Summary
Perifer injeksjon av alfa-synukleinfibriller i peritoneum eller tunge av Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) mus som uttrykker human alpha-synuclein med familiær A53T mutasjonen og ildflueluciferase, kan indusere neuropatologi, inkludert nevroinflammasjon , i deres sentralnervesystemet.
Abstract
For å studere prion-lignende oppførsel av misfoldet alpha-synuclein, blir musemodeller nødvendig for at muliggjøre rask og enkel overføring av alpha-synuclein prionoids, som forårsaker nevro innenfor sentralnervesystemet (CNS). Her beskriver vi at intraglossal eller intraperitoneal injeksjon av alfa-synukleinfibriller til bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) mus som overuttrykker humant alfa-synuclein med A53T mutasjon fra den prionprotein promoteren og ildflueluciferase fra promoteren for glialt fibrillært surt protein (GFAP), er tilstrekkelig til å indusere neuropathologic sykdom. I forhold til homozygot Tg (M83 + / +) mus som utvikler alvorlig nevrologiske symptomer som begynner ved en alder på 8 måneder, heterozygot Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) dyr forblir fri for spontan sykdom inntil de når en alder av 22 måneder. Interessant, injeksjon av alfa-synukleinfibriller via intraperitoneal rute indusert nevrologisk sykdom med lammelse i fire av fem Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) mus med en median inkubasjonstid på 229 ± 17 dager. Syke dyr viste alvorlige forekomster av fosforylert alfa-synuclein i hjernen og ryggmargen. Ansamlinger av alpha-synuclein ble sarkosyl-uløselig og colocalized med ubiquitin og p62, og ble fulgt av en inflammatorisk respons som resulterer i astrocytic gliosis og microgliosis. Overraskende, inokulering av alfa-synukleinfibriller inn i tungen var mindre effektivt til å forårsake sykdom med bare en av fem injiserte dyr som viser alpha-synuclein patologi etter 285 dager. Våre funn viser at vaksinasjonen via intraglossal rute og mer via intraperitonealt er egnet til å fremkalle nevrologisk sykdom med relevante kjennetegnene ved synukleinopatier i Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) mus. Dette gir en ny modell for å studere prion-lignende patogenesen indusered av alfa-synuclein prionoids i større detalj.
Introduction
Det er økende bevis for at alpha-synuclein har egenskaper som er lik de av prion-protein, spesielt i dens evne til selv-frø og forplanter misfolding mellom celler og langs nervebaner. Denne egenskapen av alfa-synuclein blir også referert til som 'prion-lignende' eller 'prionoid', og er støttet av observasjoner i transplantasjonsforsøk, noe som tyder transmissibilitet misfoldet alpha-synuclein fra syke neuroner til nylig transplantert friske nerveceller 1, 2 , 3, 4. Også direkte injeksjon av misfoldet alpha-synuclein inn i hjernen eller i periferien, f.eks bakbenområdet muskel eller tarmveggen, resulterer i en spredning av alfa-synuclein patologi for å distale deler av CNS 5, 6, 7, <sup class = "ekstern referanse"> 8, 9, 10. Vi analyserte overføring av alpha-synuclein prionoids via perifere ruter i mer detalj, og om spørsmålet hvorvidt misfoldet alpha-synuclein kan neuroinvade CNS etter en enkelt intraglossal eller intraperitoneal injeksjon, en funksjon som tidligere hadde blitt vist for prioner, men ikke for misfoldet alfa- synuclein. Etter injeksjon av prioner inn i tungen, blir neuroinvasion av CNS oppnås via forplantning langs hypoglossus nerve av tungen som fører til kjernen av hypoglossus nerve, som er lokalisert i hjernestammen 11. Som en musemodell valgte Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) mus som overuttrykker den A53T mutant av human alfa-synuclein fra prion-promoteren, og ildflueluciferase under kontroll av en promoter for å overvåke GFAP astrocytic aktivering av bioluminescens, som tidligere vist i hjernen hosprion-infiserte mus 12. I våre hender bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) mus ikke utvikler sykdommen før 23 måneders alder som har blitt vist av andre 13. En enkelt injeksjon av humane alfa-synukleinfibriller via intraglossal eller intraperitoneal vei indusert nevrologisk sykdom med patologi i hjernen og ryggmargen av Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) mus som støtter den hypotese at alpha-synuclein prionoids dele viktige egenskaper med prioner 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer inkludert dyrene ble utført med godkjenning av dyrevern komiteen i Nordrhein-Westfalen State Environment Agency (LANUV). Dyrene ble huset og stelles i henhold til standardbetingelser med en 12 timers lys / mørke syklus og fri adgang til mat og vann.
1. Animal Model
- Intercross hemizygous Tg (GFAP -luc +/-) mus med hemizygous Tg (M83 +/-) mus for å generere hemizygous bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) mus 15, 16.
