Summary
Her præsenterer vi en kvantitativ og skalerbar protokol til at udføre målrettede småmolekylære skærme til kinase regulatorer af den naive primede pluripotente overgang.
Abstract
Embryonale stamceller (ESC'er) kan selvforny eller differentiere i alle celletyper, et fænomen kendt som pluripotens. Forskellige pluripotente tilstande er blevet beskrevet, betegnet "naiv" og "primet" pluripotens. De mekanismer, der styrer naiv-primet overgang er dårligt forstået. Især forbliver vi dårligt orienterede om proteinkinaser, der specificerer naive og primpede pluripotente tilstande på trods af øget tilgængelighed af højkvalitetsværktøjsforbindelser til probekinasefunktion. Her beskriver vi en skalerbar platform til at udføre målrettede små molekylskærme til kinase-regulatorer af den naive-primede pluripotente overgang i mus-ESC'er. Denne fremgangsmåde anvender enkle cellekulturbetingelser og standardreagenser, materialer og udstyr til afdækning og validering af kinaseinhibitorer med hidtil uanmeldte virkninger på pluripotens. Vi diskuterer potentielle applikationer til denne teknologi, herunder screening af andet lille molekyleSamlinger som stadig mere sofistikerede kinasehæmmere og nye biblioteker af epigenetiske værktøjsforbindelser.
Introduction
Embryonale stamceller (ESC'er) har evnen til selvfornyelse eller differentiering i enhver celletype i den voksne krop, et fænomen kendt som pluripotens 1 . Nylige beviser tyder på, at udviklingsmæssigt forskellige pluripotente stater eksisterer, betegnet "naiv" og "primet" pluripotens 2 . Naive ESC'er repræsenterer en udviklingstilstand svarende til den, der findes i præimplantationsembryoen 3 . I modsætning hertil er primed pluripotente ESCer klar til at forlade pluripotency og differentiere i specialiserede embryonale linjer 4 , 5 .
Naive og primede pluripotente stater er præget af forskellige genregulatoriske netværk. Naiv pluripotens karakteriseres ved ekspression af vigtige pluripotens transkriptionsfaktorer, såsom Nanog, Krueppel-lignende transkriptionsfaktorer (Klfs), Rex1 2 og Esrrb
MESC'er tilvejebringer en traktabel model til at sonde mekanismer, som kontrollerer naive-primerede pluripotente overgange in vitro . Når de dyrkes i leukæmiinhiberende faktor (LIF) og føtalt bovinserum (FBS), undergår mESC'er dynamisk overgang mellem naive og primede pluripotente tilstande 9 , 10 . LIF-Jak-Stat3 signalfunktioner til fremme af et naivt genregulatorisk netværk 11 12 . Imidlertid er det stadig en udfordring at systematisk evaluere proteinkinases rolle ved at specificere forskellige pluripotente tilstande.
Her beskriver vi en kvantitativ og skalerbar platform, hvorved der kan udføres målrettede små molekylskærme til kinase regulatorer af den naive primede pluripotente overgang. Vi anvender simple mESC-kulturbetingelser og standardreagenser, materialer og udstyr til afdækning og validering af kinasehæmmere med hidtil uopskrevet evne til at stabilisere naiv pluripotens. Desuden drøfter vi potentielle udvidede applikationer til denne teknologi, herunder til screening af andre små molekylsamlinger, såsom fremvoksende inhibitorbiblioteker rettet mod epigenetiske regulatorer.
Protocol
1. Collation af små molekyler kinasehæmmende biblioteker
- Saml hæmmerbiblioteker fra offentligt tilgængelige kinasehæmmersamlinger, f.eks. Library of Integrated Network-Based Cellular Signatures (LINCS) fra Harvard Medical School, en målrettet samling af 228 potente og selektive kinasehæmmere (http://lincs.hms.harvard.edu) , Og Protein Kinase Inhibitor Set (PKIS), en 376 sammensat samling samlet af industrielle forskere (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS) 13 . Alternativt kan du samle en skræddersyet kinaseinhibitoropsamling fra kommercielt tilgængelige forbindelser.
BEMÆRK: I vores laboratorium har vi samlet en samling af 72 potente og selektive værktøjskinasehæmmere, der dækker 51 primære målkinaser, som alle er tilgængelige fra kommercielle kilder. - Sammensæt kinasehæmmere i 96-brøndsplader for optimal høj gennemstrømningsbehandling ved flere koncentrationer (brug 1, 0,1 aNd 0,01 mM). Inkluder i hver plade kontrolbrønde indeholdende DMSO alene og reference kontrolinhibitorer PD173074 (FGFRi) og Ruxolitinib (JAKi), som er kendt for henholdsvis at fremme naive og primede pluripotente tilstande. Angiv i et regneark eller lignende software.
