Summary
Describimos un método para el análisis cualitativo y cuantitativo de la formación de gránulos de estrés en células de mamíferos después de que las células son desafiadas con bacterias y una serie de diferentes tensiones. Este protocolo puede aplicarse para investigar la respuesta de los gránulos de estrés celular en una amplia gama de interacciones huésped-bacteriana.
Abstract
La imagen fluorescente de los componentes celulares es una herramienta eficaz para investigar las interacciones huésped-patógeno. Los patógenos pueden afectar muchas características diferentes de las células infectadas, incluyendo ultraestructura de organelos, organización de la red del citoesqueleto, así como procesos celulares como la formación de gránulos de estrés (SG). La caracterización de cómo los patógenos subvertir procesos de acogida es una parte importante e integral del campo de la patogénesis. Mientras que los fenotipos variables pueden ser fácilmente visibles, el análisis preciso de las diferencias cualitativas y cuantitativas en las estructuras celulares inducidas por el desafío del patógeno es esencial para definir diferencias estadísticamente significativas entre muestras experimentales y de control. La formación de SG es una respuesta de estrés evolutivamente conservada que conduce a respuestas antivirales y se ha investigado durante mucho tiempo utilizando infecciones virales 1 . La formación de SG también afecta a las cascadas de señalización y puede tener otras consecuencias aún desconocidas2 . La caracterización de esta respuesta de estrés a patógenos distintos de los virus, como los patógenos bacterianos, es actualmente un área de investigación emergente 3 . Por ahora, el análisis cuantitativo y cualitativo de la formación de SG aún no se utiliza rutinariamente, incluso en los sistemas virales. Aquí describimos un método sencillo para inducir y caracterizar la formación de SG en células no infectadas y en células infectadas con un patógeno bacteriano citosólico, lo que afecta a la formación de SGs en respuesta a diversas tensiones exógenas. El análisis de la formación y composición de SG se logra utilizando un número de diferentes marcadores SG y el detector de puntos del plug-in ICY, una herramienta de análisis de imágenes de código abierto.
Introduction
La visualización de las interacciones huésped-patógeno a nivel celular es un método poderoso para obtener información sobre las estrategias patógenas y para identificar las vías celulares clave. De hecho, los patógenos pueden utilizarse como herramientas para identificar objetivos o estructuras celulares importantes, ya que los patógenos han evolucionado para subvertir los procesos celulares centrales como una estrategia para su propia supervivencia o propagación. La visualización de componentes celulares puede conseguirse mediante la expresión recombinante de proteínas huésped marcadas fluorescentemente. Aunque esto permite el análisis en tiempo real, la generación de líneas celulares con proteínas huésped marcadas específicamente es muy laboriosa y puede dar lugar a efectos secundarios indeseables. Más conveniente es la detección de factores celulares utilizando anticuerpos específicos, porque múltiples factores del huésped pueden ser analizados simultáneamente y uno no se limita a un tipo de célula particular. Un inconveniente es que sólo se puede captar una vista estática, ya que el análisis de inmunofluorescencia requiere un fijador de células huéspedion. Sin embargo, una ventaja importante de la inmunofluorescencia es que se presta fácilmente al análisis cualitativo y cuantitativo. Esto, a su vez, puede utilizarse para obtener diferencias estadísticamente significativas para proporcionar nuevos conocimientos sobre las interacciones huésped-patógeno.
Los programas de análisis de imágenes fluorescentes son poderosas herramientas analíticas para realizar análisis 3D y 4D. Sin embargo, el alto costo del software y su mantenimiento hacen que los métodos basados en software libre libre sean más atractivos. El análisis cuidadoso de la imagen usando el software del bio-análisis es valioso como substancia el análisis visual y, al asignar significados estadísticos, aumenta confianza en la exactitud de un fenotipo dado. Anteriormente, las SG se analizaron utilizando el software gratuito ImageJ, que requiere la identificación manual de cada SG 4 . Aquí se proporciona un protocolo para la inducción y el análisis de la formación de SG celular en el contexto de bacUtilizando el software gratuito de análisis de bioimágenes de código abierto ICY (http://icy.bioimageanalysis.org). El software de análisis de imágenes biológicas tiene un programa de detección de manchas integrado que es muy adecuado para el análisis de SG. Permite el ajuste fino del proceso de detección automatizado en regiones de interés especificadas (ROIs). Esto supera la necesidad de un análisis manual de SG individuales y elimina el sesgo de muestreo.
Muchas tensiones ambientales inducen la formación de SGs, que son estructuras citosólicas, no membranosas, de densidad de fase de 0,2 - 5 μm de diámetro 5,6 . Esta respuesta celular se conserva evolutivamente en levaduras, plantas y mamíferos y ocurre cuando se inhibe la traducción global de proteínas. Implica la agregación de complejos de iniciación de traducción estancados en SGs, que se consideran lugares de retención para mRNAs translacionalmente inactivos, permitiendo la traducción selectiva de un subconjunto de mRNAs celulares.Tras la eliminación del estrés, los SG se disuelven y se reanudan las tasas globales de síntesis de proteínas. Las SG se componen de factores de iniciación de la elongación de la traducción, proteínas implicadas en el metabolismo del ARN, proteínas de unión a ARN, así como proteínas de andamio y factores implicados en la señalización de células hospedadoras 2 , aunque la composición exacta puede variar dependiendo de la tensión aplicada. Los factores ambientales que inducen la formación de SG incluyen la inanición de aminoácidos, la irradiación UV, el choque térmico, el choque osmótico, el estrés del retículo endoplásmico, la hipoxia y la infección viral 2 , 7 , 8 . Se ha avanzado mucho en la comprensión de cómo los virus inducir y también subvertir la formación de SG, mientras que todavía poco se sabe acerca de cómo otros patógenos, como patógenos bacterianos, hongos o protozoarios, afectan a esta respuesta al estrés celular 1 , 7 .
ShigeLla flexneri es un patógeno citosólico facultativo gramnegativo de los seres humanos y el agente causante de la diarrea o shigelosis severa. La shigelosis es una importante carga de salud pública y causa 28.000 muertes anuales en niños menores de 5 años 9 , 10 . S. flexneri infecta el epitelio del colon y se extiende célula a célula mediante el secuestro de los componentes del citoesqueleto del huésped [ 11 , 12] . La infección del epitelio apoya la replicación de S. flexneri dentro del citosol, pero los macrófagos infectados mueren a través de un proceso inflamatorio de muerte celular llamado piroptosis. La infección conduce a un reclutamiento masivo de neutrófilos e inflamación severa que es acompañada por calor, estrés oxidativo y destrucción de tejidos. De este modo, mientras que las células infectadas están sujetas a tensiones internas inducidas por la infección, tales como la interrupción de Golgi, estrés genotóxico y reordenamiento citoesqueléticoS, las células infectadas también están sometidas a tensiones ambientales debidas al proceso inflamatorio.
