Summary
Perifer injektion af alfa-synuclein fibriller i peritoneum eller tunge af Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) mus, som udtrykker humant alfa-synuclein med familiær A53T mutation og ildflueluciferase, kan inducere neuropatologi, herunder neuroinflammation , i det centrale nervesystem.
Abstract
For at undersøge prion-lignende opførsel af misfoldet alfa-synuclein, er brug musemodeller, der tillader hurtig og enkel transmission af alfa-synuclein prionoids, som forårsager neuropatologi i centralnervesystemet (CNS). Her beskriver vi, at intraglossal eller intraperitoneal injektion af alfa-synuclein fibriller i bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) mus, der overudtrykker humant alfa-synuclein med A53T mutation fra prionprotein-promotoren og ildflueluciferase fra promotoren for glial fibrillært surt protein (GFAP), er tilstrækkelig til at inducere neuropatologisk sygdom. I sammenligning med homozygot Tg (M83 + / +) mus, der udvikler alvorlige neurologiske symptomer begynder i en alder af 8 måneder, heterozygote Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) dyr forblive fri for spontan sygdom, indtil de når en alder på 22 måneder. Interessant injektion af alfa-synukleinfibriller via intraperitoneal rute induceret neurologisk sygdom med lammelse i fire af fem Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) mus med en median inkubationstid på 229 ± 17 dage. Syge dyr viste alvorlige forekomster af phosphoryleret alfa-synuclein i deres hjerner og rygmarv. Ophobninger af alfa-synuclein var sarkosyl-uopløselige og co-lokaliseret med ubiquitin og p62, og var ledsaget af en inflammatorisk respons, der resulterer i astrocytisk gliose og mikrogliose. Overraskende podning af alfa-synuclein fibriller i tungen var mindre effektiv til at forårsage sygdom med kun én af fem injicerede dyr viser alfa-synuclein patologi efter 285 dage. Vores resultater viser, at podning via intraglossal rute og mere så via den intraperitoneale vej er egnet til at fremkalde neurologisk sygdom med relevante kendetegnende for synucleinopatier i Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) mus. Dette giver en ny model til at studere prion-lignende patogenese fremkalded fra alfa-synuclein prionoids mere detaljeret.
Introduction
Der er stigende tegn på, at alfa-synuclein har egenskaber, der ligner dem af prionproteinet, især i dets evne til at selv-frø og udbreder misfoldning mellem celler og langs nervebaner. Denne egenskab af alfa-synuclein er også benævnt 'prion-lignende' eller 'prionoid', og er støttet af observationer i transplantationsforsøg, der antyder muligheden for overførsel af fejlfoldet alfa-synuclein fra syge neuroner til nyligt transplanterede sunde neuroner 1, 2 , 3, 4. Også direkte injektion af misfoldet alfa-synuclein i hjernen eller i periferien, f.eks bagbenet muskel eller tarmvæggen, resulterer i en spredning af alfa-synuclein patologi til distale dele af CNS 5, 6, 7, <sup class = "xref"> 8, 9, 10. Vi analyserede transmission af alfa-synuclein prionoids via perifere ruter mere detaljeret og behandlet spørgsmålet om, hvorvidt misfoldet alfa-synuclein kan neuroinvade CNS efter en enkelt intraglossal eller intraperitoneal injektion, en funktion, der tidligere var blevet vist for prioner, men ikke for misfoldet alfa- synuclein. Efter injektion af prioner i tungen, er neuroinvasion af CNS opnås via udbredelse langs nervus hypoglossus af tungen, der fører til kernen af nerven under tungen, som er placeret i hjernestammen 11. Som en musemodel vi valgte Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) mus, som overudtrykker A53T mutant af humant alfa-synuclein fra prion-promotoren, og ildflueluciferase under kontrol af en GFAP promotor for at overvåge astrocytaktivering ved bioluminescens, som tidligere vist i hjernen hosprion-inficerede mus 12. I vores hænder bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) gjorde musene ikke udvikle sygdommen indtil 23 måneder, som er blevet vist af andre 13. En enkelt injektion af humane alfa-synukleinfibriller via intraglossal eller intraperitoneale vej induceret neurologisk sygdom med patologi i hjernen og rygmarven hos Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) mus understøtter den hypotese, at alfa-synuclein prionoids dele vigtige karakteristika med prioner 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, herunder dyr blev udført med godkendelse af dyrebeskyttelse udvalg af Nordrhein-Westfalen Stat Miljøagentur (LANUV). Dyrene blev holdt og plejes i overensstemmelse med standardbetingelser med en 12 timers lys / mørkecyklus og fri adgang til foder og vand.
