Summary
Vi beskriver en metode for kvalitativ og kvantitativ analyse av spenningsgranuldannelse i pattedyrceller etter at cellene er utfordret med bakterier og en rekke forskjellige spenninger. Denne protokollen kan anvendes for å undersøke den cellulære stressgranuleresponsen i et bredt spekter av vertsbakterielle interaksjoner.
Abstract
Fluorescerende avbildning av cellulære komponenter er et effektivt verktøy for å undersøke verts-patogen-interaksjoner. Patogener kan påvirke mange forskjellige egenskaper ved infiserte celler, inkludert organell ultrastruktur, cytoskeletalt nettverk organisasjon, samt cellulære prosesser som Stress Granule (SG) formasjon. Karakteriseringen av hvordan patogener undergraver vertsprosesser er en viktig og integrert del av patogenesen. Mens variable fenotyper kan være lett synlige, er den nøyaktige analysen av de kvalitative og kvantitative forskjellene i cellestrukturene indusert av patogenutfordring viktig for å definere statistisk signifikante forskjeller mellom eksperimentelle og kontrollprøver. SG-dannelse er et evolusjonært konservert stressrespons som fører til antivirale responser og har lenge blitt undersøkt ved hjelp av virusinfeksjoner 1 . SG-formasjon påvirker også signaleringskaskader og kan ha andre fremdeles ukjente konseqUences 2 . Karakteriseringen av dette stressresponset mot andre patogener enn virus, som for eksempel bakterielle patogener, er for tiden et fremvoksende forskningsområde 3 . Foreløpig er kvantitativ og kvalitativ analyse av SG-dannelsen ennå ikke rutinemessig brukt, selv i virussystemene. Her beskriver vi en enkel metode for å indusere og karakterisere SG-dannelse i uinfiserte celler og i celler infisert med et cytosolisk bakterielt patogen, som påvirker dannelsen av SG som respons på ulike eksogene stress. Analyse av SG-formasjon og sammensetning oppnås ved å bruke et antall forskjellige SG-markører og spotdetektor-plugin-modulen til ICY, et open source bildeanalyseværktøy.
Introduction
Visualisering av vertspatogen-interaksjoner på mobilnivå er en kraftig metode for å få innsikt i patogene strategier og for å identifisere nøkkelcellulære veier. Faktisk kan patogener brukes som verktøy for å finne viktige cellulære mål eller strukturer, da patogener har utviklet seg til å undergrave sentrale cellulære prosesser som en strategi for egen overlevelse eller forplantning. Visualisering av cellulære komponenter kan oppnås ved rekombinant uttrykking av fluorescens-merkede vertsproteiner. Selv om dette muliggjør sanntidsanalyse, er genereringen av cellelinjer med spesifikt merkede vertsproteiner svært arbeidskrevende og kan resultere i uønskede bivirkninger. Mer praktisk er deteksjonen av cellulære faktorer ved bruk av spesifikke antistoffer, fordi flere vertsfaktorer kan analyseres samtidig, og en er ikke begrenset til en bestemt celletype. En ulempe er at bare en statisk visning kan bli tatt som immunfluorescensanalyse nødvendiggjør vertscellefiksation. Imidlertid er en viktig fordel ved immunfluorescensimaging at den lett gir seg til både kvalitativ og kvantitativ analyse. Dette kan i sin tur brukes til å oppnå statistisk signifikante forskjeller for å gi ny innsikt i verts-patogen-interaksjoner.
Fluorescerende bildeanalyseprogrammer er kraftige analytiske verktøy for å utføre 3D- og 4D-analyse. Men den høye prisen på programvare og vedlikehold gjør metoder basert på gratis åpen kildekode-programvare mer attraktiv. Forsiktig bildeanalyse ved hjelp av bioanalysesoftware er verdifull som den underbygger visuell analyse, og ved tildeling av statistiske signifikanser øker tilliten til korrektheten av en gitt fenotype. Tidligere har SGs blitt analysert ved hjelp av den gratis ImageJ-programvaren, som nødvendiggjør manuell identifisering av individuelle SG 4 . Her gir vi en protokoll for induksjon og analyse av cellulær SG-dannelse i sammenheng med bacTerielle infeksjoner ved hjelp av gratis åpen kildekode bio-bildeanalyses programvare ICY (http://icy.bioimageanalysis.org). Bio-image analyse programvare har et innebygd spot detektor program som er svært egnet for SG analyse. Det gjør det mulig å finjustere den automatiserte deteksjonsprosessen i bestemte interesserte interesser (ROI). Dette overvinne behovet for manuell analyse av individuelle SG'er og fjerner sampling-bias.
Mange miljøbelastninger induserer dannelsen av SG, som er fasete cytosoliske, ikke-membranøse strukturer på 0,2 - 5 um i diameter 5 , 6 . Denne cellulære responsen blir evolusjonært konservert i gjær, planter og pattedyr, og oppstår når global protein-oversettelse hemmes. Det innebærer aggregering av stalled translation initiation komplekser i SG, som anses å holde steder for translasjonelt-inaktive mRNAer, slik at selektiv oversettelse av en delmengde av cellulære mRNAer.Ved fjerning av spenningen oppløses SG og globale hastigheter av proteinsyntese gjenopptas. SG er sammensatt av translasjonsforlengelsesinitieringsfaktorer, proteiner involvert i RNA-metabolisme, RNA-bindende proteiner, samt stillasproteiner og faktorer involvert i vertscellesignalering 2 , selv om den eksakte sammensetningen kan variere avhengig av påført spenning. Miljøfaktorer som induserer SG-dannelse inkluderer aminosyre sult, UV-bestråling, varmestokk, osmotisk sjokk, endoplasmatisk retikulumspenning, hypoksi og virusinfeksjon 2 , 7 , 8 . Mye fremgang har blitt gjort for å forstå hvordan virus induserer og undergraver også SG-dannelse, mens lite fortsatt er kjent om hvordan andre patogener, som bakterielle, sopp- eller protozoanpatogener, påvirker dette cellulære stressrespons 1 , 7 .
ShigeLla flexneri er et gram-negativt fakultativt cytosolisk patogen av mennesker og det forårsaker av alvorlig diaré eller shigellose. Shigellose er en stor folkehelsen byrde og fører til 28.000 dødsfall årlig hos barn under 5 år 9 , 10 . S. flexneri infiserer kolonepitelet og sprer cellen til cellen ved å kapre vertsens cytoskeletalkomponenter 11 , 12 . Infeksjon av epitelet støtter replikasjonen av S. flexneri i cytosolen, men infiserte makrofager dør gjennom en inflammatorisk celledødsprosess kalt pyroptose. Infeksjon fører til en massiv rekruttering av nøytrofiler og alvorlig betennelse som er ledsaget av varme, oksidativt stress og ødeleggelse av vev. Således, mens infiserte celler er gjenstand for interne spenninger fremkalt av infeksjon, slik som Golgi-forstyrrelse, genotoksisk stress og cytoskeletisk omleggingS, infiserte celler blir også utsatt for miljøbelastninger på grunn av den inflammatoriske prosessen.
