Summary
Injecção periférica de fibrilas-sinucleína alfa no peritoneu ou língua de Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ratos, que expressam alfa-sinucleína humana com a mutação A53T familiar e a luciferase do pirilampo, pode induzir a neuropatologia, incluindo neuroinflamao , em seu sistema nervoso central.
Abstract
Para estudar o comportamento de prião de tipo de enrolamento incorrecto alfa-sinucleína, são necessários modelos de murganho que permite a transmissão rápida e simples de prionoids alfa-sinucleína, que causam neuropatologia no interior do sistema nervoso central (SNC). Aqui descrevemos que intraglossal ou injecção intraperitoneal de fibrilas-sinucleína em alfa bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ratos, que sobre-expressam alfa-sinucleína humana com a mutação A53T a partir do promotor da proteína prião e a luciferase do pirilampo de o promotor para a proteína ácida fibrilar glial (GFAP), é suficiente para induzir doença neuropatológica. Em comparação com Tg homozigótica (M83 + / +) ratinhos que desenvolvem sintomas neurológicos graves começam com uma idade de 8 meses, heterozigótica Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) animais permanecem livres da doença espontânea até atingirem um idade de 22 meses. Interessantemente, a injeco de fibrilas-sinucleína alfa através da intraperitoneal rota induzida doença neurológica com paralisia em quatro de cinco Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ratos com um tempo de incubação médio de 229 ± 17 dias. animais doentes mostrou depósitos graves de fosforilada alfa-sinucleína em seus cérebros e medulas espinhais. Acumulações de alfa-sinucleína foram sarcosil-insolúvel e co-localizada com ubiquitina e p62, e foram acompanhados por uma resposta inflamatória que resulta em gliose de astrócitos e microgliose. Surpreendentemente, a inoculação de fibrilas-sinucleína alfa para a língua era menos eficaz em causar doença com apenas um dos cinco animais injectados mostrando alfa-sinucleína patologia após 285 dias. Nossos resultados mostram que a inoculação por via intraglossal e mais ainda através da via intraperitoneal é adequado para induzir doença neurológica com características relevantes da sinucleinopatias em Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) camundongos. Isto fornece um novo modelo para estudar prion-como patogênese induzird por prionoids alfa-sinucleína em maior detalhe.
Introduction
Existe evidência crescente de que o alfa-sinucleína tem características que são semelhantes às da proteína prião, em particular na sua capacidade de se auto-propagam semente e enrolamento incorrecto entre as células e ao longo de caminhos neuronais. Esta propriedade de alfa-sinucleína é também referido como 'prião de tipo' ou 'prionoid', e é suportada por observações em experiências de transplantação, o que sugere a transmissibilidade do enrolamento incorrecto alfa-sinucleína a partir de neurónios doentes para recém-transplantados neurónios saudáveis 1, 2 , 3, 4. Também injecção directa de enrolamento incorrecto alfa-sinucleína no cérebro ou da periferia, por exemplo, o músculo do membro posterior ou parede intestinal, resulta numa disseminação da patologia alfa-sinucleína a partes distais do SNC 5, 6, 7, <sup class = "xref"> 8, 9, 10. Analisou-se a transmissão de prionoids alfa-sinucleína por vias periféricas em mais detalhe e dirigiu-se à questão de saber se misfolded alfa-sinucleína pode neuroinvade do SNC após uma única injecção intraperitoneal ou intraglossal, uma característica que tinha sido previamente demonstrado para priões, mas não para alfa- misfolded sinucleína. Após a injecção de priões para a língua, neuroinvasão do SNC é alcançada através de propagação ao longo do nervo hipoglosso da lingueta que conduz para o núcleo do nervo hipoglosso, que está localizado no tronco cerebral 11. Como um modelo de ratinho que escolheu Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) murganhos que sobre-expressam o mutante A53T de alfa-sinucleína humano a partir do promotor do prião, e luciferase de pirilampo sob o controlo de um promotor GFAP para monitorizar a activação de astrócitos pela bioluminescência, como mostrado anteriormente no cérebro deprião-infectados ratinhos 12. Em nossas mãos bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ratos não desenvolveram a doença até 23 meses de idade, como tem sido demonstrado por outros 13. Uma única injecção de fibrilas-sinucleína alfa humanos através da rota ou intraglossal induzida doença neurológica intraperitoneal com patologia nos cérebros e medulas espinhais de Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) murganhos que suportam a hipótese de que prionoids alfa-sinucleína compartilham características importantes com priões 14.
