदले, पहले दिन के लिए छोड़कर।
  5. मानव cardiomyocytes की हदबंदी
    ध्यान दें: भेदभाव प्रोटोकॉल के दो सप्ताह के बाद, ईबीएस सहज संकुचन (चित्रा 1C) दिखाना चाहिए। यदि हां, तो पृथक्करण शुरू करने और कोलैजिनेज़ समाधान तैयार करते हैं।
    1. वजन और कैल्शियम / मैग्नीशियम के बिना कैल्शियम मुक्त हैंक्स संतुलित नमक के घोल में 200 यू / एमएल सुलझाने (HbSS) द्वारा कोलैजिनेज़ समाधान तैयार और 1 मिमी HEPES, 10 माइक्रोन वाई 27,632, 30 माइक्रोन एन बेंजाइल-पी टोल्यूनि sulphonamide जोड़ने ( बीटीएस)। -20 डिग्री सेल्सियस पर छानने (0.2-सुक्ष्ममापी फिल्टर) और दुकान aliquots द्वारा नसबंदी। रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर aliquots पिघलना।
    2. अवसादन रैक पर ईबीएस का निपटान करें,महाप्राण मध्यम और 20-25 एमएल पूर्व गर्म HBSS के साथ बदलें। इस धोने कदम एक बार फिर दोहराएँ।
    3. महाप्राण HBSS और पूर्व गर्म कोलैजिनेज़ समाधान (15 एमएल / T175) के साथ बदलें। सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 4 घंटे (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 21% हे 2) के लिए सेते हैं।
    4. DMEM के साथ 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और DNase (12 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ पूरक अवरुद्ध बफर तैयार करें।
    5. बेंच पर सेल संस्कृति बोतल टैप करें, अलग ईबीएस बिखर और अलग गिर चाहिए (यदि नहीं, ऊष्मायन समय में वृद्धि)। धीरे महीन चुर्ण बनाना कोशिका निलंबन और एक शंक्वाकार 50 एमएल ट्यूब को हस्तांतरण। बफर (15 एमएल / T175) अवरुद्ध साथ बोतल धो लें और ट्यूब को हस्तांतरण।
    6. 100 x जी पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। गर्म DMEM, महीन चुर्ण में कोशिकाओं Resuspend और कोशिकाओं गिनती।

2. इंजीनियर हृदय के ऊतकों की पीढ़ी (EHT)

  1. आटोक्लेव व्यावसायिक रूप से उपलब्ध PDMS रैक और polytetrafluorethylene (PTFE) स्पेसर (सामग्री देख सकते हैं औरउपकरण स्प्रेडशीट; चित्रा 2) और बाँझ शर्तों के तहत निम्न समाधानों को तैयार, एक दिन EHT पीढ़ी से पहले।
    1. वजन और पीबीएस, आटोक्लेव के उचित मात्रा में भंग द्वारा 2% agarose तैयार, तुरंत 60 डिग्री सेल्सियस पर दुकान।
    2. aprotinin तैयार (33 मिलीग्राम / एमएल) वजन और एक्वा विज्ञापन iniectabilia की उचित मात्रा में भंग द्वारा, -20 डिग्री सेल्सियस पर फ़िल्टर कर बाँझ (0.22-सुक्ष्ममापी फिल्टर), विभाज्य और दुकान।
    3. -20 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ 0.9% सोडियम क्लोराइड (गुनगुना), विभाज्य और दुकान की उचित मात्रा में बाँझ फाइब्रिनोजेन भंग द्वारा फाइब्रिनोजेन (200 मिलीग्राम / एमएल) तैयार करें।
    4. तीन भागों में बाँझ थ्रोम्बिन भंग द्वारा थ्रोम्बिन (100 यू / एमएल) तैयार -20 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस और 2 भागों एक्वा विज्ञापन iniectabilia, छोटे ट्यूबों में 3 μL के विभाज्य भागों और दुकान बाँझ।
    5. 5 एमएल एक्वा विज्ञापन iniectabilia में 670 मिलीग्राम 10x DMEM पाउडर भंग द्वारा 10x DMEM तैयार, 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ और दुकान को फ़िल्टर।
    6. 2x DMEM तैयार2 एमएल गर्मी निष्क्रिय घोड़े सीरम, 0.2 एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 5.8 एमएल एक्वा विज्ञापन iniectabilia के साथ 2 एमएल 10x DMEM मिश्रण से, 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ और दुकान को फ़िल्टर।
    7. तैयार EHT कास्टिंग 4 डिग्री सेल्सियस पर 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण बछड़ा सीरम, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 1% एल glutamine (200 मिमी), दुकान के साथ DMEM मिश्रण से मध्यम (ईसीएम)।
  2. 1.6 एमएल गर्म agarose (2%, पीबीएस) pipetting और कुओं में PTFE स्पेसर (चित्रा 2A) रखकर 24-अच्छी तरह से प्लेटों में कास्टिंग नए नए साँचे तैयार करें।
    नोट: प्लेस स्पेसर तुरंत 8 कुओं की एक अधिकतम में pipetting के बाद - agarose बहुत तेजी से सशक्त बनाता। लंबे समय तक की तुलना में 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर agarose मत छोड़ो।
  3. Agarose solidification (~ 10 मिनट, agarose अपारदर्शी हो जाएगा) के बाद, PTFE स्पेसर (चित्रा 2C) को हटाने और कास्टिंग नए नए साँचे में PDMS रैक (चित्रा 2 बी) को जगह तो यह है कि PDMS पदों की जोड़ी एक-मोल्ड (चित्रा 2 डी) में पहुंच जाते हैं।
    4. 6 कोशिकाओं / एमएल की एक न्यूनतम एकाग्रता के साथ ईसीएम में cardiomyocytes Resuspend।
  4. , Ice.For 24 EHTs पर एक दौर नीचे 15 एमएल ट्यूब में पुनर्गठन मिश्रण की अनुमानित मात्रा की 110% तैयार मानव, चूहे या माउस cardiomyocytes के लिए तालिका 1 में सूचीबद्ध पुनर्गठन मिश्रण पिपेट, क्रमशः (10% अतिरिक्त शामिल है)।
    नोट: पुनर्गठन मिश्रण की सेल एकाग्रता मानव (10 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल), चूहे (4.1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल) और माउस (6.8 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल) EHTs के लिए अलग है। सेल निलंबन की एकाग्रता के आधार पर, 2,640 μL के अंतिम मात्रा करने के लिए अतिरिक्त ईसीएम जोड़ें। फाइब्रिनोजेन pipetting के लिए गुनगुना हो गया है। धीरे धीरे pipet की नोक भरने और जब पुनर्गठन मिश्रण करने के लिए फाइब्रिनोजेन जोड़ने फाइब्रिनोजेन युक्त pipet के साथ ठंड पुनर्गठन मिश्रण की सतह को स्पर्श नहीं करते - विंदुक टिप में फाइब्रिनोजेन का चिपचिपापन तुरंत वृद्धि होगी।
  5. पुनर्गठन मिश्रण Triturate 10 - फाइब्रिनोजेन थक्का जब तक एक सीरम वैज्ञानिक विंदुक के साथ 15 बार भंग हो जाता है। एकरूपता के लिए पिपेट में पुनर्गठन मिश्रण की जाँच करें।
  6. एक थ्रोम्बिन विभाज्य (200 μL ट्यूब में 3 μL) में प्रत्येक EHT, pipet 100 μL पुनर्गठन तालमेल के लिए, मिश्रण और संभव (चित्रा 2 ई) के रूप में के रूप में जल्दी agarose-स्लॉट में मिश्रण pipet। प्रत्येक EHT के लिए एक नया फिल्टर टिप का उपयोग करें। हर 8 EHTs के बाद पुनर्गठन मिश्रण (सीरम वैज्ञानिक पिपेट 5-10 गुना के साथ विचूर्णन) Resuspend।
  7. एक बार सभी स्लॉट पुनर्गठन मिश्रण से भर रहे हैं, सेल संस्कृति पकवान का ढक्कन बंद और 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 7% सीओ 2 में सेते हैं।
  8. एक बाँझ हुड के नीचे इनक्यूबेटर और जगह से थाली निकालें। प्रत्येक अच्छी तरह से मध्यम की एक छोटी राशि (जैसे DMEM, लगभग 200 - 500 μL) कवर, धीरे थाली हिला और कम से कम 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर फिर से सेते हैं। DMEM के अलावा agarose कास्टिंग नए नए साँचे से फाइब्रिन जैल से हटाने को कम करेगा। अच्छी तरह से 10% गर्मी निष्क्रिय घोड़े सीरम, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 10 माइक्रोग्राम / एमएल इंसुलिन, 33 माइक्रोग्राम / एमएल aprotinin साथ पूरक DMEM से मिलकर प्रति 1.5 एमएल EHT-मध्यम के साथ एक नया 24-अच्छी तरह से थाली तैयार करें।
  9. ध्यान से agarose कास्टिंग नए नए साँचे से PDMS रैक निकालने और उन्हें मध्यम से भरे 24-अच्छी तरह से थाली (चित्रा 2F) को स्थानांतरित। पकवान इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 7% सीओ 2, मानव और चूहे EHTs के लिए 40% हे 2, माउस EHTs के लिए 21% हे 2) और फ़ीड सोमवार, बुधवार और ताज़ा तैयार EHT-माध्यम के साथ शुक्रवार को में वापस रखें। EHTs 7-10 दिनों के कास्टिंग (चित्रा -1 डी, 2 जी) के बाद PDMS रैक के पदों विचलन सहज संकुचन को दिखाना चाहिए।
    1. माउस के लिए EHTs fibroblast प्रसार को सीमित करने के 48 घंटे के लिए कल्चर माध्यम से 25 माइक्रोग्राम / 5-साइटोसिन βDarabinofuranoside की एमएल जोड़ें।