Caracterización del efecto de la infección por S. flexneri sobre la capacidad de las células para responder a las tensiones ambientales utilizando un número de marcadores SG ha demostrado que la infección conduce a diferencias cualitativas y cuantitativas en la composición SG 3 . Sin embargo, se sabe poco sobre otros patógenos bacterianos. Aquí se describe una metodología para la infección de las células huésped con el patógeno citosólico S. flexneri , el estresamiento de las células con diferentes tensiones ambientales, el etiquetado de los componentes SG y el análisis cualitativo y cuantitativo de la formación y composición SG en el contexto de la infección Y células no infectadas. Este método es ampliamente aplicable a otros patógenos bacterianos. Además, el análisis de imagen de la formación de SG puede usarse para infecciones por virus u otros patógenos. Se puede utilizar para analizar SGFormación tras la infección o el efecto de la infección en la formación de SG en respuesta a tensiones exógenas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparación de bacterias y células huésped
- Transferir las tapas de cristal de 12 ó 14 mm en placas de 24 ó 12 pocillos, respectivamente, con pinzas estériles, contando un pocillo por condición experimental. Esterilizar estos por tratamiento UV en una campana de cultivo de tejidos durante 15 min.
NOTA: Incluya pocillos de control para la estimulación bacteriana y para la inducción de SG por estrés exógeno. - Para una placa de 24 pocillos con cubreobjetos de 12 mm, sembrar 1 x 105 células de mamífero ( por ejemplo, células HeLa) sobre cubreobjetos; Presione los cubreobjetos hacia abajo con una punta de pipeta estéril. Dejar que las células se adhieran durante la noche a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos de CO 2 al 5% en medio de cultivo apropiado para cada tipo de célula.
NOTA: Las células de la placa de modo que la confluencia de las células está entre 40 - 60% al día siguiente.- Para las células HeLa, incube en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con aminoácidos no esenciales (NEAA) y suero de ternera fetal (FCS) descompletado al 10%.Descomponga FCS calentando durante 30 min en un baño de agua a 56 ° C, remolino del suero una vez después de 15 min.
- Para eliminar las bacterias, use una punta de pipeta estéril para extraer una pequeña cantidad de un stock de glicerol bacteriano (20% de glicerol) almacenado en un congelador de -80 ° C y colocarlo en una placa etiquetada. Utilice un bucle estéril para esparcir las bacterias sobre alrededor del 10% de la placa. Utilice un nuevo bucle estéril y arrástrelo a través del frotis para hacer 3 líneas paralelas, media placa de largo. Traza a través de estas líneas que cubren el resto de la placa. Incubar la placa O / N a 37 ° C.
- Seleccione una sola colonia bacteriana ( p. Ej., S. flexneri ) de la placa recién chapada. Evite trabajar con colonias bacterianas mayores de 1 semana.
- Para la cepa M90T de S. flexneri , inocular una colonia roja de una placa de agar rojo de agar de soja Tryptic de soja triturada recién listada en placa de agar rojo de Congo al 0,1% en 8 mL de caldo de soja tríptica en un tubo de 15 mL; Apriete la tapa e incube el agitación a 222 rpm O / N a 30ºC6; C.
PRECAUCIÓN: No utilice grandes colonias blancas, ya que han perdido el plásmido de virulencia y no son infecciosas.
2. Desafío bacteriano de las células huésped
- Prepare las bacterias para maximizar el potencial de infección.
- Para S. flexneri , subcultivo bacterias mediante la adición de 150 μ l de O / N de cultivo a 8 mL de triptoma de soja Agar e incubar agitando 222 rpm a 37 ° C a la fase exponencial tardía (~ 2 h) para inducir la virulencia de la expresión génica y mejorar la infección.
- Cuando el cultivo tiene una densidad óptica entre 0,6 y 0,9 (medida a 600 nm), transfiera 1 ml de cultivo en un tubo de 1,5 ml. Las bacterias de Pellet durante 2 min a 8.000 xg y resuspender en medio de infección (DMEM con NEAA, sin FCS) a OD 600 = 1. Así, si la OD 600 es de 0,85, resuspender en 850 μl.
NOTA: Para S. flexneri, a OD 600 = 1, habrá 8 x 10 8 bacterias por ml cuandoCultivadas en 8 ml de medio. Una multiplicidad de infección (MOI) de 20 es apropiada. Para otros patógenos, el número de bacterias por ml a una DO 600 y la MOI apropiada deben determinarse empíricamente.
- Cuando el cultivo tiene una densidad óptica entre 0,6 y 0,9 (medida a 600 nm), transfiera 1 ml de cultivo en un tubo de 1,5 ml. Las bacterias de Pellet durante 2 min a 8.000 xg y resuspender en medio de infección (DMEM con NEAA, sin FCS) a OD 600 = 1. Así, si la OD 600 es de 0,85, resuspender en 850 μl.
- Para potenciar las interacciones bacteriano-huésped, cubra las bacterias con Poly-L-Lysine (PLL).
NOTA: El tratamiento con PLL de S. flexneri no tuvo efecto sobre la dinámica SG. Otros patógenos necesitan ser evaluados por su facilidad para el tratamiento PLL.- Para cubrir las bacterias con PLL, centrifugar 1 ml de cultivo bacteriano durante 2 min a 8.000 xg y luego resuspender el sedimento en 10 μg / ml de PLL en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una DO 600 = 1.
- Añadir la solución bacteriana a un plato pequeño, como un pocillo dentro de una placa de 12 pocillos, e incubar a RT (~ 20 ° C) durante 10 min con agitación suave en un agitador de placas.
- Las bacterias de pellets durante 2 min a 8.000 xg, eliminar el exceso de PLL. Resuspender el sedimento en 1 ml de PBS yD repetir este paso de lavado dos veces. Después del lavado final, resuspender en medio de infección a DO _ { 600 } = 1.
NOTA: Aquí, el medio de infección para S. flexneri es medio de célula huésped con HEPES 20 mM sin FCS.
- Para S. flexneri , subcultivo bacterias mediante la adición de 150 μ l de O / N de cultivo a 8 mL de triptoma de soja Agar e incubar agitando 222 rpm a 37 ° C a la fase exponencial tardía (~ 2 h) para inducir la virulencia de la expresión génica y mejorar la infección.
