Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

النهج القائم على الطيف، جنبا إلى جنب السائل اللوني الكتلة لتحليل المستقلب من Published: March 28, 2017 doi: 10.3791/55558
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 1
1Department of Biology, Georgetown University, 2Division of Infectious Diseases, Weill Cornell Medical College, 3Department of Medicine, Weill Cornell Medical College

Summary

نحن هنا وصف بروتوكول لاستخراج الأيض من المكورات العنقودية الذهبية والتحليل في وقت لاحق عبر اللوني السائل ومطياف الكتلة.

Abstract

في محاولة لإفشال مسببات الأمراض البكتيرية، وتستضيف في كثير من الأحيان تحد من توافر المواد المغذية المفيدة على موقع الإصابة. هذا التحديد يمكن أن يغير وفرة من المركبات الرئيسية التي عوامل تنظيمية تستجيب، وتعديل الأيض الخلوي. في السنوات الأخيرة، برز عدد من البروتينات والحمض النووي الريبي كما المنظمين هامة في التعبير الجيني الفوعة. على سبيل المثال، البروتين كودي يستجيب إلى مستويات الأحماض الأمينية المتفرعة السلسلة وGTP وحفظها على نطاق واسع في البلدان المنخفضة الدخل G + C البكتيريا إيجابية الجرام. كمنظم العالمي في المكورات العنقودية الذهبية، كودي تسيطر على التعبير العشرات من الفوعة والجينات التمثيل الغذائي. نحن نفترض أن بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية يستخدم كودي، في جزء منه، إلى تغيير حالته التمثيل الغذائي في محاولة للتكيف مع ظروف تحد من المغذيات يحتمل أن تكون واجهتها في بيئة المضيف. توضح هذه المخطوطة طريقة لاستخراج وتحليل نواتج الأيض من S. الذهبية باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب المواصفات الشاملtrometry، وهو البروتوكول الذي تم تطويره لاختبار هذه الفرضية. يسلط الضوء على الأسلوب أيضا أفضل الممارسات التي من شأنها ضمان الدقة والتكاثر، مثل الحفاظ على حالة مستقرة البيولوجية والتهوية المستمرة دون استخدام الثقافات ناظم كيميائي مستمرة. بالنسبة إلى USA200 للميثيسيلين عرضة الذهبية S. عزل UAMS-1 السلالة الأبوية، عرضت على كودي متحولة إسوي زيادات كبيرة في الأحماض الأمينية المستمدة من اسبارتاتي (على سبيل المثال، ثريونين وآيسولوسين) والنقصان في سلائفها (على سبيل المثال، اسبارتاتي وO -acetylhomoserine ). هذه النتائج متطابقة تماما مع البيانات التي تم الحصول عليها النسخي مع تحليل الحمض النووي الريبي وما يليها: كانت الجينات في هذه المسارات يصل ينظم بين 10- و 800 أضعاف في متحولة لاغيا كودي. يمكن اقتران التحليلات العالمية لTranscriptome على وmetabolome تكشف كيف تغير البكتيريا عملية الأيض لديهم عندما تواجه مع الإجهاد البيئي أو الغذائية، وتقديم رؤية المحتملة في فيزالتغييرات المرتبطة iological نضوب المغذيات شهدت خلال العدوى. هذه الاكتشافات قد يمهد الطريق لتطوير رواية مكافحة العدوى والعلاجات.

Introduction

يجب مسببات الأمراض البكتيرية يتعامل مع العديد من التحديات في البيئة المضيفة. بالإضافة إلى الهجوم المباشر من قبل الخلايا المناعية، التي تستضيف أيضا تعزل العناصر الغذائية الضرورية للبقاء على قيد الحياة البكتيرية والتكرار، وتوليد مناعة الغذائية 1 و 2. البقاء على قيد الحياة هذه البيئات المعادية، مسببات الأمراض البكتيرية تنتشر عوامل الفوعة. بعض هذه العوامل السماح للبكتيريا للتهرب من الاستجابة المناعية. وتشمل العوامل الأخرى يفرز الإنزيمات الهضمية، مثل هيالورونيداز، thermonuclease، والليباز، والتي قد تمكن البكتيريا لتجديد المواد الغذائية التي تستهلك في عداد المفقودين المكونات المشتقة من الأنسجة 3 و 4 و 5. والواقع أن البكتيريا تطورت النظم التنظيمية التي تربط الحالة الفسيولوجية للخلية إلى إنتاج الفوعة العوامل 6، 7، حتى الطبقة = "XREF"> 8 و 9 و 10.