3. संकुचन विश्लेषण

नोट: संकुचन विश्लेषण पर आधारित हैवीडियो ऑप्टिकल एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध EHT विश्लेषण साधन में रिकॉर्डिंग (सामग्री की तालिका देखें)। इस उपकरण की केंद्रीय इकाई एक ऊष्मायन चैम्बर (चित्रा 3 ए) है। साधन के साथ प्रदान की सॉफ्टवेयर में जाना जाता है लोचदार मापांक और ज्यामिति 11 (पूरक चित्रा 1) के साथ PDMS पदों के विक्षेपन के आधार पर संकुचन बल गणना करता है।

  1. मशीन 2 घंटे माप करने से पहले की हीटिंग उपकरण चालू करें। संकुचन विश्लेषण के ठीक पहले गैस की आपूर्ति और अक्ष प्रणाली के इलेक्ट्रॉनिक आपूर्ति चालू करें।
  2. आधारभूत रिकॉर्डिंग (विश्लेषण में संदर्भ बिंदु) के लिए, EHT विश्लेषण साधन में EHT-माध्यम में EHTs के साथ 24 अच्छी तरह से थाली जगह है और आपूर्तिकर्ता पुस्तिका के अनुसार संकुचन विश्लेषण सॉफ्टवेयर शुरू करते हैं।
    1. सही पैनल पर "प्रोटोकॉल" टैब पर क्लिक करें और अध्ययन का नाम, उपयोगकर्ता, प्रजातियां, ce के बारे में प्रासंगिक जानकारी दर्जडालूँगा प्रकार, उम्र, रिकॉर्डिंग लंबाई और अतिरिक्त टिप्पणी।
    2. बाएं फलक पर "कैमरा दृश्य" टैब पर क्लिक करके स्वत: आंकड़ा पता लगाने मोड के साथ कैमरा लाइव मोड शुरू करते हैं। xyz के साथ कैमरे की स्थिति निर्देशांक andadjust प्रत्येक के लिए 24-अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से सही पैनल पर "सेटअप" टैब पर क्लिक करें। सुनिश्चित करें कि EHT खिड़की के केंद्र में है और कैमरे के ध्यान में है।
      1. यकीन है कि के रूप में यह आंकड़ा मान्यता और संकुचन विश्लेषण ख़राब होगा सेल संस्कृति डिश के ढक्कन धूमिल न हो।
        ध्यान दें: आंकड़ा मान्यता एल्गोरिथ्म उच्च विपरीत क्षेत्रों का पता लगाने और स्थिति में अपने परिवर्तन की निगरानी पर आधारित है। सॉफ्टवेयर में यह आंकड़ा मान्यता के इन क्षेत्रों एक नीले पार कि EHT के संकुचन के साथ चलता है के साथ चिह्नित किया जाएगा।
      2. सुनिश्चित करें कि नीले पार की स्थिति EHTs के दोनों ऊपर और नीचे सिरों पर कर रहे हैं और केवल खड़ी EHTs (चित्रा 3 बी) के संकुचन मिलान बढ़ करें। एस"स्थिति ठीक" बटन दबाकर प्रत्येक अच्छी तरह से एवेन्यू सेटअप पदों।
    3. इसके बाद, बाएं फलक पर "पैरामीटर" टैब पर क्लिक करें। मापदंडों यहाँ प्रदर्शित मापदंड है जिसके द्वारा सॉफ्टवेयर एक संकुचन शिखर को दिखाता है और एक हरे वर्ग के साथ यह निशान परिभाषित करते हैं। ये मान संकुचन चोटियों (चित्रा -3 सी) और कोई झूठी डेटा बिंदुओं (चित्रा 3E-एफ) की सही पहचान के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैं।
      नोट: प्रजातियों निर्भर मापदंडों और उदाहरण की एक सूची चित्रा 3H में दिखाया गया है। अधिक जानकारी के लिए, सॉफ्टवेयर मैनुअल देखें।
    4. सही पैनल पर "स्वचालित" टैब पर क्लिक करें और "प्रारंभ" बटन को सक्रिय द्वारा विश्लेषण आरंभ करें। सॉफ्टवेयर अगले, रिकॉर्ड EHT संकुचन करने के लिए एक अच्छी तरह से से क्रमिक रूप से ले जाने और रिकॉर्डिंग (बाएं फलक पर "वास्तविक समय" टैब में दिखाया गया है) के दौरान बल की गणना करेगा। विश्लेषण, एक पीडीएफ रिपोर्ट के अंत में summariपरिणाम zing बना दी जाएगी।
  3. सहेजें और पीडीएफ परिणामों को संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए उत्पन्न प्रणाली की रिपोर्ट का विश्लेषण।
  4. कुछ दिनों में दोहराया माप से सिकुड़ा मानकों की निगरानी करें। EHT संकुचन बल में वृद्धि जब तक यह एक पठार (आमतौर पर दिन के आसपास संस्कृति का 15) पर पहुंच गया है जाएगा।
  5. औषधि की जांच
    1. एक दिन माप करने से पहले प्रोटीन मुक्त Tyrode समाधान तैयार है और 24 अच्छी तरह से प्लेटों में संतुलित करना (2 एमएल / अच्छी तरह से) सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में (37 डिग्री सेल्सियस, 7% सीओ 2, 40% हे 2) रात में: 120 मिमी NaCl, 5.4 मिमी KCl, 1 मिमी 2 MgCl, 0.1-5 मिमी 2 CaCl, 0.4 मिमी नः 2 पीओ 4, 22.6 मिमी 3 NaHCO, 5 मिमी ग्लूकोज, 0.05 मिमी ना 2 EDTA, 25 मिमी HEPES। 1.8 मिमी या पहले से निर्धारित [चुनाव आयोग 50] के लिए कैल्शियम को जोड़ें सकारात्मक इनो ट्रॉपिक प्रभाव की जांच के लिए।
