Summary
Periphere Injektion von alpha-Synuclein - Fibrillen in das Peritoneum oder die Zunge von Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) Mäuse, der humanen alpha-Synuclein mit der familial A53T - Mutation exprimieren und Glühwürmchen - Luciferase kann Neuropathologie, einschließlich neuroinflammation induziert in ihrem Zentralnervensystem.
Abstract
Um das Prion-ähnliches Verhalten von falsch gefalteten alpha-Synuclein, Mausmodelle zu studieren benötigt werden, mit denen eine schnelle und einfache Übertragung von alpha-Synuclein prionoids, die Neuropathologie im Zentralnervensystem (ZNS) führen. Hier beschreiben wir das intraglossal oder intraperitoneale Injektion von alpha-Synuclein - Fibrillen in bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) Mäuse, die humanen alpha-Synuclein mit der A53T - Mutation aus dem Prionprotein - Promotor überexprimieren und Glühwürmchen - Luciferase aus der Promotor für gliales fibrilläres saures Protein (GFAP), ist ausreichend , um neuropathologische Erkrankung zu induzieren. Im Vergleich zu homozygot Tg (M83 + / +) Mäusen , die Anfang schwere neurologische Symptome im Alter von 8 Monaten, heterozygot Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) entwickeln Tiere bleiben frei von spontaner Krankheit , bis sie ein erreichen Alter von 22 Monaten. Interessanterweise ist die Injektion von alpha-Synuclein-Fibrillen über die intraperitoneMäuse , die mit einer medianen Inkubationszeit von 229 ± 17 Tagen: al Route neurologische Erkrankung mit Paralyse in vier von fünf Tg (GFAP -Luc +/- +/- M83) induziert. Erkrankte Tiere zeigten schwere Ablagerungen von phosphoryliertem alpha-Synuclein in ihrem Gehirn und Rückenmark. Anhäufungen von alpha-Synuclein waren Sarkosyl-unlösliche und mit Ubiquitin und p62 colokalisiert, und wurden durch eine Entzündungsreaktion begleitet, was zu astrozytären Gliose und Mikrogliose. Überraschenderweise Inokulation von alpha-Synuclein-Fibrillen in die Zunge war weniger wirksam bei der Entstehung von Krankheiten mit nur einer der fünf injizierten Tieren alpha-Synuclein Pathologie nach 285 Tagen zeigen. Unsere Ergebnisse zeigen , dass die Impfung über die intraglossal Strecke und um so mehr über die intraperitoneale Route geeignet ist neurologische Erkrankung mit entsprechenden Kennzeichen Synucleinopathien in Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) zu induzieren Mäuse. Dies stellt ein neues Modell für die Untersuchung Prion-ähnliche Pathogenese induziertD durch alpha-Synuclein prionoids näher.
Introduction
Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass alpha-Synuclein-Eigenschaften hat, die die des Prion-Protein ähnlich sind, insbesondere in ihrer Fähigkeit zur Selbst Saatgut- und propagiert misfolding zwischen Zellen und Nervenbahnen entlang. Diese Eigenschaft von alpha-Synuclein wird auch als ‚Prion-like‘ oder ‚prionoid‘ genannt, und wird durch Beobachtungen in den Transplantationsexperimenten unterstützt, die die Übertragbarkeit von misfolded alpha-Synuclein von erkrankten Neuronen vorschlagen 1 gesund Neuronen neu transplantierte, 2 , 3, 4. Auch die direkte Injektion von falsch gefalteten alpha-Synuclein in das Gehirn oder den Umfang, beispielsweise die hinteren Gliedmaßen Muskel oder Darmwand, führt zu einer Ausbreitung von alpha-Synuclein Pathologie distale Teile des ZNS , 5, 6, 7, <sup class = "Xref"> 8, 9, 10. Wir analysierten die Übertragung von alpha-Synuclein prionoids über periphere Routen im Detail und mit der Frage, ob misfolded alpha-Synuclein kann das ZNS nach einer einzigen intraglossal oder intraperitoneale Injektion neuroinvade, eine Funktion, die für Prionen hatte zuvor gezeigt worden, nicht aber für falsch gefaltete alpha- Synuclein. Nach der Injektion von Prionen in die Zunge, Neuroinvasion des ZNS ist über Ausbreitung entlang des Hypoglossus der Zunge erreicht , die an den Kern des Hypoglossus führt, die im Hirnstamm 11 befindet. Als Maus - Modell wählten wir Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) -Mäusen, die die A53T Mutante von menschlichem alpha-Synuclein des Prion Promotor überexprimieren und Firefly unter der Kontrolle eines Promotors GFAP Luciferase durch astrozytischen Aktivierung zu überwachen , Biolumineszenz, wie zuvor im Gehirn gezeigt vonPrion-infizierten Mäusen 12. In unseren Händen bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) entwickelten Mäuse bis zum 23. Lebensmonat nicht Krankheit wie von anderen 13 gezeigt. Eine einzige Injektion von humanen alpha-Synuclein - Fibrillen über die intraglossal oder intraperitonealem Weg induzierte neurologische Erkrankung mit Pathologie im Gehirn und Rückenmark von Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) -Mäusen die Hypothese stützt , dass alpha-Synuclein prionoids teilen wichtige Eigenschaften mit Prionen 14.
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Protocol
Alle Verfahren einschließlich der Tiere wurden mit Genehmigung des Tierschutzausschusses des Landes Nordrhein-Westfalen Landesumweltamt (LANUV) durchgeführt. Die Tiere wurden untergebracht und gepflegt nach Standardbedingungen mit einem 12 h Hell / Dunkel-Zyklus und freiem Zugang zu Futter und Wasser.
1. Tiermodell
- Einander kreuzen hemizygot Tg (GFAP -Luc +/-) -Mäusen mit hemizygot Tg (M83 +/-) -Mäusen hemizygot bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) zu erzeugen Mäuse 15, 16.
- Genotypisierung der Nachkommenschaft mit Echtzeit - PCR auf die Anwesenheit des Transgens , kodierend menschliches alpha-Synuclein und mit Standard - PCR für Firefly - Luciferase 12, 17.
- Impfen die Tiere im Alter von sechs bis acht Wochen.
2. Inokulumherstellung
- bereiten Sie monomeric rekombinantes humaner alpha-Synuclein mit der A53T - Mutation in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS) -Puffer , enthaltend 150 mM NaCl in 20 mM Tris-HCl (pH 7,2) , wie zuvor beschrieben 14 gewesen ist.
- Bereiten fibrillären alpha-Synuclein für Inokulationen durch Rühren 3 & mgr; g / & mgr; l rekombinantes humanes monomeres alpha-Synuclein in einem Orbitalschüttler bei 800 Umdrehungen pro Minute und 37 ° C für 5 Tage.
- Verdünnte Fibrille Baugruppen in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) auf eine Endkonzentration von 1 & mgr; g / & mgr; l für die intraperitoneale oder 2 & mgr; g / & mgr; L für intraglossal Inokulationen zu erreichen.
- Fragment, das die alpha-Synuclein-Fibrillen mit einer Beschallungsvorrichtung Stange für 1 min (40 Pulse von 0,5 s Dauer mit einer Pause von einer Sekunde zwischen jedem Impulse und einer Amplitude auf 50%) auf Eis. Um eine Kontamination durch Kreuz Aussaat zu vermeiden. Verwenden Sie saubere Beschallungssonden unterschiedliche Inokulum herzustellen.
3. Intraglossal Injections
- Anesthetize Tiere mit einer intraperitoneal Injektion von 100 mg / kg Ketamin und 10 mg / kg Xylazin. Drücken Sie den Zeh des Tieres und bestätigen, dass es nicht seine hindlimb nicht entziehen richtige Anästhesie zu gewährleisten. Verwenden Sie vet Salbe auf die Augen des Tieres Trockenheit zu verhindern, während der Narkose.
- Fix narkotisierten Tiere vorsichtig mit Klebeband auf eine Heizplatte in einer dorsalen liegenden Position mit ihren Köpfen gegenüber dem Untersucher zugewandten.
- Füllen Sie eine 27 G Einweginjektionsspritze mit 5 ul von beschallten alpha-Synuclein-Fibrillen oder PBS.
- Verwenden Sie eine stumpfnasige Pinzette mit geriffelten Spitzen des Tieres Mund geöffnet zu halten, und eine zweiten kleinere Pinzette vorsichtig herausziehen, die Zunge an der Unterseite der Zunge zugänglich für die Injektion zu machen.
- Injizieren, um die Nadel der Spritze in die rechte oder untere Seite der Zunge in der Nähe des Hypoglossus gelassen. injizieren Sie langsam die Inokulum nach 5 s. einfahren die Nadel langsam nach 5 s, dass der Impfstoff, um sicherzustellen,das Gewebe eingedrungen ist und nicht verloren geht, während die Nadel zurückgezogen wird.
- Lassen Sie das Tier von seinen Fixierungen und lassen Sie es auf der Heizplatte unter ständiger Überwachung bis zum vollständigen Genesung.
4. intraperitonealeInjektionen
- Für intraperitoneale Injektionen, betäubt die Tiere kurz in einem Anästhesieraum durch Inhalation mit Isofluran / Sauerstoff mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 L / min und den Verdampfer auf 2% verwendet wird. Drücken Sie den Zeh des Tieres und bestätigen, dass es nicht seine hindlimb nicht entziehen richtige Anästhesie zu gewährleisten.
- Füllen Sie eine 27 G Einweginjektionsspritze mit 50 ul von beschallten alpha-Synuclein-Fibrillen oder PBS.
- Direkt in das Peritoneum der Maus injizieren und vermeiden den Dünndarm oder Blinddarm hinter der Bauchwand durchdringt, indem das Tier in einer dorsalen Position mit dem Kopfhalt vom Prüfer und nach unten bei etwa 45 ° abgekehrten. Überwachen Tiere, bis sie gewonnen habenaus der Narkose.
5. Biolumineszenz-Bildgebung
- Bild Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) -Mäusen alle 2-4 Wochen ein Biolumineszenz - Bilderzeugungssystem verwendet wird .
- Kurz vor der Bebilderung anästhesieren Mäuse in einer Isofluran / Sauerstoff-Kammer mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 L / min und dem Verdampfer auf 2% eingestellt. Drücken Sie den Zeh des Tieres und bestätigen, dass es nicht seine hindlimb nicht entziehen richtige Anästhesie zu gewährleisten.
- Shave und enthaart die Köpfe der Mäuse mit einer Enthaarungscreme. Färben Sie die Ohren in schwarz mit einem nicht reizend Marker unspezifisch Biolumineszenz zu blockieren.
- Verdünnte D-Luciferin-Kaliumsalz, um das Substrat der Luciferase, in PBS auf 30 mg / ml Stammlösung. Speicher dieses in 1 ml Aliquots bei -20 ° C. Schützen die gelöste D-Luciferin aus der Exposition gegenüber Licht.
- Wiegen Sie die Tiere vor der Injektion. Berechnen das genaue Volumen von D-Luciferin zur Injektion von 150 mg / kg Körpergewicht. Intraperitoneal D injizieren-luciferin und das Tier auf die Anästhesie Kammer zurück.
- Starten Sie die Imaging-Software. Nachdem das Abbildungssystem seine Betriebstemperatur initialisiert das System durch Klicken auf den ‚Initialize‘ -Taste auf dem Bedienfeld erreicht hat.
- Wählen Sie die ‚Lumineszente‘ Tasten und ‚Fotografie‘. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 60 s, den Binning ‚Medium‘, das F / Stop auf ‚1‘, und der EM-Verstärkung auf ‚Aus‘.
- Bestätigen, dass das Anregungsfilter wird auf ‚Block‘ und den Emissionsfilter auf ‚Öffnen‘ und stellen den Gegenstand Höhe bis 1,50 cm.
- Zehn Minuten nach der Injektion mit D-Luciferin, legen die Tiere auf die Heizplatte in der Abbildungskammer und sicherstellen, dass ihre Mündungen richtig in der Anästhesie Auslass angeordnet. Schließen Sie die Isofluran / Sauerstoff-Strömung von der Inhalationskammer öffnen und die Strömung für die Abbildungskammer mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,25 l / min und einer Verdampfung von 2%. Schließen der Tür der Abbildungskammer properly.
- Klicken Sie auf das ‚Acquire‘, um die Biolumineszenz zu messen, die 60 s dauert. Stoppen Sie die Isofluran-Flow und überwachen die Tiere, bis sie vollständig nach ihnen Rückkehr in ihre Käfige zurück erholt haben.
- Verwenden der Abbildungssoftware auf die Biolumineszenz zu quantifizieren. Innerhalb der ‚Werkzeugpalette‘ die Option ‚ROI Tool‘. Unter ‚Typ‘ innerhalb der ‚ROI Tools‘ wählen ‚Mess ROI‘.
- Innerhalb der ROI Tool 'klicken Sie auf das „Kreis“ Werkzeug und wählen Sie die Anzahl der ROIs aus dem Pull-Down-Menü zu ziehen - im Idealfall ‚3‘ für drei Mäuse.
- Im Bild der rechte Maustaste jeder ROI und unter ‚Eigenschaften‘ die Breite und Höhe bis 1,25 cm einzustellen. Positionieren Sie jeden ROI über den Bereich des Gehirns, die quantifiziert.
- In der oberen linken Ecke des Bildes, stellte die Einheiten Blech an Strahlung (Photonen) '.
- Innerhalb der ‚Werkzeugpalette‘ die Option ‚Bildeinstellungen‘ und das Minimum einstellen unddas Maximum der ‚Farbskala‘, zum Beispiel von 0.20e6 zu 1.00E6.
- Unter ‚Datei‘ die Daten mit ‚Speichern‘ speichern.
6. Biochemische Analyse
- Isoliert das Gehirn und Rückenmark nach etablierten Protokollen 18, 19.
- Homogenisiert gesamtes Gehirn und Rückenmark ganze Proben separat in PBS in Gegenwart von Protease und Phosphatase-Inhibitoren (verdünnt in PBS auf 1x) in zwei 30-s-Zyklen in einem Gewebe-Homogenisator mit 6000 Umdrehungen pro Minute. Stellen Sie sicher, dass das Gehirn und Rückenmark-Proben bis zu einer Endkonzentration von 20% homogenisiert werden (wt / vol).
- Beschallen die Proben zweimal, während sie auf Eis mit einem konstanten Puls von 10 s und einer Amplitude auf 50% zu halten.
- Paßt die Homogenate zu 10% in PBS und 750 mM NaCl verdünnt, indem sie 1: 1 mit 1,5 M NaCl in PBS.
- Um die Zelltrümmer abzutrennen Zentrifugation der Homogenate bei 1.000 xg für 5 min bei4 ° C. Halten Sie die Überstände für die nächsten Schritte und verwerfen die Pellets.
- Messung der Proteinkonzentration in den Homogenaten die Bicinchoninsäure (BCA) -Assay unter Verwendung von nach den Anweisungen des Herstellers. Inkubieren 1,0 mg des Gesamtproteins von Hirnhomogenaten oder 0,8 mg von Rückenmark-Homogenaten in N-laurylsarcosyl bei einer Endkonzentration von 10% (wt / vol) für 15 Minuten auf Eis.
- Überlagern die Homogenate auf eine 3 ml-Saccharose-Kissen von 10% (wt / vol) in destilliertem Wasser und Ultrazentrifuge bei 465,000 x g sie für 1 h bei 4 ° C.
- Resuspendieren des Pellets in einem Puffer, enthaltend 4% Natriumdodecylsulfat (SDS), 2% β-Mercaptoethanol, 192 mM Glycin, 25 mM Tris und 5% (wt / Vol) Saccharose.
- Kocht die Proben bei 100 ° C für 5 min und laden sie auf SDS-Polyacrylamid-Gele für die Elektrophorese in einem Morpholinethansulfonsäure (MES) Puffer-System.
- Übertragen der abgetrennten Proteine auf Polyvinylidendifluorid (PVDF) -Membranen in einer semiDry System Blotting.
- Inkubieren der Membranen in 0,4% (vol / vol) Formalin-Lösung in PBS für 30 min bei Raumtemperatur auf einem Rotor, der mit 35 Umdrehungen pro Minute zu vernetzen, die Proteine mit der Membran.
- Blockieren die Membranen in TBS-Puffer, enthaltend 0,05% (vol / vol) Tween 20 und 5% (wt / vol) Milch für 1 h bei Raumtemperatur.
- Inkubiere die Blots mit dem primären Antikörper in Puffer über Nacht bei 4 ° C blockiert.
- Waschen Sie die Membranen dreimal in TBS-Puffer und Inkubation mit Peroxidase oder sie Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörpern in TBS für 1 h bei Raumtemperatur.
- Visualisieren des gebundenen sekundären Antikörper durch Chemilumineszenz oder Fluoreszenz nach etablierten Protokollen 20.
7. Immunofluoreszenzanalyse
- Entwässern das sezierten Gehirn und Rückenmark in einer Gewebebearbeitungsstation und betten sie in Paraffin eine Paraffinstation.
- Schneiden Sie das Paraffin eingebettete tisklagt mit einem Mikrotom in 8 & mgr; m dicke koronale Schnitte und die Abschnitte auf Glasobjektträger montieren.
- Entparaffinieren Gewebeabschnitte , indem sie in zwei separate Bäder Xylol für 5 bis 10 min und rehydratisieren sie durch eine Reihe von abgestuften Ethanolbäder (100%, 90%, 70%, 50%) und schließlich mit H 2 O. Inkubieren
- Inkubieren der Schnitte in 0,01 M Citratpuffer (pH 6,0) für 5 min bei Raumtemperatur und sie zusätzlich für 10 min in einem Mikrowellenofen sieden.
- Lassen Sie die Abschnitte abkühlen auf Raumtemperatur und Inkubation sie mit einer 3% igen Wasserstoffperoxid-Lösung für 30 min endogene Peroxidasen zu hemmen.
- Blockieren die Gewebeschnitte durch Inkubation mit 20% (vol / vol) normalem Ziegenserum, 1% (vol / vol) Rinderserumalbumin (BSA) und 0,5% Triton X-100 in PBS für 1 h bei Raumtemperatur.
- Inkubiere die Abschnitte mit dem primären Antikörper, verdünnt in 1% (vol / vol) normalem Ziegenserum, 1% (Vol / Vol) BSA und 0,25% Triton X-100 in PBS über Nacht bei 4 ° C. <li> Waschen Sie die Abschnitte zweimal mit 0,25% (vol / vol) Triton X-100 in PBS und einmal mit PBS.
- Beflecken die Abschnitte mit den entsprechenden Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörpern und dem DAPI Kern Farbstoff verdünnt in 1% (vol / vol) normalem Ziegenserum, 1% (Vol / Vol) BSA und PBS für 1 h bei Raumtemperatur.
- zweimal mit 0,25% (vol / vol) Triton X-100 in PBS und einmal mit PBS, das Deckglas die Objektträger mit Einbettungsmitteln und visualisieren die Färbung mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop nach dem Waschen.
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Representative Results
Periphere Injektion von alpha-Synuclein prionoids über die Zunge oder das Peritoneum induzierte Neuropathologie im ZNS von bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) -Mäusen (Tabelle 1 und Abbildung 1). Nach einer einzigen intraperitoneale Injektion mit alpha-Synuclein-Fibrillen, vier von fünf Mäusen entwickelten neurologische Erkrankung mit einer mittleren Inkubationszeit von 229 ± 17 Tagen. Überraschenderweise nur einer von fünf Mäusen entwickelten ZNS-Erkrankung nach intraglossal Injektion mit alpha-Synuclein-Fibrillen nach 285 Tagen. Inokulation mit PBS nicht die Ursache für Krankheit innerhalb der 420 Tage Zeit des Experiments.
Die biochemische Analyse durch Western-Blot und Sondieren mit dem Phospho-spezifischen EP1536Y Antikörper gegen Ser129 von Alpha-Synuclein ergab, dass für beide Übertragungswege erkrankter Tiere Aggregate von phosphoryliert angesammelt hatten und Sarkosyl-unlösliche alpha-Synuclein in ihrem Gehirn und Rückenmark (Tabelle 2 und Abbildung 2). Im Gegensatz dazu Gehirne und Rückenmark von PBS-injizierten und nicht erkrankte Tiere enthielten nur monomere Spezies von phosphoryliertem alpha-Synuclein.
Immunofluoreszenz-Anfärbung von Gehirnschnitten von intraperitoneal injizierte und erkrankten Maus mit dem Phospho-spezifischen PSYN # 64-Antikörper zeigte eine breite Verteilung von phosphoryliertem alpha-Synuclein-Ablagerungen in der gesamten ZNS (Tabelle 2 und Abbildung 3). Außerdem kolokalisiert phosphorylierten alpha-Synuclein-Ablagerungen mit Ubiquitin und p62 eine aberrante Proteinhomöostase angibt, die zur Bildung von Ablagerungen beitragen könnten.
Die Anhäufung von alpha-Synuclein-Aggregaten in erkrankten Tieren wurde von neuroinflammatorische Veränderungen begleitet, die durch festgestellt wurdeImmunofluoreszenz - Färbung für GFAP, einen Marker von Astrozyten , die reaktiven Astrogliose (Abbildung 4) offenbart. Zusätzlich aktivierten Mikroglia wurden auch in Regionen mit reichlich vorhandenen alpha-Synuclein Pathologie durch Immunfluoreszenzfärbung für IBA-1 (ionisiertes Calcium bindenden Adaptormolekül 1). Entsprechend zeigte Biolumineszenz - Bildgebung Strahlen erhöht (> 2 × 10 6 p / s / cm 2 / sr) , emittiert von den Gehirnen von Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) Mäuse mit alpha-Synuclein - Fibrillen eingespritzt wird , kurz bevor sie Anzeichen einer neurologischen Erkrankung entwickelt. Im Gegensatz dazu Gehirne von Mäusen, die mit PBS injizierten zeigten keine Zunahme der Ausstrahlung. Erhöhter Strahlen indikativ für reaktive Astrogliose, einem Markenzeichen von Neuroinflammation, da die Luciferase - Expression aus dem GFAP - Promotor angetrieben wird.
1: Injektion mit alpha-Synuclein - Fibrillen über die intraperitoneale Route oder intraglossal verursacht Krankheit in bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) -Mäusen. (A) Elektronenmikroskopische Aufnahme von mit Ultraschall behandelt rekombinanten humanen alpha-Synuclein - Fibrillen , die intraperitoneal und intraglossally wurden in Mäuse injiziert. Negative Färbung mit Uranylacetat ergab mehrere Cluster von kurzen, stäbchenförmigen Aggregaten. Maßstabsbalken = 100 nm. (B) Kaplan-Meier - Überlebenskurven zeigen , dass nach der intraperitonealen Injektion mit alpha-Synuclein - Fibrillen vier von fünf Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) -Mäusen neurologische Erkrankung bei 229 ± 17 Tage (lila Quadrate) entwickelt, während keine der PBS-injizierten Kontrollmäuse entwickelte Anzeichen einer neurologischen Funktionsstörung in 420 Tagen (purple offene Quadrate). Nach intraglossal Inokulation mit alpha-Synuclein eine Maus von fünf starb nach 285 Tagen (grüngeschlossene Kreise). Im Gegensatz dazu keine der PBS-injizierten Kontrollmäusen entwickelt neurologische Krankheit oder starben spontan (grün offene Kreise). Geändert von Breid et al. 2016 14. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Biochemische Analyse von phosphorylierten alpha-Synuclein in das ZNS von peripher injiziert Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) -Mäusen. (A) Immunoblot mit dem Antikörper EP1536Y, Erkennen Phosphorylierung an Ser129 von alpha-Synuclein zeigte, daß intraperitoneal injizierte Mäuse und erkrankte hochmolekulare Spezies von Sarkosyl-unlöslichen Aggregaten von phosphoryliertem alpha-Synuclein in ihren Gehirnen akkumulierten eined Rückenmark. Kontrollmäuse mit PBS herausgefordert hat akkumulieren keine Aggregate von phosphoryliertem alpha-Synuclein und zeigte Banden nur für seine monomere Form. (B) Nach intraglossal Herausforderung mit alpha-Synuclein - Fibrillen nur eine Maus, Tier 121, zeigte Sarkosyl-unlösliche Aggregate von phosphoryliertem alpha-Synuclein in seinem Gehirn und Rückenmark, während alle andere intraglossally inokulierten Mäuse ohne Ablagerungen von alpha-Synuclein gesund blieben. Molekularmassen sind in Kilodalton gezeigt. Probenbeladung in jeder Bahn wird durch den Nachweis von Actin gezeigt. Geändert von Breid et al. 2016 14. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Immunofluoreszenz - Analyse zeigt , dass Ablagerungen vonphosphoryliert alpha-Synuclein colokalisieren mit Ubiquitin und p62 im Gehirn und Rückenmark von erkranktem Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) -Mäusen. Co-Färbung von phosphorylierten alpha-Synuclein, mit dem EP1536Y Antikörper nachgewiesen, und Ubiquitin ergaben eine deutliche Kolokalisation im Gehirn, wie im thalamischen Nukleus (A) beobachtet, und Rückenmark, wie es in der grauen Substanz (B) erfaßt wird , der erkrankte Mäuse nach ip Herausforderung mit alpha-Synuclein. In ähnlicher Weise phosphoryliert alpha-Synuclein, mit dem Antikörper # 64 PSYN detektiert, auch mit p62 in Gehirnen (C) und dem Rückenmark (D) von erkrankten Tieren kolokalisiert. (A bis D) PBS-injizierten gesunden Kontrolltieren zeigte keine Ablagerungen oder Kolokalisation für irgendeines dieser Proteine. Kernfärbung mit DAPI ist blau dargestellt. Maßstabsbalken = 20 um. Geändert von Breid et al. 2016 14. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) -Mäusen Gliose nach peripherer Herausforderung mit alpha-Synuclein - Fibrillen entwickelt. (A) Immunofluoreszenz - Analyse von Hirnschnitten von erkrankten Tieren , die mit einem Antikörper gegen GFAP, einen Marker von Astrozyten, offenbarte reaktive Astrogliose in Bereichen mit Ablagerungen von phosphoryliertem alpha-Synuclein, die im Hirnstamm mit dem # 64 - Antikörper PSYN nachgewiesen wurden. Im Gegensatz dazu gab es keine reaktive Astrogliose in Gehirnen von PBS-injizierten Kontrollmäusen. (B) In ähnlicher Weise mit einem Antikörper gegen IBA-1 - Färbung, eine Markierung der Mikroglia demonstrierte Mikrogliosein Gebieten mit Ablagerungen von phosphoryliertem Alpha-Synuclein in erkrankten Tieren. Gehirn von gesunden, PBS-injizierten Kontrollmäusen zeigte keine Anzeichen von Mikrogliose. (C) Biolumineszenz - Bildgebung zeigte erhöhte Strahlung aus dem Gehirn und Rückenmark von Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) -Mäusen intraperitoneal mit alpha-Synuclein - Fibrillen (linkes Feld) eingespritzt wird , die durch die Aktivierung von Astrozyten verursacht wurde , kurz bevor die Mäuse neurologische Symptome entwickelt. Im Gehirn und Rückenmark von PBS-injizierten Kontrollmäusen die basale Ausstrahlung nicht mit der Zeit (rechte Tafel) erhöhen. Nach intraglossal Inokulation mit alpha-Synuclein - Fibrillen, eine Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) Maus, Tier 121, zeigten Anzeichen von reaktiven Astrogliose kurz bevor es bei 285 Tagen (Mitte) gestorben. (D) Nach intraperitonealer Herausforderung Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) Mäuse mit alpha-Synuclein - Fibrillen, Increased Ebene der Biolumineszenz (> 2 × 10 6 p / s / cm 2 / sr) wurden aus den Gehirnen von vier Mäusen (blau, grün, braun und orange Kreise) einige Wochen gemessen , bevor sie neurologische Anzeichen einer Krankheit entwickelt. Einer von fünf Tieren zeigte auch erhöhte Werte von Biolumineszenz kurz vor 285 Tage nach intraglossal Injektion mit alpha-Synuclein-Fibrillen (Magenta Kreise) gestorben. Im Gegensatz dazu für eine gesunden, PBS-injizierten Kontrollmäuse (schwarze Kreise; Fehlerbalken zeigen SD [n = 4]) und ein Tier , das nicht Krankheit nach intraperitoneale Injektion mit alpha-Synuclein - Fibrillen (rote Kreise), die Biolumineszenzsignal entwickeln blieb unterhalb einer Schwelle von 2 x 10 & sup6 ; p / s / cm 2 / sr im Beobachtungszeitraum. Maßstabsbalken = 20 um. Geändert von Breid et al. 2016 14. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieses anzuzeigenZahl.
| Mauslinie | Inokulum (ug) | Inokulation Route | Anzahl der Mäuse, die mit Krankheit / Nr. von Mäusen geimpft | Die mittlere Überlebenszeit ± SD (Tage) |
| Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) | menschliche α-Synuclein-Fibrillen (50) | intraperitoneale | 4/5 | 229 ± 17/420 |
| Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) | PBS | intraperitoneale | 0/5 | 0/420 |
| Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) | menschliche α-Synuclein-Fibrillen (10) | intraglossal | 1/5 | 285/420 |
| Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) | PBS | intraglossal | 0/4 0/420 |
Tabelle 1: Inokulation Experimente. * Modifizierte von Breid et al. 2016 14
| Ziel [Antikörperklon] | Gastgeber | Immunogen | Verdünnung in IF | Verdünnung in WB |
| Actin [C4] | Maus | - | - | 1: 1.000 |
| α-Synuclein, phospho S129 [PSYN # 64] | Maus | pSer129 | 1: 1200 | - |
| α-Synuclein, phospho S129 [EP1536Y] | Hase | pSer129 | 1: 100 | 1: 1.000 |
| Sauren Gliafaserproteins (GFAP) | Hase | - | 1: 200 | - |
| IBA-1 | Hase | - | 1: 500 | - |
| Sequestosome-1 (p62) | Hase | - | 1: 100 | - |
| Ubiquitin [Ubi-1] | Maus | - | 1: 500 | - |
Tabelle 2: verwendet Antikörper für Immunofluoreszenz (IF) und Western Blot (WB). * Modifizierte von Breid et al. 2016 14
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Discussion
Periphere Injektion von alpha-Synuclein - Fibrillen in das Peritoneum von Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) -Mäusen stellt ein einfaches Verfahren durch Neuroinflammation begleitet neurologische Krankheit zu induzieren wichtige Eigenschaften von Synucleinopathien rekapitulieren. In ähnlicher Weise stellt Zunge Injektion eine andere Route für die Neuroinvasion von alpha-Synuclein prionoids in transgenen Mäusen ist aber weniger effizient. Wir entschieden uns für unsere Experimente bei 420 Tagen nach der Injektion zu beenden, und wir können die Möglichkeit nicht ausschließen, dass mehr oder alle der Fibrillen-injizierten Mäuse Erkrankung zu einem späteren Zeitpunkt entwickelt hat. Außerdem ist die Verwendung von Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ermöglicht Mäuse nicht-invasive Visualisierung von Astrogliose und stellt eine einfache Methode zur Behandlung von entzündlichen Reaktionen , die durch die Neuroinvasion von alpha-Synuclein über die gesamte Lebensdauer des verursachten Überwachung Maus.
Ein kritischer Schritt ist die Vorbereitungdes Inokulums. Scheinbar triviale Faktoren wie Aggregationszeit, Beschallungszeit, die Fülle von Endotoxinen, oder die Menge an Fibrillen zur Injektion verwendet wird, könnte das Ergebnis eines Experiments beeinflussen , indem sie die Aussaat Neigung von misfolded alpha-Synuclein 21 zu beeinflussen. So ist es wichtig, die gleichen Bedingungen immer zu verwenden, wenn Inokula zur Injektion vorbereitet. Für intraglossal Injektionen hat es, dass nicht nur der Hypoglossus in Betracht gezogen werden, sondern auch andere Hirnnerven wie der Glossopharyngeus die Zunge innervate und konnte im interneuronaler Transport von Alpha-Synuclein prionoids an das Gehirn beteiligt sein. So können unterschiedliche Bereiche der Zunge Targeting in verschiedener Spreitungskinetik zum Gehirn führen könnte. Wir haben nicht direkt in den Hypoglossus injizieren und es ist möglich, dass der Hypoglossus Targeting Übertragung von alpha-Synuclein prionoids CNS verbessern könnte. Für intraperitoneale Injektionen mit alpha-Synuclein-Fibrillen ist es kritical, dass das Inokulum richtig in das Peritoneum injiziert wird und nicht versehentlich in die inneren Organe wie Darm oder Blinddarm, die sich negativ auf die Neuroinvasion beeinträchtigen könnten. Dies ist auch wichtig für die Biolumineszenz-Bildgebung, wenn D-Luciferin injiziert wird. Mistargeting von D-Luciferin an inneren Organe könnte seine Verteilung an das Gehirn verlangsamen und in unterer Biolumineszenz führen. einheitliche Ergebnisse zu erzielen während es Bildgebung ist auch wichtig, immer frisch, die D-Luciferin-Lösung vor der Injektion vorzubereiten und genau 10 Minuten nach intraperitonealer Injektion vor der Bebilderung brüten zu lassen.
Biolumineszenz-Bildgebung ist eine nützliche Methode, um nicht-invasiv messen Veränderungen in Astrogliose über die Zeit und kann nicht nur nach intraperitonealer oder intraglossal Injektionen angewandt werden, sondern auch nach jeder Art von Behandlung, einschließlich zum Beispiel, intrazerebrale oder intravenöse Injektionen. Ausbreitung von alpha-Synuclein prionoids von der Peripherie zu überwachen, um die CNS und die damit verbundene neuroinflammation wir bigenic Tg verwendet (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) Mäusen. Da hemizygot Expression von alpha-Synuclein in diesen Tieren ist 40% niedriger in Bezug auf homozygote Tiere sie frei von spontaner Krankheit bleiben bis zu 22 Monate alt und haben einen geeigneten genetischen Hintergrund für alpha-Synuclein - Übertragung untersucht 13. Allerdings Änderungen die Wahl des Mausmodells für Biolumineszenz-Bildgebung in Bezug wünschenswert sein. Eine interessante Option ist die Verwendung von monogenen Tg (GFAP -Luc +/-) Mäusen, die nur als ein Transgen Luciferase, die eine Beurteilung des prionoid Verhalten von alpha-Synuclein - Fibrillen auf einem Hintergrund ermöglicht es , die im Wesentlichen Wildtyp ist so weit wie alpha-Synuclein 14 betrifft. Außerdem kreuzt Tg (GFAP -Luc +/-) -Mäusen zu anderen transgenen Mäusen, wie Tg (SOD1 G93A) Mäuse für amyotrophe Lateralsklerose oder Tg (APP23) mEis für Alzheimer-Krankheit, ermöglicht die Abbildung von neuroinflammation in anderen Krankheitsmodellen 22, 23.
Eine Beschränkung dieses Protokolls ist, dass basierend auf der Stelle der Injektion der injizierte Inokulum nicht ein gewisses Volumen nicht überschreiten kann. So Injektionen in die Zunge kann nur mit kleineren Volumina als die in das Peritoneum durchgeführt werden, die Übertragungszeiten an das ZNS beeinflussen können. Eine weitere Einschränkung ist , dass die GFAP -Luc Transgen nur Nachweis von Astrogliose ermöglicht aber nicht von Mikrogliose, die in neuroinflammation gleichermaßen wichtig ist. Schließlich hat dieses Modell Einsichten nicht geben, wie alpha-Synuclein prionoids das ZNS nach intraperitoneale Injektion erreichen.
Die Anwendung von exogenen alpha-Synuclein prionoids über Injektion wurde in rekapituliert Eigenschaften synuclei eine nützliche Methode zu untersuchen Übertragungswege zu zeigen, daß eine kritische Rolle spielennopathies. Intrazerebrale Injektionen von rekombinantem alpha-Synuclein - Fibrillen oder krankheitsassoziierten Maus oder menschlicher alpha-Synuclein Spezies in Tiermodellen wurden in mehreren Studien verwendet , um ihre seeding Eigenschaften und die Übertragungseffizienz im Laufe der Zeit 5 zu analysieren, 7, 17, 24, 25, 26. Da Injektionen in Stereotaktische Gehirn immer eine lokale Entzündungsreaktion kurz nach der Operation veranlassen, könnte dies Übertragungsweg die Ausbreitung und Infektiosität des durch eine Veränderung des Gehirn Homöostase verursacht Inokulum beeinflussen. Neuere Studien haben den Fokus auf periphere oder systemische Anwendungen geändert, nicht in erster Linie den chirurgischen Eingriff zu vermeiden, sondern die Peripherie zu analysieren, die Darmwand, Skelettmuskel, oder Blut, als Anfangspunkt, von dem Neuroinvasion an das ZNS könnte commence 6, 9, 14, 27. Für Prionen ist es, dass die Übertragung durch das Peritoneum oder die Zunge führt zu Neuroinvasion und neurologische Krankheit gezeigt; nach Zunge Infektion innerhalb von zwei Wochen auf den hypoglossalen Kern im Gehirn verteilt Prionen Schaft 11. Da alpha-Synuclein diskutiert wurde neuroinvasiv und seeding Eigenschaften wie Prionen zu haben, haben wir gezeigt , dass die Übertragung über die Zunge und das Peritoneum weitere Eintrittspunkte für alpha-Synuclein prionoids repräsentiert das CNS 14 einzufallen. Quantifizierung von Astrogliose durch Biolumineszenz-Bildgebung ermöglicht die Verfolgung des Prozesses neuroinflammatorischen Lauf der Zeit und stellt eine nicht-invasive Alternative zur histologischen Analyse.
Zu erhalten, einen tieferen Einblick in das ZNS reagiert auf die Neuroinvasion von Alpha-Synuclein prionoidsund für andere Behandlungen , die dazu führen , Neuroinflammation, wäre es vorteilhaft, Maus - Modelle zu erzeugen , die auch nicht-invasive Überwachung der Mikrogliose ermöglichen, zB mit einem Transgen , das die Luciferase - Expression aus einem Promotor , der spezifisch für die Proteinexpression in Mikroglia antreibt.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren danken Olga Sharma, Theresa Hundt, und die Mitarbeiter der DZNE-Mikroskopie und Tieranlagen für den technischen Support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-actin antibody | Merck Millipore | MAB1501 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [pSyn#64] | Wako | 015-25191 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [EP1536Y] | Abcam | ab51253 | |
| anti-GFAP antibody | Dako | Z0334 01 | |
| anti-IBA-1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| anti-Sequestosome-1 (p62) antibody | Proteintech | 18420-1-AP | |
| anti-ubiquitin antibody [Ubi-1] | Merck Millipore | MAB1510 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190169 | |
| Ketamine | Ratiopharm | 100 mg/kg | |
| Xylazine | Ratiopharm | 10 mg/kg | |
| 27 G syringe | VWR | 613-4900 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | PZN 4831850 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Secureline lab marker | Neolab | 25040 | |
| D-luciferin potassium salt | Acris | LK10000 | 30 mg/mL stock solution |
| Thermomixer | Eppendorf | 5776671 | |
| Sonopuls Mini20 sonicator | Bandelin | 3648 | |
| IVIS Lumina II imaging system | PerkinElmer | ||
| Living Image 3.0 Software | PerkinElmer | ||
| Tg(M83+/-) mice or B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice | The Jackson Laboratory | 004479 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| N-laurylasarcosyl | Sigma | L5125-100G | |
| Optima Max-XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | TLA-110 rotor | |
| Thickwall polycarbonate tubes | Beckman Coulter | 362305 | |
| NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | WG1401BOX | |
| HRP conjugated antibody | Cayman | Cay10004301-1 | |
| IR Dye 680 conjugated antibody | LI-COR Biosciences | 926-68070 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34075 | |
| Stella 3200 imaging system | Raytest | ||
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Biosciences | ||
| Tween 20 | MP Biomedicals | TWEEN201 | |
| Triton X-100 | Sigma | SA/T8787 | |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Merck Millipore | IPFL00010 | |
| Xylol | Sigma | Roth | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | SA/00216763/000500 | working solution 3% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Thermo Fisher Scientific | A3294-100G | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | working dilution 1:50,000 |
| Fluoromount media | Omnilab | SA/F4680/000025 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | ||
| HALT protease and phosphatase inhibitors | Thermo Fisher Scientific | 10516495 | |
| Precellys 24-Dual homogenizer | Peqlab | 91-PCS24D | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A31619 | |
| Alexa Fluor 594 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 10741395 | |
| Microtome RM2255 | Leica | ||
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss |
References
- Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459 (7249), 924-925 (2009).
- Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Freeman, T. B. Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson's disease. Nat Med. Olanow, C. W. 14 (5), 504-506 (2008).
- Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).
- Hansen, C., et al. alpha-Synuclein propagates from mouse brain to grafted dopaminergic neurons and seeds aggregation in cultured human cells. J Clin Invest. 121 (2), 715-725 (2011).
- Masuda-Suzukake, M., et al.
- Holmqvist, S., et al. Direct evidence of Parkinson pathology spread from the gastrointestinal tract to the brain in rats. Acta Neuropathol. 128 (6), 805-820 (2014).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
- Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1, 38 (2013).
- Sacino, A. N., et al. Intramuscular injection of alpha-synuclein induces CNS alpha-synuclein pathology and a rapid-onset motor phenotype in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10732-10737 (2014).
- Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33 (9), 2225-2228 (2012).
- Bartz, J. C., Kincaid, A. E., Bessen, R. A. Rapid prion neuroinvasion following tongue infection. J Virol. 77 (1), 583-591 (2003).
- Tamgüney, G., et al. Measuring prions by bioluminescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 15002-15006 (2009).
- Watts, J. C., et al. Transmission of multiple system atrophy prions to transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (48), 19555-19560 (2013).
- Breid, S., et al. Neuroinvasion of alpha-Synuclein Prionoids after Intraperitoneal and Intraglossal Inoculation. J Virol. 90 (20), 9182-9193 (2016).
- Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34 (4), 521-533 (2002).
- Zhu, L., et al. Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice. Neurosci Lett. 367 (2), 210-212 (2004).
- Bernis, M. E., et al. Prion-like propagation of human brain-derived alpha-synuclein in transgenic mice expressing human wild-type alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 3 (1), 75 (2015).
- Gunther, R., et al. Clinical testing and spinal cord removal in a mouse model for amyotrophic lateral sclerosis (ALS). J Vis Exp. (61), (2012).
- Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Nat Protoc. 2 (1), 141-151 (2007).
- Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).
- Kim, C., et al. Exposure to bacterial endotoxin generates a distinct strain of alpha-synuclein fibril. Sci Rep. 6, 30891 (2016).
- Keller, A. F., Gravel, M., Kriz, J. Live imaging of amyotrophic lateral sclerosis pathogenesis: disease onset is characterized by marked induction of GFAP in Schwann cells. Glia. 57 (10), 1130-1142 (2009).
- Stöhr, J., et al. Distinct synthetic Abeta prion strains producing different amyloid deposits in bigenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).
- Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice. J Exp Med. 209 (5), 975-986 (2012).
- Recasens, A., et al. Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys. Ann Neurol. 75 (3), 351-362 (2014).
- Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1 (1), 38 (2013).
- Peelaerts, W., et al. alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).