وهناك مجموعة متزايدة من الأدلة تشير الى كودي كمنظم حاسم ربط عملية التمثيل الغذائي والفوعة. على الرغم من أن اكتشفت لأول مرة في العصوية الرقيقة بمثابة كاظمة من الجين ثنائي الببتيد بيرمياز (النيابة العامة) 11، ومن المعروف كودي الآن إلى أن يتم إنتاجها من قبل ما يقرب من جميع المنخفضة البكتيريا G + C إيجابية الجرام 12 و 13 و ينظم العشرات من الجينات المسؤولة عن الكربون و الأيض 14، 15، 16، 17، 18، 19 النيتروجين. في الأنواع المسببة للأمراض، كودي أيضا تسيطر على التعبير عن بعض الجينات الفوعة أهم 20، 21،يتم تنشيط EF "> 22، 23، 24، 25، 26، 27 كودي كما بروتين ملزمة DNA من قبل فئتين من بروابط: الأحماض الأمينية المتفرعة السلسلة (BCAAs، آيسولوسين، ليسين، وحمض أميني أساسي [ILV]) وGTP . عندما تكون هذه المواد الغذائية وفيرة، ويقمع كودي (أو في بعض الحالات، ويحفز) النسخ. وتصبح هذه المواد الغذائية محدودة، وانخفاض النشاط كودي تدريجيا، مما أدى إلى استجابة النسخي متدرج أن إعادة طرق السلائف من خلال مختلف المسارات الأيضية المتصلة الأيض المركزي 28، 29، 30.
جنبا إلى جنب اللوني السائل إلى جانب لقياس الطيف الكتلي (LC-MS) هي تقنية قوية التي يمكن أن تحدد بدقة وتحديد جزيء صغير الأيض داخل الخلايا 31. عندما يقترن transcتحليل riptome (على سبيل المثال، RNA-يليها)، وهذا العمل التحليلي يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على التغيرات الفسيولوجية التي تحدث في الاستجابة للإجهاد البيئي أو التغذية. هنا، نقدم طريقة لاستخراج المستقلب من خلايا المكورات العنقودية الذهبية وتحليلها لاحقا عبر LC-MS. وقد استخدم هذا النهج لإثبات الآثار عديد المظاهر من كودي على بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية علم وظائف الأعضاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد العازلة حلول

  1. إعداد الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، ودرجة الحموضة 7.4) عن طريق تمييع الحل المخزون من 10X PBS إلى التركيز النهائي من 1X مع عالى النقاء (المقطر ومنزوع الأيونات) المياه.
  2. يعد حل التبريد عن طريق الجمع بين 2 مل من الأسيتونيتريل، 2 مل من الميثانول، 1 مل من عالى النقاء H 2 O، و 19 ميكرولتر (0.1 ملي تركيز النهائي) من حمض الفورميك.
  3. إعداد LC-MS المذيبات وذلك بإضافة حمض الفورميك (0.2٪ [ت / ت] تركيز النهائي) إلى الماء عالى النقاء.
  4. إعداد LC-MS المذيبات B بإضافة حمض الفورميك (0.2٪ [ت / ت] تركيز النهائي) لأسيتونيتريل.
    ملاحظة: يجب أن تكون مستعدة جميع الحلول باستخدام الكواشف أعلى نقاء المتاحة (عموما عالية الأداء اللوني السائل الصف). وينبغي إعداد حلول جديدة قبل كل تجربة وتخزينها على الجليد قبل استخدامها.

2. إنشاء ثابت للدولة نمو بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية

  1. خط S. aureuالصورة سلالات من الفائدة للعزلة على تريبسيني أجار الصويا (TSA) من المخزون الجلسرين المجمدة. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 16-24 ساعة.
  2. تطعيم 4 مل من مرق الصويا زيتية (TSB) أو المتوسطة مناسبة أخرى في أنابيب معقمة الزجاج الحضانة مع المستعمرات واحد من كل سلالة. احتضان ميلا (~ 70 درجة زاوية) مع دوران في 60 التناوب في الدقيقة (دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية لمدة 16-20 ساعة.
    ملاحظة: الثقافات بين عشية وضحاها عرضة للالتدرجات الأوكسجين عند استخدام الأساليب القياسية، بما في ذلك تلك التي وصفها في الخطوة 2.2، والتي تؤثر الفيزيولوجيا الخلوية. وهكذا، ونحن توظيف استراتيجية متعددة الظهر، التخفيف لضمان حالة مستقرة البيولوجية (انظر الخطوات 2،4-3،2 أدناه).
  3. استخدام معمل لقياس الكثافة البصرية للثقافات من الخطوة 2.2 في 600 نانومتر (OD 600). استخدام معقم المتوسطة باعتبارها مرجعية بصرية (فارغة). تمييع هذه الخلايا إلى OD 600 من 0.05 في 50 مل من المتوسط TSB معقم (قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية) في منفصلة، 250 قوارير مل ديلونغ.
  4. Incuباتي الثقافات عند 37 درجة مئوية في حمام مائي مع اهتزاز عند 280 دورة في الدقيقة.
  5. كل 30 دقيقة، واتخاذ OD 600 القياسات. مع زيادة الكثافة الضوئية، قد يصبح من الضروري لتخفيف الثقافات مع TSB بحيث تظل في نطاق الامتصاصية خطية من معمل.
  6. عندما الثقافات من الخطوة 2.5 تحقيق OD 600 من ~ 0،8-1،0، ثقافة فرعية منها الى 50 مل من 37 درجة مئوية TSB إلى OD 600 من 0،01-0،05 وكرر الخطوات من 2.4 و 2.5.

إعداد مجموعة 3. عينة

  1. إعداد سرير من الثلج الجاف المسحوق في وعاء المناسبة (على سبيل المثال، طبق من الزجاج، دلو الجليد، أو برودة).
  2. كما الكثافة البصرية للثقافات نهج نقطة الحصاد المطلوب، إضافة 1 مل من التبريد حل ل35 مم طبق بتري غير المعالجة وقبل بارد على الجليد الجاف ل≥5 دقيقة.
    ملاحظة: "نقطة الحصاد المرجوة" سوف تختلف تبعا لأهداف تجريبية. على سبيل المثال، كانت إذا واحدة لفحص مترetabolites خلال نمو الهوائية، المؤشرات الرئيسية لهذه الدولة وتشمل إفراز خلات وإعادة الاستيعاب للخلات خلال مرحلة النمو بعد الأسية 32 و 33. عموما، يجب أن تكون هذه النقطة في مرحلة نمو معينة (على سبيل المثال، المرحلة الأسية). قد تختلف OD 600 القيم المحددة المرتبطة هذه المرحلة بين السلالات البكتيرية المختلفة وسائط النمو.
  3. وضع غير القابل للصدأ الصلب فلتر فريت (قبل المبردة إلى -20 ° C) في سدادة مطاطية ووضعه على قمة قارورة فراغ تعلق على فراغ منزل أو مضخة فراغ.
  4. تطبيق فراغ ووضع مختلط السليلوز استر غشاء (0.22 حجم ميكرون المسام) على القمة.
    ملاحظة: من المهم جدا استخدام فلتر مع قطرها ما يساوي ذلك من فريت وإلى مركز بشكل صحيح هذا الفلتر لضمان أن العينة يتم رسمها من خلال مرشح بدلا من على الحافة. ترطيب الغشاء مع الثلج الباردة، H 2 O معقمة قد يساعدمع تحديد المواقع الغشاء.