    2. वजन और DMSO में दवा भंग करने और फ़िल्टर कर बाँझ, यदि आवश्यक हो।काम कर रहे एकाग्रता के 6 अलग 1000x-उप शेयर समाधान (DMSO में) तैयार करें (उदाहरण के लिए 0.3, 1, 3, 10, 30, संबंधित nanomolar रेंज के लिए 100 सुक्ष्ममापी)।
    3. (अच्छी तरह से प्रत्येक 2 एमएल में 2 μL) Tyrode प्लेटों में संबंधित स्टॉक पतला और अच्छी तरह से मिश्रण। प्लेटें वापस इनक्यूबेटर में रखें जब तक की जरूरत है।
    4. कुओं में बाँझ हुड और स्थिति कार्बन इलेक्ट्रोड के तहत पहली Tyrode से भरे 24-अच्छी तरह से थाली लेकर आधारभूत माप की शुरुआत करें। स्थानांतरण कार्बन इलेक्ट्रोड के शीर्ष पर रखा EHTs साथ PDMS रैक,, ढक्कन बंद थाली इनक्यूबेटर में वापस डाल दिया और ~ के 30 मिनट के एक संतुलन की अवधि के लिए प्रतीक्षा करें।
    5. EHT विश्लेषण साधन में गूंथ को इनक्यूबेटर से EHTs स्थानांतरित करें। साधन को बंद करें और सहज आधारभूत सिकुड़ना रिकॉर्ड (20 एस / EHT)।
    6. पेसिंग केबल करने के लिए कार्बन इलेक्ट्रोड कनेक्ट और EHTs (2.5 वी, 4 एमएस आवेग अवधि, मानव की बिजली की उत्तेजना शुरू: ~ 1 हर्ट्ज, चूहा: ~ 2हर्ट्ज, माउस: ~ 4 हर्ट्ज)। "गति" आधारभूत (10 एस / EHT) रिकॉर्ड। सुनिश्चित करें कि सभी EHTs ठीक से paced कर रहे हैं। उत्तेजना आवृत्ति और वोल्टेज सेल लाइन से सेल लाइन के लिए अलग-अलग हो सकता है।
    7. आधारभूत रिकॉर्डिंग के बाद, साधन से EHTs को हटा दें और पहले दवा एकाग्रता के साथ शीर्ष पर PDMS रैक के साथ इलेक्ट्रोड हस्तांतरण, 24-अच्छी तरह से थाली करने के लिए। EHTs वापस EHT विश्लेषण साधन के गूंथ पर तुरंत स्थानांतरण और वहाँ सेते (मानक दवा ऊष्मायन समय जैसे 20 मिनट)।
    8. पेसिंग केबल पुन: कनेक्ट करें, आंकड़ा मान्यता समायोजित करने और पहले दवा एकाग्रता का जवाब EHT संकुचन दर्ज करते हैं।
    9. निम्नलिखित दवा सांद्रता के लिए, उच्च दवा सांद्रता वाले 24-अच्छी तरह से प्लेटों के साथ कदम 3.5.7 और 3.5.8 दोहराएँ।
    10. सभी पीडीएफ रिकॉर्डिंग की बचत करें। संकुचन चोटियों और कलाकृतियों (3.2.1 और चित्र देखें 3 की पहचान आंकड़ा पहचान, हरे वर्गों की सही स्थिति के लिए प्रत्येक रिकॉर्डिंग की जाँच करें
    11. यदि आवश्यक हो तो अतिरिक्त ऑफ़लाइन विश्लेषण करें।
      1. "चुनें रन" पर क्लिक करके बाएं फलक पर "रन" डेटाबेस से संबंधित रन का चयन करें। बाईं ओर स्थित "पैरामीटर" टैब में, संकुचन के विश्लेषण के लिए पैरामीटर बदल जाते हैं। अब वीडियो reanalyze करने के लिए सही पैनल पर "ऑफ़लाइन" टैब में "ऑफ़लाइन विश्लेषण" चुनें।
      2. आंकड़ा मान्यता समायोजित करने के लिए और इसलिए एक नया वीडियो फ़ाइल रिकॉर्ड, "वास्तविक समय" टैब में आंकड़ा मान्यता समायोजित करने के बाद "नमूना समीक्षा" चुनें। नोट: नमूना समीक्षा केवल एक समय में एक अच्छी तरह से reanalyze सकते हैं, जबकि ऑफ़लाइन विश्लेषण बाईं ओर स्थित "पैरामीटर" पैनल में बटन "सभी कुओं पर उपयोग पैरामीटर" पर क्लिक करके सभी कुओं के लिए नए पैरामीटर आवेदन कर सकते हैं। ऑफ़लाइन विश्लेषण के दोनों प्रकार के स्वचालित रूप से नए डेटा फ़ाइलों और पीडीएफ परिणामों को प्रदर्शित करने का निर्माण करेगा।
    12. ख के परिणामों के संयोजन के द्वारा प्रयोग का विश्लेषण करेंiological replicates और आवृत्ति, संकुचन बल, संकुचन समय और आराम के समय (चित्रा 5D) और / या औसत संकुचन चोटियों (चित्रा 5C) की चित्रमय प्रदर्शन के लिए एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता में डेटा का सारांश।
      नोट: PDMS रैक और PTFE स्पेसर बार-बार इस्तेमाल किया जा सकता (PDMS अधिकतम रैक 5 बार, और PTFE स्पेसर अंतहीन।)। उपयोग के बाद, पानी के साथ उन्हें मैन्युअल रूप से साफ demineralized पानी और आटोक्लेव में दो बार उबाल। , संभावित कैरी-ओवर प्रभाव, रैक जब फिर से इस्तेमाल करने के बारे में पता होना के रूप में दवाओं PDMS द्वारा अवशोषित हो सकता है।