- Preparar las células para el desafío bacteriano.
- Eliminar el medio de las células HeLa de mamíferos utilizando una bomba de succión. Añadir 500 μl de medio de células RT HeLa para lavar las células, remover el medio con una bomba de succión y reemplazar con 500 μl de medio de infección apropiado para RT ( por ejemplo , medio de célula huésped con HEPES 20 mM sin FCS).
- NOTA: Para todos los pasos de lavado, trabaje rápidamente y procese sólo hasta 4 cubreobjetos a la vez para evitar el secado de las células.
- Desafío preparado células HeLa con bacterias para infectar 20 - 50% de las células.
NOTA: El tiempo apropiado y MOI necesitan ser determinados para cada especie bacteriana. Generalmente, un buen inicio es de 30 min a 37° C con una MOI de 10.- Para S. flexneri, desafiar las células celulares HeLa utilizando uno de los dos métodos (paso 2.3.1.1 o 2.3.1.2).
- Girar bacterias tratadas sin PLL (20 μL de DO 600 = 1 / pocillo de placa de 24 pocillos en 500 μL de medio) sobre células durante 10 min a 13000 x g.
- Añadir bacterias recubiertas de PLL (15 μL de DO 600 = 1 / pocillo de placa de 24 pocillos en 500 μL de medio) durante 15 minutos a RT para permitir que las bacterias se depositen en las células.
- Permita que la infección ocurra colocando las células con bacterias asentadas en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C durante 30 min.
NOTA: Durante períodos de tiempo cortos, sincronice la infección por S. flexneri colocando las placas en un baño de agua a 37 ° C durante 15 min en lugar de en la incubadora de cultivo de tejidos.
- Para S. flexneri, desafiar las células celulares HeLa utilizando uno de los dos métodos (paso 2.3.1.1 o 2.3.1.2).
- Parar la infección lavando las células.
- Para lavar las células y eliminar el exceso de bacterias, retire el medio con una bomba de succión, agregue 1 mLMedio de cultivo HeLa recién calentado (37 ° C) (DMEM, FCS al 10%, NEAA). Remueva el medio, remueva y reemplace con un medio fresco. Repetir dos veces y dejar medio fresco en las células.
- Para S. flexneri , u otras bacterias intracelulares, después de la infección de las células HeLa y los lavados, reemplazar el medio con medio de cultivo tisular estándar que contiene 50 μg / ml de gentamicina para matar las bacterias extracelulares e impedir la invasión celular.
NOTA: No agregue antibióticos en el medio para bacterias extracelulares.
- Para S. flexneri , u otras bacterias intracelulares, después de la infección de las células HeLa y los lavados, reemplazar el medio con medio de cultivo tisular estándar que contiene 50 μg / ml de gentamicina para matar las bacterias extracelulares e impedir la invasión celular.
- Para lavar las células y eliminar el exceso de bacterias, retire el medio con una bomba de succión, agregue 1 mLMedio de cultivo HeLa recién calentado (37 ° C) (DMEM, FCS al 10%, NEAA). Remueva el medio, remueva y reemplace con un medio fresco. Repetir dos veces y dejar medio fresco en las células.
- Incubar las bacterias con las células durante la cantidad deseada de tiempo en una incubadora de cultivo de tejidos.
NOTA: Para S. flexneri , la infección puede ser de hasta 6 h dependiendo del tipo de célula. Para las células HeLa, dejar que la infección continúe durante 1,5 - 2 h antes de añadir estrés exógenos para inducir la formación de SG. En el caso de las infecciones por Caco-2, en las que la Shigella se extiende célula a célula, se infecta durante 30 min a 6 h antes de añadir estrés exógeno. CeLls puede fijarse en este punto sin añadir estrés exógeno para evaluar la formación de SGs como resultado de la infección bacteriana (en ese caso, proceda a la sección 4).
3. La inducción de la formación de gránulos de estrés por la adición de estrógenos exógenos
- Eliminar el medio de las células HeLa infectadas y no infectadas usando una bomba de succión, reemplazar el medio con 500 μl de medio apropiado con o sin el factor de estrés e incubar.
NOTA: Las condiciones que inducen el estrés incluyen las siguientes (ver abajo). Para tratamientos adicionales véase Kedersha et al . 13 .- Para el tratamiento de choque térmico, utilice un medio regular que contenga HEPES 20 mM y coloque la placa en un baño de agua a 44 ° C durante 30 min.
- Para el tratamiento con clotrimazol (induce estrés mitocondrial), use medio regular sin FCS con 20 μM de clotrimazol e incube en una incubadora de cultivo de tejidos durante 1 h.
NOTA: Almacene las alícuotas de un solo uso de 20 mM de clotrimazol en dimetilsulfóxido (DMSO) a -20ºC durante hasta 4 meses. Use el vehículo DMSO para las células de control. - Para el tratamiento con arsenito (induce estrés oxidativo), use medio regular con arsenito 0,5 μM e incube en incubadora de cultivo de tejidos durante 1 h.
NOTA: Almacene las alícuotas de un solo uso de arsenito de 0,5 mM a -20 ° C durante un máximo de 6 meses.
PRECAUCIÓN: El clotrimazol y el arsenito son nocivos y peligrosos para el medio ambiente y deben ser eliminados de manera adecuada. - Para el tratamiento con Des-Metil Des-Amino (DMDA) -pateamina (inhibe la iniciación de la traducción eucariótica), use medio regular con DMPA-pateamina de 50 - 200 nM e incube en incubadora de cultivo de tejidos durante 1 h.
NOTA: Guarde DMDA-pateamina a -80 ° C. Guarde los reactivos como pequeñas alícuotas para evitar la descongelación por congelación.
4. Análisis de fijación e inmunofluorescencia de la formación de gránulos de estrés
NOTA: Procese el control yExperimental cubreobjetos al mismo tiempo para evitar la tinción de las diferencias que pueden afectar el análisis de imagen en pasos posteriores. Las muestras de control incluyen ninguna infección con y sin tratamiento de inducción de SG, y muestras infectadas con y sin tratamiento de inducción de SG.
- Retire completamente el medio con una bomba de succión y fije las muestras añadiendo 0,5 mL RT paraformaldehído al 4% (PFA) en PBS. Incubar durante 30 minutos a TA.
PRECAUCIÓN: La PFA es perjudicial para el manipulador y el entorno. Tomar la medida adecuada para proteger el manipulador y eliminar con residuos químicos.