4. عينة الحصاد

  1. في لOD 600 من ~ 0،4-0،5، واستخدام ماصة المصلية لإزالة 13 مل من ثقافة من القارورة وتطبيق العينة إلى التصفية.
  2. بعد أن تم تصفية عينة بأكملها، ويغسل فورا مرشح مع ≥5 مل من الجليد الباردة PBS ليغسل الأيض المرتبطة المتوسطة.
  3. فصل فراغ واستخدام زوج من ملاقط معقمة لإزالة عامل التصفية من فريت. عكس مرشح (الجانب الخلية أسفل) في حل إخماد قبل المبردة.
    ملاحظة: من المهم تنفيذ الخطوات المذكورة أعلاه بسرعة (أي في غضون ثوان) وبمجرد تمت إزالة السائل لضمان التبريد السريع للخلايا والقت القبض على النشاط الأيضي.
  4. احتضان مرشح في حل إخماد على الجليد الجاف ل≥20 دقيقة.
  5. استخدام ملاقط معقمة، عكس مرشح (الجانب خلية متابعة) في طبق بتري واستخدام micropipette لشطف خلايا الخروج من رانه غشاء في حل إخماد.
  6. إعادة تعليق الخلايا في حل إخماد ومن ثم نقل تعليق خلية إلى أنبوب معقم مقاومة للتأثير 2 مل تحتوي على ~ 100 ميكرولتر من الخرز السيليكا 0.1 ملم. تخزين هذا على الثلج الجاف أو في -80 ° C.

5. المستقلب استخراج

  1. عينات ذوبان الجليد على الرطب وتعطيل الخلايا في الخالط مع أربعة 30 ثانية رشقات نارية في 6000 دورة في الدقيقة، مع فترات التبريد 2 دقيقة على الثلج الجاف بين الدورات.
  2. توضيح لست] لمدة 15 دقيقة في قبل المبردة، microcentrifuge لالمبردة في أقصى سرعة (أي 18213 x ج في ≤4 ° C).
  3. طاف لنقل أنبوب microcentrifuge نظيفة.
  4. باستخدام micropipette، ونقل جزء صغير من العينة إلى أنبوب microcentrifuge لتقدير حجم المحتوى الببتيد المتبقية في الخطوة 6؛ تخزين الباقي في -80 ° C.
    ملاحظة: حجم العينة محفوظة تختلف، اعتمادا على الفحص BCA المستخدمة في الخطوة 6.1. هذهيجب أن يتم تخزين عينة على الجليد الرطب لتحليل فوري أو تجميدها في -80 ° C.

6. Bicinchoninic حمض (BCA) الفحص

  1. إجراء فحص BCA على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة عدة، وذلك باستخدام عينات من الخطوة 5.4 لتحديد تركيز الببتيد المتبقية لكل عينة.

7. LC-MS

  1. مزيج 75 ميكرولتر من S. الذهبية استخراج 75 ميكرولتر من LC-MS المذيبات B، أعدت في الخطوة 1.4.
  2. دوامة لخلط وتدور في 13000 x ج لمدة 5 دقائق.
  3. وضع 100 ميكرولتر من طاف في (LC) قارورة اللوني السائل والأنكى من ذلك هو. ضمان عدم وجود فقاعات الهواء محاصرون في العينة.
  4. تحميل قارورة LC على الاوتوماتيكى LC-MS وتحرير قائمة التشغيل في البرنامج "غير متصل Worklist محرر".
    1. ملء "اسم نموذج" (على سبيل المثال، من النوع البري-1)، "نموذج الوظيفة" (على سبيل المثال، P1-A1)، "أسلوب" (على سبيل المثال، الفورميك Aإدارة البحث الجنائي سلبية الطريقة)، و"ملف البيانات" (على سبيل المثال، من النوع البري-1) الأعمدة. انقر على زر "حفظ Worklist". فتح "الطيف الكتلي الحصول على البيانات محطة" البرمجيات وإدخال worklist المحفوظة مسبقا. انقر على زر "ابدأ Worklist تشغيل" لبدء قياس LC-MS المستمر.
  5. فصل العينات على عمود، ربط العمود إلى وقت الرحلة (TOF) مطياف، وزوجين مطياف TOF مع نظام LC. استخدام التدرج الطور المتحرك على النحو التالي: 0-2 دقيقة، و 85٪ المذيبات B. 3-5 دقيقة، و 80٪ المذيبات B. 6-7 دقيقة، و 75٪ المذيبات B. 8-9 دقيقة، و 70٪ المذيبات B. 10 حتي 11،1 دقيقة، و 50٪ المذيبات B. 11،1 حتي 14 دقيقة، و 20٪ المذيبات B. و14،1 حتي 24 دقيقة، 5٪ المذيبات B. تنتهي فترة 10 دقيقة إعادة موازنة-في 85٪ المذيبات B ومعدل تدفق 0.4 مل دقيقة -1.
  6. باستخدام مضخة isocratic، ولبث حل كتلة إشارة مع المدى للسماح في وقت واحد معايرة محور الجماعية.
    ملاحظة: هذه الخطوةويستند على دليل TOF مطياف القياسية.
    1. استخدام مزيج من حمض الخليك D4 وhexakis (1H، 1H، 3H-tetrafluoropropoxy) phosphazine كحل كتلة إشارة لأداء المعايرة في الوقت الحقيقي. استخدام مضخة isocratic مع معدل تدفق 2.5 مل دقيقة -1 لالتسريب.