- Genotype avkom med real-time PCR for tilstedeværelse av transgenet som koder for humant alfa-synuclein og med standard PCR for ildflue luciferase 12, 17.
- Vaksinere dyrene i en alder av seks til åtte uker.
2. Podestoffprepareringen
- Forbered monomeric rekombinant human alfa-synuclein med A53T mutasjon i Tris-bufret saltvann (TBS) buffer inneholdende 150 mM NaCl i 20 mM Tris-HCl (pH 7,2) som tidligere har vært beskrevet 14.
- Forbered fibrillær alpha-synuclein for inokulering ved å agitere 3 ug / ul av monomert rekombinant human alpha-synuclein in en orbitalrister ved 800 rpm og 37 ° C i 5 dager.
- Fortynn fibrillkomponenter sammenstillinger i fosfat-bufret saltvann (PBS) for å nå en sluttkonsentrasjon på 1 pg / pl for intraperitoneal eller 2 pg / mL for intraglossal vaksiner.
- Fragmentere alfa-synukleinfibriller med en stang sonikator i 1 min (40 pulser av 0.5 sek varighet med en pause på ett sekund mellom hver puls og en amplitude som er satt til 50%) på is. For å unngå forurensning ved kryss-poding. Bruk rene sonikering prober for å fremstille forskjellige inokulum.
3. Intraglossal Injeksjoner
- Bedøve dyr med en intraperitoneal injeksjon av 100 mg / kg ketamin og 10 mg / kg xylazin. Knip dyrets tå og bekrefter at det ikke trekke tilbake sin bakbenet for å sikre riktig anestesi. Bruk veterinær salve på dyrets øyne for å hindre tørrhet mens under anestesi.
- Fiks narkotiserte dyr omhyggelig med klebebånd på en varmeplate i en dorsal liggende stilling med hodene vendt mot undersøkeren.
- Fyll en 27 G Engangssprøyte med 5 mL av lydbehandlede alfa-synukleinfibriller eller PBS.
- Benytte en butt neset tommeltang med taggete tips for å holde dyrets munn åpen, og en andre mindre pinsett for forsiktig å trekke ut tungen for å gjøre undersiden av tungen er tilgjengelig for injeksjon.
- Injiser nålen på sprøyten inn i den høyre eller nedre venstre side av tungen i nærheten av den hypoglossal nerve. Sakte injisere pode etter 5 s. Sakte trekke nålen etter 5 s for å sikre at inokulatethar trengt inn i vevet, og blir ikke tapt mens tilbaketrekning av nålen.
- Slipp dyr fra dets fikseringer og la det på varmeplaten under konstant overvåkning inntil fullstendig helbredelse.
4. intraperitoneal injeksjon
- For intraperitoneal injeksjon, narcotize dyrene kort tid i et anestesikammer ved inhalering med isofluran / oksygen ved bruk av en strømningshastighet på 2 l / min og fordamperen settes til 2%. Knip dyrets tå og bekrefter at det ikke trekke tilbake sin bakbenet for å sikre riktig anestesi.
- Fyll en 27 G Engangssprøyte med 50 ul av lydbehandlede alfa-synukleinfibriller eller PBS.
- Direkte injeksjon inn i peritoneum fra mus, og unngå å trenge inn i tynntarmen eller cecum plassert bak bukveggen ved å holde dyret i en dorsal stilling med hodet vendt bort fra undersøkeren og nedad ved ca. 45 °. Overvåke dyr før de har kommetfra anestesi.
5. Bioluminesens Imaging
- Bilde Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) mus hver 2-4 uker med en bioluminesens imaging system.
- Forut for avbildning snart bedøve mus i en isofluran / oksygen-kammer med en strømningshastighet på 2 l / min og fordamperen settes til 2%. Knip dyrets tå og bekrefter at det ikke trekke tilbake sin bakbenet for å sikre riktig anestesi.
- Barbere og fjerne håret hodene på mus med en hårfjerningskrem. Color ørene i svart med en ikke-irriterende markør for å blokkere uspesifikke bioluminesens.
- Fortynn D-luciferin kaliumsalt, substratet av luciferase, i PBS til en 30 mg / ml stamløsning. Lagrer dette i 1 ml alikvoter ved -20 ° C. Beskytte det oppløste D-luciferin fra eksponering til lys.
- Vei dyrene før injeksjon. Beregne det nøyaktige volumet av D-luciferin for injeksjon av 150 mg / kg kroppsvekt. Intraperitonealt injisere D-luciferin og returnere dyret til anestesi kammeret.
- Start bildebehandlingsprogrammer. Etter at avbildningssystemet har nådd sin driftstemperatur initialisere systemet ved å klikke på 'Initialiser' -knappen i kontrollpanelet.