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Representative Results

कार्डिएक भेदभाव और EHT की तैयारी

HiPSC, कम वृद्धि कारक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पर विस्तार EDTA और embryoid निकायों (EBS) रात भर स्पिनर बोतल में गठन के साथ अलग कर रहे थे। तीन दिनों के लिए mesodermal प्रेरण के बाद, हृदय भेदभाव Wnt अवरोध करनेवाला के साथ शुरू किया गया था। भेदभाव प्रोटोकॉल का ~ 17 दिनों के बाद, पिटाई ईबीएस कोलैजिनेज़ प्रकार द्वितीय (चित्रा 1) के साथ एकल कक्षों में अलग किया गया था। EHTs 1.0 x 10 6 प्रति 100 μL ऊतक कोशिकाओं तुरंत ईबी पृथक्करण (चित्रा 2) के बाद से हाल में अलग-थलग पड़ cardiomyocytes से तैयार थे। जमे हुए कोशिकाओं से तैयार करने (जैसे वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ताओं) के लिए, कोशिकाओं मध्यम में गिरावट के लिहाज से मेजबान द्वारा thawed और centrifugation के बाद ईसीएम में resuspended थे। 48 घंटे के भीतर, एकल कोशिकाओं की सहज पिटाई EHT में माइक्रोस्कोप से मनाया गया। अगले दिनों में, cardiomyocytes बाहर अनुदैर्ध्य ऊतक के बल पंक्तियों के साथ, फैल मिलकर और एक जुड़कर पिटाई EHT का गठन किया। PDMS पदों की macroscopically दिखाई विक्षेपण EHT विश्लेषण साधन के साथ मापा गया था।

संकुचन विश्लेषण

EHT सिकुड़ना के विश्लेषण से वीडियो ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग (चित्रा 3) के आधार पर किया गया था। प्रणाली के भीतर, EHTs के साथ 24 अच्छी तरह से थाली गैस और एक कांच की छत के साथ तापमान नियंत्रित इनक्यूबेटर कक्ष में तैनात किया गया था। एक मोटर चालित XYZ अक्ष से जुड़ा एक कैमरा इस इकाई ऊपर तैनात किया गया था, और XYZ निर्देशांक एक सॉफ्टवेयर प्रोग्राम के साथ प्रत्येक EHT के लिए परिभाषित किया गया। प्रत्येक EHT के विश्लेषण से ऊतक के ऊपर और नीचे सिरों पर आंकड़ा मान्यता पर आधारित था। एक स्वचालित सॉफ्टवेयर एल्गोरिथ्म फिल्माया EHT संकुचन और गणना बल विकास पद विक्षेपन और इला के आधार पर विश्लेषणsticity / PDMS पदों की ज्यामिति (पूरक चित्रा 1) 11। पूर्वनिर्धारित मानदंडों के अनुसार चोटियों के निर्धारण के बाद, एक पीडीएफ रिपोर्ट सभी EHTs (पूरक चित्रा 2) सिकुड़ना के मापदंडों में संक्षेप।