8. تصحيح دفعة من التهم ايون

  1. تعيين أي نموذج لتكون بمثابة عينة مرجعية لتصحيح دفعة (على سبيل المثال، من النوع البري، وتكرار 1).
  2. حساب مجموع التهم أيون لجميع نواتج الأيض داخل العينة المرجعية. كرر هذه العملية الحسابية لجميع العينات.
  3. تقسيم عدد أيون الإجمالي لكل عينة من إجمالي عدد أيون من عينة مرجعية لتوليد النسبة.
  4. تقسيم عدد أيون لكل الأيض داخل العينة نسبة العينة / إشارة إلى الحصول على عدد ايون تصحيح دفعة لكل الأيض.

9. الببتيد التطبيع

  1. دivide القيم العد ايون تصحيح دفعة لكل عينة تم الحصول عليها في الخطوة 8 من تركيز الببتيد مع تحديد الفحص BCA في الخطوة 6 لتسفر عن قيمة تطبيع لكل الأيض.
    ملاحظة: تطبيع، دفعة دفعة تصحيح التهم ايون لكل المستقلب حصلت عليه في الخطوة 9.1 يمكن مقارنة مباشرة بين السلالات وتخضع للتحليل الإحصائي (على سبيل المثال، ومان ويتني U -test). بدلا من ذلك، الأيض المعروف أن يتغير إما عن طريق العلاج أو الخلفية الوراثية يمكن أن تستخدم بالتطبيع للكشف عن التغييرات الناجمة عن أيضة التحلل. إدراج كمية معروفة من L-norvaline أو حمض gluraric في استخراج العازلة يمكن استخدامها لتصحيح خسارة خلال تجهيز العينات 34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

قمنا بتحليل حمامات الأيض داخل الخلايا في S. الذهبية في المختبر خلال النمو في الغنية والمتوسطة معقدة. وكدليل على المبدأ، قارنا الشخصية الأيض بين S. الذهبية التهاب العظم والنقي للميثيسيلين عرضة عزل UAMS-1 (البرية من نوع [WT])، وسلالة إسوي تفتقر إلى التنظيم النسخي العالمي كودي (Δ كودي) 26. حالة استقرار، أنشئت الثقافات الأسية من سلالات WT وكودي في TSB المتوسطة، كما هو موضح في الخطوة 2 من البروتوكول. كان سلوك نمو من النوع البري وكودي -null ثقافات متحولة مماثل، مع وجود اختلافات طفيفة فقط في نمو المحصول ومعدل (الشكل 1). باستخدام الحمض النووي الريبي تسلسل وتكنولوجيا متطورة، نحن وغيرنا كشفت أن جينات متعددة الترميز لالأنزيمات المشاركة في التركيب الحيوي من الأحماض الأمينية المستمدة من اسبارتاتي تم إلغاء قمع في كودي -null ج متحولةompared إلى خلايا WT في المختبر خلال النمو في TSB (الشكل 2) 25، 27، 30. وعلاوة على ذلك، brnQ1 وbrnQ2، الذي رمز لpermeases الأحماض الأمينية المتفرعة السلسلة، وoverexpressed في codY- متحولة لاغيا 30، 35.

لتحديد مدى وفرة الخلايا ثابتة للدولة من نواتج الأيض المرتبطة يتم تغيير في متحولة لاغيا هذا المسار، أجرينا التنميط المستقلب أساس LC-MS. وقد نمت WT وcodY- خلايا متحولة فارغة إلى حالة مستقرة البيولوجية وتم أخذ عينات كما هو موضح في الخطوة 4 من البروتوكول. نحن مصممون فرة الأيض من خلال دمج منطقة ذروة أيون كثافة لكل المستقلب حل chromatographically باستخدام حزمة البرامج التحليلية (انظر قائمة المواد). نحن تصحيح للفرقerences في الكتلة الحيوية عن طريق تطبيع فرة الأيض لتركيز الببتيد المتبقية من كل عينة. نحن تصحيح مزيد من هذه القيم للآثار دفعة المحتملة بين العينات عن طريق حساب متوسط ​​عدد أيون لجميع نواتج الأيض داخل كل عينة وباستخدام عينة من النوع البري كقيمة مرجعية. هذا النهج تمكين مقارنات بين عينة من وفرة الأيض عبر الظروف. يمكن بالمثل مقارنات بين الأيض في عينة معينة يمكن تحقيقه عن طريق تحويل أولا فرة الأيض تطبيع من التهم أيون لالمولي كميات باستخدام أسلوب إضافة القياسية.