Karakterisering av effekten av S. flexneri- infeksjon på cellers evne til å reagere på miljøbelastninger ved bruk av et antall SG markører har vist at infeksjon fører til kvalitative og kvantitative forskjeller i SG-sammensetning 3 . Imidlertid er lite kjent med andre bakterielle patogener. Her beskriver vi en metode for infeksjon av vertsceller med cytosolisk patogen S. flexneri , stress av celler med forskjellige miljøbelastninger, merking av SG-komponenter og kvalitativ og kvantitativ analyse av SG-dannelse og sammensetning i sammenheng med infiserte Og ikke-infiserte celler. Denne metoden er allment gjeldende for andre bakterielle patogener. I tillegg kan bildeanalysen av SG-formasjonen brukes til infeksjoner av virus eller andre patogener. Det kan brukes til å analysere SGDannelse ved infeksjon eller effekten av infeksjon på SG-dannelse som respons på eksogene stress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av bakterier og vertsceller
- Overfør 12 eller 14 mm glassdeksel i henholdsvis 24- eller 12-brønnsplater, med sterile pinsetter, telle en brønn per eksperimentell tilstand. Steriliser disse ved UV-behandling i en vevskultur hette i 15 minutter.
MERK: Inkluder kontrollbrønner for bakteriell utfordring og for SG-induksjon av eksogene spenninger. - For en brønn med 24 brønner med 12 mm dekselglass, frø 1 x 10 5 pattedyrceller ( f.eks. HeLa-celler) på dekselplater; Trykk på dekselplaten ned med en steril pipettespiss. La cellene kle seg natten over ved 37 ° C i en 5% CO2 vevskultur-inkubator i dyrkningsmedium som er passende for hver celletype.
MERK: Plateceller slik at sammenfletting av celler er mellom 40 og 60% den påfølgende dagen.- For HeLa-celler inkuberes i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) med ikke-essensielle aminosyrer (NEAA) og 10% dekomplisert føtal kalvserum (FCS).Dekompliser FCS ved oppvarming i 30 minutter i et 56 ° C vannbad, hvirvler serumet en gang etter 15 minutter.
- For å strekke ut bakterier, bruk en steril pipettespiss for å fjerne en liten mengde fra en bakteriell glycerolmasse (20% glyserol) lagret i en -80 ° C fryser og legg den på en merket plate. Bruk en steril sløyfe for å spre bakteriene over 10% av platen. Bruk en ny steril løkke og dra den gjennom smøret for å lage 3 parallelle linjer, en halv tallerken lang. Stri gjennom disse linjene som dekker resten av platen. Inkubér plate O / N ved 37 ° C.
- Velg en enkelt bakteriekoloni ( f.eks. S. flexneri ) fra den nystrekte platen. Unngå å jobbe med bakteriekolonier eldre enn 1 uke.
- For S. flexneri stamme M90T, inokulere en rød koloni fra en nystrimt Tryptic Soy Agar-0,1% Congo rød agarplate i 8 ml Tryptic Soy bouillon i et 15 ml rør; Stram lokket og inkubér risting ved 222 o / min O / N ved 306; C.
FORSIKTIG: Ikke bruk store hvite kolonier da de har mistet virulensplasmidet og er ikke-smittsomme.
2. Bakteriell utfordring av vertsceller
- Forbered bakterier for å maksimere infeksjonspotensialet.
- For S. flexneri , subkultur bakterier ved å tilsette 150 μl O / N kultur til 8 ml Tryptic Soy Agar og inkuberer 223 rpm ved 37 ° C til sent eksponensiell fase (~ 2 timer) for å inducere virulensgenekspression og forbedre infeksjon.
- Når kulturen har en optisk tetthet mellom 0,6 og 0,9 (målt ved 600 nm), overfør 1 ml kultur til et 1,5 ml rør. Pellets bakterier i 2 minutter ved 8.000 xg og resuspenderes i infeksjonsmedium (DMEM med NEAA, mangler FCS) ved OD 600 = 1. Dermed, hvis OD 600 er 0,85, resuspenderes i 850 μl.
MERK: For S. flexneri, ved OD 600 = 1, vil det være 8 x 10 8 bakterier per ml nårDyrket i 8 ml medium. En mengde infeksjon (MOI) på 20 er hensiktsmessig. For andre patogener må antallet bakterier per ml ved en OD 600 og passende MOI bestemmes empirisk.
- Når kulturen har en optisk tetthet mellom 0,6 og 0,9 (målt ved 600 nm), overfør 1 ml kultur til et 1,5 ml rør. Pellets bakterier i 2 minutter ved 8.000 xg og resuspenderes i infeksjonsmedium (DMEM med NEAA, mangler FCS) ved OD 600 = 1. Dermed, hvis OD 600 er 0,85, resuspenderes i 850 μl.
- For å forbedre bakterie-vert-interaksjoner, beleg bakterier med Poly-L-Lysin (PLL).
MERK: PLL-behandling av S. flexneri hadde ingen effekt på SG-dynamikken. Andre patogener må vurderes for deres evne til PLL-behandling.- For å belegge bakterier med PLL, sentrifuger 1 ml bakteriekultur i 2 minutter ved 8 000 xg og resuspender deretter pelleten i 10 μg / ml PLL i fosfatbuffert saltvann (PBS) ved en OD 600 = 1.
- Tilsett bakterieoppløsningen på en liten tallerken, som en brønn i en 12-brønn plate, og inkuber ved RT (~ 20 ° C) i 10 minutter med mild omrøring på en platehake.
- Pellet bakterier i 2 minutter ved 8.000 xg, fjern overskytende PLL. Resuspender pelleten i 1 ml PBS anD Gjenta dette vaske trinnet to ganger. Etter den endelige vasken resuspenderes i infeksjonsmedium ved OD 600 = 1.
MERK: Her er infeksjonsmediet for S. flexneri vertscellemedium med 20 mM HEPES uten FCS.
- For S. flexneri , subkultur bakterier ved å tilsette 150 μl O / N kultur til 8 ml Tryptic Soy Agar og inkuberer 223 rpm ved 37 ° C til sent eksponensiell fase (~ 2 timer) for å inducere virulensgenekspression og forbedre infeksjon.