- Velg knappene 'selvlysende' og 'Fotografi'. Still eksponeringstiden til 60 sek binning til 'Medium', F / Stopp for å '1', og EM gevinst til 'Off'.
- Bekreft at eksitasjonsfilteret er satt til 'Block' og utslipp filter til 'Open', og sette faget høyde til 1,50 cm.
- Ti minutter etter injeksjonen med D-luciferin, plasseres dyrene på varmeplaten i avbildningskammeret og sørge for at deres munninger er riktig plassert i anestesi utløp. Lukk isofluran / oksygenstrømmen fra inhaleringskammeret og åpne strømnings for den billeddannende kammer med en strømningshastighet på 0,25 l / min og en fordampning av 2%. Lukke døren på bildekammeret properly.
- Klikk på 'Acquire' -knappen for å måle bioluminescence, som tar 60 sek. Stopp isofluran flyt og overvåke dyrene før de har helt restituert etter retur dem tilbake til burene.
- Bruk bildebehandlingsprogrammer å kvantifisere bioluminescence. Innenfor 'Tool Palette' velge 'ROI Tools'. Under 'Type' innenfor 'ROI Tools' velg 'Measurement ROI'.
- Innenfor 'ROI Tools' klikk "circle" verktøyet og velge antall Rois å trekke fra nedtrekksmenyen - ideelt '3' for tre mus.
- I bildet, høyreklikker du hver ROI og under 'Properties' justere bredden og høyden 1,25 cm. Plasser hver ROI over hjernen området som er kvantifisert.
- I den øvre venstre side av bildet, setter enheter panelet til lysutstråling (fotoner) '.
- Innenfor 'Tool Palette', velg 'Bildejustering' og justere minimum ogmaksimum av den 'Color Scale', for eksempel, fra 0.20e6 til 1.00e6.
- Under 'Fil' og lagre data med 'Lagre'.
6. biokjemisk analyse
- Isoler hjernen og ryggmargen i henhold til etablerte protokoller 18, 19.
- Homogenisere hele hjernen og hele ryggmargen prøver separat i PBS i nærvær av protease og fosfatase-inhibitorer (fortynnet til 1 x i PBS) i to 30 s sykluser med 6000 rpm i en vevhomogenisator. Sikre at hjernen og ryggmargen prøver blir homogenisert til en sluttkonsentrasjon på 20% (vekt / volum).
- Sonikat prøvene to ganger samtidig holde dem på is med en konstant puls på 10 s og en amplitude som er satt til 50%.
- Juster Homogenatene til 10% i PBS og 750 mM NaCl ved å fortynne dem 1: 1 med 1,5 M NaCl i PBS.
- For å skille den cellerester, sentrifugere homogenatet ved 1000 xg i 5 min ved4 ° C. Hold supernatantene i de neste trinnene og kast pelletene.
- Måle proteinkonsentrasjonen i homogenatet ved å bruke bicinchoninic syre (BCA-analyse) i henhold til produsentens instruksjoner. Inkuber 1.0 mg totalt protein fra hjerne-homogenater eller 0,8 mg fra ryggmargs homogenater i N-laurylsarcosyl ved en sluttkonsentrasjon på 10% (vekt / volum) i 15 minutter på is.
- Overlegg av homogenater på en 3 ml sukrosepute på 10% (vekt / volum) i destillert vann, og ultrasentrifuge dem ved 465.000 xg i 1 time ved 4 ° C.
- Resuspender pellet i en buffer inneholdende 4% natrium-dodecyl-sulfat (SDS), 2% β-merkaptoetanol, 192 mM glycin, 25 mM Tris, og 5% (vekt / volum) sukrose.
- Koke prøvene ved 100 ° C i 5 minutter og laste dem inn i SDS-polyakrylamidgeler for elektroforese i en morpholineethanesulfonic syre (MES) buffersystem.
- Overfør de separerte proteiner til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner i et semidry blotting system.
- Inkuber membraner i 0,4% (vol / vol) formalinløsning i PBS i 30 minutter ved romtemperatur i en rotor med 35 rpm for å kryssbinde proteiner med membranen.
- Blokkere membranene i TBS-buffer inneholdende 0,05% (vol / vol) Tween 20 og 5% (vekt / volum) melk i 1 time ved romtemperatur.
- Inkuber blottene med det primære antistoff i blokkeringsbuffer over natten ved 4 ° C.
- Vaske membranene tre ganger i TBS-buffer, og inkuber dem med peroksidase eller fluoroforen-konjugert sekundært antistoff i TBS i 1 time ved romtemperatur.
- Visual de bundne sekundære antistoff ved kjemiluminescens eller fluorescens i henhold til etablerte protokoller 20.