لقد مقارنة مستويات وسيطة رئيسية في مسار اسبارتاتي في UAMS-1 ومتحولة لاغية لها codY-. كما رأينا في الشكل 3، والمنتجات النهائية لهذا المسار (على سبيل المثال، ثريونين و(ايزو) -leucine) هي أكثر وفرة في خلايا متحولة كودي -null، في حين السلائف (على سبيل المثال،اسبارتاتي وس -acetyl homoserine) أكثر وفرة في خلايا WT. وupregulation مجتمعة BrnQ permeases 36 والتخليق الحيوى مسار ILV المرجح يؤدي إلى زيادة في آيسولوسين ويسين 30. على الرغم من أن الخلافات هي صغيرة نسبيا (<4 أضعاف)، LC-MS المستندة إلى الكميات وتصحيح دفعة تكشف عن تغييرات قوية وذات دلالة إحصائية التي تنسجم مع التعديلات النسخي بوساطة كودي.

شكل 1
الشكل 1: سلوك نمو بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية UAMS-1 وكودي متحولة -null إسوي في TSB. تمديد الوقت الخلايا قضى في النمو الهائل حالة استقرار، والثقافات المخفف العودة إلى الكثافة البصرية من 0.05 في المتوسط الطازجة بعد حققت الثقافات مسبقا على OD 600 من ~ 1. تم جمع عينات للتحليل الأيض LC-MSمن الثقافات التجريبية في كثافة ضوئية من ~ 0.5 (السهام). البيانات المعروضة هي تمثيلية من ثلاثة مكررات البيولوجية.

الشكل 2
الشكل 2: رسم تخطيطي الأيض اختيار المستمدة من اسبارتاتي. الجينات وoperons التي تحفز تخليق الأحماض الأمينية اسبارتاتي الأسرة يشار بخط مائل المنتجات؛ الزيادة في وفرة نص في متحولة -null كودي مقارنة مع النوع البري، على النحو الذي يحدده تحليل الحمض النووي الريبي وما يليها 29، ويلاحظ أيضا. DHP، 2،6-diaminoheptanedioate (2،6-diaminopimelate).

الشكل (3)
يتم تغيير الكميات المتوفرة من نواتج الأيض في الأسرة اسبارتاتي في متحولة كودي: الشكل (3). التغييرات أضعاف سجل 2 من نواتج الأيض المحدد فيوترد codY- متحولة لاغيا مقارنة UAMS-1 (WT). تم تحديد التغيير بقسمة متوسط وفرة من ثلاثة مكررات البيولوجية من سلالة باطل codY- في متوسط فرة من ثلاثة مكررات البيولوجية من سلالة WT. كان الخطأ المعياري بين مكررات البيولوجية لكل المستقلب <35٪. الخطوط المتقطعة تشير إلى وجود سجل التغيير 2 1.5 أضعاف، وقطع المستخدمة في هذه التجربة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وترتبط جميع نواتج جزيء صغير لبعضها البعض من خلال أصول المشتركة في المسارات الأيضية المركزية. خلال النمو المتسارع، الخلايا البكتيرية هي في حالة مستقرة البيولوجية والتمثيل الغذائي، وتوفير لقطة من حالة فسيولوجية في ظل ظروف محددة. كودي تراقب الاكتفاء المواد الغذائية من خلال الاستجابة لILV وGTP. كما ILV وGTP انخفاض حمامات، من المرجح خفض النشاط كودي تدريجيا، وتعديل التعبير عن الجينات المستهدفة على التكيف مع زيادة استنزاف المواد الغذائية 30. يتصرف سلالة كودي التي تعاني من نقص كما لو تنضب ILV وGTP من البيئة ولكن يعرض فقط فرق خفيف جدا في السلوك النمو نسبة إلى سلالة كودي يتقن (الشكل 1). وهكذا، فإن المقارنة حمامات ثابتة للدولة من نواتج الأيض في هذه السلالات توفر لنا فرصة فريدة من نوعها للكشف عن مدى إعادة تكوين الأيض عندما المواد الغذائية شحيحة. وتجدر الإشارة إلى أن أووص التجارب التحقيق فرة الأيض عند تكبير النشاط كودي (ILV وGTP هي الأكثر وفرة في المرحلة الأسية). ومع ذلك، يمكن توجيه أسئلة أخرى في المراحل الأخرى من النمو. على سبيل المثال، في المرحلة الأسية، حمض الكربوكسيليك (TCA) النشاط دورة منخفض جدا. في مرحلة ما بعد الأسي، يتم تنشيط دورة TCA 36. وهناك عدد من الظواهر، بما في ذلك وفرة الأيض، يعتمدون على هذا التنشيط. بالإضافة إلى ذلك، يصبح النظام الاستشعار عن النصاب AGR نشط خلال فترة الانتقال من النمو المتسارع للمرحلة ثابتة 37. جمع العينات في مرحلة ما بعد الأسي أو ثابتة قد تكون أكثر أهمية للدراسات تتناول هذه المواضيع. بغض النظر عن متى يتم حصاد العينات، من المهم جمع، وغسل، ونقل العينات إلى استخراج العازلة في أسرع وقت ممكن (أي داخل الصورة) للحد من دوران الأيض الذي يحدث عند حالة مستقرة تشعر بالانزعاج.

طريقة الكروماتوغرافي الموصوفة هنا هي مناسبة خاصة لتحليل الأحماض الأمينية القطبية وغير القطبية ومركبات الأيض الكربون المركزية. ومع ذلك، أساليب فئة محددة إضافية يمكن استخدامها لتحديد مركبات معينة من الفائدة لم تحل chromatographically بهذه الطريقة. على سبيل المثال، تغيير الرقم الهيدروجيني للمرحلة الجوالة الكروماتوغرافي عن طريق استبدال حمض الفورميك مع حمض الخليك كما تم الإبلاغ عن مادة مضافة لتمكين حل آيسولوسين ويسين 38. يمكن تعديل الإجراء استخراج بالمثل تمكين الانتعاش النوعي والكمي لنواتج عطوب التي تعتبر حساسة لطريقة استخراج المستخدمة هنا. على سبيل المثال، مركبات مثل السيستين التي تكون عرضة لتشكيل ثاني كبريتيد السندات من المحتمل أن يتم استردادها بعد اشتقاق مع كاشف المان في 39. مخازن استخراج Sparging مع غاز النيتروجين يمكن الحفاظ NAD + وNADHنسب، مما يتيح لتقييم حالة الأكسدة الخلوية 40. يمكن triphosphates نيكليوزيد تتحلل في الحلول الأساسية أو غير مصقول. يمكن المحمضة الحل استخراج تحسين استرداد هذه الجزيئات 41.