1. Animalske Model
- Intercross hemizygote Tg (GFAP -Luc +/-) mus med hemizygote Tg (M83 +/-) mus til at generere hemizygote bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) mus 15, 16.
- Genotype afkommet med realtids-PCR for tilstedeværelsen af transgenet koder for humant alfa-synuclein og med standard PCR for ildflueluciferase 12, 17.
- Inokulér dyrene i en alder af seks-til-otte uger.
2. Inokulum
- Forbered monomeric rekombinant humant alfa-synuclein med A53T mutation i Tris-bufret saltvand (TBS) buffer indeholdende 150 mM NaCI i 20 mM Tris-HCI (pH 7,2) som det har været beskrevet tidligere 14.
- Forberede fibrillært alfa-synuclein for inokulationer ved omrøring 3 pg / pi monomert rekombinant humant alfa-synuclein i en orbitalryster ved 800 rpm og 37 ° C i 5 dage.
- Fortynd fibril samlinger i phosphatbufret saltvand (PBS) for at nå en slutkoncentration på 1 pg / pi til intraperitoneal eller 2 ug / uL for intraglossal inokulationer.
- Fragmentere alfa-synukleinfibriller med en stang sonikator i 1 min (40 pulser på 0,5 s varighed med en pause på et sekund mellem hver impuls og en amplitude indstillet til 50%) på is. For at undgå forurening med cross-såning. Bruge rene sonikeringstider prober til fremstilling andet inoculum.
3. Intraglossal Injektioner
- Bedøver dyr med en intraperitoneal injektion af 100 mg / kg ketamin og 10 mg / kg xylazin. Klem dyrets tå og bekræfte, at det ikke sit bagben for at sikre korrekt anæstesi. Brug dyrlæge salve på dyrets øjne til at forebygge tørhed, mens under anæstesi.
- Fix bedøvet dyr omhyggeligt med tape på en varmeplade i et dorsalt liggende stilling med deres hoveder vendt mod investigator.
- Fyld en 27 G engangs injektionssprøjte med 5 pi sonikerede alfa-synuclein fibriller eller PBS.
- Brug en stump-næse tommelfinger pincet med savtakkede tips til at holde dyrets mund åben, og et andet mindre pincet til forsigtigt trække tungen til at gøre undersiden af tungen tilgængelig til injektion.
- Injicer sprøjtens nål i den højre eller venstre undersiden af tungen i nærheden af den hypoglossale nerve. Injicer langsomt inokulum efter 5 s. tilbagetrække langsomt nålen efter 5 s for at sikre, at inokulummeter trængt vævet og ikke går tabt, mens tilbagetrækning af nålen.
- Slip dyret fra dets optagelser og lad det på varmepladen under konstant overvågning, indtil fuldstændig helbredelse.
4. intraperitoneale injektioner
- For intraperitoneale injektioner, narcotize dyrene kort i en anæstesi kammer ved inhalation med isofluran / oxygen under anvendelse af en strømningshastighed på 2 l / min og fordamperen sat til 2%. Klem dyrets tå og bekræfte, at det ikke sit bagben for at sikre korrekt anæstesi.
- Fyld en 27 G engangs injektionssprøjte med 50 pi sonikerede alfa-synuclein fibriller eller PBS.
- Direkte injicere i peritoneum af musen og undgå gennemtrængende tyndtarmen eller coecum placeret bag bugvæggen ved at holde dyret i en dorsal stilling med hovedet vender væk fra undersøgeren og nedad ved ca. 45 °. Overvåg dyr, indtil de har inddrevetfra anæstesi.
5. Bioluminescens Imaging
- Billede Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) mus hver 2-4 uger ved hjælp af en bioluminescens imaging system.
- Forud for billeddannelse snart bedøve musene i en isofluran / oxygen kammer med en strømningshastighed på 2 l / min og fordamperen sat til 2%. Klem dyrets tå og bekræfte, at det ikke sit bagben for at sikre korrekt anæstesi.
- Barbering og fjerne hår lederne af musene med et hårfjerningsmiddel. Farvelæg ørerne i sort med en ikke-irriterende markør for at blokere uspecifik bioluminescens.
- Fortynd D-luciferin kaliumsalt, substratet af luciferase, i PBS til en 30 mg / ml stamopløsning. Gemme denne i 1 ml prøver ved -20 ° C. Beskytte den opløste D-luciferin fra lyspåvirkning.
- Vejer dyrene før injektion. Beregne det nøjagtige volumen af D-luciferin til injektion af 150 mg / kg legemsvægt. Intraperitonealt injicere D-luciferin og returnere dyret til anæstesi kammer.
- Start imaging software. Efter det billeddannende system har nået sin driftstemperatur initialisere systemet ved at klikke på knappen 'Initialize' i kontrolpanelet.