7. Immunofluorescence Analysis
- Dehydrere de dissekerte hjerne og ryggmargen i et vev behandlingsstasjon og legge dem inn i paraffin ved å bruke en parafin stasjon.
- Skjær parafin-embedded tisfremfører med en mikrotom i 8 um tykke koronalsnitt og montere delene på objektglass.
- Deparaffinize vevssnittene ved å inkubere dem i to separate xylol bad i 5 til 10 minutter og rehydrere dem gjennom en rekke graderte etanol bad (100%, 90%, 70%, 50%) og til slutt med H2O
- Inkuber delene i 0,01 M citratbuffer (pH 6,0) i 5 minutter ved romtemperatur og i tillegg koke dem i 10 minutter i en mikrobølgeovn.
- La delene avkjøles til romtemperatur og inkuber dem med en 3% hydrogenperoksidløsning i 30 minutter for å inhibere endogene peroksidaser.
- Blokkere vevssnittene etter inkubering med 20% (volum / volum) normalt geiteserum, 1% (vol / vol) bovint serumalbumin (BSA) og 0,5% Triton X-100 i PBS i 1 time ved romtemperatur.
- Inkuber seksjonene med det primære antistoff ble fortynnet i 1% (volum / volum) normalt geiteserum, 1% (vol / vol) BSA og 0,25% Triton X-100 i PBS over natten ved 4 ° C. <li> Vask seksjonene to ganger med 0,25% (vol / vol) Triton X-100 i PBS og en gang med PBS.
- Flekk seksjoner med de tilsvarende fluoroforen-konjugerte sekundære antistoffer og atom fargestoff DAPI fortynnet i 1% (volum / volum) normalt geiteserum, 1% (vol / vol) BSA, og PBS i 1 time ved romtemperatur.
- Etter vasking to ganger med 0,25% (vol / vol) Triton X-100 i PBS og en gang med PBS, dekkglassene med innebygging media og visualisere farging med en konfokal laser scanning mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Perifer injeksjon av alpha-synuclein prionoids via tungen eller peritoneum indusert nevro i CNS av bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) mus (tabell 1 og figur 1). Etter en enkel intraperitoneal injeksjon med alfa-synukleinfibriller, fire av fem mus utviklet nevrologisk sykdom med en median inkubasjonstid på 229 ± 17 dager. Overraskende er bare en av fem mus utviklet CNS-sykdom etter intraglossal injeksjon med alfa-synukleinfibriller etter 285 dager. Inokulering med PBS ikke forårsake sykdom innenfor 420 dagers periode av forsøket.
Biokjemisk analyse ved Western blotting og probing med fosfo-spesifikt antistoff mot EP1536Y Ser129 av alpha-synuclein viste at for begge overføringsveier syke dyr hadde akkumulert aggregater av fosforylert og sarkosyl-insoluble alpha-synuclein i hjernen og ryggmargen (tabell 2 og figur 2). I motsetning til dette, hjerne og ryggmargen PBS-injiserte og ikke-syke dyr bare inneholdt monomere arter av fosforylert alpha-synuclein.
Immunfluorescensfarging av hjernesnitt av injisert intraperitonealt og syke mus med fosfo-spesifikke pSyn # 64-antistoff viste en bred fordeling av fosforylerte alpha-synuclein avleiringer i hele CNS (Tabell 2 og figur 3). Videre fosforylert alpha-synuclein innskudd colocalized med ubiquitin og p62 som angir en avvikende protein homeostase som kan bidra til dannelsen av avleiringer.
Akkumuleringen av alpha-synuclein aggregater i sykt dyr ble fulgt av neuroinflammatoriske endringer, som ble påvist vedimmunofluorescensfarging for GFAP, en markør for astrocytter som kan avsløre reaktive astrogliosis (figur 4). Dessuten aktiverte mikroglia ble også funnet i områder med rikelig alpha-synuclein patologi ved immunofluorescensfarging for IBA-1 (ionisert kalsium-bindende molekyl adapter 1). I overensstemmelse, avslørte bioluminescens avbildning øket utstråling (> 2 x 10 6 p / s / cm 2 / sr) som sendes ut fra hjernen til Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) mus injisert med alfa-synukleinfibriller, kort tid før de utviklet tegn på nevrologisk sykdom. I motsetning til dette ble hjernen hos mus injisert med PBS ikke viser noen økning i utstråling. Økt utstråling er indikativ for reaktiv astrogliosis, et kjennetegn på nevroinflammasjon, ettersom luciferaseekspresjon blir drevet fra den GFAP-promoteren.