في ثقافة البكتيرية تنمو باطراد، واستنفاد واحد أو أكثر من العناصر الغذائية يؤدي إلى الانتقال إلى مراحل ما بعد الأسي وثابتة من النمو. وتتميز هذه المراحل النمو من قبل الدول الأيض متميزة 42. الثقافات على أساس ناظم كيميائي-تولد البيولوجي مثالية حالة مستقرة المستمر تقريبا للتعبير الجين والدراسات الفسيولوجية. ومع ذلك، فإن الأسلوب يتطلب معدات متخصصة، يتطلب تقنية عالية، ويتطلب أن فرض قيود المواد الغذائية للحفاظ على استقرار عدد السكان من الخلايا تحت التدفق. والشرط الأخير يسبب اضطرابات النسخي والفسيولوجية بسبب عوامل أخرى غير متغير أو إعادةgulator يجري تحليلها. للتأكد من أن لدينا على أساس النتائج قارورة هي تمثيلية من خلايا تنمو باطراد في حالة مستقرة وليس من مرحلة انتقالية بين مرحلتين، ونحن توظيف استراتيجية التخفيف المزدوج مرة أخرى مع قارورة متسقة: نسبة حجم (تغييرات طفيفة في مستويات الأكسجين يمكن أن يؤدي إلى الأيض تغير 36، 42). بعد تخفيف الأولي الثقافات بين عشية وضحاها، وتزرع هذه الخلايا إلى OD 600 من ~ 1.0، مخففة-مرة أخرى إلى OD 600 من ~ 0.05، وتحصد عندما التوصل الى OD 600 من ~ 0.5. كما يخفف مثل هذا الأسلوب جزيئات هيولي التي تتراكم خلال النمو بين عشية وضحاها، بما في ذلك الرنا مستقرة. في الواقع، RNAIII، والمستجيب للنظام الاستشعار عن النصاب AGR، هي واحدة من هذا القبيل RNA وينظم التعبير عن بعض الأهداف الجينات نفس كودي 25 و 43 و 44. RNAIII المتراكمة يمكن ان تخفي كودي-إقلاعتنظيم endent، مما يؤدي إلى أقل من الواقع لقوة القمع أو التحفيز عن طريق كودي (شارما وبرينسميد، نتائج غير منشورة).

واحد الحد من هذا التحليل هو أنه يوفر لمحة فورية من وفرة الأيض داخل الخلية. لا الاستنتاجات التي يمكن استخلاصها من نتائج بشأن التغيرات في تدفق من خلال أي مسار معين. على سبيل المثال، وفرة من ليسين وميثيونين بين اثنين من سلالات فحص لم يتغير، رغم اجتثاث القمع من الانزيمات السكروز في سلالة باطل codY- (الشكلان 2 و 3). سلالة -null كودي قد يكون في الواقع توليد المزيد يسين وميثيونين ولكن يمكن تحويلها بسرعة إلى مركبات أخرى. وبالتالي، فإن هذه الجزيئات لا تتراكم. أن مصادر الكربون أو النيتروجين باستخدام 13 C- أو 15 N المسمى تسمح لنا لمتابعة الكربون والنيتروجين الهياكل العظمية من خلال التقاطعات الرئيسية الأيضية 45 <سوب>، 46.