- Vælg de knapper 'Selvlysende' og 'Photograph'. Indstil eksponeringen tid til 60 s, den binning til 'Medium', F / Stop for at '1', og EM-gevinst til 'Off'.
- Bekræft, at exciteringsfilter er sat til 'Blok' og emissionen filteret til 'Åbn', og sæt motivet højde til 1,50 cm.
- Ti minutter efter injektion med D-luciferin, placere dyr på varmepladen i afbildningskammeret og sikre, at deres muler er korrekt placeret i anæstesi udløb. Luk isofluran / oxygen strømning fra inhalationskammeret og åbn flow for afbildningskammeret med en strømningshastighed på 0,25 l / min og en fordampning på 2%. Lukke døren afbildningskammeret properly.
- Klik på knappen 'Acquire' for at måle bioluminescens, som tager 60 s. Stop isofluran flow og overvåge dyrene, indtil de helt har genvundet efter at returnere dem tilbage til deres bure.
- Brug imaging software til at kvantificere bioluminescens. Inden for 'Tool Palette' vælg 'ROI Tools'. vælg Under 'Type' inden for de 'ROI Værktøj' 'Måling ROI'.
- Inden for de 'ROI Tools' ved at klikke på "cirklen" værktøj og vælge det antal ROI'er at trække fra pull down menu - ideelt set '3' for tre mus.
- På billedet, højreklikke på hver ROI og under 'Egenskaber' justere bredden og højden på 1,25 cm. Placer hver ROI over hjernen område, der er kvantificeret.
- I øverste venstre hjørne af billedet, skal du indstille panelet enheder til 'udstråling (fotoner)'.
- Inden for 'Tool Palette', vælg 'Tilpas billede' og justere minimum ogmaksimum af 'Color Scale', for eksempel fra 0.20e6 til 1.00e6.
- Under 'Filer' gemme dataene med 'Gem'.
6. Biokemisk Analyse
- Isoler hjerne og rygmarv ifølge etablerede protokoller 18, 19.
- Homogenisere hele hjernen og hele rygmarv prøver separat i PBS i nærvær af protease og phosphataseinhibitorer (fortyndet til 1x i PBS) i to 30 s cyklusser med 6.000 rpm i en vævshomogenisator. Sikre, at hjerne og rygmarv prøverne homogeniseres til en slutkoncentration på 20% (vægt / vol).
- Sonikeres prøverne to gange samtidig holde dem på is med en konstant puls på 10 s og en amplitude indstillet til 50%.
- Juster homogenaterne til 10% i PBS og 750 mM NaCl ved at fortynde dem 1: 1 med 1,5 M NaCl i PBS.
- At adskille cellerester, centrifugeres homogenaterne ved 1000 xg i 5 minutter ved4 ° C. Hold supernatanterne for de næste skridt og kassér pillerne.
- Måle proteinkoncentrationen i homogenaterne ved hjælp af bicinchoninsyre (BCA) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Inkubere 1,0 mg totalt protein fra hjernehomogenater eller 0,8 mg fra rygmarv homogenater i N-laurylsarcosyl i en slutkoncentration på 10% (vægt / volumen) i 15 minutter på is.
- Overlay homogenaterne på en 3 ml sucrose pude af 10% (vægt / vol) i destilleret vand og ultracentrifuge dem ved 465.000 xg i 1 time ved 4 ° C.
- Resuspendere pillerne i en puffer indeholdende 4% natriumdodecylsulfat (SDS), 2% β-mercaptoethanol, 192 mM glycin, 25 mM Tris og 5% (vægt / volumen) saccharose.
- Kog prøverne ved 100 ° C i 5 min og indlæse dem til SDS-polyacrylamidgeler til elektroforese i en morpholinethansulfonsyre (MES) buffersystem.
- Overføre de separerede proteiner til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner i en semidry blotting system.
- Inkuber membranerne i 0,4% (vol / vol) formalinopløsning i PBS i 30 minutter ved stuetemperatur på en rotor med 35 rpm at tværbinde proteinerne med membranen.
- Blokere membranerne i TBS-buffer indeholdende 0,05% (vol / vol) Tween 20 og 5% (vægt / vol) mælk i 1 time ved stuetemperatur.
- Inkubér blots med det primære antistof i blokeringsbuffer natten over ved 4 ° C.
- Vask membranerne tre gange i TBS-buffer og inkuberes dem med peroxidase- eller fluorofor-konjugeret sekundære antistoffer i TBS i 1 time ved stuetemperatur.
- Visualisere de bundne sekundære antistoffer ved kemiluminescens eller fluorescens ifølge etablerede protokoller 20.
7. Immunofluorescensanalyse
- Dehydrere dissekerede hjerner og rygmarv i et væv forarbejdningsstation og indlejre dem i paraffin under anvendelse af en paraffin station.