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Protocol
Todos os procedimentos, incluindo animais foram realizados com a aprovação da comissão de proteção animal de Rhine-Westphalia Agência Norte Estadual do Meio Ambiente (LANUV). Os animais foram alojados e tratados de acordo com condições padrão com um 12 h ciclo de luz / escuro e acesso livre a alimento e água.
1. Modelo Animal
- Intercross hemizigótica Tg (GFAP -Luc +/-) ratinhos com ratinhos hemizigótica Tg (M83 +/-) para gerar hemizigótica bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ratos 15, 16.
- Genótipo a descendência com PCR em tempo real para a presença do transgene que codifica alfa-sinucleína humana e com a PCR padrão para a luciferase de pirilampo 12, 17.
- Inocular os animais em uma idade de seis a oito semanas.
2. Preparação do inóculo
- Prepare monomeric alfa-sinucleína recombinante humana com a mutação A53T em solução salina tamponada com Tris (TBS) contendo 150 mM de NaCl em Tris-HCl 20 (pH 7,2) como foi anteriormente descrito 14.
- Prepare fibrilar alfa-sinucleína para inoculações, por agitação de 3? G /? L de alfa-sinucleína monomérica humana recombinante num agitador orbital a 800 rpm e 37 ° C durante 5 dias.
- Dilui-se conjuntos de fibrilas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) para atingir uma concentração final de 1 ug / mL para intraperitoneal ou 2 ug / mL para inoculações intraglossal.
- Fragmentar as fibrilas-sinucleína alfa com um sonicador de haste durante 1 min (40 impulsos de duração de 0,5 s com uma pausa de um segundo entre cada pulso e uma amplitude definida como 50%) em gelo. Para evitar a contaminação por cross-sementeira. Utilizar sondas de sonicação limpas para preparar inoculo diferente.
3. Injeções Intraglossal
- Anestesiar os animais com uma intraperitoneal injecção de 100 mg / kg de cetamina e 10 mg / kg de xilazina. Beliscar dedo do pé do animal e confirmar que ele não retirar a pata traseira para garantir anestesia adequada. Use vet pomada sobre os olhos do animal para evitar a secura sob anestesia.
- Fix animais narcotizados cuidadosamente com fita adesiva sobre uma placa de aquecimento numa posição de decúbito dorsal com as cabeças viradas para o investigador.
- Encher uma seringa hipodérmica descartável 27 G com 5 mL de fibrilas-sinucleína alfa sonicadas ou PBS.
- Use uma pinça polegar sem corte de nariz com pontas serrilhadas para manter a boca do animal aberta, e um par segunda menor de pinça para retirar cuidadosamente a língua para fazer a parte de baixo da língua acessível para injeção.
- Injectar a agulha da seringa no lado inferior direito ou esquerdo da língua em proximidade com o nervo hipoglosso. Lentamente injectar o inoculo após 5 s. Lentamente retrair a agulha depois de 5 segundos para assegurar que o inoculotenha penetrado no tecido e não é perdida durante a retracção da agulha.
- Solte o animal de suas fixações e deixá-lo na placa de aquecimento sob monitoramento constante até a recuperação completa.
4. injeção intraperitoneal
- Para injecções intraperitoneais, narcotizar os animais em breve numa câmara de anestesia por inalao com isoflurano / oxigénio utilizando um caudal de 2 L / min e o vaporizador ajustado para 2%. Beliscar dedo do pé do animal e confirmar que ele não retirar a pata traseira para garantir anestesia adequada.
- Encher uma seringa hipodérmica descartável 27 G com 50 uL de fibrilas-sinucleína alfa sonicadas ou PBS.
- Injectar directamente no peritoneu do rato e evitar a penetração do intestino delgado ou ceco localizado por trás da parede abdominal, mantendo o animal numa posição dorsal, com a cabeça virada para longe do investigador e para baixo a cerca de 45 °. Monitorar os animais até que tenham recuperadoda anestesia.
5. A bioluminescência imagem
- Imagem Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ratos cada 2-4 semanas, utilizando um sistema de imagem de bioluminescência.
- Antes da imagiologia, pouco anestesiar os ratos numa câmara de isoflurano / oxigénio com uma taxa de fluxo de 2 L / min e o vaporizador ajustado para 2%. Beliscar dedo do pé do animal e confirmar que ele não retirar a pata traseira para garantir anestesia adequada.
- Raspar e depilar as cabeças dos ratinhos com um creme depilatório. Colorir as orelhas em preto com um marcador não irritante para bloquear a bioluminescência inespecífica.
