Summary
(+/- M83: GFAP -Luc +/-) Tg periton ya da dil içine alfa-sinüklein fibrillerinin Çevresel enjeksiyon ailesel A53T mutasyon ve ateş böceği lusiferaz ile insan alfa-sinükleinin eksprese eden farelerden, nöro de dahil olmak üzere, nevropatlojinin uyarabilir bunların merkezi sinir sistemindeki.
Abstract
yanlış katlı alfa-sinüklein prion benzeri bir davranış çalışma yapmak için, fare modelleri, merkezi sinir sistemi (CNS) içinde nevropatlojinin neden olan alfa-sinüklein prionoids, hızlı ve basit bir iletimine izin verir ihtiyaç vardır. Farelerde, prion proteini promoterinden A53T mutasyonu ile insan alfa-sinükleinin aşırı ifade eden ve ateş böceği lusiferaz: Burada bigenic Tg (GFAP -Luc +/- M83 +/-) içine alfa-sinüklein fibrillerinin bu intraglossal veya intraperitoneal enjeksiyon tarif glial fibriller asidik protein promotörü (GFAP), nöropatolojik hastalık oluşturmak için yeterlidir. Hayvanların bir ulaşana kadar spontan hastalığı serbest kalır: 8 ay, heterozigot Tg (GFAP -Luc +/- M83 +/-) bir yaşta başlayan şiddetli nörolojik semptomlar gelişebilir homozigot Tg (M83 + / +) fareler karşılaştırıldığında 22 ay yaşı. İlginç bir şekilde, intraperitone ile alfa-sinüklein fibrillerinin enjeksiyonu229 ± 17 günlük bir ortalama kuluçka süresi ile farelerde: el yol beş Tg (GFAP -Luc +/- M83 +/-) dördünde felçli nörolojik hastalık kaynaklı. Hastalıklı hayvanların beyinleri ve omurilik fosforile alfa-sinüklein ciddi birikme gösterdi. alfa-sinüklein birikimleri sarkosil çözünmeyen ve ubikuitin ve P62 ile birlikte lokalize olduğunu ve astrositik gliyoz ve mikrogliyozu sonuçlanan bir enflamatuar tepki eşlik etti. Şaşırtıcı bir şekilde, dil içine alfa-sinüklein fibrillerinin aşılama 285 gün sonra, alfa-sinüklein patolojiyi gösteren beş enjekte edilen hayvanların sadece bir tanesi ile hastalığa neden olan daha az etkili olmuştur. Bulgularımız (+/- M83: GFAP -Luc +/-) intraperitoneal yolla intraglossal rota ve daha çok yolu ile aşılama Tg sinükleinopatilerin ilgili işaretlerinden ile nörolojik hastalık ortaya çıkarmak için uygun olduğunu göstermektedir fareler. Bu neden prion-benzeri patojenezinin araştırılması için yeni bir model sağlardaha ayrıntılı olarak, alfa-sinüklein prionoids tarafından d.
Introduction
alfa-sinüklein özellikle kendinden tohuma sıfatıyla prion proteininin benzeyen ve hücreler arasındaki ve nöronal yollar boyunca yanlış katlanması yaymak özelliklere sahip olduğunu kanıtlar gittikçe artmaktadır. Alfa-sinüklein Bu özellik aynı zamanda 'prion-benzeri' ya da 'prionoid' olarak adlandırılır, ve yeni sağlıklı nöronlar 1, 2 nakledilen hastalıklı nöronlardan yanlış katlanmış alfa-sinüklein bulaşıcılığını göstermektedir nakli deneylerinde, gözlem ile desteklenmektedir , 3, 4. Ayrıca beyin veya çevresine, örneğin arka bacak, kas veya bağırsak duvarı, distal kısımlarına alfa-sinüklein patoloji yayılması ile sonuçlanır içine yanlış katlanmış alfa-sinüklein doğrudan enjeksiyon MSS 5, 6, 7, <sup sınıfı = "xref"> 8, 9, 10. Daha ayrıntılı olarak, periferik yollar ile alfa-sinüklein prionoids iletimini analiz edilmiş ve yanlış katlı alfa-sinüklein, tek intraglossal veya intraperitoneal enjeksiyondan sonra daha önce prionlar için değil, yanlış katlanmış alfa- için gösterilmiş olan bir özellik merkezi sinir neuroinvade olup olmadığı sorusunu ele synuclein. Dillerine prionların enjeksiyonundan sonra, CNS neuroinvasion beyin sapı 11 bulunur hipoglosal sinir, çekirdeğine neden dilin hipoglosal sinir boyunca yayılımı ile elde edilir. Tarafından astrositik aktivasyon izleme prion promotöründen insan alfa-sinüklein A53T mutantını aşırı ifade eden, ve ateş böceği bir GFAP promotörünün kontrolü altında lusiferaz fareler: bir fare modelinde olarak, Tg (GFAP -Luc +/- M83 +/-) seçtik biyoışıldama, daha önce beyinde de gösterildiği gibifareler 12 prion ile enfekte. Bizim ellerde bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) başkaları 13 tarafından gösterildiği gibi fareler yaşı 23 aya kadar hastalık olmadı. Beyinlerinde patolojisi ve Tg omurilik ile intraglossal ya da intraperitoneal yol kaynaklı nörolojik hastalık ile insan alfa-sinüklein fibrillerinin bir tek bir enjeksiyonu: hipotezi destekleyen farelerde (+/- M83 +/- GFAP -Luc) alfa-sinüklein prionoids prionların 14 ile önemli özellikleri paylaşır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
hayvanlar dahil tüm işlemler Kuzey Ren-Vestfalya Eyalet Çevre Ajansı (LANUV) hayvan koruma komitesi onayı ile gerçekleştirildi. Hayvanlar konuldu ve 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsünde ve yiyecek ve suya serbest erişim ile standart koşullara göre bakım.