- Skær paraffinindstøbt tisanlægger med en mikrotom i 8 um tykke koronale snit og montere afsnittene om objektglas.
- Afparaffiniser vævssnit ved at inkubere dem i to separate xylol bade for 5 til 10 minutter og rehydrere dem gennem en række graduerede ethanolopløsninger bade (100%, 90%, 70%, 50%) og til sidst med H2O
- Inkubere sektionerne i 0,01 M citratpuffer (pH 6,0) i 5 minutter ved stuetemperatur og derudover kog dem i 10 minutter i en mikrobølgeovn.
- Lad sektionerne køle ned til stuetemperatur og inkubere dem med en 3% hydrogenperoxidopløsning i 30 minutter for at inhibere endogene peroxidaser.
- Blokere vævssnit ved inkubation med 20% (vol / vol) normalt gedeserum, 1% (vol / vol) bovint serumalbumin (BSA), og 0,5% Triton X-100 i PBS i 1 time ved stuetemperatur.
- Inkubere sektionerne med det primære antistof fortyndet i 1% (vol / vol) normalt gedeserum, 1% (vol / vol) BSA og 0,25% Triton X-100 i PBS natten over ved 4 ° C. <li> Vask sektionerne to gange med 0,25% (vol / vol) Triton X-100 i PBS og en gang med PBS.
- Plette sektioner med de tilsvarende fluorofor-konjugeret sekundære antistoffer og den nukleare farvestof DAPI fortyndet i 1% (vol / vol) normalt gedeserum, 1% (vol / vol) BSA, og PBS i 1 time ved stuetemperatur.
- Efter vask to gange med 0,25% (vol / vol) Triton X-100 i PBS og en gang med PBS, dækglas objektglassene med indlejring medier og visualisere farvning med et konfokalt laserscanningsmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Perifer injektion af alfa-synuclein prionoids via tungen eller bughinden induceret neuropatologi i CNS af bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) mus (tabel 1 og figur 1). Efter en enkelt intraperitoneal injektion med alfa-synukleinfibriller, fire af fem mus udviklede neurologiske sygdom med en median inkubationstid på 229 ± 17 dage. Overraskende kun én af fem mus udviklede CNS sygdom efter intraglossal injektion med alfa-synuclein fibriller efter 285 dage. Podning med PBS ikke forårsage sygdom inden for den periode af forsøget 420 dage.
Biokemisk analyse ved Western blotting og probing med phospho-specifikke EP1536Y antistof mod Ser129 af alfa-synuclein afslørede, at syge dyr for begge transmissionsveje havde akkumuleret aggregater af phosphoryleret og sarkosyl-insoluble alfa-synuclein i deres hjerner og rygmarv (tabel 2 og figur 2). I modsætning hertil hjerne og rygmarv PBS-injicerede og ikke-syge dyr kun indeholdt monomere arter af phosphoryleret alfa-synuclein.
Immunfluorescensfarvning af hjernen skiver af intraperitonealt injiceret og syge mus med phospho-specifikke PSYN # 64-antistof afslørede en bred fordeling af phosphorylerede alfa-synuclein indskud i hele CNS (Tabel 2 og figur 3). Desuden phosphorylerede alfa-synuclein indskud co-lokaliseret med ubiquitin og p62 indikerer en afvigende protein homeostase, som kan bidrage til dannelsen af aflejringer.
Ophobningen af a-synuclein aggregater i syge dyr blev ledsaget af neuroinflammatoriske ændringer, som blev påvist vedimmunfluorescensfarvning for GFAP, en markør for astrocytter, der kan afsløre reaktiv astrogliose (figur 4). Derudover blev aktiverede mikroglia også fundet i regioner med rigelige alfa-synuclein patologi ved immunfluorescensfarvning for IBA-1 (ioniseret calcium-bindende adaptormolekyle 1). I overensstemmelse, afslørede bioluminescens billeddannelse øget udstråling (> 2 × 10 6 s / s / cm2 / sr) udsendes fra hjernerne fra Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) mus injiceret med alfa-synukleinfibriller, kort før de udviklede tegn på neurologisk sygdom. I modsætning hertil hjerner fra mus injiceret med PBS ikke nogen stigning i udstråling. Øget udstråling er et tegn på reaktiv astrogliose, et kendetegn for neuroinflammation, eftersom luciferaseekspressionen drives fra GFAP promotoren.