NOTA: Alternativamente, fijar durante 15 minutos y luego reemplazar con metanol pre-enfriado a -20 ° C durante 10 minutos para retener más localización citoplasmática de los marcadores SG 13 . - Retire la PFA con una pipeta y deseche el líquido en un recipiente de residuos apropiado. Lavar la cubreobjetos con 1 ml de solución salina tamponada con Tris (TBS: Tris 25 mM, pH 7,3, NaCl 15 mM). Incubar el cubreobjetos durante 2 min con agitación suaveEn un agitador de placas durante el lavado.
- Quitar TBS completamente con una bomba de succión y añadir 500 μ l 0,3% Triton-X100 en TBS durante 10 minutos para permeabilizar las células.
- Quitar la solución permeabilizante con una bomba de succión. Reemplazar con 1 mL de TBS, agitar suavemente la placa, eliminar TBS por succión y agregar 1 mL de solución de bloqueo (5% de FCS en TBS) durante 1 h a RT.
- Preparar la solución de anticuerpo primario (dilución 1: 300) en FCS al 5% en TBS. Calcule 50 μl por cubreobjetos de 12 mm y haga suficiente para todos los cubreobjetos en un lote.
NOTA: Los anticuerpos primarios comunes que se usan son G3BP1, eIF3b y TIA1. - Coloque 50 μL de la mezcla de anticuerpos primarios sobre una película de parafina de plástico (parafilm) firmemente adherida sobre el banco o cámara.
NOTA: En la Tabla de Materiales se proporciona una lista de marcadores SGs canónicos, pero la composición de los SG puede depender de la tensión aplicada. Otros marcadores SG se enumeran en Kedersha et al. 13 S. flexneri se enumeran en la Tabla 1 . - Recoja el cubreobjetos con pinzas, limpie el borde del cubreobjetos sobre el tejido, libere brevemente las pinzas para eliminar el exceso de líquido y coloque suavemente boca abajo sobre la gota. Incubar cubreobjetos durante 1,5 h a RT o durante la noche a 4 ° C en una cámara húmeda.
NOTA: Para preparar una cámara húmeda, coloque los tejidos humedecidos a lo largo de los bordes de una cámara firmemente cerrada forrada con parafilm plástico. - Transferir cada cubreobjetos con pinzas en un pozo de una nueva placa de 24 pocillos llena de 1 mL de TBS; Incubar con agitación suave en un agitador de placas durante 5 min. Aspirar el TBS en cada pocillo usando una bomba de succión, reemplazar con 1 mL de TBS y colocar de nuevo en el agitador de placas durante 5 min. Repita el lavado una vez más.
NOTA: Reutilice el parafilm quitando el exceso de líquido con un pañuelo de papel y lavando la superficie con agua. Asegúrese de que la película de parafina esté completamente seca antes de usinG para la siguiente etapa de tinción. - Preparar la solución de anticuerpos secundarios en TBS (dilución 1: 500-1: 2000). Para teñir el núcleo y las bacterias, añadir 2 μ g / mL DAPI a la mezcla. Para teñir actina, añada fluorescentes phalloidin. Pipetear 50 μL de mezcla de anticuerpos secundarios sobre la película de parafina de plástico.
NOTA: Se recomienda el uso de anticuerpos secundarios de burro de absorción cruzada altamente purificados para estudios de co-localización de diferentes marcadores SG cuando se usa G3BP1 (anticuerpo de cabra). Elija anticuerpos secundarios marcados fluorescentemente con espectros no superpuestos. EIF3b mancha claramente el citoplasma de las células y por lo tanto es un buen marcador para delinear las células. La tinción de actina ayuda además a delinear las células en los sitios de contacto de célula a célula y las áreas de entrada bacteriana. - Recoja el cubreobjetos con pinzas, dab el borde de la cubreobjetos en el tejido, liberando brevemente las pinzas, para eliminar el exceso de líquido. Coloque suavemente el cubreobjeto boca abajo sobre la gota e incube los cubreobjetosEn la oscuridad durante 1 h a TA.
- Utilice pinzas para colocar el cubreobjetos de nuevo en las placas de 24 pocillos llenos de 1 ml de PBS fresco. Asegúrese de que el cubreobjetos esté completamente cubierto por el PBS. Lave las células 3 veces con agitación suave durante 5 minutos cada una.
NOTA: Mantenga la placa durante los lavados bajo una cubierta para protegerla de la luz ya que los fluoróforos del anticuerpo secundario son sensibles a la luz. - Sumergir brevemente el cubreobjetos en agua desionizada para quitar la sal, secar con un paño seco del borde sobre un tejido y montar el cubreobjetos sobre 5 μl de medio de montaje de fluorescencia en un portaobjetos de vidrio. Selle el cubreobjetos antes de hacer imágenes usando esmalte de uñas. Mantenga los portaobjetos a 4 ° C para el corto plazo (semana) oa -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo (mes).
NOTA: Evite las burbujas de aire al sellar, ya que esto dañará la calidad de la imagen.
5. Imágenes de fluorescencia
NOTA: Consulte el manual del usuario del microscopio para optimizar la configuración.
- Adquirir imágenes usando un microscopio confocal usando una lente de inmersión de aceite 40 o 63X. Seleccione los canales fluorescentes deseados para la adquisición de imágenes. Cuando utilice varios canales fluorescentes, seleccione el modo de adquisición secuencial.
NOTA: Comience con las muestras experimentales en las que se han inducido las SG con mayor fuerza para evitar la sobreexposición en las muestras posteriores. Asegúrese de no tener sobreexpuestos SGs a lo largo de toda la profundidad de la celda.- Establezca un tamaño de bit de 12 o superior dentro de la configuración del microscopio para asegurar la precisión del análisis de la imagen.
- Establezca las pilas de imagen para cubrir toda la profundidad de la celda. Compruebe en los diferentes canales y para diferentes marcadores SG para asegurarse de que todo el rango está incluido. Establezca el comienzo de la pila en la base de las celdas y la parte superior de las pilas a la altura en la parte superior de las celdas donde no se observan más marcadores SG.
- Adquiera la pila. Mantenga la altura de la pila igual para todas las imágenes.
NOTA: NoCambiar la configuración de adquisición entre el control y muestras experimentales que se utilizarán para la comparación posterior.