- Dilui-se o sal de potássio de D-luciferina, o substrato da luciferase, em PBS a uma solução estoque de 30 mg / mL. Conserva-se a em aliquotas de 1 ml a -20 ° C. Proteger o D-luciferina dissolvido da exposição à luz.
- Pesar os animais antes da injecção. Calcular o volume exacto de D-luciferina para injecção de 150 mg / kg de peso corporal. Intraperitonealmente injectar D-luciferin e retornar o animal à câmara de anestesia.
- Inicie o software de imagem. Depois que o sistema de imagem atingiu sua temperatura de funcionamento inicializar o sistema, clicando no botão 'Inicializar' no painel de controle.
- Selecione os botões 'luminescentes' e 'Photograph'. Defina o tempo de exposição a 60 s, o binning de 'Medium', o F / Stop para '1', e o ganho EM para 'Off'.
- Confirme se o filtro de excitação é definido como 'bloco' eo filtro de emissão para 'Open' e definir a altura sujeita a 1,50 cm.
- Dez minutos após a injecção com D-luciferina, colocar os animais sobre a placa de aquecimento na câmara de imagiologia e assegurar que os focinhos estão correctamente colocados na saída de anestesia. Fechar o fluxo de isoflurano / oxigénio a partir da câmara de inalação e abrir o fluxo para a câmara de imagem com um caudal de 0,25 L / min e uma evaporação de 2%. Feche a porta do pr câmara de imagemoperly.
- Clique no botão 'Adquirir' para medir a bioluminescência, que leva 60 s. Parar o fluxo de isoflurano e monitorar os animais até que tenham recuperado completamente depois devolvê-los de volta às suas gaiolas.
- Use o software de imagem para quantificar a bioluminescência. Dentro do 'Tool Palette' selecionar 'Ferramentas de ROI'. Em 'Tipo' dentro 'Ferramentas de ROI' selecionar 'Medição ROI'.
- Dentro das ferramentas de ROI 'clique na ferramenta "círculo" e selecione o número de ROIs para desenhar a partir do menu suspenso - idealmente '3' por três ratos.
- Na imagem, clique com o botão direito em cada ROI e sob 'Propriedades' ajustar a largura e altura para 1,25 cm. Posicionar cada ROI sobre a área do cérebro que é quantificado.
- No canto superior esquerdo da imagem, definir o painel de unidades de 'radiância (fotões)'.
- Dentro do 'Tool Palette', selecione 'Ajuste de Imagem' e ajustar o mínimo ea máxima do 'escala de cores', por exemplo, a partir 0.20e6 para 1.00E6.
- Em 'File' salvar os dados com 'Save'.
6. A análise bioquímica
- Isolar os cérebros e medulas espinhais de acordo com protocolos estabelecidos 18, 19.
- Homogeneizar o cérebro inteiro e amostras da medula espinal inteiros separadamente em PBS na presença de inibidores de protease e fosfatase (diluídos até 1x em PBS) em dois ciclos de 30 s com a 6000 rpm num homogeneizador de tecidos. Assegure-se que o cérebro e na medula espinhal amostras são homogeneizados a uma concentração final de 20% (peso / vol).
- Sonicar as amostras duas vezes, mantendo-os em gelo com um impulso constante de 10 s e uma amplitude definida como 50%.
- Ajustar os homogenatos a 10% em PBS e NaCl 750 mM, por diluição com 1: 1 com NaCl 1,5 M em PBS.
- Para separar os detritos celulares, centrifugar os homogenatos a 1000 xg durante 5 min a4 ° C. Mantenha os sobrenadantes para os próximos passos e descartar os pellets.
- Medir a concentração da proteína nos homogeneizados usando o ensaio de ácido bicinconínico (BCA) de acordo com as instruções do fabricante. Incubar 1,0 mg de proteína total a partir de homogenatos de cérebro ou de 0,8 mg a partir de homogenatos de medula espinhal de N-laurylsarcosyl a uma concentração final de 10% (p / vol) durante 15 min em gelo.
- Sobrepor os homogeneizados numa almofada de sacarose a 3 mL de 10% (p / vol) em água destilada e ultracentrífuga-los em 465.000 xg durante 1 h a 4 ° C.
- Ressuspender as pastilhas numa solução tampão contendo 4% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 2% β-mercaptoetanol, glicina 192 mM, Tris 25 mM, e 5% (p / v) de sacarose.