लॉन्ग टर्म मापन में स्थिरता

EHTs की दीर्घकालिक माप स्वचालित दोहराया माप हर 20 मिनट के साथ सतत मोड में प्रदर्शन किया था। संकुचन विश्लेषण (चित्रा 4) संकुचन बल में कोई समय पर निर्भर परिवर्तन (रैखिक रुझान के लिए पोस्ट परीक्षण किया गया था नहीं महत्वपूर्ण) से पता चला है, जिनमें 20 घंटे के लिए आवृत्ति, संकुचन समय T1 या विश्राम समय टी 2 की धड़कन, स्थिरता के एक उच्च स्तर का संकेत है। हर जैविक नमूने हालांकि के रूप में, EHTs के रूप में जैविक प्रतिकृति के लिए उम्मीद, परिवर्तनशीलता के कुछ स्तर दिखा। भिन्नता शुरुआत और लंबी अवधि measu के अंत में गुणांकrement क्रमश बल के लिए 7/13%, आवृत्ति के लिए 12/6%, संकुचन समय के लिए 4/3% और आराम के समय के लिए 4/3% थे (n = 4)। जैविक प्रतिकृति के बीच इस परिवर्तनशीलता आंकड़ा मान्यता या विश्लेषण के एक विरूपण साक्ष्य के रूप में प्रत्येक एकल EHT के लिए परिणाम प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं और कम परिवर्तनशीलता (पूरक चित्रा 2) की जरूरत नहीं है।

औषधि की जांच

दवा स्क्रीनिंग सीरम मुक्त Tyrode समाधान में प्रदर्शन किया था। संचयी एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता 0.1% की एक अधिकतम DMSO वाहन एकाग्रता के साथ उत्पन्न किया गया। आधारभूत संकुचन विश्लेषण प्रतिकृति के बीच पैटर्न और बहुत कम परिवर्तनशीलता की धड़कन में बहुत कम अनियमितता दिखाया। HERG चैनल अवरोधक E4031 के संपर्क में एक महत्वपूर्ण उच्च सांद्रता (चित्रा 5) पर 10 एनएम पर छूट समय (टी 2) की मोहलत और अनियमित धड़कन पैटर्न में हुई। frequenc के लिएy नियंत्रित संकुचन विश्लेषण, माप वैकल्पिक रूप से कार्बन इलेक्ट्रोड बिजली की उत्तेजना का उपयोग कर के साथ प्रदर्शन किया गया।

आकृति 1
चित्र 1: कार्डिएक भेदभाव। (ए) मानव स्टेम सेल प्रेरित किया। स्केल बार = 100 सुक्ष्ममापी। Mesodermal भेदभाव की शुरुआत में (बी) embryoid निकायों। स्केल बार = 100 सुक्ष्ममापी। हृदय भेदभाव के अंत में (सी) करार embryoid निकायों। स्केल बार = 100 सुक्ष्ममापी। (डी) मानव हृदय के ऊतकों इंजीनियर। स्केल बार = 1 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2: उद्योगों की पीढ़ीeered हृदय के ऊतकों (EHT)। (ए) PTFE स्पेसर। (बी) PDMS रैक। ए, (बी) स्केल बार = 1 सेमी (सी) PTFE स्पेसर को हटाने के बाद agarose में ढालना कास्टिंग के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से पर शीर्ष दृश्य। (डी) PDMS रैक कास्टिंग मोल्ड में तैनात की पोस्ट की जोड़ी। (ई) पुनर्गठन मिश्रण कास्टिंग मोल्ड में और PDMS पोस्ट पर pipetted। (एफ) हाल में 0 दिन में EHT उत्पन्न, मध्यम के साथ एक नई संस्कृति डिश के लिए स्थानांतरित कर दिया। (G) 15. दिन कम से मध्यम में EHT रिमॉडल्ड यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्र 3: इंजीनियर हृदय के ऊतकों का संकुचन विश्लेषण (EHT)। (ए) EHTगैस और एक एलईडी पैनल के शीर्ष पर 24-अच्छी तरह से संस्कृति डिश में EHTs साथ तापमान नियंत्रित ऊष्मायन चैम्बर ऊपर कंप्यूटर नियंत्रित कैमरा के साथ विश्लेषण साधन। (बी) स्वचालित संकुचन विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण के दौरान कोई EHT का लाइव देखें। (सी) अनुकरणीय संकुचन पैटर्न, प्रति सेकंड और बढ़े हुए योजनाबद्ध संकुचन शिखर 100 फ्रेम के साथ मापा समय के साथ संकुचन बल प्रदर्शित विश्लेषण पैरामीटर बल, संकुचन समय (T1), विश्राम का समय (टी 2), संकुचन वेग (CV), विश्राम वेग प्रदर्शित ( आर.वी., यह आंकड़ा 7 और 27) से पुनः प्रकाशित किया गया है। DH: संकुचन के विश्लेषण के लिए पैरामीटर। (डी) विभिन्न फिल्टर का स्तर (नीला फ़िल्टर्ड लाइन) आंकड़ा मान्यता को प्रभावित करने के उदाहरण। वाम: फ़िल्टर स्तर = 0. ध्यान दें कि कोई नीले फ़िल्टर्ड लाइन दिखाई दे रहा है, लेकिन केवल लाल मूल का पता लगाने। मध्य: फ़िल्टर स्तर = 3, यह दर्शाता है वें आदर्श मान्यता / विश्लेषणई संकुचन चोटियों। अधिकार: फ़िल्टर स्तर = 20. ध्यान दें कि नीले रंग से फ़िल्टर लाइनों गरीब संकुचन शिखर विश्लेषण यह दर्शाता मूल निशान की तुलना में बहुत छोटे होते हैं। (ई) एक बहुत अधिक बल सीमा (बाएं) और मान्यता प्राप्त सभी चोटियों के साथ कम बल सीमा (दाएं) के साथ विश्लेषण अतालता EHT संकुचन का उदाहरण। (एफ) सोडियम चैनल एगोनिस्ट ATX द्वितीय संकुचन के बाद जल्दी से एक लंबे समय तक तनाव कम करने के समय में जिसके परिणामस्वरूप के संपर्क में EHTs के उदाहरण निशान। ध्यान दें कि बाएं पैनल पर चौथे संकुचन शिखर एक बहुत कम न्यूनतम कारक के कारण (कोई हरे वर्ग) मान्यता प्राप्त नहीं है। (G) के साथ (सही पैनल) संकुचन चोटियों के उदाहरण और बिना (सही पैनल) गुलाबी वक्र (संकुचन वक्र, संकुचन और आराम वेग के पहले व्युत्पन्न)। (एच) murine और मानव EHTs के लिए पैरामीटर सिफारिशों का सारांश। ध्यान दें कि इन मानकों दवा जोखिम के दौरान संकुचन पैटर्न में परिवर्तन के रूप समायोजन की आवश्यकता हो सकती (ई देखते हैं,एफ)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्र 4: अनायास मानव इंजीनियर हृदय के ऊतकों को पीटने की लॉन्ग टर्म मापन (EHT) के दौरान समय नियंत्रण। अनायास मानव इंजीनियर हृदय के ऊतकों (EHT) की धड़कन के दीर्घकालिक माप के दौरान समय नियंत्रण। EHTs EHT विश्लेषण साधन में तैनात है और 20 घंटे की अवधि के लिए इनक्यूबेट रहे थे। स्वचालित संकुचन विश्लेषण रैखिक रुझान के लिए महत्वपूर्ण नहीं के बाद परीक्षण के साथ हर 20 मिनट के प्रदर्शन किया गया (n = 4; डेटा मतलब + मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