6. Análisis de imágenes
NOTA: Aquí se describe el análisis de SG en pilas colapsadas usando freeware ICY. El análisis de imágenes de reconstrucciones 3D también se puede hacer usando otro software especializado. La detección de SG puede realizarse a través de un flujo de trabajo totalmente automatizado establecido para este protocolo (disponible en http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/Stress_granule_detection_in_fluorescence_imaging). Para usar este protocolo, los núcleos necesitan ser manchados con una mancha de ADN para que el software encuentre el centro de cada célula, y los bordes de la célula necesitan ser marcados por un marcador citoplasmático (como eIF3b) o tinción de actina para el software Para identificar los límites celulares. El flujo de trabajo automático se puede utilizar para validar manualmente los resultados derivados o directamente para el análisis cuando los límites de las células se detectan con alta confianza, lo que moDependen de la densidad de las células y del marcador utilizado para detectar los límites celulares.
- Con ImageJ o Fiji, contraiga las pilas de imágenes (Imagen> Pilas> Proyección Z) y guárdelas como archivos .tiff.
NOTA: cree una nueva carpeta para cada imagen, ya que el software de análisis de imágenes vinculará sus resultados al sitio de la imagen original. - Cargue una imagen control y experimental de .tiff en la plataforma de análisis de imágenes (Archivo> Abrir). Vaya a la ventana Secuencia. Desplácese hacia abajo en la "Tabla de búsqueda" a los parámetros del canal.
- Desactive todos los canales haciendo clic en la casilla de verificación de todas las pestañas del canal. Haga clic en el canal 0 y luego seleccione el color preferido haciendo clic en la barra de colores de arriba. Aumentar la intensidad del canal según sea necesario para ver todas las estructuras haciendo clic y moviendo la línea en el campo de intensidad. Repita esto para todos los canales.
NOTA: Desactive los canales que no son necesarios para una tarea determinada para minimizar el sesgo en el análisis de la muestra. - VolutaY dentro de la pestaña Canvas, realice un zoom de aproximadamente 10 celdas por campo ajustando la pestaña de zoom.
- Utilice las herramientas de funciones de polígono (en la barra superior) para delinear los límites celulares de las celdas de la imagen. Use la mancha de actina o un marcador citosólico para delinear los límites celulares ( por ejemplo, eIF3b).
- Haga clic en la función de polígono dentro de las herramientas "Archivo & ROI". Comience a delinear haciendo clic en la celda y luego extender la línea haciendo anclas a través de clics repetidos alrededor del límite de la celda. Para finalizar un ROI, haga clic de nuevo en la función de polígono dentro de las herramientas "Archivo & ROI".
NOTA: Identifique las subpoblaciones de las células delimitadas infectadas. La muestra consiste en una mezcla de células infectadas y no infectadas. Para identificar bacterias, utilice la tinción DAPI o bacterias fluorescentes (como las bacterias que expresan GFP). Aumentar la intensidad para asegurar que todas las bacterias se ven. - Para nombrar un ROI, vaya a la ventana ROI a la derecha y cliCk en la celda de interés en la imagen. Esto resaltará el ROI correspondiente en la pestaña ROI. Haga doble clic en el nombre del ROI y modifique el nombre ( por ejemplo, celda infectada # 1).
NOTA: Si una imagen debe usarse para analizar células infectadas y no infectadas, es más fácil guardar la imagen en dos carpetas separadas y delinear las células infectadas y no infectadas por separado, generando dos hojas de cálculo diferentes, lo que facilitará el análisis. luego.
- Haga clic en la función de polígono dentro de las herramientas "Archivo & ROI". Comience a delinear haciendo clic en la celda y luego extender la línea haciendo anclas a través de clics repetidos alrededor del límite de la celda. Para finalizar un ROI, haga clic de nuevo en la función de polígono dentro de las herramientas "Archivo & ROI".
- Abra la aplicación del detector de puntos en la pestaña "Detección y seguimiento" (barra superior). Dentro de la ficha Entrada, se seleccionará la imagen actual. No cambie nada. En la ficha Preprocesamiento, seleccione el canal que desea analizar.
NOTA: Sólo se puede analizar un canal en un momento dado. Se puede seleccionar aquí un análisis por lotes si se utiliza la secuencia de análisis completamente automatizada cuyos parámetros se han comprobado para dar resultados satisfactorios.- En la pestaña Detector, seleccione "DeTect las manchas brillantes sobre el fondo oscuro. "Luego seleccione la escala apropiada y la sensibilidad.Por favor, pruebe diferentes configuraciones y la detección cruzada de puntos en el control y las muestras experimentales.
NOTA: Para una imagen con una resolución de 2,048 x 2,048 y un tamaño de píxel de 0,12 μm 2 , un umbral de nivel 2 con una sensibilidad de 25 a 100 es generalmente apropiado, pero cada marcador de SG tiene que ser probado empíricamente. Configure la detección de manchas para que en la muestra de control no tratada no se detecten manchas, mientras que en la muestra experimental con SGs se cuentan todas las SGs pequeñas y grandes. - En la pestaña ROI, seleccione el ROI de secuencia sugerido. En la ficha Filtrado, seleccione Sin filtrado. En la ficha Salida, elija la salida adecuada.
NOTA: Elegir Activar archivo específico es útil para guardar diferentes condiciones de detección o canales diferentes. Seleccionar para exportar la imagen binaria y la imagen original con ROIs y detección es helPful para el análisis de control de calidad. - Seleccione "Eliminar puntos anteriores mostrados como ROI". Elija la carpeta para guardar el archivo haciendo clic en el botón "ningún archivo seleccionado". En la ficha Pantalla, seleccione las opciones deseadas. Haga clic en "Iniciar detección".
NOTA: Se creará una carpeta con el nombre y la ubicación elegida que contiene las opciones de imágenes exportadas. Estas imágenes se sobrescribirán para cada nueva condición probada. Para guardar las imágenes, cambie el nombre de la carpeta para que se cree una nueva carpeta o transfiera las imágenes de la carpeta de guardar a una nueva carpeta. Para el control de calidad de las imágenes, es útil seleccionar la marca de detección de la pantalla, el número de detección de ROI y el número de ROI y el nombre.
- En la pestaña Detector, seleccione "DeTect las manchas brillantes sobre el fondo oscuro. "Luego seleccione la escala apropiada y la sensibilidad.Por favor, pruebe diferentes configuraciones y la detección cruzada de puntos en el control y las muestras experimentales.
- Consolide y guarde los datos para los diferentes parámetros usando la hoja de cálculo generada para cada imagen o condición probada.
NOTA: Los parámetros a analizar incluyen el número de SG por ROI, las áreas de superficie SG y el SG maxIntensidad media y mínima. - Transferir los datos y analizar utilizando un programa de análisis capaz de analizar, representar gráficamente y determinar la significación estadística.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Para explicar y demostrar el protocolo descrito en este manuscrito, se caracterizó la imagen de clotrimazole inducida SGs en células HeLa infectadas o no con el patógeno citosólico S. flexneri . Un esquema del procedimiento se presenta en la Figura 1 , e incluye virulenta y avirulenta S. flexneri rayado en placas de Congo Rojo, preparación de bacterias, infección, adición de estrés ambiental, fijación de muestras y tinción, imagen de muestra y cuantificación, así como análisis de imágenes . Pueden usarse una serie de tensiones diferentes para inducir la formación de SG y una variedad de marcadores SG están disponibles para la interrogación. EIF3b es un marcador canónico SG que también mancha claramente el compartimiento citoplasmático de la célula y se puede utilizar para identificar los bordes de la célula. G3BP1 es un marcador de SG ampliamente utilizado que se agrega en SGs sin ninguna tinción de fondo ( Figura 2 A, B D ). Las células son mejor visualizadas con un microscopio confocal, y las pilas que cubren toda la profundidad de la celda se cargan en el análisis de imagen de ICY freeware ( Figura 2 A - C ). Para identificar mejor las células infectadas y poner las células en el grupo infectado o no infectado para un análisis posterior, es útil aumentar la intensidad de la tinción con ácido nucleico ( Figura 2D ). Dentro del software de análisis de imágenes, el detector de puntos se utiliza para identificar SGs dentro de cada uno de los ROI designados ( Figura 2E) y se genera una imagen binaria que muestra todas las SGs identificadas ( Figura 2F ).
El análisis SG debe ser adaptado a cada marcador SG analizado y el ajuste apropiado para el análisis debe ser cuidadosamente elegido. Centrándose en el SG maEl cambio del requisito de tamaño del punto detectado o el cambio de la sensibilidad de los parámetros de detección conducirán a resultados variables, como se demuestra en la Figura 3 A - C. La escala de selección (1 - 3, aunque se pueden añadir escalas) se basa en el tamaño de los píxeles y, por lo tanto, en las escalas más altas, no se contarán las SG más pequeñas y los números de SG disminuirán ( Figura 3 C ). La sensibilidad se mide de 1 a 100, siendo 100 la más sensible. Aumentando la sensibilidad, el número de SG detectados aumenta ( Figura 3 C ). Por lo tanto, los ajustes correctos deben ser encontrados para minimizar falsos positivos y falsos negativos. Esto se hace mejor analizando cuidadosamente las imágenes obtenidas para cada ajuste. Para G3BP1, una escala de 2 con una sensibilidad de 100 (2 - 100, resaltada en rojo) dio el mejor resultado. Una escala de 2 con una menor sensibilidad (50 ó 25) dejó pequeñaSG sin contar (ver flechas naranjas). Del mismo modo, una escala de 3 SG pequeño izquierdo no contabilizado mientras que una escala de 1 sobremuestreó. Es importante destacar que se pueden agregar escalas adicionales para enfocarse sólo en SGs grandes, si esto es necesario. Para eIF3b, una escala de 2 con una sensibilidad de 55 (2 - 55) dio el mejor resultado para eIF3b (destacado en rojo), aunque las flechas rojas destacan bajo o sobremuestreo en una escala 2 - 50 y 2 - 55, respectivamente.
Una vez que los parámetros para el análisis SG se establecen correctamente, los datos se pueden analizar de muchas maneras ( Figura 4 ). El detector de puntos proporciona el número de SG detectados dentro de cada ROI de tal manera que las células no infectadas e infectadas pueden compararse ( Figura 4A ). Del mismo modo, se da el tamaño, en este caso el número de píxeles, a partir del cual se puede calcular el área superficial ( Figura 4 B ). Distribución de frecuencias plOts también son útiles para resaltar cambios en el tamaño de SGs encontrados en diferentes poblaciones celulares. Aquí, una ausencia completa de grandes SG en S. flexneri células infectadas, así como un cambio definido en la distribución se hace más claro ( Figura 4 C ). Además, la intensidad (mostrada aquí es la intensidad mínima y máxima) proporciona información sobre la calidad de las SG analizadas. Para las células infectadas por S. flexneri , las SG son significativamente menos intensas. Estos análisis proporcionan información estadísticamente relevante sobre la naturaleza tanto cualitativa como cuantitativa de los SG formados en respuesta al estrés exógeno cuando las células están infectadas con o sin S. flexneri .
Figura 1 : Esquema del procedimiento experimental para infectar células con S. Flexneri yPara analizar el efecto de la formación de SG de infección. Una colonia Congo-roja y una colonia Congo-red-negativa no virulenta, se recogen y crecen O / N en caldo de soja tríptico. El cultivo durante la noche se subcultiva hasta la fase exponencial tardía antes de que las bacterias se recubren con PLL para promover la adherencia. Las células huésped cultivadas en cubreobjetos de vidrio en placas de 12 pocillos se infectan con bacterias durante 30 min. Las células de control no están infectadas. Las células se lavan y se tratan con inductores de estrés para inducir la formación de SG sustituyendo el medio con un medio que contiene estrés o sometiendo a las células a condiciones de estrés, tales como calor. Las células se fijan, se permeabilizan, se tiñen con marcadores específicos de SG inmunofluorescentes y se forman imágenes utilizando microscopía confocal. Las proyecciones en Z se realizan con ImageJ y se analizan utilizando el detector de puntos del software de análisis de imágenes. Los datos se analizan a continuación. Haga clic aquí para ver un largoDe esta cifra.
Figura 2 : Análisis del detector de puntos de células HeLa infectadas con S. Flexneri durante 1,5 h antes de la adición de clotrimazol durante 1 h. A. Imagen inmunofluorescente de una proyección z que muestra células teñidas con los marcadores SG eIF3b y G3BP1, DAPI y actina. B. La misma imagen que en (A) pero sin la mancha de actina para resaltar el uso de eIF3b para delinear los límites celulares. C. Captura de pantalla del software de análisis de imágenes con el módulo detector de puntos. D. Gated de las células infectadas y no infectadas como se ve utilizando diferentes canales. Para ver todas las bacterias, la intensidad se incrementa. Las células con más de una bacteria presente en la célula están marcadas con una estrella roja. E. Salida de la detección de puntoDe los ROI individuales, indicando el nombre del ROI, el número de puntos y su ubicación. F Imagen de los puntos detectados en los ROI. Barra de escala = 30 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Comparaciones de diferentes configuraciones de escala y sensibilidad del detector de puntos para la detección de SG a través de diferentes marcadores SG. A. Zoom in a células HeLa infectadas o no con S. flexneri y teñidas con DAPI y el marcador SG G3BP1, y analizadas a diferentes escalas (tamaño de píxel cortado, 1 - 3) y sensibilidad (1 - 100). Representación gráfica de los números SG en las células infectadas y no infectadas analizadas a diferentes escalas (
Es / ftp_upload / 55536 / 55536fig4.jpg "/>
Figura 4 : Análisis de los datos de SG generados por detector de puntos obtenidos a partir de células HeLa tratadas con Clotrimazole infectadas con S. Flexneri . A. Número de SGs G3BP1 por célula en células HeLa infectadas y no infectadas. B. Superficie de G3BP1-SGs en las células infectadas y no infectadas, y su frecuencia de distribución porcentual ( C ). D. Valores de intensidad mínima y máxima (arbitraria) de G3BP1-SGs. Los valores incluyen la media con error estándar. El análisis estadístico seleccionado se incluyó para mayor claridad utilizando los valores de p-valores de la suma de rango de Wilcoxon a la izquierda y la prueba de F de la varianza a la derecha. * = <0,05, ** = <0,01, *** = <0,001, ns = no significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El protocolo descrito aquí describe la inducción, localización y análisis de SGs en células no infectadas y células infectadas con el patógeno citosólico S. flexneri en presencia o ausencia de estrés exógeno. Usando software de imagen libre, los protocolos permiten el análisis cualitativo y cuantitativo preciso de la formación de SG para identificar y tratar estadísticamente las diferencias en fenotipos dados.
Hay varios pasos críticos dentro del protocolo para la infección, SG-inducción y las partes de la proyección de imagen. Para la infección, es importante que la interacción bacteriana con las células huésped, como la invasión descrita aquí, se sincronice tanto como sea posible. Esto es particularmente importante cuando se investigan los efectos del reto bacteriano temprano durante el proceso de infección. Anteriormente se ha demostrado que algunos fenotipos, como la localización de eIF3b después de la infección por S. flexneri , se perturban temprano durante el tipo salvajeS. flexneri desafío, mientras que otros fenotipos, como la agregación de G3BP1 que contienen SGs, se ven más afectados en los últimos puntos de tiempo [ 3] . Por lo tanto, para describir con precisión el efecto temporal del desafío bacteriano, la sincronización de la infección es aconsejable. En particular, para analizar la formación de SG, las células deben estar en fase exponencial de crecimiento, y por lo tanto la densidad celular en el momento de la adición de estrés también es un parámetro importante. También limita el análisis SG a modelos de infección celular no confluentes. Otro aspecto crítico es el co-procesamiento de muestras de control y experimentales durante el procesamiento de las muestras para formación de imágenes y durante la adquisición de imágenes. Para el procesamiento inmunofluorescente, todas las muestras deben ser manchadas con las mismas diluciones de trabajo del anticuerpo por la misma cantidad de tiempo y bajo las mismas condiciones ( es decir, RT Vs 4 ° C), mientras también se cuida tratar cada cubreobjetos de manera similar durante las etapas de lavado y Montaje oF los cubreobjetos. Esto garantiza tinciones inmunofluorescentes comparables que pueden ser analizadas tanto cualitativa como cuantitativamente. Las diferencias en el medio de montaje pueden tener efectos significativos sobre el blanqueo de las muestras durante la adquisición de la imagen y por lo tanto deben mantenerse constantes. De manera similar, la adquisición de imágenes para todas las muestras que se van a comparar en el análisis debe realizarse dentro de una sesión y con los mismos ajustes para minimizar las diferencias que surgen de la resistencia del láser o de la configuración de la muestra.
Cuando se utilizan tensiones exógenas, es importante almacenar adecuadamente el reactivo y hacer con frecuencia nuevas existencias de trabajo. Los períodos prolongados (> 4 meses para el clotrimazol, por ejemplo) conducen a una disminución de la potencia del fármaco y afectarán a la formación de SG. Los reactivos deben añadirse al medio de cultivo inmediatamente antes de su adición a las células; Si se observa una reducción en la formación de SG en células de control o la agregación de SG parece aberrante, los reactivos deben ser probados para su acLas nuevas existencias.
Una limitación es que la identificación SG que utiliza el detector de puntos se vuelve menos fiable cuando hay demasiada fluorescencia de fondo. Aunque esto no es un problema para muchos marcadores SG, algunos, como eIF3b, que es un marcador citosólico claro tanto en condiciones de inducción SG como no inductoras, son más difíciles de analizar como se muestra en la Figura 3 . Además, las escalas y las sensibilidades deben determinarse empíricamente para cada marcador SG. Otra limitación es que el análisis a través del software de análisis de imágenes es mejor con imágenes 2D y, por lo tanto, funciona bien en cortes ópticos o pilas colapsadas, lo que sin embargo da como resultado una pérdida de información en 3D. Por lo tanto, el análisis de las proyecciones z tiende a exagerar el tamaño de las SG y subestimar el número de SG. El análisis 3D de las SG puede realizarse con Imaris para dar una caracterización espacial aún más precisa, si se considera necesario para un fenotipo particular. La caracterización SG puede realizarse rápida y de forma estandarizada utilizando el detector de puntos automatizado del software de análisis de imágenes. Por el contrario, los métodos manuales para identificar y delinear SGs como se realizó previamente 4 , dejan el análisis abierto a más prejuicios y es considerablemente más tiempo. SG utilizando el detector de puntos también puede adaptarse para incluir o excluir pequeños agregados SG seleccionando diferentes umbrales de sensibilidad y tamaño, lo que permite flexibilidad en la evaluación de diferentes aspectos de la formación de SG. SG también se puede realizar de una manera totalmente automatizada utilizando un flujo de trabajo automatizado establecido 3 . Dentro de este flujo de trabajo, el centro de la célula se identifica a través de una tinción DAPI y el programa entonces deja una esfera maleable crecer hacia fuera para delinear los límites celulares basados en una mancha citoplásmica (como eIF3b) o actina. Al mismo tiempo, utilizando un análisis semi-automatizadoDelineando manualmente las células individuales para el análisis, puede ser ventajoso cuando las células crecen en grupos y los límites celulares son difíciles de delinear claramente para el programa automatizado. En estas circunstancias, la definición manual de límites de células puede eliminar falsos valores positivos o negativos.