Figur 1: Injektion med alfa-synukleinfibriller via intraperitoneal eller intraglossal rute forårsager sygdom i bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) mus. (A) Elektronmikrofotografi af sonikerede rekombinante humane alpha-synukleinfibriller der var intraperitonealt og intraglossally injiceret i mus. Negativ farvning med uranylacetat afslørede multiple klynger af korte stavformede aggregater. Skalapanelerne = 100 nm. (B) Kaplan-Meier-overlevelseskurver viser, at efter intraperitoneal injektion med alfa-synuclein fibriller fire af fem Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) mus udviklede neurologisk sygdom i 229 ± 17 dag (lilla lukkede firkanter), hvorimod ingen af PBS-injicerede kontrolmus udviklede tegn på neurologisk dysfunktion inden 420 dage (lilla åbne firkanter). Efter intraglossal podning med a-synuclein fibriller en mus af fem døde efter 285 dage (grønlukkede cirkler). I modsætning hertil var ingen af de PBS-injicerede kontrolmus udviklede neurologiske sygdom eller spontant døde (grønne cirkler). Modificeret fra Breid et al. 2016 14. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Biokemisk analyse af phosphoryleret alfa-synuclein i CNS af perifert injiceret Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) mus. (A) Immunoblotting med EP1536Y antistof erkendelse phosphorylering ved Ser129 af alfa-synuclein, viste, at intraperitonealt injicerede og syge mus akkumuleret høj molekylvægt arter af sarkosyl-uopløselige aggregater af phosphoryleret alfa-synuclein i deres hjerner end rygmarv. Kontrolmus provokeret med PBS blev ikke akkumuleret aggregater af phosphoryleret alfa-synuclein og viste bånd kun for sin monomere form. (B) Efter intraglossal udfordring med alfa-synukleinfibriller kun én mus, animal 121, udviste sarkosyl-uopløselige aggregater af phosphoryleret alfa-synuclein i hjerne og rygmarv, mens alle andre intraglossally inokulerede mus forblev sunde uden aflejringer af alfa-synuclein. Molekylmasser er vist i kilodalton. Prøvepåsætning i hver bane er vist ved påvisning af actin. Modificeret fra Breid et al. 2016 14. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Immunofluorescensanalyse viser, at aflejringer afphosphorylerede alfa-synuclein lokaliserer sig med ubiquitin og p62 i hjerne og rygmarv af sygdomsramt Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) mus. Co-farvning af phosphoryleret alfa-synuclein, påvist med EP1536Y antistof og ubiquitin afslørede en tydelig lokalisering i hjernen, som observeret i det thalamiske kerne (A), og rygmarv, som påvist i den grå substans (B), af syge mus efter intraperitoneal udfordring med alfa-synuclein fibriller. Tilsvarende phosphorylerede alfa-synuclein, påvist med PSYN # 64-antistof, også co-lokaliseret med p62 i hjerner (C) og rygmarv (D) fra syge dyr. (A til D) PBS-injicerede raske kontroldyr udviste ikke indskud eller colokalisering for nogen af disse proteiner. Nuklear farvning med DAPI er vist med blåt. Målestok = 20 um. Modificeret fra Breid et al. , 2016 14. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) udviklede musene gliose efter perifer udfordring med alfa-synuclein fibriller. (A) Immunofluorescensanalyse af hjerneudsnit fra syge dyr med et antistof mod GFAP, en markør for astrocytter, afslørede reaktiv astrogliose i områder med aflejringer af phosphoryleret alfa-synuclein, som blev påvist i hjernestammen med PSYN # 64-antistof. I modsætning hertil var der ingen reaktiv astrogliose i hjerner fra PBS-injicerede kontrolmus. (B) På samme måde farvning med et antistof til IBA-1, en markør for mikroglia, demonstrerede mikrogliosei områder med aflejringer af fosforyleret alfa-synuclein i syge dyr. Hjerner af sunde, PBS-injicerede kontrol mus viste ikke tegn på mikrogliose. (C) Bioluminescens billeddannelse afslørede forhøjede udstråling fra hjerne og rygmarv af Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) mus intraperitonealt injiceret med alfa-synukleinfibriller (venstre panel), som blev forårsaget af aktivering af astrocytter kort før musene udviklede neurologiske symptomer. I hjerne og rygmarv PBS-injicerede kontrolmus havde den basale udstråling ikke stige med tiden (højre panel). Efter intraglossal inokulation med alfa-synukleinfibriller, en Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) mus, dyr 121, viste tegn på reaktiv astrogliose kort før det døde 285 dage (center panel). (D) Efter intraperitoneal udfordring Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) mus med a-synukleinfibriller, increased niveauer af bioluminescens (> 2 × 10 6 s / s / cm2 / sr) blev målt fra hjernerne på fire mus (blå, grøn, brun, og orange cirkler) nogle uger før de udviklede neurologiske tegn på sygdom. En af fem dyr viste også forhøjede niveauer af bioluminescens kort før det døde 285 dage efter intraglossal injektion med alfa-synukleinfibriller (magenta cirkler). I modsætning hertil for sunde, PBS-injicerede kontrolmus (sorte cirkler; fejlsøjler viser SD [n = 4]) og et dyr, der ikke udvikler sygdommen efter intraperitoneal injektion med alfa-synukleinfibriller (røde cirkler), bioluminescensen signalet forblev under en tærskelværdi på 2 x 10 6 s / s / cm2 / sr inden observationsperioden. Målestok = 20 um. Modificeret fra Breid et al. 2016 14. Klik her for at se en større version af dennefigur.
| mus linje | Inoculum (ug) | podning rute | Antal mus med sygdom / nej. af mus inokuleret | Middeloverlevelsestiden ± SD (dage) |
| Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) | humane a-synuclein fibriller (50) | intraperitoneal | 4/5 | 229 ± 17/420 |
| Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) | PBS | intraperitoneal | 0/5 | 0/420 |
| Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) | humane a-synuclein fibriller (10) | intraglossal | 1/5 | 285/420 |
| Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) | PBS | intraglossal | 0/4 0/420 |
Tabel 1: Inokuleringsbetingelser eksperimenter. * Modificeret fra Breid et al. 2016 14
| Target [antistof klon] | Vært | immunogen | Fortynding i IF | Fortynding i WB |
| Actin [C4] | Mus | - | - | 1: 1,000 |
| α-synuclein, phospho S129 [PSYN # 64] | Mus | pSer129 | 1: 1200 | - |
| α-synuclein, phospho S129 [EP1536Y] | Kanin | pSer129 | 1: 100 | 1: 1,000 |
| Glial fibrillært surt protein (GFAP) | Kanin | - | 1: 200 | - |
| IBA-1 | Kanin | - | 1: 500 | - |
| Sequestosome-1 (p62) | Kanin | - | 1: 100 | - |
| Ubiquitin [Ubi-1] | Mus | - | 1: 500 | - |
Tabel 2: Antistoffer anvendes til immunofluorescens (IF) og Western blotting (WB). * Modificeret fra Breid et al. 2016 14
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Perifer injektion af alfa-synuclein fibriller i peritoneum af Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) -mus betegner en let metode til at inducere neurologisk sygdom ledsaget af neuroinflammation at rekapitulere vigtige kendetegn ved synucleinopatier. Tilsvarende tungen injektion repræsenterer en anden rute for neuroinvasion med alfa-synuclein prionoids i transgene mus, men er mindre effektiv. Vi valgte at opsige vores eksperimenter på 420 dage efter injektion, og vi kan ikke udelukke, at flere eller alle de fibril injicerede mus kan have udviklet sygdommen på et senere tidspunkt. Derudover anvendelsen af Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) mus muliggør ikke-invasiv visualisering af astrogliose og repræsenterer en enkel metode til overvågning inflammatoriske responser forårsaget af neuroinvasion af alfa-synuclein over hele levetid mus.
Et kritisk trin er fremstillingenaf podestoffet. Tilsyneladende trivielle faktorer som aggregering tid, lydbehandlingstid, den overflod af endotoksiner, eller mængden af fibriller anvendes til injektion kunne påvirke resultatet af et eksperiment ved at påvirke podning tilbøjelighed fejlfoldet alfa-synuclein 21. Derfor er det vigtigt altid at bruge de samme betingelser, når de udarbejder inokulum til injektion. For intraglossal injektioner må det antages, at ikke kun nerven under tungen, men også andre kraniale nerver ligesom glossopharyngeal nerve innerverer tungen og kunne være involveret i nye indbyrdes transport af alfa-synuclein prionoids til hjernen. Således rettet mod forskellige områder af tungen kan resultere i forskellige spredningskoder kinetik til hjernen. Vi har ikke direkte injicere i nerven under tungen, og det er muligt, at målrette nerven under tungen kunne forbedre CNS transmission af alfa-synuclein prionoids. For intraperitoneale injektioner med a-synukleinfibriller det er kritik afcal at inokulummet indsprøjtes korrekt i peritoneum og ikke ved et uheld i indre organer såsom tarm eller coecum, der kunne influere negativt neuroinvasion. Dette er også vigtigt for bioluminescens billeddannelse ved injektion D-luciferin. Mistargeting af D-luciferin på indre organer kunne bremse dets fordeling til hjernen og resultere i lavere bioluminescens. At opnå ensartede resultater under billeddannelse er det også afgørende at altid frisk fremstille D-luciferin opløsning før injektion og lade det nøjagtigt inkubere i 10 minutter efter intraperitoneal injektion før billeddannelse.