1. Hayvan Modeli
- Çaprazlamak hemizigot Tg (GFAP -Luc +/-) hemizigot bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) oluşturmak için hemizigot Tg (M83 +/-) fareler ile farelerinde 15, 16.
- Ateşböceği lusiferaz 12, 17 için transgen kodlayan insan alfa-sinüklein ve standart PCR ile varlığı için, gerçek zamanlı PCR ile soy bir genotip.
- Altı-sekiz haftalık bir yaşta hayvanları aşılamak.
2. Aşı hazırlanması
- mo hazırlayınolduğu gibi 20 mM Tris-HCl (pH 7.2) içinde 150 mM NaCl içeren Tris-tamponlu tuzlu su (TBS) tampon içinde A53T mutasyonu ile nomeric rekombinant insan alfa-sinüklein, daha önce 14 tarif.
- 800 rpm ve 5 gün boyunca 37 ° C'de bir orbital çalkalayıcı içinde monomerik rekombinant insan alfa-sinüklein 3 ug / uL çalkalanması suretiyle aşıları için fibril alfa-sinükleinin hazırlayın.
- intraglossal aşılar için intraperitoneal ya da 2 ug / uL için 1 ug / uL nihai konsantrasyona ulaşmak için fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde fibril montajları seyreltin.
- Buz üzerinde (her bir darbe ve% 50 olarak belirlenmiş bir genliği arasındaki bir saniyelik bir ara ile 0.5 s süresi 40 darbeleri) 1 dakika boyunca çubuk sonikatör ile alfa-sinüklein fibriller parçası. Çapraz tohumlama ile kirlenmesini önlemek için. Farklı inokülumu hazırlamak için temiz sonication sondalar kullanın.
3. Intraglossal Enjeksiyonlar
- Bir intrape hayvanlara anestezi100 mg / kg ketamin ve 10 mg / kg ksilazin ritoneal enjeksiyonu. hayvanın ayak sıkıştırın ve uygun anestezi sağlamak için elinden hindlimb çekilme olmadığını teyit etmektedir. anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için hayvanın gözleri veteriner merhem kullanın.
- dikkatle araştırmacı doğru bakan başlarını dorsal yatar konumda bir ısıtıcı plaka üzerine yapıştırıcı bant ile narkotize hayvanlar sabitleyin.
- ultrasonik titreşim alfa-sinüklein liflerin veya PBS 5 uL 27 G tek kullanımlık deri altı şırınga doldurun.
- hayvanın ağzı açık tutmak için tırtıklı ipuçları ile bir küt burunlu başparmak forseps kullanın ve forseps daha küçük olan ikinci çifti dikkatle enjeksiyon için dilin alt tarafı erişilebilir hale getirmek dilini dışarı çekmek için.
- Hipoglossal sinire yakın dilin sağ veya sol alt tarafına şırınganın iğnesini enjekte edin. Yavaşça 5 sn sonra inokulum enjekte edin. Yavaşça inokulum sağlamak için 5 sn sonra iğneyi geri çekindoku nüfuz etmiş ve geri çekilmeden iğne olurken kayıp değildir.
- onun tespitlerinin gelen hayvan bırakın ve tam iyileşme kadar sürekli izleme altında ısıtma plakası üzerinde bırakın.
4. intraperitoneal enjeksiyonları
- periton içine enjeksiyonlar için, 2 L / dakikalık bir akış oranı ve% 2 olarak ayarlanır buharlaştırıcı kullanılarak izofluran / oksijen ile soluma yoluyla bir anestezi bölmesi içerisinde kısa bir süre hayvanlar uyuşturuyorsun. hayvanın ayak sıkıştırın ve uygun anestezi sağlamak için elinden hindlimb çekilme olmadığını teyit etmektedir.
- ultrasonik titreşim alfa-sinüklein, fibrillerin ya da PBS, 50 uL, 27 G tek kullanımlık deri altı şırınga doldurun.
- Doğrudan fare periton içine enjekte ve araştırmacı uzağa bakan kafası olan bir sırt pozisyonda hayvan tutma ve aşağı doğru yaklaşık 45 ° ile karın duvarının arkasına yerleştirilmiş, ince bağırsağa veya çekum nüfuz kaçının. , tamamen iyileşene kadar hayvan izleyinanesteziden.
5. Biyoparlaklık Görüntüleme
- Resim Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) farelerde bir biyoışıldama görüntüleme sistemi kullanılarak her 2-4 haftada bir.
- kısa bir süre görüntüleme 2 L / dk'lık bir akış oranı ve% 2 olarak ayarlanmış buharlaştırıcı ile izofluran / oksijen bölmesi içinde fareler anestezi önce. hayvanın ayak sıkıştırın ve uygun anestezi sağlamak için elinden hindlimb çekilme olmadığını teyit etmektedir.
- Tıraş ve tüy dökücü bir kremle farelerin başları atmaktadır. spesifik olmayan biyoluminesansının engellemek için bir tahriş işaretleyici ile siyah kulaklarını renklendirin.
- 30 mg / mL stok solüsyonu PBS içinde D-lusiferin potasyum tuzu, lusiferaz alt-tabakanın, seyreltin. -20 ° C'de 1 ml'lik numuneler bu saklayın. ışığa maruz çözülmüş D-lusiferin koruyun.
- enjeksiyondan önce hayvanlar tartılır. 150 mg / kg vücut ağırlığı, enjeksiyon için, D-luciferase tam hacmi hesaplayın. İntraperitoneal D enjekte-luciferin ve anestezi bölmesi hayvan dönün.
- görüntüleme yazılımını başlatın. görüntüleme sistemi ulaşmıştır sonra onun çalışma sıcaklığı kontrol panelinde 'Initialize' düğmesine tıklayarak sistemini başlatın.
- düğmeleri 'Luminescent' ve 'fotoğrafı seçin. 60 sn, 'Orta', F / Stop '1' e binning ve 'Kapalı' EM kazanç pozlama süresini ayarlayın.
- uyarma filtresi 'Aç' için 'Blok' ve emisyon filtresine ayarlandığını doğrulayın ve 1.50 cm tabi yüksekliğini ayarlayın.
- On dakika D-lusiferin ile enjeksiyondan sonra, görüntüleme odasında ısıtma plakası üzerine, hayvanları ve Ağızlıklar doğru anestezi çıkışına yerleştirilmiş olduğundan emin olun. inhalasyon odasından izofluran / oksijen akışı kapatın ve 0.25 L / dk'lık bir akış oranı ve% 2'lik bir buharlaştırma ile görüntüleme bölmesi için akış açın. görüntüleme odasının pr kapağını kapatınoperly.
- 60 s sürer ışıldaması, ölçmek için 'Acquire' butonuna tıklayın. izofluran akışını durdurun ve onlar tamamen kendi kafeslerine geri döndükten sonra iyileşene kadar hayvanları izlemek.
- biyoluminesansının ölçmek için görüntüleme yazılımı kullanın. 'Araç Paleti' içinde 'ROI Araçlar' ı seçin. YG Araçları 'içinde 'Türü' altında 'Ölçüm YG'yi' seçin.
- YG Araçları 'kapsamında "daire" aracını tıklayın ve açılan menüden çizmek ROI sayısını seçmek - ideal olarak '3' üç fareler için.
- resimde, her bir ilgi ve altındaki 'Özellikleri' 1.25 cm genişliği ve yüksekliği ayarlamak sağ tıklayın. ölçülür beyin alanı üzerinde her bir YG yerleştirin.
- Resmin sol üst olarak, '(fotonlar)' için birim paneli ayarlayın.
- 'Araç Paleti' içinde, seçin 'Görüntü ayarla' ve minimum ayarlamak ve0.20e6 den 1.00e6 için örneğin 'Renk Ölçeği', maksimum.
- 'Dosya' altında 'Kaydet' ile verileri kaydetmek.
6. Biyokimyasal Analizi
- Standart prosedürlere 18, 19 uygun olarak beyin ve omurilik izole edin.
- bir doku homojenleştirici 6000 rpm'de iki 30 döngüleri (PBS 1x seyreltilmiş) proteaz ve fosfataz inhibitörleri varlığında ayrı PBS içinde bütün beyin ve bütün omurilik örnekleri homojenize. beyin ve omurilik numuneleri% 20 (ağırlık / hacim) bir son konsantrasyona kadar homojenize emin olun.
- 10 s sabit bir nabız ve% 50 olarak ayarlanır, bir genlik ile buz üzerinde tutarken, iki kez numune sonikasyon.
- PBS içinde 1.5 M NaCl ile 1: olanağına 1 seyreltilerek PBS ve 750 mM NaCl içinde% 10 homojenatları ayarlayın.
- hücre tortularım ayırmak için, 5 dk için 1000 x g'de santrifüj homojenatları4 ° C. Bir sonraki adımlar için süpernatantlar tutun ve granül atın.
- üreticinin talimatlarına uygun olarak bisinkoninik asit (BCA) deneyi kullanılarak homojenatlarda protein konsantrasyonu ölçülür. Buz üzerinde 15 dakika süre ile,% 10 (ağırlık / hacim) içindeki bir nihai konsantrasyonda, N-laurylsarcosyl omurilik homojenatlarında homojenleştirilmiş beyinlerinden toplam proteinin 1.0 mg ya da 0.8 mg inkübe edin.
- damıtılmış su içinde% 10 (ağırlık / hacim) içindeki bir 3 ml sakroz yastığı üzerine homojenatları Yerleşimi ve 4 ° C 'de 1 saat boyunca 465,000 x g'de bunları ultrasantrifüj.
- % 4 sodyum dodesil sülfat (SDS),% 2 β-merkaptoetanol, 192 mM glisin, 25 mM Tris ve% 5 (ağırlık / hacim) sukroz içeren bir tampon içinde yeniden süspanse peletler.
- 5 dakika boyunca 100 ° C'de örnekleri kaynatın ve morpholineethanesulfonic asit (MES), tampon sisteminde elektroforez için SDS-poliakrilamit jeller üzerine yerleştirin.
- Bir sem ayrılan poliviniliden diflorit proteinler (PVDF) zarlara aktarmablot sistemi idry.
- Çapraz bağlantı 35 rpm'lik bir rotor üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS (hacim / hacim) formalin çözeltisi membran proteinleri% 0.4 membranları inkübe edin.
- % 0.05 (hacim / hacim) içeren TBS tamponu Tween 20 ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 5 (ağırlık / hacim) süt membranları bloke eder.
- 4 ° C'de gece boyunca bloke edici tampon içinde primer antikor ile blot inkübe edin.
- TBS tampon membranlar üç kez yıkanır ve oda sıcaklığında 1 saat süre ile TBS içinde peroksidaz ya da florofor-konjuge sekonder antikor ile inkübe edin.
- Kurulu protokollere 20'ye göre kimyasal ışıldama veya floresan ile bağlı sekonder antikor görselleştirmek.
7. immünofloresan analizi
- bir doku işleme istasyonunda disseke beyinleri ve omurilik Kurut ve bir parafin istasyonunu kullanarak parafin içine gömmek.
- parafine gömülü tis Kesme8 mikron kalınlığında koronal bölümlerde bir mikrotom ile dava açar ve lamlar üzerine bölümler monte edin.
- 5 ila 10 dakika için iki ayrı ksilol banyolarında enkübe edilerek doku bölümleri deparafınize ve dereceli etanol banyoları (100,% 90,% 70,% 50,%) bir dizi ve son olarak da H2O ile rehidrate
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 0.01 M sitrat tampon maddesi (pH 6.0) bölümleri inkübe ve buna ek olarak bir mikrodalga fırın içinde 10 dakika boyunca kaynatın.
- kesitleri oda sıcaklığına kadar soğuması ve endojen peroksidazlar inhibe 30 dakika süreyle% 3 hidrojen peroksit çözeltisi ile inkübe edin.
- % 20 (hacim / hacim) normal keçi serumu,% 1 (hacim / hacim) sığır serum albümini (BSA) ve% 0.5 Triton X-100, oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS içinde ile kuluçkalama ile doku bölümleri bloke eder.
- % 1 (hacim / hacim) normal keçi serumu,% 1 (hacim / hacim) BSA ve% 0.25 Triton, PBS içinde X-100, gece boyunca 4 ° C'de seyreltilmiş primer antikor ile bölümleri inkübe edin. <li>% 0.25 (hacim / hacim) Triton X-100, PBS içinde bir kez PBS ile iki kez bölümleri yıkayın.
- karşılık gelen fluorofor-konjuge sekonder antikor ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 1 seyreltilmiş nükleer boya DAPI (hacim / hacim) normal keçi serumu,% 1 (hacim / hacim) BSA ve PBS bölümleri leke.
- % 0.25 (hacim / hacim) Triton X-100, PBS içinde bir kez PBS ile iki kez yıkandıktan sonra, gömme ortamı ile slaytlar lamel ve konfokal lazer tarama mikroskobu ile boyama görselleştirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fareler (Tablo 1 ve Şekil 1): dil ya da bigenic Tg CNS (GFAP -Luc +/- M83 +/-) içerisinde periton neden nöropatoloji ile alfa-sinüklein prionoids periferik enjeksiyonu. alfa-sinüklein fibrillerinin ile tek bir entraperitoneal enjeksiyon sonrasında beş fareden oluşan dört 229 ± 17 günlük bir ortalama kuluçka süresi ile nörolojik hastalık geliştirdi. Şaşırtıcı bir şekilde, sadece, bir ila beş arasında fareler, 285 gün sonra, alfa-sinüklein fibrilleri ile intraglossal enjeksiyonundan sonra merkezi sinir sistemi hastalığı geliştirdi. PBS ile aşılama deney 420 günlük süre içinde hastalığa neden olmadı.
Batı beneklemesi ve alfa-sinüklein Ser129 karşı fosfo-spesifik EP1536Y antibadi ile araştırılarak biyokimyasal analizi, her iki aktarma yolları için hastalıklı hayvanların fosforile ve Sarkosil agrega biriken ortayabeyinleri ve omurilik (Tablo 2 ve Şekil 2) olarak -insoluble alfa-sinüklein. Bunun aksine, beyin ve PBS ile enjekte edilen ve hastalanmayan hayvan omurilik yalnızca fosforillenmiş alfa-sinüklein monomer türlerini ihtiva etmiştir.
fosfo-spesifik pSyn 64. antikoru ile intraperitoneal olarak enjekte edilir ve hastalıklı farelerin beyin kesitleri immünofloresan boyama CNS yoluyla fosforile alfa-sinüklein yataklarının geniş bir dağılım gösterdi (Tablo 2 ve Şekil 3). Ayrıca, fosforile alfa-sinüklein yatakları ubikitin ve P62 kaplama oluşumuna katkıda bulunabilir bir atipik protein homeostasisi gösteren ile birlikte lokalize.
Hastalıklı hayvanların alfa-sinüklein agregaların birikimi ile tespit edilmiştir nöroenflamatuar değişiklikler eşlikGFAP, reaktif astrogliyozun ortaya çıkarabilir astrositler bir belirteci (Şekil 4) immünofloresan boyama. Buna ek olarak, aktif mikroglia IBA-1 için immünofloresan boyama ile bol alfa-sinüklein patoloji (iyonize kalsiyum bağlayıcı adaptör molekülü 1) ile bölgelerde bulunmuştur. Uygun olarak, biyoışıldama görüntüleme parlaklığı yüksek olduğunu gösterdi (> 2 x 10 6 s / s / cm2 / sr) Tg beyinlerinden yayılan (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) alfa-sinüklein fibrillerinin enjekte edilen fareler, onlar nörolojik hastalık belirtileri geliştirdi kısa bir süre önce. Buna karşılık, PBS ile enjekte edilen farelerin beyinleri ışıltısını herhangi bir artış göstermedi. Lusiferaz ekspresyonu GFAP promotörü ile yapılır çünkü artan parlaklık, reaktif astrogliyozun, nöro bir özelliğidir göstergesidir.
Şekil 1: Farelerde: intraperitoneal veya intraglossal yolla alfa-sinüklein fibrillerinin ile enjeksiyon (GFAP -Luc +/- +/- M83) bigenic Tg hastalığa neden olmaktadır. Edildi sonike rekombinant insan alfa-sinüklein fibrillerinin (A) elektron mikrografı intraperitoneal ve intraglossally farelere enjekte edildi. uranil asetat ile negatif boyama kısa, çubuk şeklindeki agrega çoklu gruplar ortaya çıkardı. Ölçek çubukları 100 nm =. Fareler (mor kareler kapalı) 229 ± 17 gün içinde nörolojik hastalık geliştirmiş: (B) Kaplan-Meier hayatta kalma eğrileri, dört, beş, Tg alfa-sinüklein fibrilleri ile intraperitoneal enjeksiyon (GFAP -Luc +/- M83 +/-) sonra göstermektedir PBS enjekte edilmiş kontrol farelerinden hiç biri 420 gün (mor açık kareler) içinde nörolojik fonksiyon bozukluğu belirtileri görülmüştür, oysa. alfa-sinüklein fibrilleri ile intraglossal aşılamadan sonra beş kişiden biri fare 285 gün sonra öldü (yeşilKapalı daireler). Buna karşılık, PBS enjekte kontrol farelerinden hiç (yeşil açık daireler) öldü kendiliğinden nörolojik hastalık gelişti ya. Breid et al den modifiye edilmiştir. 2016 14. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 2: fareler: çevresel MSS fosforile alfa-sinüklein biyokimyasal analizi Tg (GFAP -Luc +/- M83 +/-) enjekte edildi. (A) 'Bağışıklık EP1536Y antikoru ile, alfa-sinüklein Ser129 fosforilasyondan tanıyan, intraperitoneal olarak uygulanmış ve hastalıklı farelerin beyinlerinde fosforile alfa-sinüklein sarkosil-erimez agregaların varlığı veya yüksek molekül ağırlıklı türlerin birikmiştir, bird omurilikler. PBS ile tehdit Kontrol fareleri, fosforile edilmiş alfa-sinüklein agrega birikir ve sadece monomerik form için bant gösterdi yoktu. Diğer tüm intraglossally inoküle edilmiş fareler, alfa-sinüklein birikmeksizin sağlıklı kalmıştır ise alfa-sinüklein fibrillerinin tek bir fare, hayvan 121 ile intraglossal Tehditten sonra (B) olarak, beyin ve omurilik fosforile alfa-sinüklein sarkosil çözülmeyen agrega göstermiştir. Moleküler kütleleri kilodaltonlarla gösterilmiştir. Her şeritte örnek yükleme aktin tespiti ile gösterilmiştir. Breid et al den modifiye edilmiştir. 2016 14. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 3: immünofloresans analizi bu mevduat göstermektedirfarelerde: fosforile alfa-sinüklein beyin ve hastalıklı Tg (GFAP -Luc +/- M83 +/-) omuriliklerinde ubikuitin ve P62 ile colocalize. Talamik çekirdeği, (A) ve omurilik gözlenen gri madde (B) 'de tespit edilen, EP1536Y antikoru ile tespit fosforile alfa-sinüklein Co-boyama, ve ubikitin, beyinlerinde ayrı bir ko ortaya ait alfa-sinüklein fibrilleri ile intraperitonal yüklemeden sonra hastalıklı farelerin. Benzer şekilde, pSyn 64. antikoru ile tespit fosforile alfa-sinüklein, aynı zamanda beyinleri (C) ve hastalıklı hayvan omurilik (D) 'de P62 ile birlikte lokalize. (A ila D), bu proteinlerin herhangi biri için tabakalar ya da ko göstermemiştir sağlıklı hayvanlar, PBS enjekte edilir. DAPI ile nükleer boyama mavi renkte gösterilir. Ölçek çubukları 20 um =. Breid et al den modifiye edilmiştir. 2016 14. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 4: Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) farelerde alfa-sinüklein fibrilleri ile çevresel yüklemeden sonra gliozis geliştirdi. GFAP, astrositler bir göstergesi, karşı bir antikor ile hastalıklı hayvanların beyin kesitlerinin (A), immünofloresans analizi pSyn 64. antikoru ile beyin sapı tespit edilmiştir fosforile alfa-sinüklein, mevduat olduğu bölgelerde reaktif astrogliyozun saptandı. Bunun aksine, PBS ile enjekte edilmiş kontrol farelerinin beyinlerinde hiçbir reaktif astrogliasis yoktu. (B) Benzer bir şekilde, IBA-1 için olan bir antikor ile boyanarak, mikroglia bir belirteci mikrogliyoz gösterdiHastalıklı hayvanların fosforile alfa-sinüklein yatakları olan alanlarda. Sağlıklı, PBS enjekte kontrol farelerin beyinleri mikrogliyozu belirtileri göstermemiştir. Astrositlerin aktivasyonu neden oldu intraperitoneal alfa-sinüklein fibrillerinin (sol panel) enjekte edilmiş farelerin, (C) Biyolojik olarak görüntüleme beyin ve (GFAP -Luc +/- +/- M83) Tg omurilik ile ilgili yükseltilmiş parlaklık ortaya fareler nörolojik semptomlar geliştirmiştir kısa bir süre önce. PBS enjekte edilmiş kontrol farelerinin beyin ve omurilik bazal parlaklık süresi (sağ panel) ile artmamıştır. Alfa-sinüklein fibrillerinin ile intraglossal Aşılamadan sonra, tek bir Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) fare, hayvan 121, bu 285 gün (orta panel) öldü kısa bir süre önce, reaktif astrogliyozun belirtileri gösterdi. Tg intraperitoneal Tehditten sonra (D) (+/- M83: GFAP -Luc +/-) alfa-sinüklein fibriller, increa ile fareninbiyolüminesans sed seviyeleri (> 2 x 10 6 s / s / cm2 / sr) hastalığın nörolojik belirtilerin ortaya birkaç hafta önce dört fareden (mavi, yeşil, kahverengi ve portakal daireler) beyinlerinden ölçüldü. Beş hayvandan biri de 285 gün alfa-sinüklein fibrillerinin (eflatun daireler) ile intraglossal enjeksiyondan sonra ölen kısa bir süre önce biyolüminesans yüksekliğidir gösterdi. Sağlıklı, PBS ile enjekte edilmiş kontrol faresi için aksine, ve alfa-sinüklein fibrillerinin (kırmızı daireler) ile intraperitoneal enjeksiyon sonrasında hastalık olmadı bir hayvan, biyoluminesans sinyali kalmıştır (siyah dairelerle hata çubukları SD [n = 4] göstermektedir) gözlem süresi içinde 2 x 10 6, p / s / cm2 / sr bir eşik değerinin altında. Ölçek çubukları 20 um =. Breid et al den modifiye edilmiştir. 2016 14. Bu daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınrakam.
| Fare çizgi | Aşı (ug) | Aşılama rota | hastalıklı farelerin sayısı / no. Farelerin aşılanmış | ± SD ortalama hayatta kalma süresi (gün) |
| Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) | İnsan α-sinüklein fibriller (50) | intraperitonal | 4/5 | 229 ± 17/420 |
| Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) | PBS | intraperitonal | 0/5 | 0/420 |
| Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) | İnsan α-sinüklein fibriller (10) | intraglossal | 1/5 | 285/420 |
| Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) | PBS | intraglossal | 0/4 0/420 |
Tablo 1: Aşılama deneyleri. * Breid et al den modifiye edilmiştir. 2016 14
| Hedef [antikor klonu] | evsahibi | antijen | IF Seyreltme | WB Seyreltme |
| Aktin [C4] | Fare | - | - | 1: 1000 |
| α-sinüklein, fosfo S129 [pSyn 64.] | Fare | pSer129 | 1200: 1 | - |
| α-sinüklein, fosfo S129 [EP1536Y] | Tavşan | pSer129 | 1: 100 | 1: 1000 |
| Glial fibriller asidik protein (GFAP) | Tavşan | - | 1: 200 | - |
| IBA-1 | Tavşan | - | 1: 500 | - |
| Sequestosome-1 (P62) | Tavşan | - | 1: 100 | - |
| Ubikuitin [Ubi-1] | Fare | - | 1: 500 | - |
Tablo 2: immunfloresan (IF) ve Batı lekeleme (WB) için kullanılan antikorlar. * Breid et al den modifiye edilmiştir. 2016 14
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) periton içine alfa-sinüklein fibrillerinin Çevresel enjeksiyon farenin sinükleinopatilerin önemli özelliklerini özetlemek için nöro eşlik nörolojik hastalık oluşturmak için, basit bir yöntemi temsil eder. Benzer bir şekilde, dil enjeksiyon transgenik farelerde alfa-sinüklein prionoids ile neuroinvasion için başka bir yol tasvir eder fakat daha az etkilidir. Biz enjeksiyon sonrası 420 gün bizim deneyler sonlandırmak için seçti ve biz daha fazla veya kökcük enjekte edilmiş farelerin hepsinde daha sonraki bir zaman noktasında bu hastalığa yakalanmış olabilir durum gözardı edilemez. Buna ek olarak, (+/- M83: GFAP -Luc +/-) Tg kullanımı farelerin astrogliyozun müdahalesiz görüntülenmesine olanak sağlar ve bütün ömrü boyunca alfa-sinüklein neuroinvasion neden olduğu enflamatuar yanıtları izlemek için basit bir metodu temsil eder fare.
Kritik bir safha, hazırlanmasıdırinokulum. Birleştirme süresi, sonikasyon zaman, endotoksin bolluğu, veya yanlış katlanmış alfa-sinüklein 21 tohumlama eğilimini etkileyerek bir deney sonucunu etkileyebilecek enjeksiyon için kullanılan fibrillerin miktarı gibi görünüşte önemsiz faktörler. Böylece enjeksiyon için inokulum hazırlarken her zaman aynı koşullar kullanmak önemlidir. intraglossal enjeksiyonlar için hipoglosal sinir, aynı zamanda glossofaringeal sinir gibi diğer kranyal sinirler, sadece dil innerve ve beyin alfa-sinüklein prionoids arasında internöronal taşınmasında rol de göz önüne alınmalıdır. Bu nedenle beyin farklı yayılma kinetiği neden olabilir zıvananın farklı alanları hedefleyen. Biz doğrudan Hipoglossal sinir içine enjekte yoktu ve Hipoglossal siniri hedeflemesi alfa-sinüklein prionoids CNS iletimini geliştirmek mümkündür. alfa-sinüklein fibrillerinin intraperitoneal enjeksiyonlar için bu great.Thanks olduğuAşı doğru periton içine enjekte değil yanlışlıkla olumsuz neuroinvasion etkileyebilecek bağırsak veya çekum gibi iç organların içine almaktadır cal. D-lusiferin enjekte Bu aynı zamanda biyolüminesans görüntüleme için önemlidir. iç organlara D-lusiferin Hedef Değiştirme beyne dağılımını yavaşlatmak ve daha düşük biyolüminesans ile sonuçlanabilir. bunu görüntüleme sırasında homojen sonuçlar elde etmek için, aynı zamanda, her zaman taze enjeksiyondan önce ve tam görüntüleme önce intraperitonal enjeksiyon sonrası 10 dakika boyunca inkübe edin D-luciferase çözelti hazırlamak için çok önemlidir.
Bio-ışıldama görüntü zamanla astrogliyozun olmayan invazif ölçü değişiklikleri için yararlı bir yöntem olup, örneğin, beyin içi veya damar içi enjeksiyonlar için, sadece intraperitoneal veya intraglossal enjeksiyondan sonra değil aynı zamanda da dahil olmak üzere tedavi her türlü sonra uygulanabilir. CN çevresi arasında alfa-sinüklein prionoids yayılması izlemekS ve bigenic Tg kullanılan takip eden nöroenflamasyon (+/- M83: GFAP -Luc +/-) gösteren bir grafiktir. Bu hayvanlarda, alfa-sinüklein hemizigot ekspresyonunda bir yaş kadar 22 ay kendiliğinden hastalığın serbest kalır ve alfa-sinüklein iletimi için uygun bir genetik arka plan 13 çalışmalar sahip homozigot hayvanlar için% 40 daha düşük bağıl olduğu için. Ancak, biyolüminesans görüntüleme için fare modelinin seçimi bakımından değişiklikler istenebilir. İlginç bir seçenek sokak türü esas kadarıyla bir arka plan üzerinde alfa-sinüklein fibrillerinin prionoid davranışının bir değerlendirme sağlayan bir transgen, lusiferaz sadece ifade eden fareler (+/- GFAP -Luc) monogenik Tg kullanılmasıdır alfa-sinüklein 14 ilişkindir. Ayrıca, bu gibi Tg (SOD1 G93A) amiyotrofik lateral skleroz ya da Tg (APP23) m fareler gibi diğer transjenik fareler, Tg (GFAP -Luc +/-) fareler geçenAlzheimer hastalığı için buz, 23, diğer hastalık modellerinde 22 nöro görüntüleme sağlar.
Bu protokolün bir sınırlama enjeksiyon yerinde göre enjekte aşı, belirli bir hacim geçemez olmasıdır. Bu nedenle dil içine enjeksiyonu sadece CNS'deki iletim süreleri etkileyebilen periton içine bu, daha küçük hacimli gerçekleştirilebilir. Diğer bir sınırlama, GFAP -Luc transgen sadece değil, nöro aynı derecede önemlidir mikrogliyozu ait astrogliyozun saptanmasına izin vermektedir. Son olarak, bu model alfa-sinüklein prionoids intraperitoneal enjeksiyon sonrasında CNS nasıl ulaşacağını gibi bilgileri sağlamaz.
enjeksiyon ile ekzojen alfa-sinüklein prionoids uygulama synuclei özelliklerini yansıtan de kritik bir rol oynadığı iletim yollan araştırmak için yararlı bir yöntem olduğu gösterilmiştirnopathies. Hayvan modellerinde rekombinant alfa-sinüklein liflerin veya hastalıkla ilişkili fare veya insan alfa-sinüklein türlerin intraserebral enjeksiyonu zamanda 5, 7, 17, 24, 25, 26 üzerindeki tohum özellikleri ve iletim verimliliği analiz için çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır. beyne sterotaktik enjeksiyonu her ameliyat kısa bir süre sonra lokal bir enflamatuvar yanıta neden olduğundan, bu iletim yolu yayılması ve beyin homeostazının bir değişikliğe neden inokulum enfeksiyon etkileyebilir. Daha yeni çalışmalar, esas olarak cerrahi prosedür önlemek için değil, CNS'ye neuroinvasion birlikte olabilir gelen bir başlangıç noktası olarak, çevreye, bağırsak duvarını, iskelet kası ya da kan analiz için, periferik veya sistemik uygulamalar için odak değiştimmence 6, 9, 14, 27. prionlara için periton üzerinden iletiminin gösterilmiştir ya da dil neuroinvasion ve nörolojik hastalığa neden; dil enfeksiyondan sonra, beyindeki hipoglossal çekirdeğine sadece iki hafta içinde yayıldı prionlardır 11 kaynaklanıyor. Alfa-sinüklein prionlar gibi neuroinvasive ve tohum özelliklerine sahip olduğu tartışılmıştır yana, dil ve periton ile aktarma merkezi sinir 14 istila alfa-sinüklein prionoids için başka giriş noktalarını temsil ettiğini gösterdi. biyoluminesans görüntüleme ile astrogliyozun miktarının zamanla nöro işleminin takip edilmesini kolaylaştırır ve histolojik analiz için non-invazif bir alternatiftir.
MSS alfa-sinüklein prionoids ait neuroinvasion nasıl tepki daha derin bir anlayış elde etmek içinve Nöro-neden olan diğer tedavilere, aynı zamanda mikroglia protein ifadesi için özel bir promoter lusiferaz ekspresyonunu tahrik eden bir transgen ile mikrogliyozu da non-invazif izleme, örneğin izin fare modelleri oluşturmak için yararlı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar Olga Sharma, Theresa Hundt ve teknik destek için DZNE mikroskopi ve hayvan tesislerinin çalışanlarına teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-actin antibody | Merck Millipore | MAB1501 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [pSyn#64] | Wako | 015-25191 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [EP1536Y] | Abcam | ab51253 | |
| anti-GFAP antibody | Dako | Z0334 01 | |
| anti-IBA-1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| anti-Sequestosome-1 (p62) antibody | Proteintech | 18420-1-AP | |
| anti-ubiquitin antibody [Ubi-1] | Merck Millipore | MAB1510 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190169 | |
| Ketamine | Ratiopharm | 100 mg/kg | |
| Xylazine | Ratiopharm | 10 mg/kg | |
| 27 G syringe | VWR | 613-4900 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | PZN 4831850 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Secureline lab marker | Neolab | 25040 | |
| D-luciferin potassium salt | Acris | LK10000 | 30 mg/mL stock solution |
| Thermomixer | Eppendorf | 5776671 | |
| Sonopuls Mini20 sonicator | Bandelin | 3648 | |
| IVIS Lumina II imaging system | PerkinElmer | ||
| Living Image 3.0 Software | PerkinElmer | ||
| Tg(M83+/-) mice or B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice | The Jackson Laboratory | 004479 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| N-laurylasarcosyl | Sigma | L5125-100G | |
| Optima Max-XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | TLA-110 rotor | |
| Thickwall polycarbonate tubes | Beckman Coulter | 362305 | |
| NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | WG1401BOX | |
| HRP conjugated antibody | Cayman | Cay10004301-1 | |
| IR Dye 680 conjugated antibody | LI-COR Biosciences | 926-68070 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34075 | |
| Stella 3200 imaging system | Raytest | ||
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Biosciences | ||
| Tween 20 | MP Biomedicals | TWEEN201 | |
| Triton X-100 | Sigma | SA/T8787 | |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Merck Millipore | IPFL00010 | |
| Xylol | Sigma | Roth | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | SA/00216763/000500 | working solution 3% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Thermo Fisher Scientific | A3294-100G | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | working dilution 1:50,000 |
| Fluoromount media | Omnilab | SA/F4680/000025 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | ||
| HALT protease and phosphatase inhibitors | Thermo Fisher Scientific | 10516495 | |
| Precellys 24-Dual homogenizer | Peqlab | 91-PCS24D | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A31619 | |
| Alexa Fluor 594 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 10741395 | |
| Microtome RM2255 | Leica | ||
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss |
References
- Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459 (7249), 924-925 (2009).
- Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Freeman, T. B. Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson's disease. Nat Med. Olanow, C. W. 14 (5), 504-506 (2008).
- Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).
- Hansen, C., et al. alpha-Synuclein propagates from mouse brain to grafted dopaminergic neurons and seeds aggregation in cultured human cells. J Clin Invest. 121 (2), 715-725 (2011).
- Masuda-Suzukake, M., et al.
- Holmqvist, S., et al. Direct evidence of Parkinson pathology spread from the gastrointestinal tract to the brain in rats. Acta Neuropathol. 128 (6), 805-820 (2014).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
- Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1, 38 (2013).
- Sacino, A. N., et al. Intramuscular injection of alpha-synuclein induces CNS alpha-synuclein pathology and a rapid-onset motor phenotype in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10732-10737 (2014).
- Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33 (9), 2225-2228 (2012).
- Bartz, J. C., Kincaid, A. E., Bessen, R. A. Rapid prion neuroinvasion following tongue infection. J Virol. 77 (1), 583-591 (2003).
- Tamgüney, G., et al. Measuring prions by bioluminescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 15002-15006 (2009).
- Watts, J. C., et al. Transmission of multiple system atrophy prions to transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (48), 19555-19560 (2013).
- Breid, S., et al. Neuroinvasion of alpha-Synuclein Prionoids after Intraperitoneal and Intraglossal Inoculation. J Virol. 90 (20), 9182-9193 (2016).
- Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34 (4), 521-533 (2002).
- Zhu, L., et al. Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice. Neurosci Lett. 367 (2), 210-212 (2004).
- Bernis, M. E., et al. Prion-like propagation of human brain-derived alpha-synuclein in transgenic mice expressing human wild-type alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 3 (1), 75 (2015).
- Gunther, R., et al. Clinical testing and spinal cord removal in a mouse model for amyotrophic lateral sclerosis (ALS). J Vis Exp. (61), (2012).
- Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Nat Protoc. 2 (1), 141-151 (2007).
- Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).
- Kim, C., et al. Exposure to bacterial endotoxin generates a distinct strain of alpha-synuclein fibril. Sci Rep. 6, 30891 (2016).
- Keller, A. F., Gravel, M., Kriz, J. Live imaging of amyotrophic lateral sclerosis pathogenesis: disease onset is characterized by marked induction of GFAP in Schwann cells. Glia. 57 (10), 1130-1142 (2009).
- Stöhr, J., et al. Distinct synthetic Abeta prion strains producing different amyloid deposits in bigenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).
- Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice. J Exp Med. 209 (5), 975-986 (2012).
- Recasens, A., et al. Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys. Ann Neurol. 75 (3), 351-362 (2014).
- Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1 (1), 38 (2013).
- Peelaerts, W., et al. alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).