El protocolo puede adaptarse a otras condiciones de inducción de SG ya otros patógenos, incluyendo virus, bacterias, levaduras y protozoos. De particular interés pueden ser otros patógenos citosólicos tales como Rickettsia spp., Francisella tularensis , Burkholdieria pseudomallei y Listeria spp. Para cada agente infeccioso, y posiblemente también para diferentes líneas celulares, el protocolo de infección deberá ser adaptado y los tiempos de muestreo de los esfuerzos exógenos se determinarán empíricamente. Además, la caracterización de SG utilizando el software de análisis de imágenes también se puede extender a imágenes de células vivas en el futuro. El análisis de SG en tiempo realItate la expresión de uno o más marcadores SG marcados fluorescentemente en las células huésped, pero permitiría que las preguntas relativas a la dinámica temporal y especial de la formación de SG sean tratadas bajo diferentes condiciones experimentales. Entonces se necesitarían bacterias fluorescentemente marcadas para complementar el análisis de SG en tiempo real en células infectadas y no infectadas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
PS es un ganador de la Bill y Melinda Gates Grand Challenge Grant OPP1141322. PV recibió el apoyo de una beca de Postdoc Mobility de la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza y una beca postdoctoral Roux-Cantarini. PJS es compatible con una subvención HHMI y ERC-2013-ADG 339579-Decrypt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| eIF3b (N20), origin goat | Santa Cruz | sc-16377 | Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1:300 |
| eIF3b (A20), origin goat | Santa Cruz | sc-16378 | Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1:300 |
| eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal) | Cell Signaling | 3411 | Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1:800 |
| eIF4AI, origin goat | Santa Cruz | sc-14211 | Recommended by (Ref # 13). Dilution 1:200 |
| eIF4B, origin rabbit | Abcam | ab186856 | Good stress granule marker in our hands. Dilution 1:300 |
| eIF4B, origin rabbit | Cell Signaling | 3592 | Recommended by Ref # 13. Dilution 1:100 |
| eIF4G, origin rabbit | Santa Cruz | sc-11373 | Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1:300 |
| G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal) | BD Biosciences | 611126 | Widely used SG marker. Dilution 1:300 |
| Tia-1, origin goat | Santa Cruz | sc-1751 | Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1:300 |
| Alexa-conjugated Secondary Antibodies | |||
| A488 anti-goat , origin donkey | Thermo Fisher | A-11055 | Cross absorbed. Dilution 1:500 |
| A568 anti-goat, origin donkey | Thermo Fisher | A-11057 | Cross absorbed. Dilution 1:500 |
| A488 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A-21202 | Dilution 1:500 |
| A568 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A10037 | Dilution 1:500 |
| A647 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A31571 | Dilution 1:500 |
| A488 anti-rabbit, origin donkey | Thermo Fisher | A-21206 | Dilution 1:500 |
| A568 anti-rabbit, origin donkey | Thermo Fisher | A10042 | Dilution 1:500 |
| Other Reagents | |||
| Shigella flexneri | Available from various laboratories by request | ||
| Tryptone Casein Soya (TCS) broth | BD Biosciences | 211825 | Standard growth medium for Shigella, application - bacterial growth |
| TCS agar | BD Biosciences | 236950 | Standard growth agar for Shigella, application - bacterial growth |
| Congo red | SERVA Electrophoresis GmbH | 27215.01 | Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application - bacterial growth |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P1274 | Useful to coating bacteria to increase infection, application - infection |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application - infection |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | PH buffer useful when cells are incubated at RT, application - cell culture |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 31885 | Standard culture medium for HeLa cells, application - cell culture |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biowest | S1810-100 | 5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application - cell culture |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140 | 1:100 dilution used for HeLa cell culture medium, application - cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | Reagent diluent, application - cell culture |
| Sodium arsenite | Sigma-Aldrich | S7400 | Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application - stress inducer |
| Clotrimazole | Sigma-Aldrich | C6019 | Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application - stress inducer |
| Paraformaldehyde (PFA | Electron Microscopy Scences | 15714 | 4% PFA is used for standard fixation of cells, application - fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application - permeabilization |
| A647-phalloidin | Thermo Fisher | A22287 | Dilution is at 1:40, best added during secondary antibody staining, application - staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application - staining |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | BR701501 | Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application - staining |
| Prolong Gold | Thermo Fisher | 36930 | Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application - mounting |
| Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting |
| 24-well cell culture plate | Sigma-Aldrich | CLS3527 | Standard tissue culture plates, application - cell culture |
| 12 mm glass coverslips | NeuVitro | 1001/12 | Cell culture support for immunofluorescent applications, application - cell support |
| forceps | Sigma-Aldrich | 81381 | Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting |
| Programs and Equipment | |||
| Prism | GraphPad Software | Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application - data analysis | |
| Leica SP5 | Leica Microsystems | Confocal microsope, application - image acquisition | |
| Imaris | Bitplane | Professional image analysis program, application - data analysis | |
| Excel | Microsoft | Data analysis and graphing program, application - data analysis |
References
- Reineke, L. C., Lloyd, R. E. Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection. Virology. 436 (2), 255-267 (2013).
- Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase. Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).
- Vonaesch, P., Campbell-Valois, F. -X., Dufour, A., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. Shigella flexneri modulates stress granule composition and inhibits stress granule aggregation. Cell Microbiol. 18 (7), 982-997 (2016).
- Kolobova, E., Efimov, A., et al. Microtubule-dependent association of AKAP350A and CCAR1 with RNA stress granules. Exp Cell Res. 315 (3), 542-555 (2009).
- Anderson, P., Kedersha, N. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends in biochemical sciences. 33 (3), 141-150 (2008).
- Anderson, P., Kedersha, N.
- Mohr, I., Sonenberg, N. Host translation at the nexus of infection and immunity. Cell Host Microbe. 12 (4), 470-483 (2012).
- Hu, S., Claud, E. C., Musch, M. W., Chang, E. B. Stress granule formation mediates the inhibition of colonic Hsp70 translation by interferon- and tumor necrosis factor. Am J Physiol Gastointest Liver Physiol. 298 (4), 481-492 (2010).
- Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B., Fasano, A., Kotloff, K. L., Levine, M. M. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).
- Lanata, C. F., Fischer-Walker, C. L., et al. Global Causes of Diarrheal Disease Mortality in Children. PloS One. 8 (9), 72788 (2013).
- Ashida, H., Ogawa, M., et al. Shigella deploy multiple countermeasures against host innate immune responses. Curr Opin Microbiol. 14 (1), 16-23 (2011).
- Ashida, H., Ogawa, M., Mimuro, H., Kobayashi, T., Sanada, T., Sasakawa, C. Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system. Curr Opin Immunol. 23 (4), 448-455 (2011).
- Kedersha, N., Anderson, P. Mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).
- Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nat Re. Micro. 7 (5), 333-340 (2009).