Bioluminescens billeddannelse er en nyttig metode til ikke-invasivt at måle ændringer i astrogliose over tid og kan anvendes ikke kun efter intraperitoneal eller intraglossal injektioner men også efter hver type behandling, herunder for eksempel, intracerebrale eller intravenøse injektioner. At overvåge spredning af alfa-synuclein prionoids fra periferien af KNS og den efterfølgende neuroinflammation vi bruges bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) mus. Fordi hemizygotiske ekspression af alfa-synuclein i disse dyr er 40% lavere i forhold til homozygote dyr, de forbliver frie af spontan sygdom i op til 22 måneder og har en egnet genetisk baggrund til alfa-synuclein transmission undersøgelser 13. modifikationer vedrørende valget af musemodellen for bioluminescens billeddannelse, kan dog være ønskelig. En interessant mulighed er anvendelsen af monogeniske Tg (GFAP -Luc +/-) mus, der udtrykker kun luciferase som et transgen, som muliggør en vurdering af prionoid opførsel af alfa-synuclein fibriller på en baggrund, der er i det væsentlige vildtype videst alfa-synuclein er bekymret 14. Endvidere krydser Tg (GFAP -Luc +/-) mus til andre transgene mus, såsom Tg (SOD1 G93A) mus til amyotrofisk lateral sklerose eller til Tg (APP23) mis til Alzheimers sygdom, gør det muligt for billeddannelse af neuroinflammation i andre sygdomsmodeller 22, 23.
En begrænsning af denne protokol er at baseret på injektionsstedet den injicerede inokulum kan ikke overstiger et bestemt omfang. Således kan kun udføres injektioner i tungen med mindre mængder end dem i peritoneum, hvilket kan påvirke transmissions- tider til CNS. En anden begrænsning er, at GFAP -Luc transgen kun tillader detektering af astrogliose men ikke af mikrogliose, der er lige så vigtigt i neuroinflammation. Endelig er denne model ikke giver indsigt, hvordan alfa-synuclein prionoids nå CNS efter intraperitoneal injektion.
Anvendelsen af exogene alfa-synuclein prionoids via injektion har vist sig at være en nyttig metode til at studere overføringsveje, der spiller en kritisk rolle i rekapitulerer karakteristika synucleinopathies. Intracerebrale injektioner af rekombinant alfa-synuclein fibriller eller sygdom-associeret muse eller humane alfa-synuclein arter i dyremodeller er blevet anvendt i flere undersøgelser til at analysere deres seeding egenskaber og transmission effektivitet over tid 5, 7, 17, 24, 25, 26. Eftersom stereotaktiske injektioner i hjernen altid inducere en lokal inflammatorisk respons kort efter kirurgi, kan denne transmission rute påvirke spredning og infektivitet af podestoffet forårsaget af en ændring af hjerne homeostase. Nyere undersøgelser har ændret fokus til perifere eller systemiske anvendelser, ikke primært for at undgå den kirurgiske procedure, men snarere at analysere periferien, tarmvæggen, skeletmuskel, eller blod, som et indledende punkt, hvorfra neuroinvasion til CNS kunne commence 6, 9, 14, 27. For prioner er det blevet vist, at transmission gennem bughinden eller tungen fører til neuroinvasion og neurologisk sygdom; efter tunge infektion, prioner spredning inden kun to uger til den hypoglossale kerne i hjernestammen 11. Eftersom alfa-synuclein er blevet diskuteret at have neuroinvasive og såning egenskaber som prioner viste vi, at transmission via tungen og bughinden repræsenterer yderligere indgang point for a-synuclein prionoids at invadere CNS 14. Kvantificering af astrogliose ved bioluminescens billeddannelse letter sporingen af neuroinflammatorisk proces over tid og repræsenterer en ikke-invasiv alternativ til histologisk analyse.
For at opnå en dybere indsigt i, hvordan CNS reagerer på neuroinvasion af alfa-synuclein prionoidsog til andre behandlinger, som forårsager neuroinflammation, ville det være gavnligt at generere musemodeller, som også tillader ikke-invasiv overvågning af mikrogliose, fx med et transgen, som driver luciferaseekspression fra en promotor specifik for protein ekspression i mikroglia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Olga Sharma, Theresa Hundt, og personalet i de DZNE mikroskopi og dyrefaciliteter for teknisk support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-actin antibody | Merck Millipore | MAB1501 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [pSyn#64] | Wako | 015-25191 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [EP1536Y] | Abcam | ab51253 | |
| anti-GFAP antibody | Dako | Z0334 01 | |
| anti-IBA-1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| anti-Sequestosome-1 (p62) antibody | Proteintech | 18420-1-AP | |
| anti-ubiquitin antibody [Ubi-1] | Merck Millipore | MAB1510 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190169 | |
| Ketamine | Ratiopharm | 100 mg/kg | |
| Xylazine | Ratiopharm | 10 mg/kg | |
| 27 G syringe | VWR | 613-4900 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | PZN 4831850 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Secureline lab marker | Neolab | 25040 | |
| D-luciferin potassium salt | Acris | LK10000 | 30 mg/mL stock solution |
| Thermomixer | Eppendorf | 5776671 | |
| Sonopuls Mini20 sonicator | Bandelin | 3648 | |
| IVIS Lumina II imaging system | PerkinElmer | ||
| Living Image 3.0 Software | PerkinElmer | ||
| Tg(M83+/-) mice or B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice | The Jackson Laboratory | 004479 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| N-laurylasarcosyl | Sigma | L5125-100G | |
| Optima Max-XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | TLA-110 rotor | |
| Thickwall polycarbonate tubes | Beckman Coulter | 362305 | |
| NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | WG1401BOX | |
| HRP conjugated antibody | Cayman | Cay10004301-1 | |
| IR Dye 680 conjugated antibody | LI-COR Biosciences | 926-68070 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34075 | |
| Stella 3200 imaging system | Raytest | ||
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Biosciences | ||
| Tween 20 | MP Biomedicals | TWEEN201 | |
| Triton X-100 | Sigma | SA/T8787 | |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Merck Millipore | IPFL00010 | |
| Xylol | Sigma | Roth | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | SA/00216763/000500 | working solution 3% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Thermo Fisher Scientific | A3294-100G | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | working dilution 1:50,000 |
| Fluoromount media | Omnilab | SA/F4680/000025 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | ||
| HALT protease and phosphatase inhibitors | Thermo Fisher Scientific | 10516495 | |
| Precellys 24-Dual homogenizer | Peqlab | 91-PCS24D | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A31619 | |
| Alexa Fluor 594 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 10741395 | |
| Microtome RM2255 | Leica | ||
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss |
References
- Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459 (7249), 924-925 (2009).
- Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Freeman, T. B. Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson's disease. Nat Med. Olanow, C. W. 14 (5), 504-506 (2008).
- Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).
- Hansen, C., et al. alpha-Synuclein propagates from mouse brain to grafted dopaminergic neurons and seeds aggregation in cultured human cells. J Clin Invest. 121 (2), 715-725 (2011).
- Masuda-Suzukake, M., et al.
- Holmqvist, S., et al. Direct evidence of Parkinson pathology spread from the gastrointestinal tract to the brain in rats. Acta Neuropathol. 128 (6), 805-820 (2014).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
- Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1, 38 (2013).
- Sacino, A. N., et al. Intramuscular injection of alpha-synuclein induces CNS alpha-synuclein pathology and a rapid-onset motor phenotype in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10732-10737 (2014).
- Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33 (9), 2225-2228 (2012).
- Bartz, J. C., Kincaid, A. E., Bessen, R. A. Rapid prion neuroinvasion following tongue infection. J Virol. 77 (1), 583-591 (2003).
- Tamgüney, G., et al. Measuring prions by bioluminescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 15002-15006 (2009).
- Watts, J. C., et al. Transmission of multiple system atrophy prions to transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (48), 19555-19560 (2013).
- Breid, S., et al. Neuroinvasion of alpha-Synuclein Prionoids after Intraperitoneal and Intraglossal Inoculation. J Virol. 90 (20), 9182-9193 (2016).
- Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34 (4), 521-533 (2002).
- Zhu, L., et al. Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice. Neurosci Lett. 367 (2), 210-212 (2004).
- Bernis, M. E., et al. Prion-like propagation of human brain-derived alpha-synuclein in transgenic mice expressing human wild-type alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 3 (1), 75 (2015).
- Gunther, R., et al. Clinical testing and spinal cord removal in a mouse model for amyotrophic lateral sclerosis (ALS). J Vis Exp. (61), (2012).
- Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Nat Protoc. 2 (1), 141-151 (2007).
- Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).
- Kim, C., et al. Exposure to bacterial endotoxin generates a distinct strain of alpha-synuclein fibril. Sci Rep. 6, 30891 (2016).
- Keller, A. F., Gravel, M., Kriz, J. Live imaging of amyotrophic lateral sclerosis pathogenesis: disease onset is characterized by marked induction of GFAP in Schwann cells. Glia. 57 (10), 1130-1142 (2009).
- Stöhr, J., et al. Distinct synthetic Abeta prion strains producing different amyloid deposits in bigenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).
- Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice. J Exp Med. 209 (5), 975-986 (2012).
- Recasens, A., et al. Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys. Ann Neurol. 75 (3), 351-362 (2014).
- Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1 (1), 38 (2013).
- Peelaerts, W., et al. alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).