- Klargjør celler for bakteriell utfordring.
- Fjern medium fra pattedyr HeLa-celler ved hjelp av en sugepumpe. Legg til 500 μL RT HeLa-cellemedium for å vaske cellene, virvle, fjerne medium ved hjelp av en sugepumpe, og erstatt med 500 μL RT-egnet infeksjonsmedium ( f.eks . Vertscellemedium med 20 mM HEPES uten FCS).
- MERK: For alle vaske trinnene, arbeid raskt og behandle kun opptil 4 deksler om gangen for å unngå å tørke ut av cellene.
- Utfordre forberedt HeLa-celler med bakterier for å infisere 20-50% av cellene.
MERK: Den aktuelle tiden og MOI må bestemmes for hver bakterieart. Vanligvis er en god start 30 min på 37° C med en MOI på 10.- For S. flexneri utfordrer HeLa-celler celler med en av de to metodene (trinn 2.3.1.1 eller 2.3.1.2).
- Spin-ikke-PLL-behandlede bakterier (20 μl OD 600 = 1 / brønn av 24 brønnplate i 500 ul medium) på celler i 10 minutter ved 13000 x g.
- Legg til PLL-belagte bakterier (15 μl OD 600 = 1 / brønn av 24 brønns plate i 500 μl medium) i 15 minutter ved RT for å tillate bakterier å sedimentere på celler.
- Tillat infeksjonen å skje ved å plassere celler med sedimenterte bakterier i en 37 ° C vævskultur-inkubator i 30 minutter.
MERK: For korte tidspunkter synkroniserer S. flexneri- infeksjon ved å plassere plater i et 37 ° C vannbad i 15 minutter i stedet for i vevkulturs inkubatoren.
- For S. flexneri utfordrer HeLa-celler celler med en av de to metodene (trinn 2.3.1.1 eller 2.3.1.2).
- Stopp infeksjon ved å vaske celler.
- For å vaske celler og fjerne overflødige bakterier, fjern mediet ved hjelp av en sugepumpe, tilsett 1 mlFrisk forvarmet (37 ° C) HeLa dyrkningsmedium (DMEM, 10% FCS, NEAA). Vri mediet, fjern og erstatt med friskt medium. Gjenta to ganger og la ferskt medium stå på cellene.
- For S. flexneri eller andre intracellulære bakterier, etter infeksjon av HeLa-celler og vasker, erstatte medium med standard vevskulturmedium inneholdende 50 μg / ml gentamicin for å drepe ekstracellulære bakterier og forhindre ytterligere celleinvasion.
MERK: Ikke legg antibiotika i mediet for ekstracellulære bakterier.
- For S. flexneri eller andre intracellulære bakterier, etter infeksjon av HeLa-celler og vasker, erstatte medium med standard vevskulturmedium inneholdende 50 μg / ml gentamicin for å drepe ekstracellulære bakterier og forhindre ytterligere celleinvasion.
- For å vaske celler og fjerne overflødige bakterier, fjern mediet ved hjelp av en sugepumpe, tilsett 1 mlFrisk forvarmet (37 ° C) HeLa dyrkningsmedium (DMEM, 10% FCS, NEAA). Vri mediet, fjern og erstatt med friskt medium. Gjenta to ganger og la ferskt medium stå på cellene.
- Inkuber bakterier med celler i ønsket mengde tid i en vevskultur-inkubator.
MERK: For S. flexneri kan infeksjon være så lang som 6 timer avhengig av celletypen. For HeLa-celler, la smitte fortsette i 1,5-2 timer før du legger til eksogene spenninger for å indusere SG-dannelse. For Caco-2-infeksjoner, hvor Shigella sprer celle-til-celle, infiserer i 30 minutter til 6 timer før eksogen stress blir tilsatt. ceLls kan bli løst på dette punktet uten å legge til eksogene spenninger for å vurdere dannelsen av SG som følge av bakterieinfeksjonen (i så fall fortsett til avsnitt 4).
3. Inducing Stress Granule Formasjon ved Tilsetning av Eksogene Stressorer
- Fjern mediet fra infiserte og ikke-infiserte HeLa-celler ved hjelp av en sugepumpe, bytt medium med 500 μL egnet medium med eller uten stressor og inkuber.
MERK: Stressinducerende tilstander inkluderer følgende (se nedenfor). For ytterligere behandlinger, se Kedersha et al . 13 .- For varmeskokbehandling, bruk vanlig medium som inneholder 20 mM HEPES og plasser platen i 44 ° C vannbad i 30 minutter.
- For behandling med clotrimazol (induserer mitokondriell stress), bruk vanlig medium uten FCS med 20 μM clotrimazol og inkuber i en vævskultur-inkubator i 1 time.
MERK: Oppbevar engangs-alikvoter på 20 mM clotrimazol stamme i dimetylsulfoksid (DMSO) ved -20 ° C i opptil 4 måneder. Bruk DMSO-kjøretøy for kontrollceller. - For behandling av arsenitt (induserer oksidativ stress), bruk vanlig medium med 0,5 μM arsenitt og inkuber i vævskultur-inkubator i 1 time.
MERK: Oppbevar endelige alikvoter med 0,5 mM arsenitlager ved -20 ° C i opptil 6 måneder.
FORSIKTIG: Clotrimazol og arsenitt er skadelige og miljøfarlige og må kasseres hensiktsmessig. - For behandling med DesMethyl Des-Amino (DMDA) -pateamin (hemmer eukaryotisk oversettelse initiering), bruk vanlig medium med 50-200 nM DMDA-pateamin og inkuber i vevkulturs inkubator i 1 time.
MERK: Oppbevar DMDA-pateamin ved -80 ° C. Oppbevar reagenser som små alikvoter for å unngå fryseopptining.
4. Fiksering og immunfluorescensanalyse av stress-granulatdannelse
MERK: Behandle kontrollen ogEksperimentelle coverlips samtidig for å unngå flekkerforskjeller som kan påvirke bildeanalyse i etterfølgende trinn. Kontrollprøver inkluderer ingen infeksjon med og uten SG-induksjonsbehandling og infiserte prøver med og uten SG-induksjonsbehandling.
- Fjern medium helt med en sugepumpe og fest prøver ved å tilsette 0,5 ml RT 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS. Inkuber i 30 minutter ved RT.
FORSIKTIG: PFA er skadelig for håndterer og miljø. Ta det riktige tiltaket for å beskytte håndteringen og kast bort med kjemisk avfall.