टी = "चित्रा 5" src = "/ फ़ाइलें / ftp_upload / 55,461 / 55461fig5.jpg" />
चित्र 5: मानव इंजीनियर हृदय के ऊतकों पर hERG चैनल अवरोधक E4031 (EHT) का प्रभाव।
(ए) आधार रेखा पर अनुकरणीय संकुचन पैटर्न। (बी) 300 nm E4031 में ऊष्मायन के बाद अनुकरणीय संकुचन पैटर्न। (सी) औसत संकुचन शिखर (n = 4) आधारभूत (काला) पर और बाद 100 एनएम E4031 (लाल) में 30 मिनट ऊष्मायन विद्युत प्रेरित EHTs की। प्रति सेकंड 100 फ्रेम के साथ विश्लेषण। अनायास मानव EHTs पिटाई पर E4031 के लिए (डी) एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता। विद्युत प्रेरित EHTs (सी) बनाम अनायास पिटाई EHTs (डी) में ध्यान दें टी 2 मोहलत में छोटे प्रभाव आकार। एक तरह से एनोवा, Dunnett के बाद परीक्षण बनाम आधारभूत के साथ दोहराया उपायों; * पी <0.05; एन = 4. Z '300 nm E4031 पर टी 2 मोहलत के लिए कारक 25 0.75 है।स्नातकोत्तर "target =" _ blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मानव चूहा माउस
प्रकोष्ठों 26.4x10 6 10.8x10 6 18.0x10 6
2xDMEM [μL] 147 147 147
तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स [μL] 264 - 264
वाई 27,632 [μL] 2.6 - -
फाइब्रिनोजेन [μL] 66.8 66.8 66.8
ईसीएम [μL] विज्ञापन 2640 विज्ञापन 2640 विज्ञापन 2640

तालिका 1: पी के लिए योजना pipetting24 मानव, चूहा और माउस EHTs के लिए पुनर्गठन मिक्स की मरम्मत। फाइब्रिनोजेन एकाग्रता 5 मिलीग्राम / सभी EHTs के लिए एमएल है। ध्यान दें कि सेल एकाग्रता प्रत्येक प्रजाति के लिए अलग है। मानव EHTs के लिए, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स जोड़ने (जैसे Matrigel, सामग्री तालिका देखें) और रो-काइनेज अवरोध करनेवाला वाई 27,632 मिश्रण करने के लिए। माउस EHTs के लिए, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स जोड़ें। सेल निलंबन की प्रारंभिक एकाग्रता के आधार पर, अतिरिक्त ईसीएम जोड़ने 2,640 μL पुनर्गठन मिश्रण की कुल मात्रा तक पहुँचने के लिए।

पूरक चित्रा 1
पूरक चित्रा 1: संकुचन सेना के लिए गणना सूत्र पोस्ट विक्षेपन 26 के आधार पर। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


पूरक चित्रा 2: सॉफ्टवेयर का संकुचन विश्लेषण रिपोर्ट से अनुकरणीय डाटा अंश।
(:; गुलाबी संकुचन बल: संकुचन वेग लाल): शीर्ष के साथ 100 फ्रेम / s दर्ज की गई समय के 20 रों अधिक संकुचन चोटियों। नीचे: विश्लेषण संकुचन न्यूनतम, मतलब, अधिकतम मूल्य और 18 का विश्लेषण किया संकुचन चोटियों एक हरे वर्ग (ऊपर) के साथ चिह्नित के मानक विचलन दिखा पैरामीटर। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इंजीनियर हृदय के ऊतकों हृदय अनुसंधान के टूल बॉक्स करने के लिए एक मूल्यवान विकल्प प्रदान करता है। 24-अच्छी तरह प्रारूप में EHTs रोग मॉडलिंग 8, 14, दवा सुरक्षा स्क्रीनिंग 7, 8, 10, 11, 15, या बुनियादी हृदय अनुसंधान 16, 17 के लिए मूल्यवान साबित हुए हैं।

बुनियादी EHT प्रोटोकॉल के संभावित संशोधनों cardiomyocytes और गैर cardiomyocytes 18 और प्रकुंचन दाब वृद्धि 14 से परिभाषित मिश्रण के साथ सेलुलर बातचीत पर अध्ययन शामिल है। समस्या निवारण के लिए महत्वपूर्ण पहलुओं इनपुट सेल आबादी की गुणवत्ता और फाइब्रिनोजेन की गुणवत्ता शामिल हैं। प्रारंभिक जेल गठन अनियमित या कॉम्पैक्ट टी छड़ी करने के लिए पर्याप्त नहीं है, तोओ PDMS पोस्ट, या अगर जेल तेजी से कम aprotinin एकाग्रता की वजह से डालने के बाद कुछ दिनों के भीतर विकृत है, EHTs पीढ़ी नहीं सफल हो जाएगा।

निम्नलिखित सीमाओं पर विचार करना होगा। (I) 24-अच्छी तरह प्रारूप में प्रवाह क्षमता अच्छी तरह से एक प्राथमिक जांच सेटअप के लिए अनुकूल नहीं है, लेकिन एक उच्च माध्यमिक पुष्टि स्क्रीन के लिए पर्याप्त है। (Ii) बल के एकीकृत रीडआउट, संकुचन गतिकी और ताल कम विशिष्टता है, जो यह मुश्किल विशिष्ट आणविक तंत्र को बल में परिवर्तन लिंक कर सकते है। (Iii) 3 डी संस्कृति प्रारूप और खिंचाव तुला PDMS पदों द्वारा लगाए गए परिपक्वता की रूपात्मक और कार्यात्मक पहलुओं में सुधार करते हैं, सच intercalated डिस्क, सहज पिटाई की कमी है, और सामान्य एड्रीनर्जिक प्रतिक्रियाओं की तुलना में कम संकेत मिलता है कि पूर्ण हृदय परिपक्वता अभी तक के साथ प्राप्त नहीं कर रहा है इस प्रोटोकॉल। (iv) PDMS का विस्तार 19 और वास्तविक प्रभावी concentrat विभिन्न करने के लिए विभिन्न दवाओं को अवशोषित करने के दिखाया गया हैआयन EHTs पर भिन्न हो सकता है। यह पूर्वाग्रह का अध्ययन करता है 15 तीव्र दवा प्रभाव 7, 8 और स्पष्ट रूप से हाथ में दवा पर निर्भर करता है की जांच कर उन लोगों की तुलना पुरानी विषाक्तता में अधिक महत्वपूर्ण हो सकता है। एक परिणाम के रूप में, किसी भी PDMS रैक दवाओं के संपर्क में उपयोग के बाद खारिज कर दिया जाना चाहिए और विभिन्न दवाओं के संभावित अवशोषण जब डेटा का विश्लेषण ध्यान में रखा जाना करने की आवश्यकता होगी। (v) तथ्य यह है कि 1x10 6 hiPSCs EHT प्रति आवश्यक हैं डेटा बिंदु प्रति लागत अधिक होती है को देखते हुए।

पूर्व vivo दिल सिकुड़ना विश्लेषण की तुलना में इस प्रोटोकॉल के महत्व को एक मानव प्रणाली में काम करने की क्षमता, प्रयोगात्मक संक्षिप्त जानकारी दी गई की कमी, और EHTs के मानकीकृत उत्पादन जो अप (जैसे रोग मॉडलिंग विशिष्ट आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर बड़े अध्ययन की स्थापना की अनुमति देता है )। अन्य hiPSC परीक्षण प्रणाली (बहु इलेक्ट्रोड सरणी, प्रतिबाधा) की तुलना में, इस प्रणाली का विश्लेषणएक तीन आयामी संरचना में cardiomyocytes के सबसे महत्वपूर्ण शारीरिक पैरामीटर के रूप में रों सिकुड़ा बल और परिभाषित लोड के अंतर्गत खेती की अनुमति देता है। EHTs अनुबंध नियमित रूप से और स्थिर बल, आवृत्ति और कई घंटे और सप्ताह, लंबी अवधि के माप और जीर्ण विषाक्तता के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता से अधिक ताल पर। EHT विश्लेषण बिजली की उत्तेजना जो मांसपेशियों में संकुचन और नशीली दवाओं के प्रभाव पर अपनी क्षमता प्रभाव के बल आवृत्ति रिश्ते के संबंध में महत्वपूर्ण है के तहत किया जा सकता है। HiPSC-मुख्यमंत्री की अपरिपक्व स्थिति के संबंध में, बिजली की उत्तेजना संभावित एक अधिक परिपक्व फेनोटाइप 20, 21 की ओर कोशिकाओं पुश करने के लिए है और EHT रखरखाव में शामिल किया जा सकता है। इसके अलावा, EHT परीक्षा प्रणाली सभी मानक ऊतकीय मापदंडों सहित उच्च सामग्री रीडआउट के साथ-साथ जैव रसायन (आरएनए, डीएनए, प्रोटीन अलगाव) 11 प्रदान करता है। संभावित भविष्य के अनुप्रयोगों पहलुओं में शामिल हैं isogenic नियंत्रण के CRISPR / Cas9 मध्यस्थता पीढ़ी के साथ संयोजन में नशीली दवाओं के विकास (लक्ष्य सत्यापन, सुरक्षा औषध विज्ञान) और रोग मॉडलिंग विशेष रूप से की।

EHTs और एकाग्रता-प्रतिक्रिया घटता के प्रदर्शन के रखरखाव के दौरान, यह ध्यान से बाँझ सेल संस्कृति प्रक्रियाओं के लिए निर्देशों का पालन करने के लिए 24 अच्छी तरह से प्लेटों के बीच PDMS रैक के हस्तांतरण के दौरान फंगल संदूषण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। EHT के साथ सबसे महत्वपूर्ण कदम हालांकि, cardiomyocyte भेदभाव प्रोटोकॉल है। EHTs जुड़कर पिटाई मांसपेशी स्ट्रिप्स के रूप में के लिए, इनपुट आबादी कम से कम 60% cardiomyocytes से मिलकर किया है। सौभाग्य से, भेदभाव प्रोटोकॉल और अधिक मजबूत और पिछले कुछ वर्षों में कुशल बन गया है और cardiomyocytes अब तक आसानी से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। hiPSC व्युत्पन्न इंजीनियर हृदय के ऊतकों के विकास में गैर myocytes की भूमिका पूरी तरह से समझ नहीं है, अभी तक। उच्च शुद्धता hiPSC-मुख्यमंत्री के साथ प्रयोग आश्चर्यजनक रूप से अच्छा EHT करने के लिए नेतृत्वगधा = "xref"> 7, लेकिन ऊतक में अन्य प्रकार की कोशिकाओं के एकीकरण ऊतक कार्य में सुधार करने और एक परिपक्व शरीर क्रिया विज्ञान 22, 23, 24 की ओर फेनोटाइप धक्का सकता है दिखाया गया है। ऊतकों ऊतक प्रति एक लाख की कोशिकाओं के साथ एक 24 अच्छी तरह से प्रारूप में उत्पन्न कर रहे हैं के रूप में, इस मंच अभी भी बल्कि महंगा है। एक 96 अच्छी तरह प्रारूप करने के लिए नीचे स्केलिंग आकांक्षी है, लेकिन इस कमी को outbalances अब तक मजबूती। इस पांडुलिपि में प्रस्तुत प्रोटोकॉल तकनीकी रूप से प्रतिकृति के बीच थोड़ा परिवर्तनशीलता के साथ बहुत मजबूत है। और संकुचन बल (भिन्नता 10% के गुणांक मतलब) (भिन्नता 17% के गुणांक मतलब) इंट्रा-बैच परिवर्तनशीलता गतिकी के लिए बहुत कम (भिन्नता = 5% के गुणांक मतलब), और सहज पिटाई आवृत्ति के लिए कुछ हद तक बड़ी है। तकनीक बहुत मजबूत है। विभिन्न प्रयोगकर्ताओं के पार, दक्षता पिटाई EHTs उत्पन्न करने के लिए casted हाइड्रोजेल की> 90% है।

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Disclosures

आईएम, TE और एएच EHT टेक्नोलॉजीज जीएमबीएच, जर्मनी के सह-संस्थापक हैं।

Acknowledgments

लेखकों सामग्री की अपनी तरह योगदान के लिए एलेसेंड्रा मोरेटी और डेनिस स्केड लिए आभारी हैं। हम प्रायोगिक औषध विज्ञान और UKE का विष विज्ञान विभाग में आईपीएस और EHT कार्यदल के महान समर्थन स्वीकार करते हैं। लेखकों के कार्य DZHK (हृदय अनुसंधान के लिए जर्मन सेंटर) और शिक्षा के जर्मन मंत्रालय और अनुसंधान (BMBF), जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (DFG Es 88 / 12-1, हा 3423 / 5-1 से अनुदान द्वारा समर्थित है ), ब्रिटिश नेशनल सेंटर फॉर रिप्लेसमेंट शोधन एवं अनुसंधान में पशु की कमी (NC3Rs दरार आईटी 35,911-259,146 नहीं दे सकते) ब्रिटिश हार्ट फाउंडेशन आर एम / 13/30157 के लिए, यूरोपीय अनुसंधान परिषद (उन्नत अनुदान IndivuHeart), जर्मन हार्ट फाउंडेशन और Freie und Hansestadt हैम्बर्ग।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EHT analysis intrument EHT Technologies GmbH A0001 Software is included
EHT PDMS rack EHT Technologies GmbH C0001
EHT PTFE spacer EHT Technologies GmbH C0002
EHT electrode EHT Technologies GmbH P0001
EHT pacing adapter/cable EHT Technologies GmbH P0002
24-well-plate Nunc 144530
6 well-cell culture plate Nunc 140675
15 mL falcon tube, graduated  Sarstedt 62,554,502
Cell scraper Sarstedt 831,830
Spinner flask Integra 182 101
Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct  Thermo scientific 70101 Adjust rotor speed to 40 rpm
T175 cell culture flask  Sarstedt  831,812,002
V-shaped sedimentation rack  Custom made at UKE Hamburg na
10× DMEM Gibco 52100
1-Thioglycerol  Sigma Aldrich M6145
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt Sigma Aldrich 49752
Activin-A  R&D systems 338-AC
Agarose  Invitrogen 15510-019
Aprotinin Sigma Aldrich A1153
Aqua ad injectabilia Baxter GmbH 1428
B27 PLUS insulin  Gibco 17504-044
BMP-4 R&D systems 314-BP
Collagenase II  Worthington LS004176
DMEM Biochrom F0415
DMSO  Sigma Aldrich D4540
DNase II, type V (from bovine spleen) Sigma  D8764
Dorsomorphin  abcam ab120843
EDTA  Roth 8043.2
Fetal calf serum Gibco 10437028
FGF2 Miltenyi Biotec 130-104-921
Fibrinogen (bovine) Sigma Aldrich F8630
Geltrex  Gibco A1413302 For coating: 1:200 dilution
HBSS w/o Ca2+/Mg2+  Gibco 14175-053
HEPES  Roth 9105.4
Horse serum Life technologies 26050088
Human serum albumin  Biological Industries 05-720-1B
Insulin, human Sigma Aldrich I9278
L-Glutamin Gibco 25030-024
Lipidmix  Sigma Aldrich L5146
Matrigel BD Biosciences 354234 For EHT reconsitutionmix.
N-Benzyl-p-Toluenesulfonamide TCI B3082-25G
PBS w/o MgCl2/CaCl2 Biochrom 14190
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140
Pluronic F-127  Sigma Aldrich P2443
Polyvinyl alcohol  Sigma Aldrich P8136
RPMI 1640  Gibco 21875
Sodium selenite Sigma Aldrich S5261
TGFß1 Peprotech 100-21
Thrombin Sigma Aldrich T7513
Transferrin  Sigma Aldrich T8158
Y-27632 Biorbyt orb6014
hiPSC Custom made at UKE hamburg na
iCell cardiomyocytes kit Cellular Dynamics International CMC-100-010-001
Pluricyte cardiomyocyte kit Pluriomics PCK-1.5
Cor.4U - HiPSC cardiomyocytes kit Axiogenesis AG Ax-C-HC02-FR3
Cellartis cardiomyocytes Takara Bio USA, Inc. Y10075

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References

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  27. EHT Technologies GmbH. , Available from: http://www.eht-technologies.com Forthcoming.

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जैव अभियांत्रिकी अंक 122 Engineered हृदय के ऊतकों cardiomyocytes ऊतक इंजीनियरिंग हृदय भेदभाव दवा सुरक्षा औषध विज्ञान
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Mannhardt, I., Saleem, U., Benzin, A., Schulze, T., Klampe, B., Eschenhagen, T., Hansen, A. Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening. J. Vis. Exp. (122), e55461, doi:10.3791/55461 (2017).

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