- Ferver as amostras a 100 ° C durante 5 min e carregá-los no géis de SDS-poliacrilamida para electroforese em um sistema tampão de ácido morpholineethanesulfonic (MES).
- Transferir as proteínas separadas para difluoreto de polivinilideno (PVDF) em membranas de uma SEMiDry sistema de mata-borrão.
- Incubar as membranas em 0,4% (vol / vol) de solução de formalina em PBS durante 30 min à temperatura ambiente em um rotor com 35 rpm para reticular as proteínas com a membrana.
- Bloquear as membranas em tampão TBS contendo 0,05% (vol / vol) de Tween 20 e 5% (p / v) de leite durante 1 h à temperatura ambiente.
- Incubar as manchas com o anticorpo primário em tampão de bloqueio durante a noite a 4 ° C.
- Lavam-se as membranas três vezes em tampão de TBS e incube-as com anticorpos secundários peroxidase ou fluoróforos em TBS durante 1 h à temperatura ambiente.
- Visualizar os anticorpos secundários ligados por quimioluminesccia ou fluorescência de acordo com protocolos estabelecidos 20.
Análise 7. Imunofluorescência
- Desidratar os cérebros dissecados e medulas espinhais de uma estação de processamento de tecidos e incorporá-los em parafina usando um banho de parafina.
- Cortar o tis embebidos em parafinasues com um micrótomo em 8 mm cortes coronais de espessura e montar as secções sobre lâminas de vidro.
- Desparafinar as secções de tecido, incubando-as em dois banhos separados xilol durante 5 a 10 minutos e re-hidratar-los através de uma série de banhos de etanol graduadas (100%, 90%, 70%, 50%) e finalmente com H 2 O.
- Incubar as secções em 0,01 M de tampão de citrato (pH 6,0) durante 5 min à temperatura ambiente e, adicionalmente, ferve-las durante 10 min num forno de microondas.
- Deixe as secções de arrefecer até à temperatura ambiente e incube-as com uma solução de peróxido de hidrogénio a 3% durante 30 minutos para inibir as peroxidases endógenas.
- Bloquear as secções de tecido, por incubação com 20% (vol / vol) de soro de cabra normal a 1% (vol / vol) de albumina de soro bovino (BSA) e 0,5% de Triton X-100 em PBS durante 1 h à temperatura ambiente.
- Incubar as secções com o anticorpo primário diluído em 1% (vol / vol) de soro de cabra normal a 1% (vol / vol) de BSA, e 0,25% de Triton X-100 em PBS durante a noite a 4 ° C. <li> Lavar as secções duas vezes com 0,25% (vol / vol) Triton X-100 em PBS e uma vez com PBS.
- Corar as secções com anticorpos secundários conjugados com fluoróforo correspondentes e o corante nuclear DAPI diluída em 1% (vol / vol) de soro de cabra normal a 1% (vol / vol) de BSA e PBS durante 1 h à temperatura ambiente.
- Depois de lavar duas vezes com 0,25% (vol / vol) Triton X-100 em PBS e uma vez com PBS, as lâminas com lamela meios de embebimento e visualizar a coloração com um microscópio confocal de varrimento laser.
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Representative Results
Injecção periférica de prionoids alfa-sinucleína através da língua ou no peritoneu induzida neuropatologia no CNS de Tg bigenic (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) murganhos (Tabela 1 e Figura 1). Após uma única injecção intraperitoneal com fibrilas-sinucleína alfa, quatro de cinco ratinhos desenvolveram uma doença neurológica com um tempo de incubação médio de 229 ± 17 dias. Surpreendentemente, apenas um de cinco ratinhos desenvolveram uma doença do SNC após injecção intraglossal com fibrilas de alfa-sinucleína após 285 dias. A inoculação com PBS não causar doença dentro do período de 420 dias de experiência.
A análise bioquímica através de Western blotting e sondagem com o anticorpo específico EP1536Y-fosfo contra Ser129 da alfa-sinucleína revelou que para ambas as vias de transmissão de animais doentes tinha acumulado agregados de fosforilada e sarcosil-insoluble alfa-sinucleína em seus cérebros e medulas espinhais (Tabela 2 e Figura 2). Em contraste, os cérebros e medulas espinais de animais injectados com PBS e não doentes continha apenas espécies monoméricas de alfa-sinucleína fosforilada.
coloração de imunofluorescência de fatias cerebrais de ratos injectados por via intraperitoneal e doente com o anticorpo específico # 64 pSyn-fosfo revelou uma ampla distribuição dos depósitos de alfa-sinucleína fosforilados em todo o CNS (Tabela 2 e Figura 3). Além disso, os depósitos fosforilada alfa-sinucleína colocalized com ubiquitina e p62, indicando uma homeostase da proteína aberrante que pode contribuir para a formação de depósitos.