MERK: Alternativt fikseres i 15 minutter og erstattes deretter med -20 ° C forkjølt metanol i 10 minutter for å beholde mer cytoplasmisk lokalisering av SG markører 13 . - Fjern PFA med en pipette og kast væsken i en passende avfallsbeholder. Vask dekselglasset med 1 ml Tris-Buffered Saline (TBS: 25 mM Tris, pH 7,3, 15 mM NaCl). Inkubér dekselglasset i 2 minutter med mild ristingPå en plate shaker under vask.
- Fjern TBS helt med en sugepumpe og tilsett 500 μL 0,3% Triton-X100 i TBS i 10 minutter for å permeabilisere cellene.
- Fjern permeabiliserende oppløsning med sugepumpe. Erstatt med 1 mL TBS, virvl opp platen forsiktig, fjern TBS ved suging og tilsett 1 mL blokkeringsløsning (5% FCS i TBS) i 1 time ved RT.
- Forbered den primære antistoffoppløsningen (1: 300 fortynning) i 5% FCS i TBS. Beregn 50 μL per 12 mm deksel og gjør nok for alle dekselglassene i ett parti.
MERK: De vanlige primære antistoffene som brukes, er målrettet G3BP1, eIF3b og TIA1. - Spot 50 μL av den primære antistoffblandingen på en plastparafinfilm (parafilm) som er tett festet på benken eller kammeret.
MERK: En liste over kanoniske SG markører er gitt i Materialetabellen , men sammensetningen av SG-er kan avhenge av spenningen som påføres. Andre SG markører er oppført i Kedersha et al. 1. 3 S. flexneri infeksjon er oppført i tabell 1 . - Plukk opp dekselet med pincet, dytt kanten av dekselet på vevet, kortvarig løs pincetene for å fjerne overflødig væske, og legg forsiktig ned ansiktet ned på dråpen. Inkuber dekselglass i 1,5 timer ved RT eller over natten ved 4 ° C i et fuktig kammer.
MERK: For å forberede et fuktig kammer, plasser forvunnet vev langs kantene av et godt lukket kammer foret med plastparafilm. - Overfør hver deksel med pinsett inn i en brønn i en ny 24-brønnplate fylt med 1 mL TBS; Inkuber med mild risting på en plate rister i 5 min. Sug av TBS i hver brønn ved hjelp av en sugepumpe, erstatt med 1 mL TBS og sett tilbake på platehakeren i 5 minutter. Gjenta vask en gang til.
MERK: Gjenbruk parafilmen ved å fjerne overflødig væske med et vev og vask overflaten med vann. Pass på at parafinfilmen er helt tørr før usinG det for det etterfølgende fargingstrinnet. - Forbered den sekundære antistoffoppløsningen i TBS (fortynning 1: 500-1: 2000). For å flekke kjernen og bakteriene, tilsett 2 μg / ml DAPI til blandingen. Til å flekke aktin, tilsett fluorescerende phalloidin. Pipette 50 μL sekundær antistoffblanding på plastparafinfilmen.
MERK: Bruk av høyt rensede, kryssabsorberte esel sekundære antistoffer anbefales for samlokalisasjonsstudier av forskjellige SG markører når G3BP1 (geitantistoff) brukes. Velg fluorescensmerkede sekundære antistoffer med ikke-overlappende spektra. EIF3b flekker tydelig cytoplasma av celler og er derfor en god markør for å avgrense celler. Actin-flekken bidrar videre til å avgrense celler ved celle-til-celle kontaktområder og områder av bakteriell inngang. - Plukk opp dekselet med pincet, dab kanten av deksel på vev, slipp kort pincettene, for å fjerne overflødig væske. Legg forsiktig dekselet på ansiktet ned på dråpen og inkuber dekseletI mørket i 1 time ved RT.
- Bruk pincett til å sette dekselet tilbake i 24-brønnsplatene fylt med fersk 1 ml PBS. Kontroller at dekslet er fullt dekket av PBS. Vask cellene 3 ganger med mild risting i 5 minutter hver.
MERK: Hold platen under vaskene under et deksel for å beskytte mot lys da fluoroforene til det sekundære antistoffet er lysfølsomme. - Dyp dekselglasset kort i deionisert vann for å fjerne saltet, tørk det fra kanten på et vev og fest dekselet på 5 μl fluorescensmonteringsmedium på en glideskinne. Tett dekselglasset før bildebehandling ved hjelp av neglelakk. Hold lysbildene ved 4 ° C for kortsiktig (uke) eller ved -20 ° C for langvarig (måned) oppbevaring.
MERK: Unngå luftbobler ved tetting, da dette vil skade bildekvaliteten.
5. Fluorescens Imaging
MERK: Se mikroskopens brukermanual for optimalisering av oppsettet.
- Oppnå bilder ved hjelp av et konfokalmikroskop ved hjelp av enten en 40 eller 63X oljedusseobjektiv. Velg de ønskede fluorescerende kanalene for bildeinnsamling. Når du bruker flere fluorescerende kanaler, velger du sekvensiell oppkriftsmodus.
MERK: Begynn med forsøksprøver hvor SG er indusert, den sterkeste for å unngå overeksponering på etterfølgende prøver. Pass på at du ikke har overeksponerte SG i hele dypet av cellen.- Angi bitstørrelse på 12 eller høyere i mikroskopinnstillingene for å sikre nøyaktighet av bildeanalysen.
- Sett bildestablene for å dekke hele dybden av cellen. Sjekk inn de forskjellige kanalene og for forskjellige SG markører for å sikre at hele spekteret er inkludert. Sett begynnelsen av bunken på bunnen av cellene og toppen av stablene i høyden øverst på cellene hvor det ikke blir observert mer SG-markører.
- Hent stakken. Hold stabellhøyden den samme for alle bilder.
MERK: Ikke gjør detEndre oppkjøpsinnstillinger mellom kontroll- og eksperimentelle prøver som skal brukes til etterfølgende sammenligning.
6. Bildeanalyse
MERK: Her beskrives SG-analyse på kollapsede stabler med freeware ICY. Bildeanalyse av 3D-rekonstruksjoner kan også gjøres ved hjelp av annen spesialisert programvare. SG-deteksjon kan utføres via en fullstendig automatisert arbeidsflyt etablert for denne protokollen (tilgjengelig på http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/Stress_granule_detection_in_fluorescence_imaging). For å bruke denne protokollen må kjernefargene smusses med en DNA-flekk for programvaren for å finne midten av hver celle, og cellekantene må merkes med enten en cytoplasmisk markør (for eksempel eIF3b) eller actin-flekk for programvaren Å identifisere cellegrensene. Den automatiske arbeidsflyten kan brukes til å validere manuelt avledede resultater eller direkte for analyse når cellegrenser oppdages med høy selvtillit, hvilket vil moStly avhenger av tettheten av celler og markøren som brukes til å oppdage cellegrensene.