وقد استخدمنا الطريقة الموصوفة لتوضيح التغييرات في برك الأيض في S. المذهبة، B. الرقيقة 29، المتفطرة السلية 47، والتكور المعوي 48، ولكن يمكن تطبيق طريقة للبكتيريا إيجابية الغرام وسلبية الغرام أخرى، بما في ذلك البعض مسببات الأمراض البشرية المزروعة بسهولة في المختبر. في الواقع، ودمج المعلومات metabolomic وtranscriptomic يمكن أن تكشف عن اتصالات غير متوقعة بين التمثيل الغذائي والفوعة، مما قد يؤدي إلى استراتيجيات جديدة لعلاج الالتهابات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من ممر NIH لجائزة الاستقلال (منح GM 099893) وصناديق بدء التشغيل أعضاء هيئة التدريس لSRB، فضلا عن مشروع بحث غرانت (منح GM 042219). وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتفسيرها، أو قرار لتقديم عمل للنشر.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material/Equipmenta
DeLong Culture Flask (250 mL) Belco 2510-00250
Sidearm Flask, 500 mL Pyrex 5340
3-hole Rubber Stopper, #7 Fisher 14-131E
Stainless Steel Filter holder/frit VWR 89428-936
Petri Dish, 35 mm Corning 430588 Not tissue culture treated
Mixed cellulose ester membrane, 0.22 μm pore size Millipore GSWP02500
Impact-resistant tubes, 2 mL USA Scientific 1420-9600
Silica Beads, 0.1 mm Biospec Products Inc 11079101Z
Precellys 24 homogenizer Bertin Instruments EQ03119-200-RD000.0
Micro BCA Protein Assay Kit Pierce (Thermo Scientific) 23235
Cogent Diamond hydride type C column Agilent 70000-15P-2
Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series Agilent G6230B
Quat Pump, 1290 Series Agilent G4204A 
Bin Pump, 1290 Series Agilent G4220A 
Valve Drive, 1290 Series Agilent G1107A 
Isocratic Pump, 1290 Series Agilent G1310B 
TCC, 1290 Series Agilent G1316C 
Sampler, 1290 Series Agilent G4226A 
Thermostat, 1290 Series Agilent G1330B 
Chemical
Tryptic Soy Broth Becton Dickinson 211825
Difco Agar, Granulated Becton Dickinson 214530 Solid media contains 1.5% [w/v] agar
Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10x Ambion AM9624 Dilute fresh to 1x with ultra-pure water
Acetonitrile Fisher Scientific A955-500 Optima LC-MS
Methanol Fisher Scientific A456-500 Optima LC-MS; toxic
Formic Acid Sigma Aldrich 94318 For mass spectrometry, 98%
Software
MassHunter Agilent G3337AA
Bacterial Strain Species Strain Genotype
SRB 337 Staphylococcus aureus USA200 MSSA UAMS-1 wild type
SRB 372 Staphylococcus aureus USA200 MSSA UAMS-1 ΔcodY::erm
aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nat. Rev. Microbiol. 10 (8), 525-537 (2012).
  2. Weinberg, E. D. Clinical enhancement of nutritional immunity. Comp. Ther. 1 (5), 38-40 (1975).
  3. Ibberson, C. B., et al. Staphylococcus aureus hyaluronidase is a CodY-regulated virulence factor. Infect. Immun. 82 (10), 4253-4264 (2014).
  4. Lee, C. Y., Iandolo, J. J. Mechanism of bacteriophage conversion of lipase activity in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 164 (1), 288-293 (1985).
  5. Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infect. Immun. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  6. Somerville, G. A., Proctor, R. A. At the crossroads of bacterial metabolism and virulence factor synthesis in Staphylococci. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 73 (2), 233-248 (2009).
  7. Seidl, K., et al. Staphylococcus aureus CcpA affects virulence determinant production and antibiotic resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 50 (4), 1183-1194 (2006).
  8. Richardson, A. R., Somerville, G. A., Sonenshein, A. L. Regulating the intersection of metabolism and pathogenesis in Gram-positive bacteria. Microbiol. Spectr. 3 (3), 1-27 (2015).
  9. Geiger, T., et al. Role of the (p)ppGpp synthase RSH, a RelA/SpoT homolog, in stringent response and virulence of Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 78 (5), 1873-1883 (2010).
  10. Gaupp, R., et al. RpiRc is a pleiotropic effector of virulence determinant synthesis and attenuates pathogenicity in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 84 (7), 2031-2041 (2016).
  11. Serror, P., Sonenshein, A. L. Interaction of CodY, a novel Bacillus subtilis DNA-binding protein, with the dpp promoter region. Mol. Microbiol. 20 (4), 843-852 (1996).
  12. Sonenshein, A. L. CodY, a global regulator of stationary phase and virulence in Gram-positive bacteria. Curr. Opin. Microbiol. 8 (2), 203-207 (2005).
  13. Brinsmade, S. R. CodY, a master integrator of metabolism and virulence in Gram-positive bacteria. Curr. Genet. , [Epub ahead of print] (2016).
  14. Molle, V., et al. Additional targets of the Bacillus subtilis global regulator CodY identified by chromatin immunoprecipitation and genome-wide transcript analysis. J. Bacteriol. 185 (6), 1911-1922 (2003).
  15. Moses, S., et al. Proline utilization by Bacillus subtilis: Uptake and catabolism. J. Bacteriol. 194 (4), 745-758 (2012).
  16. Lobel, L., Herskovits, A. A. Systems level analyses reveal multiple regulatory activities of CodY controlling metabolism, motility, and virulence in Listeria monocytogenes. PLoS Genet. 12 (2), 1-27 (2016).
  17. Belitsky, B. R., Sonenshein, A. L. CodY-mediated regulation of guanosine uptake in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 193 (22), 6276-6287 (2011).
  18. den Hengst, C. D., Buist, G., Nauta, A., Van Sinderen, D., Kuipers, O. P., Kok, J. Probing direct interactions between CodY and the oppD promoter of Lactococcus lactis. Microbiol. 187 (2), 512-521 (2005).
  19. Fisher, S. H. Regulation of nitrogen metabolism in Bacillus subtilis: vive la différence. Mol. Microbiol. 32 (2), 223-232 (1999).
  20. Dineen, S. S., McBride, S. M., Sonenshein, A. L. Integration of metabolism and virulence by Clostridium difficile CodY. J. Bacteriol. 192 (20), 5350-5362 (2010).
  21. Dineen, S. S., Villapakkam, A. C., Nordman, J. T., Sonenshein, A. L. Repression of Clostridium difficile toxin gene expression by CodY. Mol. Microbiol. 66 (1), 206-219 (2007).