A acumulação de agregados alfa-sinucleína em animais doentes foi acompanhado por alterações neuro-inflamatórias, que foi detectado pelacoloração de imunofluorescência para a GFAP, um marcador de astritos que podem revelar astrogliose reactivo (Figura 4). Além disso, a microglia activadas também foram encontrados em regiões com abundante patologia alfa-sinucleína por colorao de imunofluoresccia para IBA-1 (ionizado molécula adaptadora se liga a cálcio 1). Em conformidade, imagem de bioluminescência revelou aumento da luminosidade (> 2 × 10 6 p / s / cm 2 / SR) emitida a partir dos cérebros de Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) murganhos injectados com fibrilas-sinucleína alfa, pouco antes de eles desenvolveram sinais de doença neurológica. Em contraste, os cérebros de ratinhos injectados com PBS não mostrou qualquer aumento no brilho. O aumento da irradiação é indicativo de astrogliose reactivo, uma marca de neuroinflamao, uma vez que a expressão da luciferase é conduzida a partir do promotor GFAP.
Figura 1: Injecção com fibrilas-sinucleína alfa via intraperitoneal ou intraglossal causa doença em bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ratinhos. (A) micrografia de electrões de fibrilhas de alfa-sinucleína sonicadas recombinantes humanas que foram intraperitonealmente e intraglossally injectadas em ratinhos. coloração negativa com acetato de uranilo mostrou múltiplos conjuntos de agregados curtas, em forma de bastonete. Barras de escala = 100 nm. As curvas de sobrevivência (B) de Kaplan-Meier mostram que, após injecção intraperitoneal com fibrilas de alfa-sinucleína quatro de cinco Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ratinhos desenvolveram uma doença neurológica em 229 ± 17 dias (roxo quadrados fechados), enquanto que nenhum dos murganhos de controlo injectados com PBS desenvolveram sinais de disfunção neurológica dentro de 420 dias (quadrados abertos roxo). Após a inoculação com intraglossal fibrilas alfa-sinucleína um ratinho de cinco morreu após 285 dias (verdecírculos fechados). Em contraste, nenhum dos ratinhos de controlo injectados com PBS desenvolveram uma doença neurológica ou espontaneamente morreu (cculos verdes). Modificado de Breid et al. , 2016 14. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A análise bioquímica de fosforilada alfa-sinucleína no SNC de perifericamente injectado Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ratinhos. (A) A imunotransferência com o anticorpo EP1536Y, reconhecendo fosforilação na Ser129 da alfa-sinucleína, mostrou que injectados intraperitonealmente ratinhos doentes e acumulado espécies de alto peso molecular de agregados insolúveis sarcosil-fosforilada de alfa-sinucleína em seus cérebros umd medulas espinhais. Os ratinhos de controlo desafiados com PBS não acumular agregados de fosforilada alfa-sinucleína e mostrou bandas apenas para a sua forma monomérica. (B) Depois de desafio intraglossal com fibrilas-sinucleína alfa apenas um rato, animal 121, mostraram agregados sarcosil-insolúveis de fosforilada alfa-sinucleína em seu cérebro e da espinal medula, ao passo que todos os outros ratinhos intraglossally inoculados permaneceu saudável, sem depósitos de alfa-sinucleína. As massas moleculares estão apresentados em quilodaltons. O carregamento da amostra em cada pista é mostrado por detecção de actina. Modificado de Breid et al. , 2016 14. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise por imunofluorescência mostra que os depósitos defosforilada alfa-sinucleína colocalize com ubiquitina e p62 nos cérebros e medulas espinhais de doente Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ratinhos. A co-colorao de fosforilada alfa-sinucleína, detectado com o anticorpo EP1536Y, e ubiquitina revelou uma co-localização distinta no cérebro, como observado no núcleo talâmico (A), e na medula espinhal, como detectado na matéria cinzenta (B), de ratinhos doentes após desafio intraperitoneal com fibrilas de alfa-sinucleína. Da mesma forma, fosforilada alfa-sinucleína, detectado com o anticorpo pSyn # 64, também co-localizada com p62 em cérebros (C) e medulas espinhais (D) de animais doentes. (A a D) de PBS-injectado os animais de controlo saudáveis não mostrou depósitos ou co-localização para qualquer uma destas proteínas. A coloração nuclear com DAPI é mostrado em azul. Barras de escala = 20 um. Modificado de Breid et al. , 2016 14. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ratinhos desenvolveram gliose após desafio periférica com fibrilas de alfa-sinucleína. (A) Análise por imunofluorescência de secções do cérebro de animais doentes, com um anticorpo contra a GFAP, um marcador de astritos, revelou astrogliose reactivo em áreas com depósitos de fosforilada alfa-sinucleína, que foram detectados no tronco cerebral com o anticorpo pSyn # 64. Em contraste, não houve astrogliose reactivo em cérebros de ratinhos de controlo injectados com PBS. (B) Similarmente, coloração com um anticorpo para IBA-1, um marcador da microglia, demonstrou microglioseem áreas com depósitos de fosforilada alfa-sinucleína em animais doentes. Os cérebros de ratinhos de controlo saudáveis, injectados com PBS não mostrou sinais de microgliose. (C) imagem de bioluminescência revelou brilho elevado a partir de cérebros e medulas espinhais de Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ratinhos intraperitonealmente injectados com fibrilas-sinucleína alfa (painel esquerdo), o qual foi causada pela activação de astrócitos , pouco antes de os camundongos desenvolveram sintomas neurológicos. Nos cérebros e medulas espinais de murganhos de controlo injectados com PBS a radiância basal não aumentou com o tempo (painel da direita). Após a inoculação com intraglossal fibrilas-sinucleína alfa, uma Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) rato, animal 121, mostrou sinais de astrogliose reactivo pouco antes que morreu aos 285 dias (painel central). (D) Depois do desafio intraperitoneal de Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ratos com fibrilas-sinucleína alfa, aumensed níveis de bioluminescência (> 2 × 10 6 p / s / cm 2 / SR) foram medidos a partir de cérebros de quatro ratinhos (azul, verde, castanho, e círculos laranja) algumas semanas antes que eles desenvolveram sinais neurológicos da doença. Um dos cinco animais também apresentaram níveis elevados de bioluminescência pouco antes de ela morreu 285 dias após a injecção intraglossal com fibrilas-sinucleína alfa (círculos magenta). Em contraste, para os ratinhos de controlo saudáveis, injectados com PBS (círculos pretos; barras de erro mostram SD [n = 4]) e um animal que não desenvolvem a doença após a injecção intraperitoneal com fibrilas-sinucleína alfa (círculos vermelho), o sinal de bioluminescência permaneceu abaixo de um limiar de 2 x 10 6 p / s / cm 2 / SR dentro do período de observação. Barras de escala = 20 um. Modificado de Breid et al. , 2016 14. Por favor clique aqui para ver uma versão maior destafigura.
| linha de rato | Inoculo (g) | via de inoculação | N ° de ratinhos com doença / sem. de ratinhos inoculados | tempo de sobrevivência ± DP média (dias) |
| Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) | fibrilas-sinucleína alfa humanos (50) | intraperitoneal | 4/5 | 229 ± 17/420 |
| Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) | PBS | intraperitoneal | 0/5 | 0/420 |
| Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) | fibrilas-sinucleína alfa humano (10) | intraglossal | 1/5 | 285/420 |
| Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) | PBS | intraglossal | 0/4 0/420 |
Tabela 1: experiências de inoculação. * Modificado de Breid et al., 2016 14
| Alvo [clone de anticorpo] | Hospedeiro | Imunogénio | Diluição em SE | Diluição em WB |
| Actina [C4] | Rato | - | - | 1: 1.000 |
| α-sinucleína, fosfo S129 [pSyn # 64] | Rato | pSer129 | 1: 1200 | - |
| α-sinucleína, fosfo S129 [EP1536Y] | Coelho | pSer129 | 1: 100 | 1: 1.000 |
| proteína ácida fibrilar glial (GFAP) | Coelho | - | 1: 200 | - |
| IBA-1 | Coelho | - | 1: 500 | - |
| Sequestosoma 1 (p62) | Coelho | - | 1: 100 | - |
| Ubiquitina [Ubi-1] | Rato | - | 1: 500 | - |
Tabela 2: Os anticorpos utilizados para imunofluorescência (IF) e transferência de Western (WB). * Modificado de Breid et al., 2016 14
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Discussion
Injecção periférica de fibrilas-sinucleína alfa no peritoneu de Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ratinhos representa um método fácil para induzir a doença neurológica acompanhada por neuroinflamao recapitular características importantes de sinucleinopatias. Da mesma forma, a injecção língua representa uma outra via para neuroinvasão por prionoids alfa-sinucleína em ratinhos transgénicos, mas é menos eficiente. Escolhemos para terminar nossas experiências em 420 dias após a injecção e não podemos excluir a possibilidade de que mais ou todos os camundongos injetados fibrilas podem ter desenvolvido a doença em um ponto mais tarde. Além disso, a utilização de TG (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ratinhos permite a visualização não invasiva de astrogliose e representa um método simples para monitorizar as respostas inflamatórias causadas pelo neuroinvasão de alfa-sinucleína ao longo de todo o tempo de vida do rato.
Um passo importante é a preparaçãodo inóculo. Factores aparentemente triviais como tempo de agregação, tempo de sonicação, a abundância de endotoxinas, ou a quantidade de fibrilas utilizados para injecção poderia influenciar o resultado de uma experiência afectando a propensão de sementeira de enrolamento incorrecto alfa-sinucleína 21. Assim, é importante usar sempre as mesmas condições ao preparar inóculos para injecção. Para injecções intraglossal isso tem de ser considerado que não só o nervo do hipoglosso, mas também outros nervos cranianos, como o nervo glossofargeo inervam a língua e pode estar envolvida no transporte de interneuronal prionoids alfa-sinucleína para o cérebro. Assim alvo diferentes áreas da língua pode resultar em diferentes cinéticas se espalhando para o cérebro. Nós não injectar directamente no nervo hipoglosso e é possível que a segmentação do nervo hipoglosso poderia melhorar a transmissão do SNC de prionoids alfa-sinucleína. Para injecções intraperitoneais com fibrilas-sinucleína alfa é critical que o inóculo é corretamente injetado no peritônio e não acidentalmente em órgãos internos como o intestino ou ceco, o que poderia afetar negativamente neuroinvasão. Isto também é importante para a imagem de bioluminescência quando se injecta D-luciferina. Mistargeting de D-luciferina para órgãos internos poderia retardar a sua distribuição ao cérebro e resultar em menor bioluminescência. Para obter resultados uniformes durante a imagem é também crítica para sempre frescos preparar a solução de D-luciferina, antes da injecção e para deixá-lo exactamente incubar durante 10 minutos após a injecção intraperitoneal antes de imagem.
imagem de bioluminescência é um método útil para mudanças de medida de forma não invasiva em astrogliose ao longo do tempo e pode ser aplicado não só depois de injecções intraperitoneal ou intraglossal mas também depois de cada tipo de tratamento, incluindo, por exemplo, intracerebral ou injecções intravenosas. Para monitorar a propagação de prionoids alfa-sinucleína a partir da periferia para o NCS e a neuroinflamao que se seguiu foi utilizado bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ratinhos. Porque a expressão hemizigótica de alfa-sinucleína nestes animais é 40% mais baixa em relação a animais homozigóticos eles permanecem livres de doença espontânea para até 22 meses de idade e têm um fundo genético adequado para a transmissão de alfa-sinucleína estuda 13. No entanto, as modificações em relação à escolha do modelo de rato para imagem de bioluminescência pode ser desejável. Uma opção interessante é a utilização de monogénica (-Luc GFAP +/-) Tg expressando apenas luciferase como um transgene, o qual permite uma avaliação do comportamento prionoid de fibrilas-sinucleína alfa sobre um fundo que é essencialmente de tipo selvagem, tanto quanto alfa-sinucleína está em causa 14. Além disso, atravessando Tg (GFAP -Luc +/-) ratos com outros ratinhos transgénicos, tal como TG (SOD1 G93A) ratinhos para a esclerose lateral amiotrófica ou de Tg (APP23) mgelo para a doença de Alzheimer, permite imagens de neuroinflamação em outros modelos de doenças 22, 23.
Uma limitação deste protocolo é que, com base no local de injecção do inoculo injectado não pode exceder um certo volume. Assim injecções na língua só pode ser realizada com volumes menores do que aqueles para o peritoneu, o que pode afectar o tempo de transmissão para o SNC. Outra limitação é que o transgene -Luc GFAP só permite a detecção de astrogliose mas não de microgliose, o que é igualmente importante em neuroinflamao. Por último, este modelo não fornecer insights sobre a forma como prionoids-sinucleína alfa atingir o CNS após a injeção intraperitoneal.