- Ved å bruke ImageJ eller Fiji, kollapse bildestablene (Bilde> Stabler> Z-projeksjon), og lagre som .tiff-filer.
MERK: Opprett en ny mappe for hvert bilde, da bildeanalyseprogrammet vil koble resultatene til nettstedet til det opprinnelige bildet. - Last inn et kontroll og eksperimentelt .tiff bilde til bildeanalyseplanen (File> Open). Gå til sekvensvinduet. Rull ned i "Oppslagstabellen" til kanalparametrene.
- Deaktiver alle kanaler ved å klikke i avmerkingsboksen for alle kanalfaner. Klikk på kanal 0 og velg deretter ønsket farge ved å klikke på fargebjelken ovenfor. Øk intensiteten til kanalen etter behov for å se alle strukturer ved å klikke og flytte linjen i intensitetsfeltet. Gjenta dette for alle kanaler.
MERK: Deaktiver kanaler som ikke kreves for en gitt oppgave, for å minimere bias i prøveanalyse. - RullOpp og i kategorien Lerret, zoom inn til ca. 10 celler per felt ved å justere zoomfanen.
- Bruk polygonfunksjonene (i topplinjen) for å avgrense cellens grenser i bildet. Bruk actin flekken eller en cytosolisk markør for deling av cellegrenser ( f.eks. EIF3b).
- Klikk på polygonfunksjonen i verktøyene "Fil og avkastning". Start avgrensning ved å klikke på cellen og deretter strekke linjen ved å lage ankre gjennom gjentatt klikke rundt cellegrensen. For å fullføre avkastning klikker du igjen på polygonfunksjonen i verktøyene "Fil og avkastning".
MERK: Identifiser subpopulasjonene til de avgrensede cellene som er smittet. Prøven består av en blanding av infiserte og ikke-infiserte celler. For å identifisere bakterier, bruk enten DAPI-flekken eller fluorescerende bakterier (for eksempel GFP-uttrykkende bakterier). Øk intensiteten for å sikre at alle bakterier blir sett. - For å nevne avkastning, gå til avkastningsvinduet til høyre og cliCk på cellen av interesse for bildet. Dette vil markere den tilsvarende avkastningen i avkastning-fanen. Dobbeltklikk på avkastningsnavnet og endre navnet ( f.eks . Infisert celle # 1).
MERK: Hvis ett bilde skal brukes til å analysere både infiserte og ikke-infiserte celler, er det lettere å lagre bildet i to separate mapper og avgrense de infiserte og ikke-infiserte cellene separat, og generere to forskjellige regneark, noe som vil lette analysen seinere.
- Klikk på polygonfunksjonen i verktøyene "Fil og avkastning". Start avgrensning ved å klikke på cellen og deretter strekke linjen ved å lage ankre gjennom gjentatt klikke rundt cellegrensen. For å fullføre avkastning klikker du igjen på polygonfunksjonen i verktøyene "Fil og avkastning".
- Åpne spotdetektorapplikasjonen i kategorien "Detection & Tracking" (topplinje). I kategorien Inntasting velges det aktuelle bildet. Ikke endre noe. Velg den kanalen som skal analyseres, i kategorien Forhåndsbehandling.
MERK: Bare en kanal kan analyseres til enhver tid. En batchanalyse kan velges her hvis man bruker den fullt automatiserte analysesekvensen hvis parametere er blitt sjekket for å gi tilfredsstillende resultater.- På fanen Detektor velger du "DeTekt lyse flekker over mørk bakgrunn. "Velg deretter riktig skala og følsomhet. Gjør dette ved å teste forskjellige innstillinger og kryssjekkingsoppdagelsesdeteksjon i både kontroll og eksperimentelle prøver.
MERK: For et bilde med en 2.048 x 2.048 oppløsning og en pikselstørrelse på 0,12 μm 2 , er en nivå 2-grense med en følsomhet på 25 til 100 generelt passende, men hver SG-markør må prøves empirisk. Sett opp spot deteksjon slik at i den ikke-behandlede kontrollprøven blir flekker ikke detektert, mens i den eksperimentelle prøven med SG'er, teller alle de små og store SGene. - Innen ROI-fanen velger du den foreslåtte avkastningen fra sekvens. I kategorien Filtrering velger du Ingen filtrering. I kategorien Output velger du riktig utgang.
MERK: Velge Aktiver Spesifikk fil er nyttig for å lagre forskjellige deteksjonsforhold eller forskjellige kanaler. Velger for å eksportere binærbilde og det opprinnelige bildet med avkastning og deteksjon er helPful for kvalitetskontroll analyse. - Velg "Fjern tidligere punkter gjengitt som avkastning". Velg mappen for å lagre filen ved å klikke på "ingen fil valgt" -knappen. På skjermbildet velger du de ønskede alternativene. Klikk på "Start påvisning".
MERK: En mappe med navnet og stedet valgt vil bli opprettet som inneholder de eksporterte bildealternativer. Disse bildene blir overskrevet for hver ny testet tilstand. For å beholde bildene, kan du enten omdøpe mappen slik at en ny mappe blir opprettet eller overført fra lagremappen til en ny mappe. For kvalitetskontroll av bildene, er det nyttig å velge visningsdetekteringsmerke, antall påvisning av avkastning og avkastningsnummer og navn.
- På fanen Detektor velger du "DeTekt lyse flekker over mørk bakgrunn. "Velg deretter riktig skala og følsomhet. Gjør dette ved å teste forskjellige innstillinger og kryssjekkingsoppdagelsesdeteksjon i både kontroll og eksperimentelle prøver.
- Konsolidere og lagre dataene for de ulike parametrene ved hjelp av det genererte regnearket for hvert avbildet eller tilstanden som er testet.
MERK: Parametrene som skal analyseres, inkluderer antall SG per ROI, SG overflatearealene og SG maxImum, gjennomsnitt og minimum intensiteter. - Overfør dataene og analyser ved hjelp av et analyseprogram som er i stand til å analysere, grafer og bestemme statistisk signifikans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å forklare og demonstrere protokollen beskrevet i dette manuskriptet karakteriserte vi bildet av clotrimazol-induserte SG i HeLa-celler infisert eller ikke med cytosolisk patogen S. flexneri . En oversikt over prosedyren er presentert i figur 1 , og inkluderer virulent og avirulent S. flexneri stripet på Kongo Røde plater, bakteriepreparasjon, infeksjon, tillegg av miljøspenning, prøvefiksering og farging, prøvebilding og kvantitering, samt bildeanalyse . En rekke forskjellige spenninger kan brukes til å indusere SG-dannelse og en rekke SG-markører er tilgjengelige for forhør. EIF3b er en kanonisk SG-markør som også tydelig flekker det cytoplasmatiske rommet i cellen og kan brukes til å identifisere cellekanter. G3BP1 er en mye brukt SG-markør som aggregerer i SG uten bakgrunnsfarvning ( Figur 2 A, B D ). Celler er best avbildet med et konfokalmikroskop, og stablene som dekker hele celledybden er lastet inn på bildeanalysen freeware ICY ( figur 2 A-C ). For bedre å identifisere infiserte celler og å sette celler inn i enten den infiserte eller ikke-infiserte gruppen for senere analyse, er det nyttig å øke intensiteten av nukleinsyreflekken ( Figur 2 D ). Innenfor bildeanalyseprogrammet brukes spotdetektoren til å identifisere SG'er innenfor hvert av de angitte ROI ( figur 2 E ) og et binært bilde genereres som viser alle de identifiserte SG-ene ( figur 2 F ).
SG-analyse må skreddersys for hver SG-markør som analyseres, og den aktuelle innstillingen for analyse må nøye velges. Fokuserer på SG maRker G3BP1, endring av størrelseskravet til stedet som oppdages eller endrer sensitiviteten til deteksjonsparametrene, vil føre til varierende resultater, som vist i figur 3 A-C . Skalavalget (1 - 3, selv om skalaer kan legges til) er basert på pikselstørrelse og dermed ved høyere skalaer, vil mindre SG'er ikke bli talt og antallet SG'er vil synke ( figur 3C ). Følsomhet er målt fra 1 til 100, hvor 100 er mest følsomme. Ved å øke følsomheten øker antallet SG som oppdages ( Figur 3 C ). Således må de riktige innstillingene bli funnet for å minimere falske positive og falske negativer. Dette gjøres best ved å nøye analysere visuellene som er oppnådd for hver innstilling. For G3BP1 ga en skala på 2 med en følsomhet på 100 (2 - 100, uthevet i rødt) det beste resultatet. En skala på 2 med en lavere følsomhet (50 eller 25) igjen litenSGs uncounted (se oransje piler). På samme måte ble en skala på 3 igjen, liten SG, utregnet mens en skala ble overskrømt. Det er viktig at flere skalaer legges til for å fokusere bare på store SG, hvis dette er berettiget. For eIF3b ga en skala på 2 med en følsomhet på 55 (2 - 55) det beste resultatet for eIF3b (uthevet i rødt), selv om røde piler markerer enten under eller oversampling i en skala fra 2 til 50 og 2 - 55.
Når parametrene for SG-analyse er riktig satt, kan dataene analyseres på mange måter ( figur 4 ). Spotdetektoren gir det antall SG som oppdages innenfor hver avkastning, slik at de uinfiserte og infiserte cellene kan sammenlignes ( figur 4 A ). Tilsvarende er størrelsen, i dette tilfelle antall piksler, gitt fra hvilket overflatearealet kan beregnes ( figur 4B ). Frekvensfordeling plOts er også nyttige for å markere skift i størrelsen på SG som finnes i forskjellige cellepopulasjoner. Her blir et komplett fravær av store SG i S. flexneri- infiserte celler, samt et klart skifte i fordelingen klarere ( Figur 4 C ). I tillegg gir intensiteten (vist her minimum og maksimal intensitet) informasjon om kvaliteten på de analyserte SG-ene. For S. flexneri- infiserte celler er SG'er signifikant mindre intense. Disse analysene gir statistisk relevant informasjon om både kvalitativ og kvantitativ karakter av SG som er dannet som respons på eksogen stress når celler er smittet med eller uten S. flexneri .
Figur 1 : Oversikt over eksperimentell prosedyre til infeksjon av celler med S. Flexneri ogÅ analysere effekten av infeksjon SG formasjon. En Kongo-rød koloni, og en ikke-viruløs Kongo-rød-negativ koloni, plukkes og dyrkes O / N i tryptisk soyabuljong. Den overnatte kulturen er subkultivert til den sentrale eksponensielle fasen før bakterier er belagt med PLL for å fremme adherens. Vertsceller dyrket på glassdeksel i brønner med 12 brønner er infisert med bakterier i 30 minutter. Kontrollceller er ikke infisert. Celler vaskes og behandles med spenningsinduktorer for å indusere SG-formasjon, enten ved å erstatte mediet med spenningsholdig medium eller underkaste cellene til spenningsbetingelser, slik som varme. Celler blir deretter fikset, permeabilisert, farget med immunofluorescerende SG-spesifikke markører, og avbildet ved bruk av konfokal mikroskopi. Z-projeksjoner er laget ved hjelp av ImageJ og analysert ved hjelp av spotdetektoren til bildeanalyseprogrammet. Dataene analyseres deretter. Vennligst klikk her for å se en largEr versjon av denne figuren.
Figur 2 : Spotdetektoranalyse av HeLa-celler infisert med S. Flexneri i 1,5 timer før tilsetning av Clotrimazole i 1 time. A. Immunfluorescerende bilde av en z-projeksjon som viser celler farget med SG-markørene eIF3b og G3BP1, DAPI og actin. B. Samme bilde som i (A), men uten actin-flekken for å markere bruken av eIF3b for å avgrense cellegrenser. C. Skjermbilde av bildeanalyseprogrammet med spotdetektormodulen. D. Gating av de infiserte og ikke-infiserte cellene som sett ved hjelp av forskjellige kanaler. For å se alle bakterier øker intensiteten. Celler med mer enn 1 bakterie tilstede i cellen er merket med en rød stjerne. E. Output av spot detecAnalyse av individuelle avkastning, som angir ROI-navnet, antall plasseringer og deres plassering. F. Bilde av flekker oppdaget i avkastningene. Skalbjelke = 30 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 : Sammenligninger av forskjellige skala- og følsomhetsinnstillinger for spotdetektor for deteksjon av SGer gjennom forskjellige SG markører. A. Zoom inn i HeLa-celler som er infisert eller ikke med S. flexneri og farget med DAPI og SG-merkeren G3BP1, og analysert i forskjellige skalaer (pikselstørrelse avbrutt, 1 - 3) og følsomhet (1 - 100). Grafisk fremstilling av SG-tall i uinfiserte og infiserte celler analysert på forskjellige skalaer (
Es / ftp_upload / 55536 / 55536fig4.jpg "/>
Figur 4 : Analyse av punktdetektor Generert SG-data oppnådd fra Clotrimazole-behandlede HeLa-celler infisert med S. Flexneri . A. Antall G3BP1 SGs per celle i infiserte og uinfiserte HeLa-celler. B. Overflateareal av G3BP1-SG i infiserte og uinfiserte celler, og deres prosentfordelingsfrekvens ( C ). D. Minimum og maksimum intensitetsverdier (vilkårlig) av G3BP1-SGs. Verdier inkluderer gjennomsnittlig standardfeil. Utvalgt statistisk analyse inkludert for klarhet ved bruk av Wilcoxon rangsummestest p-verdiene til venstre og variansen F-test til høyre. * = <0,05, ** = <0,01, *** = <0,001, ns = ikke-signifikant. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen som er skissert her beskriver induksjon, lokalisering og analyse av SG i ikke-infiserte celler og celler infisert med cytosolisk patogen S. flexneri i nærvær eller fravær av eksogen stress. Ved hjelp av gratis bildebehandling, tillater protokollene nøyaktig kvalitativ og kvantitativ analyse av SG-formasjonen for å identifisere og statistisk adressere forskjeller i gitt fenotyper.
Det er flere kritiske skritt innen protokollen for infeksjonen, SG-induksjon og bildebehandling. For infeksjonen er det viktig at bakterieinteraksjonen med vertsceller, som invasjon som skissert protokoll her, synkroniseres så mye som mulig. Dette er spesielt viktig når man undersøker effekten av bakteriell utfordring tidlig i infeksjonsprosessen. Vi har tidligere vist at noen fenotyper, for eksempel eIF3b lokalisering etter S. flexneri- infeksjon, forstyrres tidlig under villtypeS. flexneri- utfordring mens andre fenotyper, slik som aggregering av G3BP1-holdige SG'er, er mer berørt ved senere tidspunkter 3 . For å nøyaktig beskrive den tidsmessige effekten av bakteriell utfordring, er synkronisering av infeksjon derfor tilrådelig. Spesielt, for å analysere SG-dannelse, bør cellene være i eksponensiell vekstfase, og dermed er celletettheten ved tidspunktet for spenningsaddisjon også en viktig parameter. Det begrenser også SG-analyse til ikke-konfluente celleinfeksjonsmodeller. Et annet kritisk aspekt er sambehandlingen av kontroll- og eksperimentelle prøver under både behandling av prøvene for avbildning og under bildeoppkjøp. For immunfluorescensbehandling bør alle prøvene farges med samme antistoffbehandlingsfortynninger i samme tid og under de samme forholdene ( f.eks. RT Vs 4 ° C), samtidig som de også behandler hver dekselglass på samme måte i vaskefasen og Montering oF dekselet. Dette vil sikre sammenlignbare immunfluorescerende fargestoffer som kan analyseres både kvalitativt og kvantitativt. Forskjeller i monteringsmedium kan ha signifikante effekter på bleking av prøvene under bildeoppkjøpet og bør derfor holdes konstant. På samme måte bør bildeoppkjøp for alle prøver som skal sammenlignes i analysen utføres innenfor en sittende og med samme innstillinger for å minimere forskjeller som oppstår ved laserstyrke eller prøveoppsett.
Ved bruk av eksogene påkjenninger er det viktig å lagre reagenset ordentlig og å lage nye arbeidslager ofte. Forlengede perioder (> 4 måneder for clotrimazol, for eksempel) fører til redusert styrke av stoffet og vil påvirke SG-dannelsen. Reagenser bør legges til dyrkningsmedium umiddelbart før tilsetning til cellene; Hvis en reduksjon i SG-dannelse i kontrollceller observeres eller aggregering av SG'er virker avvikende, bør reagenser testes for deres acTivitet og nye aksjer bør gjøres.
En begrensning er at SG-identifikasjon ved hjelp av spotdetektor blir mindre pålitelig når for mye bakgrunnsfluorescens er tilstede. Selv om dette ikke er et problem for mange SG-markører, er noen, som eIF3b, som er en klar cytosolisk markør under både SG-inducerende og ikke-induserende betingelser, vanskeligere å analysere som vist i figur 3 . I tillegg må skalaer og følsomhetene bestemmes empirisk for hver SG-markør. En annen begrensning er at analysen gjennom bildeanalyseprogrammet er best med 2D-bilder, og fungerer derfor godt på optiske skiver eller sammenfellede stabler, noe som imidlertid medfører tap av 3D-informasjon. Analysen på z-projeksjoner har derfor en tendens til å overstige størrelsen på SG og undergrave antall SG'er. 3D-analyse av SG kan utføres med Imaris for å gi en enda mer presis romlig karakterisering, dersom det anses nødvendig for en bestemt fenotype. SG karakterisering kan utføres raskt og på en standardisert måte ved å bruke den automatiserte spotdetektoren til bildeanalyseprogrammet. I motsetning er manuelle metoder for å identifisere og avgrense SG som tidligere utført 4 , la analysen være åpen for mer bias og er betydelig mer tidkrevende. SG-analyse ved hjelp av spotdetektor kan også skreddersys for å inkludere eller ekskludere små SG-aggregater ved å velge forskjellige følsomhets- og størrelsesgrenser, og dermed tillate fleksibilitet i å evaluere forskjellige aspekter ved SG-formasjon. SG-analyse kan også utføres på en fullstendig automatisert måte ved å bruke en etablert automatisert arbeidsflyt 3 . Innenfor denne arbeidsflyten identifiseres senteret av cellen ved hjelp av en DAPI-flekk, og programmet lar da en formbar sfære vokse utover for å avgrense cellelinjene basert på enten en cytoplasmatisk flekk (som eIF3b) eller aktin. På samme tid bruker du en halvautomatisert analyse avManuell avgrensning av individuelle celler for analyse, kan være fordelaktig når celler vokser i klynger og cellegrenser er vanskelige for det automatiserte programmet å avgrense klart. Under slike omstendigheter kan man definere cellegrenser manuelt for å eliminere falske positive eller negative verdier.
Protokollen kan tilpasses andre SG-induksjonsbetingelser og til andre patogener, inkludert virus, bakterier, gjær og protozoaner. Av spesiell interesse kan være andre cytosoliske patogener som Rickettsia spp., Francisella tularensis , Burkholdieria pseudomallei og Listeria spp. 14 For hvert smittsomt middel, og muligens også forskjellige cellelinjer, må infeksjonsprotokollen bli tilpasset og prøvetidene for eksogene spenninger empirisk bestemt. I tillegg kan SG karakterisering ved hjelp av bildeanalyseprogram også utvides til levende celledannelse i fremtiden. Real-time SG analyse ville være nødvendigItate uttrykket av en eller flere fluorescens-merkede SG markører i vertscellene, men ville dermed tillate spørsmål angående den midlertidige og spesielle dynamikken til SG-formasjonen å bli adressert under forskjellige eksperimentelle forhold. Fluorescens-merkede bakterier ville da være nødvendig for å komplementere sanntids-SG-analysen i infiserte og uinfiserte celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
PS er mottaker av Bill og Melinda Gates Grand Challenge Grant OPP1141322. PV ble støttet av et sveitsisk nasjonalt vitenskapsstiftelse tidlig postdoc mobilitet fellesskap og et Roux-Cantarini postdoktoralt fellesskap. PJS støttes av et HHMI-tilskudd og ERC-2013-ADG 339579-Decrypt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| eIF3b (N20), origin goat | Santa Cruz | sc-16377 | Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1:300 |
| eIF3b (A20), origin goat | Santa Cruz | sc-16378 | Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1:300 |
| eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal) | Cell Signaling | 3411 | Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1:800 |
| eIF4AI, origin goat | Santa Cruz | sc-14211 | Recommended by (Ref # 13). Dilution 1:200 |
| eIF4B, origin rabbit | Abcam | ab186856 | Good stress granule marker in our hands. Dilution 1:300 |
| eIF4B, origin rabbit | Cell Signaling | 3592 | Recommended by Ref # 13. Dilution 1:100 |
| eIF4G, origin rabbit | Santa Cruz | sc-11373 | Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1:300 |
| G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal) | BD Biosciences | 611126 | Widely used SG marker. Dilution 1:300 |
| Tia-1, origin goat | Santa Cruz | sc-1751 | Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1:300 |
| Alexa-conjugated Secondary Antibodies | |||
| A488 anti-goat , origin donkey | Thermo Fisher | A-11055 | Cross absorbed. Dilution 1:500 |
| A568 anti-goat, origin donkey | Thermo Fisher | A-11057 | Cross absorbed. Dilution 1:500 |
| A488 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A-21202 | Dilution 1:500 |
| A568 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A10037 | Dilution 1:500 |
| A647 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A31571 | Dilution 1:500 |
| A488 anti-rabbit, origin donkey | Thermo Fisher | A-21206 | Dilution 1:500 |
| A568 anti-rabbit, origin donkey | Thermo Fisher | A10042 | Dilution 1:500 |
| Other Reagents | |||
| Shigella flexneri | Available from various laboratories by request | ||
| Tryptone Casein Soya (TCS) broth | BD Biosciences | 211825 | Standard growth medium for Shigella, application - bacterial growth |
| TCS agar | BD Biosciences | 236950 | Standard growth agar for Shigella, application - bacterial growth |
| Congo red | SERVA Electrophoresis GmbH | 27215.01 | Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application - bacterial growth |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P1274 | Useful to coating bacteria to increase infection, application - infection |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application - infection |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | PH buffer useful when cells are incubated at RT, application - cell culture |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 31885 | Standard culture medium for HeLa cells, application - cell culture |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biowest | S1810-100 | 5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application - cell culture |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140 | 1:100 dilution used for HeLa cell culture medium, application - cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | Reagent diluent, application - cell culture |
| Sodium arsenite | Sigma-Aldrich | S7400 | Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application - stress inducer |
| Clotrimazole | Sigma-Aldrich | C6019 | Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application - stress inducer |
| Paraformaldehyde (PFA | Electron Microscopy Scences | 15714 | 4% PFA is used for standard fixation of cells, application - fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application - permeabilization |
| A647-phalloidin | Thermo Fisher | A22287 | Dilution is at 1:40, best added during secondary antibody staining, application - staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application - staining |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | BR701501 | Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application - staining |
| Prolong Gold | Thermo Fisher | 36930 | Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application - mounting |
| Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting |
| 24-well cell culture plate | Sigma-Aldrich | CLS3527 | Standard tissue culture plates, application - cell culture |
| 12 mm glass coverslips | NeuVitro | 1001/12 | Cell culture support for immunofluorescent applications, application - cell support |
| forceps | Sigma-Aldrich | 81381 | Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting |
| Programs and Equipment | |||
| Prism | GraphPad Software | Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application - data analysis | |
| Leica SP5 | Leica Microsystems | Confocal microsope, application - image acquisition | |
| Imaris | Bitplane | Professional image analysis program, application - data analysis | |
| Excel | Microsoft | Data analysis and graphing program, application - data analysis |
References
- Reineke, L. C., Lloyd, R. E. Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection. Virology. 436 (2), 255-267 (2013).
- Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase. Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).
- Vonaesch, P., Campbell-Valois, F. -X., Dufour, A., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. Shigella flexneri modulates stress granule composition and inhibits stress granule aggregation. Cell Microbiol. 18 (7), 982-997 (2016).
- Kolobova, E., Efimov, A., et al. Microtubule-dependent association of AKAP350A and CCAR1 with RNA stress granules. Exp Cell Res. 315 (3), 542-555 (2009).
- Anderson, P., Kedersha, N. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends in biochemical sciences. 33 (3), 141-150 (2008).
- Anderson, P., Kedersha, N.
- Mohr, I., Sonenberg, N. Host translation at the nexus of infection and immunity. Cell Host Microbe. 12 (4), 470-483 (2012).
- Hu, S., Claud, E. C., Musch, M. W., Chang, E. B. Stress granule formation mediates the inhibition of colonic Hsp70 translation by interferon- and tumor necrosis factor. Am J Physiol Gastointest Liver Physiol. 298 (4), 481-492 (2010).
- Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B., Fasano, A., Kotloff, K. L., Levine, M. M. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).
- Lanata, C. F., Fischer-Walker, C. L., et al. Global Causes of Diarrheal Disease Mortality in Children. PloS One. 8 (9), 72788 (2013).
- Ashida, H., Ogawa, M., et al. Shigella deploy multiple countermeasures against host innate immune responses. Curr Opin Microbiol. 14 (1), 16-23 (2011).
- Ashida, H., Ogawa, M., Mimuro, H., Kobayashi, T., Sanada, T., Sasakawa, C. Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system. Curr Opin Immunol. 23 (4), 448-455 (2011).
- Kedersha, N., Anderson, P. Mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).
- Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nat Re. Micro. 7 (5), 333-340 (2009).