Figur 1: Injeksjon med alfa-synukleinfibriller via den intraperitoneale eller intraglossal rute forårsaker sykdom hos bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) mus. (A) elektronmikrografi av lydbehandlede rekombinante humane alfa-synukleinfibriller som var intraperitonealt og intraglossally injisert i mus. Negativ farging med uranylacetat avslørte flere klynger av korte, stavformede aggregater. Skala Stolper = 100 nm. (B) Kaplan-Meier-overlevelseskurver viser at etter intraperitoneal injeksjon med alfa-synukleinfibriller fire av fem Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) mus utviklet nevrologisk sykdom i 229 ± 17 dager (lilla lukkede firkanter), mens ingen av de PBS-injiserte kontroll mus utviklet tegn på neurologisk dysfunksjon i løpet av 420 dager (lilla åpne firkanter). Etter intraglossal inokulering med alfa-synukleinfibriller en mus av fem døde etter 285 dager (grønnlukkede sirkler). I motsetning til dette ingen av de PBS-injiserte kontroll mus utviklet neurologisk sykdom eller spontant døde (grønne åpne sirkler). Forandringer fra Breid et al. 2016 14. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Biokjemisk analyse av fosforylert alpha-synuclein in CNS av periferisk injisert Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) mus. (A) Immunoblotting med EP1536Y antistoffet gjenkjenner fosforylering ved Ser129 av alfa-synuclein, viste at injisert intraperitonealt og syke mus akkumulert høy molekylvekt arter av sarkosyl-uløselige aggregater av fosforylert alpha-synuclein in sine hoder end ryggmargen. Kontroll mus utfordret med PBS ikke hope seg opp aggregater av fosforylert alfa-synuclein og viste bånd bare for sin monomere form. (B) Når intraglossal utfordring med alfa-synukleinfibriller bare én mus, animalske 121, viste sarkosyl-uløselige aggregater av fosforylert alpha-synuclein in dens hjernen og ryggmargen, mens alle andre intraglossally inokulerte mus forble friske uten forekomster av alfa-synuclein. Molekylmasser er vist i kD. Eksempel lasting i hver bane er vist ved påvisning av aktin. Forandringer fra Breid et al. 2016 14. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Immunofluorescensanalyse viser at forekomster avfosforylert alpha-synuclein colocalize med ubiquitin og p62 i hjernen og ryggmargen av sykelig Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) mus. Co-farging av fosforylert alpha-synuclein, detektert med EP1536Y antistoff, og ubiquitin viste en tydelig colocalization i hjernen, som observert i thalamus kjernen (A), og ryggmargen, som detektert i den grå materie (B), av syke mus etter intraperitoneal utfordring med alpha-synuclein fibriller. På lignende måte, fosforylert alpha-synuclein, detektert med den pSyn # 64-antistoff, også colocalized med p62 i hjernen (C) og ryggmargen (D) av syke dyr. (A til D) PBS-injiserte friske kontrolldyrene viste ingen innskudd eller colocalization for noen av disse proteiner. Nukleær farging med DAPI er vist i blått. Skala Stolper = 20 um. Forandringer fra Breid et al. 2016 14. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) mus utviklet gliosis etter perifer utfordring med alpha-synuclein fibriller. (A) Immunofluorescensanalyse av hjernesnitt av syke dyr med et antistoff mot GFAP, en markør for astrocytter, avslørte reaktive astrogliosis i områder med forekomster av fosforylert alpha-synuclein, som ble detektert i hjernestammen med den pSyn # 64 antistoff. I motsetning til dette var det ingen reaktiv astrogliosis i hjernen til PBS-injiserte kontroll mus. (B) På tilsvarende måte, farging med et antistoff til IBA-1, en markør av mikroglia, demonstrerte microgliosisi områder med forekomster av fosforylert alpha-synuclein i sykt dyr. Hjernen hos friske, PBS-injiserte kontroll mus viste ingen tegn til microgliosis. (C) Bioluminescence avbildning viste forhøyet utstråling fra hjernen og ryggmargen av Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) mus intraperitonealt injisert med alfa-synukleinfibriller (venstre panel), som ble forårsaket ved aktivering av astrocytter , kort tid før musene utviklet nevrologiske symptomer. I hjernen og ryggmargen av PBS-injiserte kontroll mus basal utstråling ikke økte med tiden (høyre panel). Etter intraglossal inokulering med alfa-synukleinfibriller, en Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) mus, animalsk 121, viste tegn på reaktiv astrogliosis kort tid før den døde 285 dager (midtseksjon). (D) etter intraperitoneal utfordring av Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) mus med alfa-synukleinfibriller, økt selvtilsed nivåer av bioluminescens (> 2 x 10 6 p / s / cm 2 / sr) ble målt fra hjernen til fire mus (blå, grønn, brun, orange og sirkler) noen uker før de utviklet nevrologiske tegn på sykdom. En av fem dyr viste også forhøyede nivåer av bioluminesens kort tid før det døde 285 dager etter intraglossal injeksjon med alfa synukleinfibriller (magenta sirkler). I motsetning til dette, for friske, PBS-injiserte kontroll mus (sorte sirkler; Feilstolpene viser SD [n = 4]) og ett dyr som ikke utviklet sykdommen etter intraperitoneal injeksjon med alfa-synukleinfibriller (røde sirkler), forble Bioluminescens signalet under en terskel på 2 x 10 6 p / s / cm 2 / sr innenfor observasjonsperioden. Skala Stolper = 20 um. Forandringer fra Breid et al. 2016 14. Klikk her for å se en større versjon av dennefigur.
| mus linjen | Inokulum (ug) | inoculation rute | Antall mus med sykdom / no. av mus inokulert | Gjennomsnittlig overlevelsestid ± SD (dager) |
| Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) | Humant a-synukleinfibriller (50) | intraperitoneal | 4/5 | 229 ± 17/420 |
| Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) | PBS | intraperitoneal | 0/5 | 0/420 |
| Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) | Humant a-synukleinfibriller (10) | intraglossal | 1/5 | 285/420 |
| Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) | PBS | intraglossal | 0/4 0/420 |
Tabell 1: Inokulering eksperimenter. * Modifisert fra Breid et al., 2016 14
| Target [antistoff klon] | Vert | immunogen | Fortynning i IF | Fortynning i WB |
| Actin [C4] | Mus | - | - | 1: 1000 |
| α-synuclein, fosfo S129 [pSyn # 64] | Mus | pSer129 | 1: 1200 | - |
| α-synuclein, fosfo S129 [EP1536Y] | Kanin | pSer129 | 1: 100 | 1: 1000 |
| Glial fibrillært surt protein (GFAP) | Kanin | - | 1: 200 | - |
| IBA-en | Kanin | - | 1: 500 | - |
| Sequestosome-1 (P62) | Kanin | - | 1: 100 | - |
| Ubiquitin [Ubi-1] | Mus | - | 1: 500 | - |
Tabell 2: Antistoffer anvendt for immunofluorescens (IF) og Western blotting (WB). * Modifisert fra Breid et al., 2016 14
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Perifer injeksjon av alfa-synukleinfibriller i peritoneum til Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) mus representerer en lettvint fremgangsmåte for å indusere nevrologisk sykdom ledsaget av nevroinflammasjon å rekapitulere viktige kjennetegn ved synukleinopatier. Tilsvarende, representerer tunge injeksjon annen rute for neuroinvasion av alfa-synuclein prionoids i transgene mus, men er mindre effektiv. Vi valgte å si opp våre forsøk på 420 dager etter injeksjon, og vi kan ikke utelukke at flere eller alle fibrilens injisert mus kan ha utviklet sykdommen på et senere tidspunkt. I tillegg er bruken av Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) mus muliggjør ikke-invasiv visualisering av astrogliosis og representerer en enkel metode for overvåkning av inflammatoriske responser som forårsakes av neuroinvasion av alfa-synuclein over hele levetiden til mus.
Et kritisk trinn er fremstillingenav pode. Tilsynelatende ubetydelige faktorer som aggregering tid, sonikeringstid, overflod av endotoksiner, eller mengden av fibriller som brukes for injeksjon kan påvirke utfallet av et eksperiment ved å påvirke poding tilbøyelighet til misfoldet alpha-synuclein 21. Derfor er det viktig alltid å bruke de samme betingelser som ved tilberedning av inokula for injeksjon. For intraglossal injeksjoner må det tas hensyn til at ikke bare hypoglossus nerve men også andre hjernenerver som glossofaryngeal nerve innerverer tunge og kan være involvert i den interneuronal transport av alfa-synuclein prionoids til hjernen. Således tillater targetisering av forskjellige områder av tungen kan resultere i forskjellige spredningskinetikk til hjernen. Vi har ikke direkte injisere i hypoglossal nerve og det er mulig at målretting hypoglossus nerve kan forbedre CNS overføring av alpha-synuclein prionoids. For intraperitoneal injeksjon med alfa-synukleinfibriller er det Critical at inokulatet er korrekt injisert i peritoneum og ikke ved et uhell inn i indre organer som tarmen eller cecum, som negativt kan påvirke neuroinvasion. Det er også viktig med hensyn på bioluminescens avbildning ved injisering D-luciferin. Feilmålretting av D-luciferin på indre organer kunne forsinke dens fordeling til hjernen og resultere i lavere bioluminescens. For å oppnå jevne resultater under avbildning det er også viktig å alltid ferskt fremstille D-luciferin oppløsning før injeksjon, og for å la det nøyaktig inkuber i 10 minutter etter intraperitoneal injeksjon før avbildning.
Bioluminescence avbildning er en nyttig metode for ikke-invasiv måle endringer i astrogliosis over tid og kan anvendes ikke bare etter intraperitoneal eller intraglossal injeksjoner, men også etter hver type behandling, inkludert, for eksempel, intracerebral eller intravenøse injeksjoner. For å overvåke spredning av alpha-synuclein prionoids fra periferien til den CNS og den påfølgende nevroinflammasjon vi brukte bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) mus. På grunn hemizygous ekspresjon av alfa-synuclein hos disse dyr er 40% lavere i forhold til homozygote dyr som de forblir fri for spontan sykdom i opp til 22 måneders alder, og har en passende genetisk bakgrunn for alpha-synuclein overføring studerer 13. Imidlertid kan endringer med hensyn til valg av musemodellen på bioluminescens avbildning være ønskelig. Et interessant alternativ er bruk av monogene Tg (GFAP -luc +/-) mus som uttrykker bare luciferase som et transgen, som tillater en vurdering av prionoid opptreden av alfa-synukleinfibriller på en bakgrunn som er i det vesentlige villtype så langt alpha-synuclein er opptatt 14. Videre krysser Tg (GFAP -luc +/-) mus til andre transgene mus, for eksempel Tg (SOD1 G93A) -mus for amyotrofisk lateral sklerose eller for å Tg (APP23) mis for Alzheimers sykdom, muliggjør avbildning av nevroinflammasjon i andre sykdomsmodeller 22, 23.
En begrensning av denne fremgangsmåte er at basert på injeksjonsstedet den injiserte inokulum kan ikke overstige et visst volum. Således injeksjoner i tungen kan bare utføres med mindre volum enn de i peritoneum, noe som kan påvirke overføringstidene til CNS. En annen begrensning er at GFAP -luc transgenet bare tillater påvisning av astrogliosis men ikke fra microgliosis, noe som er like viktig i nevroinflammasjon. Til slutt, ikke denne modellen gi innsikt om hvordan alfa-synuclein prionoids nå CNS etter intraperitoneal injeksjon.
Anvendelsen av eksogene alpha-synuclein prionoids via injeksjon har vist seg å være en nyttig metode for å studere overføringsveier som spiller en kritisk rolle i recapitulating karakteristika for synucleinopathies. Intracerebrale injeksjoner av rekombinant alfa-synukleinfibriller eller sykdomsassosierte mus eller humane alfa-synuclein arter inn i dyremodeller er blitt anvendt i mange studier for å analysere deres pode egenskaper og overføring effektivitet over tid 5, 7, 17, 24, 25, 26. Siden stereotaktiske injeksjoner i hjernen alltid indusere en lokal betennelsesreaksjon kort tid etter operasjonen, kan dette smittevei påvirke spredning og smittsomhet av pode forårsaket av en endring av hjernen homeostase. Nyere studier har endret fokus til perifere eller systemiske anvendelser, ikke først og fremst for å unngå den kirurgiske prosedyre, men snarere for å analysere periferien, tarmveggen, skjelettmuskel, eller blod, som et startpunkt hvorfra neuroinvasion til CNS kan commence 6, 9, 14, 27. For prioner er det blitt vist at transmisjonen gjennom peritoneum eller tungen fører til neuroinvasion og nevrologisk sykdom; etter tunge infeksjon, prioner spredt i løpet av bare to uker for å hypoglossus kjernen i hjernestammen 11. Siden alfa-synuclein har vært diskutert å ha neuroinvasive og såing egenskaper som prioner, viste vi at overføring via tungen og peritoneum representerer ytterligere inngangspunkter for alpha-synuclein prionoids å invadere CNS 14. Kvantifisering av astrogliosis ved bioluminescens avbildning letter sporing av neuroinflammatoriske prosessen over tid og representerer et ikke-invasivt alternativ til histologisk analyse.
For å oppnå en dypere innsikt i hvordan CNS reagerer på neuroinvasion av alfa-synuclein prionoidsog til andre behandlinger som forårsaker nevroinflammasjon, ville det være fordelaktig å generere musemodeller som også lar ikke-invasiv overvåking av microgliosis, for eksempel med et transgen som driver luciferaseekspresjon fra en promoter som er spesifikke for protein ekspresjon i mikroglia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Olga Sharma, Theresa Hundt, og de ansatte på DZNE mikroskopi og dyre fasiliteter for teknisk støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-actin antibody | Merck Millipore | MAB1501 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [pSyn#64] | Wako | 015-25191 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [EP1536Y] | Abcam | ab51253 | |
| anti-GFAP antibody | Dako | Z0334 01 | |
| anti-IBA-1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| anti-Sequestosome-1 (p62) antibody | Proteintech | 18420-1-AP | |
| anti-ubiquitin antibody [Ubi-1] | Merck Millipore | MAB1510 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190169 | |
| Ketamine | Ratiopharm | 100 mg/kg | |
| Xylazine | Ratiopharm | 10 mg/kg | |
| 27 G syringe | VWR | 613-4900 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | PZN 4831850 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Secureline lab marker | Neolab | 25040 | |
| D-luciferin potassium salt | Acris | LK10000 | 30 mg/mL stock solution |
| Thermomixer | Eppendorf | 5776671 | |
| Sonopuls Mini20 sonicator | Bandelin | 3648 | |
| IVIS Lumina II imaging system | PerkinElmer | ||
| Living Image 3.0 Software | PerkinElmer | ||
| Tg(M83+/-) mice or B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice | The Jackson Laboratory | 004479 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| N-laurylasarcosyl | Sigma | L5125-100G | |
| Optima Max-XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | TLA-110 rotor | |
| Thickwall polycarbonate tubes | Beckman Coulter | 362305 | |
| NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | WG1401BOX | |
| HRP conjugated antibody | Cayman | Cay10004301-1 | |
| IR Dye 680 conjugated antibody | LI-COR Biosciences | 926-68070 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34075 | |
| Stella 3200 imaging system | Raytest | ||
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Biosciences | ||
| Tween 20 | MP Biomedicals | TWEEN201 | |
| Triton X-100 | Sigma | SA/T8787 | |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Merck Millipore | IPFL00010 | |
| Xylol | Sigma | Roth | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | SA/00216763/000500 | working solution 3% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Thermo Fisher Scientific | A3294-100G | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | working dilution 1:50,000 |
| Fluoromount media | Omnilab | SA/F4680/000025 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | ||
| HALT protease and phosphatase inhibitors | Thermo Fisher Scientific | 10516495 | |
| Precellys 24-Dual homogenizer | Peqlab | 91-PCS24D | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A31619 | |
| Alexa Fluor 594 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 10741395 | |
| Microtome RM2255 | Leica | ||
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss |
References
- Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459 (7249), 924-925 (2009).
- Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Freeman, T. B. Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson's disease. Nat Med. Olanow, C. W. 14 (5), 504-506 (2008).
- Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).
- Hansen, C., et al. alpha-Synuclein propagates from mouse brain to grafted dopaminergic neurons and seeds aggregation in cultured human cells. J Clin Invest. 121 (2), 715-725 (2011).
- Masuda-Suzukake, M., et al.
- Holmqvist, S., et al. Direct evidence of Parkinson pathology spread from the gastrointestinal tract to the brain in rats. Acta Neuropathol. 128 (6), 805-820 (2014).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
- Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1, 38 (2013).
- Sacino, A. N., et al. Intramuscular injection of alpha-synuclein induces CNS alpha-synuclein pathology and a rapid-onset motor phenotype in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10732-10737 (2014).
- Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33 (9), 2225-2228 (2012).
- Bartz, J. C., Kincaid, A. E., Bessen, R. A. Rapid prion neuroinvasion following tongue infection. J Virol. 77 (1), 583-591 (2003).
- Tamgüney, G., et al. Measuring prions by bioluminescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 15002-15006 (2009).
- Watts, J. C., et al. Transmission of multiple system atrophy prions to transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (48), 19555-19560 (2013).
- Breid, S., et al. Neuroinvasion of alpha-Synuclein Prionoids after Intraperitoneal and Intraglossal Inoculation. J Virol. 90 (20), 9182-9193 (2016).
- Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34 (4), 521-533 (2002).
- Zhu, L., et al. Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice. Neurosci Lett. 367 (2), 210-212 (2004).
- Bernis, M. E., et al. Prion-like propagation of human brain-derived alpha-synuclein in transgenic mice expressing human wild-type alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 3 (1), 75 (2015).
- Gunther, R., et al. Clinical testing and spinal cord removal in a mouse model for amyotrophic lateral sclerosis (ALS). J Vis Exp. (61), (2012).
- Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Nat Protoc. 2 (1), 141-151 (2007).
- Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).
- Kim, C., et al. Exposure to bacterial endotoxin generates a distinct strain of alpha-synuclein fibril. Sci Rep. 6, 30891 (2016).
- Keller, A. F., Gravel, M., Kriz, J. Live imaging of amyotrophic lateral sclerosis pathogenesis: disease onset is characterized by marked induction of GFAP in Schwann cells. Glia. 57 (10), 1130-1142 (2009).
- Stöhr, J., et al. Distinct synthetic Abeta prion strains producing different amyloid deposits in bigenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).
- Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice. J Exp Med. 209 (5), 975-986 (2012).
- Recasens, A., et al. Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys. Ann Neurol. 75 (3), 351-362 (2014).
- Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1 (1), 38 (2013).
- Peelaerts, W., et al. alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).