A aplicação de prionoids alfa-sinucleína exógenos via de injecção foi mostrado ser um método útil para estudar vias de transmissão que desempenham um papel crítico na recapitulando características de synucleinopathies. Injecções intracerebrais de fibrilas-sinucleína alfa recombinantes ou rato associada a doença ou espécies-sinucleína alfa humanos em modelos animais têm sido utilizados em vários estudos para analisar as suas propriedades de semeadura e a eficiência de transmissão ao longo do tempo 5, 7, 17, 24, 25, 26. Desde injeções estereotáxica no cérebro sempre induzir uma resposta inflamatória local logo após a cirurgia, esta rota de transmissão pode influenciar a propagação e infectividade do inóculo causada por uma alteração da homeostase cerebral. Estudos mais recentes têm mudado o foco para aplicações periféricas ou sistêmicos, não primariamente para evitar o procedimento cirúrgico, mas sim para analisar a periferia, a parede intestinal, músculo esquelético, ou sangue, como um ponto inicial de onde neuroinvasão ao SNC poderiam commence 6, 9, 14, 27. Para priões tem sido demonstrado que a transmissão através do peritoneu ou a língua leva a neuroinvasão e doenças neurológicas; após a infecção língua, prions se propagam em apenas duas semanas para o núcleo hipoglosso no tronco cerebral 11. Desde alfa-sinucleína foi discutido ter neuroinvasive e semeadura de imóveis como prions, mostramos que a transmissão através da língua e do peritônio representam mais pontos de entrada para prionoids alfa-sinucleína para invadir o SNC 14. Quantificação de astrogliose por imagem de bioluminescência facilita o acompanhamento do processo neuroinflamatória ao longo do tempo e representa uma alternativa não invasiva para análise histológica.
Para obter uma visão mais profunda de como o CNS responde a neuroinvasão de prionoids alfa-sinucleínae a outros tratamentos que causam neuroinflamao, seria benéfico para gerar modelos de murganho que também permitem a monitorização não invasiva de microgliose, por exemplo, com um transgene que conduz a express de luciferase a partir de um promotor específico para a expressão da proteína em microglia.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem Olga Sharma, Theresa Hundt, e os funcionários das microscopia e animais instalações DZNE para suporte técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-actin antibody | Merck Millipore | MAB1501 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [pSyn#64] | Wako | 015-25191 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [EP1536Y] | Abcam | ab51253 | |
| anti-GFAP antibody | Dako | Z0334 01 | |
| anti-IBA-1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| anti-Sequestosome-1 (p62) antibody | Proteintech | 18420-1-AP | |
| anti-ubiquitin antibody [Ubi-1] | Merck Millipore | MAB1510 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190169 | |
| Ketamine | Ratiopharm | 100 mg/kg | |
| Xylazine | Ratiopharm | 10 mg/kg | |
| 27 G syringe | VWR | 613-4900 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | PZN 4831850 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Secureline lab marker | Neolab | 25040 | |
| D-luciferin potassium salt | Acris | LK10000 | 30 mg/mL stock solution |
| Thermomixer | Eppendorf | 5776671 | |
| Sonopuls Mini20 sonicator | Bandelin | 3648 | |
| IVIS Lumina II imaging system | PerkinElmer | ||
| Living Image 3.0 Software | PerkinElmer | ||
| Tg(M83+/-) mice or B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice | The Jackson Laboratory | 004479 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| N-laurylasarcosyl | Sigma | L5125-100G | |
| Optima Max-XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | TLA-110 rotor | |
| Thickwall polycarbonate tubes | Beckman Coulter | 362305 | |
| NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | WG1401BOX | |
| HRP conjugated antibody | Cayman | Cay10004301-1 | |
| IR Dye 680 conjugated antibody | LI-COR Biosciences | 926-68070 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34075 | |
| Stella 3200 imaging system | Raytest | ||
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Biosciences | ||
| Tween 20 | MP Biomedicals | TWEEN201 | |
| Triton X-100 | Sigma | SA/T8787 | |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Merck Millipore | IPFL00010 | |
| Xylol | Sigma | Roth | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | SA/00216763/000500 | working solution 3% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Thermo Fisher Scientific | A3294-100G | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | working dilution 1:50,000 |
| Fluoromount media | Omnilab | SA/F4680/000025 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | ||
| HALT protease and phosphatase inhibitors | Thermo Fisher Scientific | 10516495 | |
| Precellys 24-Dual homogenizer | Peqlab | 91-PCS24D | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A31619 | |
| Alexa Fluor 594 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 10741395 | |
| Microtome RM2255 | Leica | ||
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss |
References
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