2. mESC-kulturbetingelser og fremgangsmåder til fremstilling af skærm
- Tilbered 0,1% gelatinekovert 10 cm skål ved tilsætning af 5 ml 0,1% (w / v) gelatine til 10 cm plader og inkuber ved stuetemperatur i 5 minutter. Aspirer gelatine og lad pladen tørre i 2 minutter.
- Kultur enhver standard mESC-linie ved 37 ° C 5% CO2 på 0,1% gelatinekovert 10 cm skål i standard mESC medier (se Materialetabel ) indeholdende 100 ng / mL GST-LIF, 10% føtalt kalveserum og 5% knockout serum Udskiftning. Udskift medier hver dag og passage mESC'er ved ca. 80% konfluens hver anden dag med en fortynding på 1: 5-1: 10.
- Til passage af mESC'er, aspirere medier og vask med 5 ml oF phosphatpufret saltvand (PBS) pr. Plade.
- Tilsæt 1 ml trypsin-EDTA (0,05% trypsin, 0,02% EDTA) pr. Plade af mESC'er og inkuber ved 37 ° C i 10 min.
- Resuspender trypsiniserede celler i 4 ml mESC medier og centrifuge ved 1200 rpm i 5 min.
- Resuspender cellepellet grundigt i 5 ml mESC-medier, pipettering op og ned for at danne en enkeltcellesuspension.
- Tæl celler ved at kombinere en 10 μl cellesuspension og 10 μl Trypan Blue (0,4%). Placer i et celletællingskammer eller brug et hæmocytometer og lysmikroskop.
- Frø 3 x 10 3 mESC'er i 0,1% gelatine-belagte 96-brønds plader, slutvolumen 100 μl medier, ved anvendelse af en flerkanalspipette.
- Påfør kinasehæmmere ved 1: 100 fortynding (1 μL inhibitor tilsat til 100 μL medier) ved anvendelse af en flerkanalspipette. Forsigtigt pipette medier til at blande inhibitor og celle suspension, så lad cellerne sætte sig i en vævskulturhætte i 1 time for at sikre lige fordeling acroSs pletteringsoverfladen. Kulturceller i 48 timer uden at ændre medierne.
BEMÆRK: Lagerplader på 1 / 0,1 / 0,01 mM vil give en endelig inhibitorkoncentration på henholdsvis 10/1 / 0,1 μM. Vi anbefaler, at du starter skærmen ved en slutkoncentration på 1 μM for at sikre effektiv inhibering af primære målkinaser samtidig med, at målene ikke minimeres.
3. Kinaseinhibitor screeningsanalyse
- Vask 96 brønde mESC plader i 200 μl PBS ved anvendelse af flerkanals aspirator og pipetter.
- Lav celleekstrakter i 150 μl lysisbuffer (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40 (volumen / volumen), 0,5% natriumdeoxycholat (vægt / volumen), 10 mM β-glycerophosphat , 10 mM natriumpyrophosphat, 1 mM NaF, 2 mM Na3VO4, Kompletproteaseinhibitor Cocktail Tablets).
- Afklare ekstrakter ved centrifugering ved 1.500 xg i 30 minutter i V-bundede 96-brøndsplader.
- Immobiliser 100 μl supernatanter på en nitrocelLulose membran ved anvendelse af en 96-brønds vakuumdot-blot-manifold.
- Tør membranen og pletter med 40 ml Ponceau S for at sikre ensartet overførsel.
- Vask membran med TBST og bloker i TBST / 3% (w / v) mælk.
- Inkuber i Nanog og Dnmt3b antistoffer ved en fortynding på 1: 1000 (v / v) i TBST / 3% (w / v) mælkepulver natten over.
- Vask membraner i 3 x 10 minutter i TBST og inkuber i 30 ml sekundære antistoffer ved en fortynding på 1: 10.000 (vol / vol) i TBST / 3% (vægt / volumen) mælk.
- Udvikle ved hjælp af et digitalt immunoblottende billeddannelsessystem.
BEMÆRK: Anvend evt. Kvantitativ fluorescens immunoblotting for at detektere Nanog og Dnmt3b. Baggrundssignalet for Dnmt3b ved fluorescensimmunoblotting er imidlertid for højt. Derfor anvendes 800 nm fluorescens anti-kanin (Nanog) og anti-mouse-HRP (Dnmt3b) sekundære antistoffer.
4. Analyse af skærmdata og validering af inhibitorer som Bona Fide Pluripotency Regulators
- Kvantificere Nanog og Dnmt3b signal ved hjælp af immunoblotting analyse software, og importer værdier i et regneark eller lignende software. Beregn Nanog: Dnmt3b forholdet for alle prøver sammenlignet med DMSO kontrol. Bestem også det samlede Nanog og Dnmt3b signal for at sikre, at kinasehæmmere ikke påvirker nanog: dnmt3b forholdet ved at ændre mESC levedygtighed.
- Brug rangerede nanog: Dnmt3b forhold til at identificere inhibitorer, der fremmer naiv pluripotency (Nanog: Dnmt3b forhold højere end kontrol) og primet pluripotency (Nanog: Dnmt3b forhold lavere end kontrol). Indstil cut-off ved 2x afvigelse fra kontrolværdier og filtrer ud kinasehæmmere, der producerer et totalt Nanog + Dnmt3b signal med mindre det50% af DMSO-kontrolværdien for at generere en høj tillidsliste over kinasehæmmere, der stabiliserer naivt (højt nanog: Dnmt3b forhold) og grundede (lave nanog: dnmt3b forhold) pluripotente tilstande.
- Validér kinasehæmmere ved at seede mESC'er ved 2 x 10 5 celler pr. 6 brønd i 2 ml medier og tilsæt kinasehæmmere ved 1 μM i 48 timer uden at ændre medier.
- Lyse mESC'er i lysisbuffer og analysere Nanog og Dnmt3b ekspression ved konventionel SDS-PAGE immunoblotting.
- Yderligere validere hits ved SDS-PAGE immunoblotting for naive pluripotensmarkører Klf2 og Klf4 og Oct4 for at sikre, at pluripotens opretholdes efter 48 timers hæmmerbehandling.
Representative Results
Ved at anvende den her viste procedure ( Figur 1 ), skærm vi LINCS-biblioteket med 228 potente og selektive kinasehæmmere for at identificere dem, som modulerer mESC pluripotens. Biblioteket fremstilles i en koncentration på 0,1 mM for en 1: 100 fortynding og slutscreeningskoncentration på 1 μM i mESC'er. 48 timer blev mESC'er lyseret og ekstrakter fremstillet til kvantitativ dot blot-analyse af Nanog og Dnmt3b-ekspression ( Figur 2 , top). Resultater fra andre screeningskoncentrationer er ikke repræsenteret her for kortfattethed. Nanog: Dnmt3b-forholdet bestemmes for hver kinaseinhibitor og forbindelser rangeres og en 2x cut-off påføres ( figur 2 , bund). Samlet Nanog- og Dnmt3b-signal i forhold til kontrol overlejres på inhibitorrangeringen og udsættes for en 0,5x cut-off for at muliggøre triaging af inhibitorer, der udviser signifikant mESC-toksicitet. Vælg kinaseinhibitorer, der stabiliserer den naive staTe valideres ved anvendelse af konventionel Nanog / Dnmt3b immunoblotting ( Figur 3 ). De primære kinase mål for disse inhibitorer er vist i tabel 1 . Vi demonstrerer også anvendeligheden af denne skærm for at identificere inhibitorer, der stabiliserer primed tilstanden 14 .
Figur 1: Arbejdsstrøm til screening af kinasehæmmere, der modulerer naiv-primet overgang. MESC blev behandlet med et 228-forbindelseskinaseinhibitorbibliotek ved en slutkoncentration på 1 μM. Lysater blev fremstillet og overført til nitrocellulosemembraner til immundot-blot-analyse, og nanog- og Dnmt3b-niveauer blev bestemt (Figur tilpasset fra Williams et al. 14 ). Klik her for at se al Arger version af denne figur.
Figur 2: Naiv-primet pluripotens skærm analyse og inhibitor identifikation. (Top) Repræsentative Nanog og Dnmt3b immunotip-blot billeder. (Nederste) Nanog- og Dnmt3b-værdier for hver kinaseinhibitor blev bestemt i forhold til DMSO-kontrollen og nanog: Dnmt3b-forhold og total relative Nanog + Dnmt3b-signal bestemt og inhibitorer rangeret i sammenligning med DMSO-kontrol. Inhibitorer, der blev fundet at ændre nanog: Dnmt3b forholdet ud over en 2 gange tærskel over eller under DMSO kontrol, blev identificeret som førere af naiv eller primet pluripotency. En tærskel på 2x under DMSO-kontrol blev sat til triageinhibitorer, hvilket kompromitterer mESC-overlevelse. Inhibitorer, der er valgt til yderligere validering, fremhæves. (Figur tilpasset fra Williams et al. 14 ).S / ftp_upload / 55515 / 55515fig2large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Validering af udvalgte hitforbindelser identificeret. MESC'er blev behandlet med enten 1 μM AZD4547 (en selektiv FGFR-inhibitor) eller de angivne inhibitorer identificeret fra skærmen i figur 2. Nanog: Dnmt3b niveauer bestemt ved standard SDS-PAGE og immunoblot analyse. Numeriske værdier af relative Nanog: Dnmt3b og Nanog + Dnmt3b er angivet i nedenstående tabel, og inhibitorer, der stabiliserer den naive pluripotente tilstand fremhævet i grønt. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Forbindelse | Primære mål | Andre mål | |
| AV-951 | VEGFR | ||
| HG-6-64-01 | ABL, BRAF, RET, CSF1R, EGFR, EPHA8, FGFR, FLT3, KIT, LOK, MAP4K1, p38b, MUSK, PDGFR, TAOK3, TNNI3K | ||
| WH-4-023 | Lck | src | |
| R406 | Syk | ||
| GW-572.016 | HER2 | EGFR | |
| KIN001-244 | PDK1 | ||
| WZ-4-145 | CSF1R, DDR1, EGFR, TIE1, PDGFR2 | ||
| WZ-7043 | CSF1R, DDR1, FGFR og TAO1 | ||
| GW786034 | VEGFR1 | VEGFR2, VEGFR3 &# 160; | |
| AZD-1480 | JAK2 | ||
Tabel 1: Udvalgte hitforbindelser og deres primære kinase mål (er).
Discussion
Her demonstrerer vi en bredt tilgængelig metode til at undersøge rollen som kinasignalveje i regulering af naiv-primet pluripotent overgang. Dette omhandler et nøgle spørgsmål i ESC-feltet. Selvom high-throughput genomics og transcriptomics approaches rutinemæssigt bruges til at identificere nøgle transkriptionelle regulatorer af naive og primed pluripotent stater, har belysende pluripotency signalering netværk vist sig at være udfordrende. Vi leverer nu en fleksibel strategi, der anvender kemiske inhibitorer til at identificere kinaser, der styrer naiv-præpareret pluripotent overgang i mESC'er. Dette afhænger af simpelt udstyr, reagenser og materialer, der er tilgængelige for de fleste laboratorier, der studerer cellesignal og ESC-biologi. Kritisk til succesen med denne platform er vores udvikling af et robust assay for at kvantificere overgangen mellem naive og primed pluripotent stater. Etablering af dette assay krævede signifikante iterative modifikationer af cellepladsInkubationstiden, tidspunktet for inhibitorinkubation og immunoblottningsbetingelser.
Små molekyler nærmer sig trækkraft til rationel anvendelse i terapeutiske ESC applikationer 15 , 16 . En stor styrke ved screening af små molekyler er, at værktøjsforbindelser er designet og / eller modificeret til effektiv cellulær optagelse. Transfektionseffektivitet er ikke begrænsende, og brug af farlige leveringssystemer som lentivirus er ikke nødvendigt. Desuden inhiberer inhibitorer ofte flere isoformer inden for en kinasefamilie ( fx Fgfr1-4, Jak1-3), som overvinder funktionel redundans, der forhindrer genetisk / genomisk interferensteknikker såsom RNAi og CRISPR / Cas9. Da mere effektive og selektive værktøjsforbindelser bliver tilgængelige fra både akademiske og farmaceutiske lægemiddelopdagelsesprogrammer, vil understudied og dårligt forstået kinaser blive skubbet til forkant med ESC-forskning. Vi foreslår derfor, at denne høj-thRoughput screening tilgang vil åbne nye veje til forskning i centrale ESC regulatoriske netværk.
En mindre begrænsning af denne teknologi er, at selv de mest potente og selektive små molekylinhibitorer engagerer og hæmmer flere ikke-relaterede kinaser in vivo . Imidlertid giver stadig mere omfattende kinasehæmmers profileringsdata mulighed for at identificere funktionelle mål af kinasehæmmere (http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan; http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase -hæmmere). Endelig kan vores platform i princippet anvendes til at forhøre enhver indsamling af små molekyler og / eller cellulære analyser, for hvilke der findes høje immunoblottende antistoffer. Dette vil muliggøre undersøgelse af flere reguleringssystemer i regulering af pluripotens og lette identifikation af små molekylinhibitorer, som modificerer forskellige cellulære processer. Specielt vi forestiller os anvendelsen af nye småmolekylsamlinger, såsom epigenenTic prober, der udvikles af Structural Genomics Consortium (http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics) har potentiale til at afdække yderligere nye regulatorer af pluripotente overgange.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter som følge af denne undersøgelse.
Acknowledgments
CACW understøttes af et ph.d.-studium af et lægeligt forskningsråd. GMF understøttes delvist af en ny forskningsinstitut for medicinsk forskningsråd (MR / N000609 / 1) og et Tenovus Scotland-stipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mESC media | |||
| CCE mESCs | ATCC | ATCC SCRC-1023 | |
| DMEM Media | Gibco | 11965092 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | Final: 2 mM |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | Final: 50 U/ml |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Final: 0.1 mM |
| Leukemia Inhibitory Factor (GST fusion) | MRC-PPU reagents and services | Final: 100 ng/mL | |
| Leukemia Inhibitory Factor | Thermo | PMC9484 | Final: 100 ng/mL |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140050 | Final: 0.1 mM |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | Final: 1 mM |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Final: 5% |
| Defined Fetal Bovine Serum | Fisher | 10703464 | Final: 10% |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TC materials | |||
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo | 25300054 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | 1890 | |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | Thermo | 156545 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190136 | |
| V-bottom 96 well plates | Greiner Bio-one | 651261 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysis Buffer | |||
| Tris buffer | VWR | 103157P | |
| Sodium Chloride | VWR | 97061 | |
| EDTA | Sigma | E4884 | |
| 1% NP-40 | Sigma | 9016-45-9 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-100g | |
| β-glycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Sodium Pyrophosphate | Sigma | 13472-36-1 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | 450022 | |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Sigma | CO-RO | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Tween | Sigma | P1379-1L | |
| Milk Powder | Marvel | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Western Blotting | |||
| Protran BA 85 Nitrocellulose 0.45 &micor;M Pore size (20 cm x 20 cm Sheets) (25 Sheet) | GE | 10401191 | |
| Ponceau S | Sigma | P7170-1L | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laboratory Equipment | |||
| Minifold I System | GE | 10447850 | |
| ChemiDoc imager | BioRad | 1708280 | |
| LiCor Odyssey Imager | LiCor | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Nanog | Reprocell | RCAB001P | |
| Anti-Dnmt3b | Imgenex | IMG-184A | |
| IRDye 800CW Donkey anti-Rabbit | Licor | 926-32213 | |
| Anti-mouse-HRP | Cell Signalling Technology | 7076S | |
| Anti-Klf2 | Millipore | 09-820 | |
| Anti-Klf4 | R&D Systems | AF3158 | |
| Anti-Oct4 | Santa Cruz | sc-5279 |
References
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
- Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4 (6), 487-492 (2009).
- Boroviak, T., et al. Lineage-Specific Profiling Delineates the Emergence and Progression of Naive Pluripotency in Mammalian Embryogenesis. Developmental Cell. 35 (3), 366-382 (2015).
- Tesar, P. J., et al. New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells. Nature. 448 (7150), 196-199 (2007).
- Brons, I. G. M., et al. Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos. Nature. 448 (7150), 191-195 (2007).
- Festuccia, N., et al. Esrrb is a direct Nanog target gene that can substitute for Nanog function in pluripotent cells. Cell Stem Cell. 11 (4), 477-490 (2012).
- Ficz, G., et al. FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency. Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).
- Guo, G., et al. Klf4 reverts developmentally programmed restriction of ground state pluripotency. Development. 136 (7), 1063-1069 (2009).
- Chambers, I., et al. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).
- Findlay, G. M., et al. Interaction domains of Sos1/Grb2 are finely tuned for cooperative control of embryonic stem cell fate. Cell. 152 (5), 1008-1020 (2013).
- Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12 (13), 2048-2060 (1998).
- Kunath, T., et al. FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment. Development. 134 (16), 2895-2902 (2007).
- Elkins, J. M., et al. Comprehensive characterization of the Published Kinase Inhibitor Set. Nature Biotechnology. 34 (1), 95-103 (2016).
- Williams, C. A. C., et al. Erk5 Is a Key Regulator of Naive-Primed Transition and Embryonic Stem Cell Identity. Cell Reports. 16 (7), 1820-1828 (2016).
- Cao, N., et al. Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules. Science. 352 (6290), (2016).
- Zhang, M., et al. Pharmacological reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by signaling-directed transcriptional activation. Cell Stem Cell. 18 (5), 653-667 (2016).