  22. Hendriksen, W. T., et al. CodY of Streptococcus pneumoniae: Link between nutritional gene regulation and colonization. J. Bacteriol. 190 (2), 590-601 (2008).
  23. Bennett, H. J., et al. Characterization of relA and codY mutants of Listeria monocytogenes: Identification of the CodY regulon and its role in virulence. Mol. Microbiol. 63 (5), 1453-1467 (2007).
  24. Stenz, L., Francois, P., Whiteson, K., Wolz, C., Linder, P., Schrenzel, J. The CodY pleiotropic repressor controls virulence in Gram-positive pathogens. FEMS Immunol. and Med. Microbiol. 62 (2), 123-139 (2011).
  25. Majerczyk, C. D., et al. Direct targets of CodY in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 192 (11), 2861-2877 (2010).
  26. Majerczyk, C. D., Sadykov, M. R., Luong, T. T., Lee, C., Somerville, G. A., Sonenshein, A. L. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. J. Bacteriol. 190 (7), 2257-2265 (2008).
  27. Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: A regulatory link between metabolism and virulence gene expression. J. Bacteriol. 191 (9), 2953-2963 (2009).
  28. Sonenshein, A. L. Control of key metabolic intersections in Bacillus subtilis. Nat. Rev. Microbiol. 5 (12), 917-927 (2007).
  29. Brinsmade, S. R., et al. Hierarchical expression of genes controlled by the Bacillus subtilis global regulatory protein CodY. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 111 (22), 2-7 (2014).
  30. Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Mol. Microbiol. 101 (3), 495-514 (2016).
  31. Zhou, B., Xiao, J. F., Tuli, L., Ressom, H. W. LC-MS-based metabolomics. Mol. Biosyst. 8 (2), 470-481 (2012).
  32. Somerville, G. A., et al. Staphylococcus aureus aconitase inactivation unexpectedly inhibits post-exponential-phase growth and enhances stationary-phase survival. Infect. Immun. 70 (11), 6373-6382 (2002).
  33. Somerville, G. A., Said-Salim, B., Wickman, J. M., Raffel, S. J., Kreiswirth, B. N., Musser, J. M. Correlation of acetate catabolism and growth yield in Staphylococcus aureus: Implications for host-pathogen interactions. Infect. Immun. 71 (8), 4724-4732 (2003).
  34. Brinsmade, S. R., Kleijn, R. J., Sauer, U., Sonenshein, A. L. Regulation of CodY activity through modulation of intracellular branched-chain amino acid pools. J. Bacteriol. 192 (24), 6357-6368 (2010).
  35. Kaiser, J. C., Omer, S., Sheldon, J. R., Welch, I., Heinrichs, D. E. Role of BrnQ1 and BrnQ2 in branched-chain amino acid transport and virulence in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 83 (3), 1019-1029 (2015).
  36. Ledala, N., Zhang, B., Seravalli, J., Powers, R., Somerville, G. A. Influence of iron and aeration on Staphylococcus aureus growth, metabolism, and transcription. J. Bacteriol. 196 (12), 2178-2189 (2014).
  37. Novick, R. P. Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence. Mol. Micorbiol. 48 (6), 1429-1449 (2003).
  38. Pesek, J. J., Matyska, M. T., Fischer, S. M., Sana, T. R. Analysis of hydrophilic metabolites by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry using a silica hydride-based stationary phase. J. Chromatog. A. 1204 (1), 48-55 (2008).
  39. Guan, X., Hoffman, B., Dwivedi, C., Matthees, D. P. A simultaneous liquid chromatography/mass spectrometric assay of glutathione, cysteine, homocysteine and their disulfides in biological samples. J. Pharm. Biomed. Anal. 31 (2), 251-261 (2003).
  40. Sporty, J. L., Kabir, M. M., Turteltaub, K. W., Ognibene, T., Lin, S. J., Bench, G. Single sample extraction protocol for the quantification of NAD and NADH redox states in Saccharomyces cerevisiae. J. Sep. Sci. 31 (18), 3202-3211 (2008).
  41. Rabinowitz, J. D., Kimball, E. Acidic acetonitrile for cellular metabolome extraction from Escherichia coli. Anal. Chem. 79 (16), 6167-6173 (2007).
  42. Somerville, G. A., Powers, R. Growth and preparation of Staphylococcus epidermidis for NMR metabolomic analysis. Methods Mol. Biol. 1106, 71-91 (2014).
  43. Roux, A., Todd, D. A., Velazquez, J. V., Cech, N. B., Sonenshein, A. L. CodY-Mediated regulation of the Staphylococcus aureus Agr system integrates nutritional and population density signals. J. Bacteriol. 196 (6), 1184-1196 (2014).
  44. Guillet, J., Hallier, M., Felden, B. Emerging functions for the Staphylococcus aureus RNome. PLoS Pathog. 9 (12), 1003767 (2013).
  45. Sauer, U., et al. Metabolic flux ratio analysis of genetic and environmental modulations of Escherichia coli central carbon metabolism. J. Bacteriol. 181 (21), 6679-6688 (1999).
  46. Niittylae, T., Chaudhuri, B., Sauer, U., Frommer, W. B. Comparison of Quantitative Metabolite Imaging Tools and Carbon-13 Techniques for Fluxomics. Methods Mol. Biol. 553 (1), 355-372 (2009).
  47. de Carvalho, L. P. S., Fischer, S. M., Marrero, J., Nathan, C., Ehrt, S., Rhee, K. Y. Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates. Chem. Biol. 17 (10), 1122-1131 (2010).
  48. Weisenberg, S. A., Butterfield, T. R., Fischer, S. M., Rhee, K. Y. Suitability of silica hydride stationary phase, aqueous normal phase chromatography for untargeted metabolomic profiling of Enterococcus faecium and Staphylococcus aureus. J. Sep. Sci. 32 (13), 2262-2265 (2009).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 121، علم الأحياء الدقيقة، علم وظائف الأعضاء البكتيرية، والايض،
النهج القائم على الطيف، جنبا إلى جنب السائل اللوني الكتلة لتحليل المستقلب من<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Samuels, D. J., Wang, Z., Rhee, K.… More

Samuels, D. J., Wang, Z., Rhee, K. Y., Brinsmade, S. R. A Tandem Liquid Chromatography–Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (121), e55558, doi:10.3791/55558 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter