Summary
Hier beschrijven we een protocol voor extractie van metabolieten van Staphylococcus aureus en de daaropvolgende analyse via vloeistofchromatografie en massaspectrometrie.
Abstract
In een poging om bacteriële pathogenen te dwarsbomen, hosts beperken vaak de beschikbaarheid van voedingsstoffen op de plaats van infectie. Deze beperking kan de abundanties van de belangrijkste metabolieten waaraan regulerende factoren te reageren, het aanpassen van cellulaire metabolisme te veranderen. In de afgelopen jaren is een aantal eiwitten en RNA zijn gekomen als belangrijke regulatoren van genexpressie virulentie. Bijvoorbeeld, de CodY eiwit reageert hoeveelheden vertakte aminozuren en GTP en wordt veel geconserveerd bij lage G + C Grampositieve bacteriën. Als globale regulator in Staphylococcus aureus, CodY de expressie van tientallen virulentie en metabole genen. Onze hypothese is dat S. aureus gebruikt CodY, voor een deel, aan de metabole toestand te veranderen in een poging aan te passen aan voedingsstoffen randvoorwaarden potentieel aangetroffen in de nieuwe omgeving. Dit manuscript beschrijft een werkwijze voor de extractie en analyse van metabolieten van S. aureus met behulp van vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrietrometry, een protocol dat is ontwikkeld om deze hypothese te testen. De werkwijze wijst ook beste praktijken die zorgt voor nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid, zoals het behoud van biologische stabiele en voortdurende beluchting zonder het gebruik van continue chemostaatcultures. Ten opzichte van de USA200 methicilline-gevoelige S. aureus isolaat UAMS-1 uitgangsstam, de isogene mutant Cody vertoonden significante verhogingen van aminozuren afgeleid van aspartaat (bijvoorbeeld threonine en isoleucine) en afnamen in hun precursors (bijvoorbeeld aspartaat en O -acetylhomoserine ). Deze resultaten correleren goed met transcriptionele gegevens verkregen met RNA-seq analyse: genen in deze trajecten werden opgereguleerd tussen 10- en 800-voudig in Cody null-mutant. Koppeling globale analyse van de transcriptoom en het metaboloom kan onthullen hoe bacteriën veranderen hun metabolisme wanneer zij worden geconfronteerd met het milieu of nutritionele stress, het verstrekken van potentiële inzicht in de physiological veranderingen in verband met een tekort aan nutriënten ervaren tijdens infectie. Dergelijke ontdekkingen de weg voor de ontwikkeling van nieuwe anti-infectieuze middelen en therapeutische middelen vrijmaken.
Introduction
Bacteriële pathogenen te kampen met vele uitdagingen in de nieuwe omgeving. Naast directe aantasting door immuuncellen, de gastheer sekwestreert ook voedingsstoffen die essentieel zijn voor bacteriële overleving en replicatie, genereren nutritionele immuniteit 1, 2. Om deze vijandige omgeving te overleven, bacteriële ziekteverwekkers implementeren virulentiefactoren. Sommige van deze factoren kan de bacterie om de immuunrespons te ontwijken; Andere factoren zijn uitgescheiden spijsverteringsenzymen, zoals hyaluronidase, thermonuclease en lipase, waarbij de bacteriën in staat kan stellen ontbrekende voedingsstoffen aan te vullen door de consumptie van weefsel afgeleide bestanddelen 3, 4, 5. Sterker nog, bacteriën regulerende systemen die de fysiologische toestand van de cel te binden aan de productie van virulentiefactoren 6, 7 geëvolueerd,
Een groeiende hoeveelheid bewijs wijst op CodY als kritische regulator koppelen metabolisme en virulentie. Hoewel in Bacillus subtilis eerst ontdekt als een repressor van het dipeptide permease (dpp) -gen 11, is CodY nu bekend dat door vrijwel alle lage G + C Gram-positieve bacteriën 12, 13 en regelt tientallen genen betrokken bij koolstof en stikstofmetabolisme 14, 15, 16, 17, 18, 19. In pathogene species, CodY bestuurt ook de expressie van een aantal van de belangrijkste virulentiegenen 20, 21,. ef '> 22, 23, 24, 25, 26, 27 CodY wordt geactiveerd als een DNA-bindend eiwit door twee klassen van liganden: vertakte aminozuren (BCAA, isoleucine, leucine en valine [ILV]) en GTP . Wanneer deze voedingsmiddelen zijn overvloedig, CodY onderdrukt (of in sommige gevallen, stimuleert) transcriptie. Al deze voedingsstoffen beperkter is CodY activiteit geleidelijk verminderd, waardoor een gegradeerde transcriptionele respons die omleidt precursoren via verschillende metabolische wegen verbonden centraal metabolisme 28, 29, 30.
Tandem vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (LC-MS) is een techniek die nauwkeurig kan identificeren en kwantificeren van kleine moleculen intracellulaire metabolieten 31. In combinatie met Transcriptome analyse (bijvoorbeeld RNA-Seq) Dit analytisch workflow inzicht in de fysiologische veranderingen die optreden in reactie op milieu- of nutritionele stress. Hier presenteren we een methode voor het metaboliet extractie uit Staphylococcus aureus cellen en daaropvolgende analyse door LC-MS. Deze benadering is gebruikt om de pleiotrope effecten van CodY op S. aureus fysiologie aan te tonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van de Buffer Solutions
- Bereid fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) door verdunning van een voorraadoplossing van 10x PBS tot een eindconcentratie van 1 x met ultrazuiver (gedestilleerd en gedeïoniseerd) water.
- Bereid quenching oplossing combineert 2 ml acetonitril, 2 ml methanol, 1 ml ultrazuiver H2O en 19 pl (0,1 mM eindconcentratie) mierenzuur.
- Bereid LC-MS oplosmiddel A door toevoeging van mierezuur (0,2% [v / v] eindconcentratie) met ultrazuiver water.
- Bereid LC-MS oplosmiddel B door toevoeging van mierezuur (0,2% [v / v] eindconcentratie) acetonitril.
LET OP: Alle oplossingen moeten worden bereid met behulp van de hoogste zuiverheidsgraad reagentia beschikbaar (in het algemeen high-performance vloeistofchromatografie graad). Oplossingen moeten vers voor elk experiment worden voorbereid en opgeslagen op ijs voorafgaand aan het gebruik.
2. Vaststelling van Steady-state S. aureus Growth
- Streak S. aureus stammen van belang zijn voor isolatie op tryptische soja-agar (TSA) uit een bevroren glycerol voorraad. Incubeer bij 37 ° C gedurende 16-24 uur.
- Beënten van 4 ml tryptische soja bouillon (TSB) of een ander geschikt medium in steriele glazen incubatiebuizen met enkele kolonies van elke stam. Incubeer schuin (70 ° hoek ~) met rotatie bij 60 omwentelingen per minuut (rpm) bij 37 ° C gedurende 16-20 uur.
OPMERKING: Overnacht kweken zijn gevoelig voor zuurstof verlopen bij gebruik van standaard werkwijzen, waaronder de in stap 2.2 beschreven, waarbij de cellulaire fysiologie beïnvloeden. Derhalve maken we een meerdere back-verdunning strategie biologische steady state verzekeren (zie stap 2,4-3,2, hieronder). - Met een spectrofotometer om de optische dichtheid van de kweken te meten van stap 2,2 bij 600 nm (OD 600). Gebruik steriel medium als een optische referentie (leeg). Deze cellen verdund tot een OD 600 van 0,05 in 50 ml steriele TSB-medium (voorverwarmd tot 37 ° C) in afzonderlijke 250 mL DeLong flessen.
- Incuverminder de kweken bij 37 ° C in een waterbad onder schudden bij 280 rpm.
- Elke 30 minuten, neem OD600 metingen; Als optische dichtheden toenemen, kan het nodig zijn de kweken verdunnen met TSB zodat ze binnen het lineaire bereik van de absorptie spectrofotometer blijven.
- Bij culturen uit stap 2.5 komen tot een OD600 van 0,8-1,0 ~, subcultuur ze in 50 ml 37 ° C TSB tot een OD 600 van 0,01-0,05 en herhaal de stappen 2.4 en 2.5.
3. Sample Collection Setup
- Bereid een bed van gemalen droog ijs in een geschikt vat (bijvoorbeeld glazen schaal, ijsemmer of koeler).
- Wanneer de optische dichtheid van de kweken naderen het gewenste punt oogst, voeg 1 ml blussen oplossing tot een 35 mm petrischaal onbehandeld en pre-koel op droogijs ≥5 min.
OPMERKING: De "gewenste oogst point" zal variëren afhankelijk van experimentele doelen. Bijvoorbeeld, als men m onderzoekenetabolites tijdens aërobe groei kengetallen van deze toestand omvatten acetaat excretie en opnieuw assimilatie van het acetaat tijdens de post-exponentiële groeifase 32, 33. In het algemeen dient dit punt binnen een bepaald groeistadium (bijvoorbeeld exponentiële fase). De specifieke OD600 waarden die met deze fase kan variëren tussen verschillende bacteriestammen en groeimedia. - Plaats een roestvrij stalen filter frit (voorgekoeld tot -20 ° C) in een rubberstop en plaats deze bovenop een vacuum kolf bevestigd aan een vacuümbron of vacuümpomp.
- Breng het vacuüm en plaats een gemengde cellulose-ester membraan (0,22 urn poriegrootte) geplaatst.
Opmerking: Het is cruciaal om een filter te gebruiken met een diameter gelijk aan die van de frit en goed Deze filter zodat het monster wordt getrokken door het filter in plaats van over de rand. Bevochtigen van het membraan met ijskoud, steriel H2O kan helpenmet het positioneren van het membraan.
4. De steekproef Harvest
- Bij een OD600 van 0,4-0,5 ~ Gebruik een serologische pipet 13 ml kweek uit de kolf te verwijderen en het monster op het filter.
- Nadat het gehele monster werd gefilterd, spoel de filter met ≥5 ml ijskoude PBS tot middelgrote geassocieerde metabolieten wegspoelen.
- Neem de vacuümslang en gebruik een paar steriele pincet om het filter uit de frit verwijderd. Keren de filter (cel naar beneden) in de voorgekoeld afschrikoplossing.
Opmerking: Het is belangrijk om de bovengenoemde stappen snel uit te voeren (dat wil zeggen binnen enkele seconden) en zodra de vloeistof is verwijderd om de snelle afkoeling van de cellen te waarborgen het stoppen metabolische activiteit. - Incubeer de filter in uitwasoplossing op droog ijs gedurende ≥20 min.
- Met steriele pincet Draai het filter (cel naar boven) in de petrischaal en gebruik een micropipet om de cellen af te spoelen aan Thij membraan in de demping oplossing.
- Geresuspendeerd de cellen in uitwasoplossing en breng de celsuspensie in een steriele 2 mL slagvaste buis met -100 pl 0,1 mm silicapareltjes. Bewaar deze op droog ijs of bij -80 ° C.
5. Extractie Afbraakproduct
- Dooi samples op nat ijs en verstoren de cellen in een homogenisator met vier 30 s uitbarstingen op 6000 rpm, 2 min koelperioden op droogijs tussen cycli.
- Verduidelijking van de lysaten gedurende 15 minuten in een vooraf gekoelde, gekoelde microcentrifuge bij topsnelheid (dwz 18.213 xg bij ≤4 ° C).
- Breng het supernatant in een schone microcentrifugebuis.
- Met behulp van een micropipet, dragen een klein gedeelte van het monster naar een microcentrifugebuis voor de kwantificering van residuele peptidegehalte in stap 6; Bewaar de rest bij -80 ° C.
Opmerking: Het volume van gereserveerde monster varieert, afhankelijk van de BCA assay gebruikt in stap 6.1. Dezemonster moet worden opgeslagen op nat ijs voor onmiddellijke analyse of ingevroren bij -80 ° C.
6. bicinchoninezuur (BCA) assay
- Voer een BCA assay zoals aanbevolen door de fabrikant kit hand monsters uit stap 5.4 om de resterende peptideconcentratie voor elk monster te bepalen.
7. LC-MS
- Meng 75 pl S. aureus extract met 75 pi van LC-MS solvent B, bereid in stap 1.4.
- Vortex te mengen en centrifugeren bij 13.000 xg gedurende 5 minuten.
- Plaats 100 pi supernatans in een vloeistof chromatografie (LC) flesje en sluit het. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen gevangen zitten in het monster.
- Laad de LC flesjes op de LC-MS autosampler en de running te bewerken in de software "Offline Worklist Editor."
- Vul de "Sample Name" (bijvoorbeeld wildtype-1), "Sample Position" (bijvoorbeeld P1-A1), "Method" (bijvoorbeeld A Mierenzuurcid-Negative Method) en "Data File" (bijvoorbeeld wild-type-1) kolommen. Klik op de knop "Save werkvoorraad" knop. Open de "Mass Spectrometry Data Acquisition Workstation" software en voer de eerder opgeslagen werklijst. Klik op de "Start Worklist Run" knop om de continue LC-MS meting te starten.
- Scheid de monsters op een kolom, de kolom te koppelen aan een time of flight (TOF) spectrometer, en koppelen van de TOF spectrometer met het LC-systeem. Met een mobiele fase gradiënt als volgt: 0-2 min, 85% oplosmiddel B; 3-5 min, 80% oplosmiddel B; 6-7 min, 75% oplosmiddel B; 8-9 min, 70% oplosmiddel B; 10-11,1 min, 50% oplosmiddel B; 11,1-14 min, 20% oplosmiddel B; en 14,1-24 min, 5% oplosmiddel B; eindigen met een 10 min re-equilibratie periode bij 85% oplosmiddel B en een stroomsnelheid van 0,4 ml min-1.
- Onder toepassing van een isocratische pomp trekken een referentiemassa oplossing met de run om gelijktijdige mass as kalibratie.
LET OP: Deze stapis gebaseerd op de standaard TOF spectrometer handleiding.- Gebruik het mengsel van azijnzuur D4 en hexakis (1H, 1H, 3H--tetrafluorpropoxy) fosfazine de referentiemassa oplossing voor de real-time kalibreren. Met de isocratische pomp met debiet van 2,5 ml min-1 gedurende de infusie.
8. Batch Correctie van Ion Counts
- Wijzen een monster dienen als referentiemonster voor batch corrigeren (bijvoorbeeld wildtype, repliceren 1).
- Bereken de som van de ion telt voor alle metabolieten binnen de referentie-monster. Herhaal deze berekening voor alle monsters.
- Verdeel het totaal aantal ionen van elk monster door de ionen van het referentiemonster om een verhouding te genereren.
- Verdeel het ion telling voor elke metaboliet in een monster door het monster / referentieaandeel een batch-gecorrigeerde ion telling voor elke metaboliet te verkrijgen.
9. Peptide Normalisatie
- Divide de batch-gecorrigeerde ion telwaarden voor elke verkregen in stap 8 door de peptideconcentratie bepaald met BCA assay stap 6 om een genormaliseerde waarde verkregen voor elk monster metaboliet.
OPMERKING: De genormaliseerde, batch-batch ion gecorrigeerde tellingen per metaboliet, verkregen in stap 9.1 kan direct worden vergeleken tussen stammen en onderworpen aan statistische analyse (bijvoorbeeld een Mann-Whitney U test). Als alternatief, een metaboliet waarvan bekend is onveranderd, hetzij door de behandeling of genetische achtergrond kan worden gebruikt als een normalizer om veranderingen als gevolg van ontleding metaboliet detecteren. De toevoeging van een bekende hoeveelheid L-norvaline of gluraric zuur in de extractiebuffer kan worden gebruikt voor het corrigeren voor het verlies tijdens monster verwerking 34.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We hebben intracellulaire metaboliet zwembaden in S. aureus geanalyseerd tijdens de in vitro groei in een rijke, complexe medium. Als bewijs van het principe, vergeleken we metabolietprofielen tussen de methicilline-gevoelige S. aureus osteomyelitis isoleren UAMS-1 (wildtype [WT]) en een isogene stam zonder de globale transcriptionele regulator CodY (Δ Cody) 26. Steady-state, exponentiële kweken van de WT en Cody stammen werden in TSB medium, zoals beschreven in stap 2 van het protocol. Het groeigedrag van de wild-type en mutant-null Cody culturen waren vergelijkbaar, ook bij geringe verschillen in groei opbrengst en snelheid (figuur 1). Gebruikmakend van RNA-Seq en microarray technologie wij en anderen aangetoond dat meerdere genen coderen voor enzymen betrokken bij de biosynthese van aminozuren afgeleid van aspartaat werden de-onderdrukt in Cody-null-mutant compared WT-cellen tijdens de in vitro groei van TSB (figuur 2) 25, 27, 30. Bovendien brnQ1 en brnQ2, die voor vertakte keten aminozuur permeasen, tot overexpressie worden gebracht in de codY- null-mutant 30, 35.
De mate waarin steady-state intracellulaire abundantie van metabolieten waaraan deze route worden gewijzigd in de nul mutant, voerden we LC-MS-gebaseerde metaboliet profilering bepalen. WT en codY- nul mutante cellen werden gekweekt tot biologisch stabiele en werden bemonsterd zoals beschreven in stap 4 van het protocol. We bepaald metaboliet abundances door het integreren van het piekoppervlak ion intensiteit voor elk chromatografisch opgelost metaboliet met behulp van een analytische softwarepakket (zie Materials List). We gecorrigeerd voor diffwijzingen in biomassa normaliseren metaboliet abundances om de resterende peptideconcentratie van elk monster. Verder hebben we deze waarden voor mogelijke batch effecten tussen monsters gecorrigeerd door berekening van het gemiddelde aantal ionen voor metabolieten in elk monster en met het wildtype monster als referentiewaarde. Door deze werkwijze heeft inter-sample vergelijkingen van metaboliet dichtheden over omstandigheden. Inter-metaboliet vergelijkingen binnen een gegeven monster kan op soortgelijke wijze worden bereikt door eerst genormaliseerd metaboliet dichtheden van ionen tellingen hoeveelheden volgens de methode van standaard additie molair.
We hebben de niveaus van belangrijke tussenproducten in de aspartaatroute in UAMS-1 en zijn codY- null mutant vergeleken. Zoals blijkt uit figuur 3, de eindproducten van de route (bijvoorbeeld threonine en (iso) -leucine) zijn overvloedig in Cody-null-mutant cellen, terwijl precursors (bijvoorbeeldaspartaat en o-acetyl homoserine) zijn overvloedig in WT cellen. De gecombineerde opregulatie van BrnQ permeasen 36 en ILV biosyntheseroute waarschijnlijk leidt tot een verhoogde isoleucine en leucine 30. Hoewel de verschillen zijn betrekkelijk klein (<4-voudig), LC-MS-gebaseerde kwantificering en batch correctie onthullen robuust en statistisch significante veranderingen die consistent zijn met transcriptionele veranderingen gemedieerd door CodY zijn.
Figuur 1: Groeigedrag S. aureus UAMS-1 en een isogene Cody-null-mutant in TSB. Om de tijd te verlengen de cellen doorgebracht in steady-state exponentiële groei, kweken werden teruggeëxtraheerd verdund tot een optische dichtheid van 0,05 in vers medium na de pre-cultuur een OD 600 van ~ 1 bereikt. Monsters voor LC-MS metabolietanalyse verzameldexperimentele kweken bij een optische dichtheid van -0,5 (pijlen). De getoonde gegevens zijn representatief voor drie biologische repliceert.
Figuur 2: Schematische voorstelling van geselecteerde metabolieten afgeleid van aspartaat. Genen en operons waarvan katalyseren van de synthese van aspartaat-familie aminozuren zijn cursief weergegeven; de toename transcript overvloed in Cody-null-mutant vergeleken met wildtype, zoals bepaald met RNA-seq analyse 29 wordt ook opgemerkt. DHP, 2,6-diaminoheptanedioate (2,6-diaminopimelate).
Figuur 3: dichtheden van metabolieten in de aspartaatfamilie worden veranderd in een mutant Cody. Het log 2-voudige veranderingen van geselecteerde metabolieten in decodY- null-mutant vergeleken met UAMS-1 (WT) getoond. De verandering werd bepaald door het gemiddelde abundantie van biologische drie replicaten van de codY- null-stam door het gemiddelde abundantie van biologische drie replicaten van de WT stam. De standaardafwijking tussen biologische replica voor elke metaboliet was <35%. De stippellijnen geven een log2-1,5-voudige verandering, de cutoff gebruikt in dit experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alle kleine moleculen metabolieten zijn met elkaar verbonden via hun gemeenschappelijke oorsprong in centrale metabole routes. Tijdens exponentiële groei, bacteriële cellen in biologische en metabolische steady state, die een momentopname van de fysiologische toestand onder specifieke omstandigheden. CodY controleert voedingsstoffen voldoende door te reageren op ILV en GTP. Als ILV en GTP zwembaden druppel wordt CodY verricht waardoor geleidelijk verlaagd, het aanpassen van de expressie van de doelwitgenen te passen aan toenemende tekort aan nutriënten 30. Een CodY-deficiënte stam gedraagt alsof ILV en GTP zijn uitgeput uit het milieu maar vertoont een zeer milde verschil in groeigedrag opzichte van de CodY-bekwame stam (Figuur 1). Zo is de vergelijking van de steady-state pools van metabolieten in deze stammen biedt ons een unieke kans om de mate waarin de stofwisseling wordt geconfigureerd als voedingsstoffen zijn schaars onthullen. Opgemerkt dient te worden dat our experimenten onderzoeken metaboliet abundanties wanneer CodY Activiteit gemaximaliseerd (ILV en GTP komen het meest voor in de exponentiële fase). Er kunnen echter andere vragen in andere fasen van de groei worden aangepakt. Bijvoorbeeld, in exponentiële fase tricarbonzuur (TCA) cyclus activiteit is zeer laag; in post-exponentiële fase wordt de TCA cyclus 36 geactiveerd. Een aantal fenotypen, waaronder metaboliet abundanties, zijn afhankelijk van deze activering. Bovendien, de agr quorum sensing systeem actief tijdens de overgang van exponentiële groei stationaire fase 37. Van monsters in post-exponentiële of stationaire fase kan relevanter studies over deze onderwerpen zijn. Ongeacht wanneer de monsters geoogst, is het van belang te verzamelen, te wassen, en de monsters dragen aan de extractiebuffer zo snel mogelijk (dat wil zeggen, binnen s) aan de metaboliet omzet die optreedt minimaliseren steady state is verstoord.
De chromatografische hier beschreven methode is bijzonder geschikt voor de analyse van polaire en niet-polaire aminozuren en centrale koolstof metabolisme verbindingen. Echter, andere methoden klasse-specifiek worden gebruikt om specifieke verbindingen van belang niet chromatografisch opgelost door deze methode te kwantificeren. Bijvoorbeeld het veranderen van de pH van het HPLC mobiele fase door het vervangen van mierenzuur met azijnzuur als additief is gerapporteerd dat de oplossing van isoleucine en leucine 38 mogelijk. Modificeren van de extractieprocedure kan op soortgelijke wijze maken de terugwinning en kwantificering van labiele metabolieten die gevoelig zijn voor de extractiewerkwijze worden daarbij. Bijvoorbeeld kunnen verbindingen zoals cysteïne die gevoelig zijn voor de vorming van disulfidebinding in potentie worden teruggewonnen na derivatisering met Ellman's reagens 39. Doorborrelen extractiebuffers stikstofgas te be NAD + en NADHverhoudingen, waardoor een beoordeling van de cellulaire redox toestand 40. Nucleoside trifosfaten kunnen ontleden of ongebufferde basische oplossingen; aanzuren van de extractieoplossing kan het herstel van deze moleculen 41 te verbeteren.
In een exponentieel groeiende bacteriecultuur, de uitputting van één of meer voedingsstoffen leidt tot de overgang naar de post-exponentiële en stationaire fasen van groei. Deze groeifasen worden gekenmerkt door verschillende metabolische toestanden 42. Chemostaat gevestigde culturen genereren nagenoeg continue biologische steady state ideaal voor genexpressie en fysiologische studies. Echter, de methode vereist gespecialiseerde apparatuur, technisch veeleisend en vereist dat een nutriënt beperking opgelegd aan een stabiele populatie van cellen onder stroom te handhaven. Deze laatste eis veroorzaakt transcriptionele en fysiologische verstoringen als gevolg van het variabele her factorengulator geanalyseerd. Opdat onze kolf gebaseerde resultaten zijn representatief voor cellen die exponentieel in steady state en niet van een overgang tussen twee fasen, gebruiken we een dubbel-back verdunning strategie een consequente fles: volumeverhouding (lichte veranderingen in zuurstofniveaus kunnen leiden tot veranderd metabolisme 36, 42). Na een initiële verdunning van overnacht kweken, worden deze cellen gekweekt tot een OD600 van -1,0, back-verdund tot een OD600 van -0,05 en geoogst wanneer deze een OD600 van -0,5 bereiken. Een dergelijke werkwijze verdunt ook cytoplasmatische moleculen die accumuleren tijdens groei gedurende de nacht, waaronder stabiele RNA. Inderdaad, RNAIII de effector van het agr quorum sensing systeem, is een dergelijk RNA en de expressie van sommige van hetzelfde gen doelen als CodY 25, 43, 44. Verzameld RNAIII kan maskeren CodY-dependent regelgeving, wat leidt tot een onderschatting van de sterkte van repressie of stimulatie door CodY (Sharma en Brinsmade, niet gepubliceerde resultaten).
Een beperking van deze analyse is dat het voorziet in een onmiddellijke glimp van metaboliet dichtheden in de cel; kunnen geen conclusies worden getrokken uit de resultaten met betrekking tot veranderingen in de flux door een bepaalde route. Bijvoorbeeld, de abundanties van lysine en methionine tussen de twee onderzochte stammen niet veranderen, ondanks de repressie van biosynthetische enzymen in de codY- null-stam (figuren 2 en 3). The Cody-null-stam kan in feite het genereren van meer lysine en methionine, maar kunnen snel worden omgezet in andere verbindingen; derhalve zijn deze moleculen niet ophopen. Gebruik 13C- en 15N-gelabeld koolstof- of stikstofbronnen zou ons koolstof en stikstof skeletten volgen door bekende metabolische knooppunten 45 <sup>, 46.
We hebben de beschreven werkwijze voor veranderingen in metaboliet pools in S. aureus helderen, B. subtilis 29, 47 Mycobacterium tuberculosis, en Enterococcus faecium 48 toegepast, maar de werkwijze kan worden toegepast op andere Gram-positieve en Gram-negatieve bacteriën, met inbegrip van andere menselijke pathogenen gemakkelijk gekweekt in het laboratorium. Sterker nog, de integratie van metabolomics en transcriptomics informatie kan onverwachte verbindingen tussen de stofwisseling en de virulentie, die kunnen leiden tot nieuwe strategieën om infecties te behandelen onthullen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd deels gefinancierd door een NIH Pathway to Independence Award (verlenen GM 099.893) en de faculteit opstarten fondsen om SRB, evenals een Research Project Grant (toekennen GM 042.219). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en de interpretatie, of het besluit om het werk in te zenden voor publicatie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Equipmenta | |||
| DeLong Culture Flask (250 mL) | Belco | 2510-00250 | |
| Sidearm Flask, 500 mL | Pyrex | 5340 | |
| 3-hole Rubber Stopper, #7 | Fisher | 14-131E | |
| Stainless Steel Filter holder/frit | VWR | 89428-936 | |
| Petri Dish, 35 mm | Corning | 430588 | Not tissue culture treated |
| Mixed cellulose ester membrane, 0.22 μm pore size | Millipore | GSWP02500 | |
| Impact-resistant tubes, 2 mL | USA Scientific | 1420-9600 | |
| Silica Beads, 0.1 mm | Biospec Products Inc | 11079101Z | |
| Precellys 24 homogenizer | Bertin Instruments | EQ03119-200-RD000.0 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | Pierce (Thermo Scientific) | 23235 | |
| Cogent Diamond hydride type C column | Agilent | 70000-15P-2 | |
| Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series | Agilent | G6230B | |
| Quat Pump, 1290 Series | Agilent | G4204A | |
| Bin Pump, 1290 Series | Agilent | G4220A | |
| Valve Drive, 1290 Series | Agilent | G1107A | |
| Isocratic Pump, 1290 Series | Agilent | G1310B | |
| TCC, 1290 Series | Agilent | G1316C | |
| Sampler, 1290 Series | Agilent | G4226A | |
| Thermostat, 1290 Series | Agilent | G1330B | |
| Chemical | |||
| Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson | 211825 | |
| Difco Agar, Granulated | Becton Dickinson | 214530 | Solid media contains 1.5% [w/v] agar |
| Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10x | Ambion | AM9624 | Dilute fresh to 1x with ultra-pure water |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A955-500 | Optima LC-MS |
| Methanol | Fisher Scientific | A456-500 | Optima LC-MS; toxic |
| Formic Acid | Sigma Aldrich | 94318 | For mass spectrometry, 98% |
| Software | |||
| MassHunter | Agilent | G3337AA | |
| Bacterial Strain | Species | Strain | Genotype |
| SRB 337 | Staphylococcus aureus | USA200 MSSA UAMS-1 | wild type |
| SRB 372 | Staphylococcus aureus | USA200 MSSA UAMS-1 | ΔcodY::erm |
| aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies. | |||
References
- Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nat. Rev. Microbiol. 10 (8), 525-537 (2012).
- Weinberg, E. D. Clinical enhancement of nutritional immunity. Comp. Ther. 1 (5), 38-40 (1975).
- Ibberson, C. B., et al. Staphylococcus aureus hyaluronidase is a CodY-regulated virulence factor. Infect. Immun. 82 (10), 4253-4264 (2014).
- Lee, C. Y., Iandolo, J. J. Mechanism of bacteriophage conversion of lipase activity in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 164 (1), 288-293 (1985).
- Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infect. Immun. 81 (4), 1316-1324 (2013).
- Somerville, G. A., Proctor, R. A. At the crossroads of bacterial metabolism and virulence factor synthesis in Staphylococci. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 73 (2), 233-248 (2009).
- Seidl, K., et al. Staphylococcus aureus CcpA affects virulence determinant production and antibiotic resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 50 (4), 1183-1194 (2006).
- Richardson, A. R., Somerville, G. A., Sonenshein, A. L. Regulating the intersection of metabolism and pathogenesis in Gram-positive bacteria. Microbiol. Spectr. 3 (3), 1-27 (2015).
- Geiger, T., et al. Role of the (p)ppGpp synthase RSH, a RelA/SpoT homolog, in stringent response and virulence of Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 78 (5), 1873-1883 (2010).
- Gaupp, R., et al. RpiRc is a pleiotropic effector of virulence determinant synthesis and attenuates pathogenicity in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 84 (7), 2031-2041 (2016).
- Serror, P., Sonenshein, A. L. Interaction of CodY, a novel Bacillus subtilis DNA-binding protein, with the dpp promoter region. Mol. Microbiol. 20 (4), 843-852 (1996).
- Sonenshein, A. L. CodY, a global regulator of stationary phase and virulence in Gram-positive bacteria. Curr. Opin. Microbiol. 8 (2), 203-207 (2005).
- Brinsmade, S. R. CodY, a master integrator of metabolism and virulence in Gram-positive bacteria. Curr. Genet. , [Epub ahead of print] (2016).
- Molle, V., et al. Additional targets of the Bacillus subtilis global regulator CodY identified by chromatin immunoprecipitation and genome-wide transcript analysis. J. Bacteriol. 185 (6), 1911-1922 (2003).
- Moses, S., et al. Proline utilization by Bacillus subtilis: Uptake and catabolism. J. Bacteriol. 194 (4), 745-758 (2012).
- Lobel, L., Herskovits, A. A. Systems level analyses reveal multiple regulatory activities of CodY controlling metabolism, motility, and virulence in Listeria monocytogenes. PLoS Genet. 12 (2), 1-27 (2016).
- Belitsky, B. R., Sonenshein, A. L. CodY-mediated regulation of guanosine uptake in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 193 (22), 6276-6287 (2011).
- den Hengst, C. D., Buist, G., Nauta, A., Van Sinderen, D., Kuipers, O. P., Kok, J. Probing direct interactions between CodY and the oppD promoter of Lactococcus lactis. Microbiol. 187 (2), 512-521 (2005).
- Fisher, S. H. Regulation of nitrogen metabolism in Bacillus subtilis: vive la différence. Mol. Microbiol. 32 (2), 223-232 (1999).
- Dineen, S. S., McBride, S. M., Sonenshein, A. L. Integration of metabolism and virulence by Clostridium difficile CodY. J. Bacteriol. 192 (20), 5350-5362 (2010).
- Dineen, S. S., Villapakkam, A. C., Nordman, J. T., Sonenshein, A. L. Repression of Clostridium difficile toxin gene expression by CodY. Mol. Microbiol. 66 (1), 206-219 (2007).
- Hendriksen, W. T., et al. CodY of Streptococcus pneumoniae: Link between nutritional gene regulation and colonization. J. Bacteriol. 190 (2), 590-601 (2008).
- Bennett, H. J., et al. Characterization of relA and codY mutants of Listeria monocytogenes: Identification of the CodY regulon and its role in virulence. Mol. Microbiol. 63 (5), 1453-1467 (2007).
- Stenz, L., Francois, P., Whiteson, K., Wolz, C., Linder, P., Schrenzel, J. The CodY pleiotropic repressor controls virulence in Gram-positive pathogens. FEMS Immunol. and Med. Microbiol. 62 (2), 123-139 (2011).
- Majerczyk, C. D., et al. Direct targets of CodY in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 192 (11), 2861-2877 (2010).
- Majerczyk, C. D., Sadykov, M. R., Luong, T. T., Lee, C., Somerville, G. A., Sonenshein, A. L. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. J. Bacteriol. 190 (7), 2257-2265 (2008).
- Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: A regulatory link between metabolism and virulence gene expression. J. Bacteriol. 191 (9), 2953-2963 (2009).
- Sonenshein, A. L. Control of key metabolic intersections in Bacillus subtilis. Nat. Rev. Microbiol. 5 (12), 917-927 (2007).
- Brinsmade, S. R., et al. Hierarchical expression of genes controlled by the Bacillus subtilis global regulatory protein CodY. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 111 (22), 2-7 (2014).
- Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Mol. Microbiol. 101 (3), 495-514 (2016).
- Zhou, B., Xiao, J. F., Tuli, L., Ressom, H. W.
- Somerville, G. A., et al. Staphylococcus aureus aconitase inactivation unexpectedly inhibits post-exponential-phase growth and enhances stationary-phase survival. Infect. Immun. 70 (11), 6373-6382 (2002).
- Somerville, G. A., Said-Salim, B., Wickman, J. M., Raffel, S. J., Kreiswirth, B. N., Musser, J. M. Correlation of acetate catabolism and growth yield in Staphylococcus aureus: Implications for host-pathogen interactions. Infect. Immun. 71 (8), 4724-4732 (2003).
- Brinsmade, S. R., Kleijn, R. J., Sauer, U., Sonenshein, A. L. Regulation of CodY activity through modulation of intracellular branched-chain amino acid pools. J. Bacteriol. 192 (24), 6357-6368 (2010).
- Kaiser, J. C., Omer, S., Sheldon, J. R., Welch, I., Heinrichs, D. E. Role of BrnQ1 and BrnQ2 in branched-chain amino acid transport and virulence in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 83 (3), 1019-1029 (2015).
- Ledala, N., Zhang, B., Seravalli, J., Powers, R., Somerville, G. A. Influence of iron and aeration on Staphylococcus aureus growth, metabolism, and transcription. J. Bacteriol. 196 (12), 2178-2189 (2014).
- Novick, R. P. Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence. Mol. Micorbiol. 48 (6), 1429-1449 (2003).
- Pesek, J. J., Matyska, M. T., Fischer, S. M., Sana, T. R. Analysis of hydrophilic metabolites by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry using a silica hydride-based stationary phase. J. Chromatog. A. 1204 (1), 48-55 (2008).
- Guan, X., Hoffman, B., Dwivedi, C., Matthees, D. P. A simultaneous liquid chromatography/mass spectrometric assay of glutathione, cysteine, homocysteine and their disulfides in biological samples. J. Pharm. Biomed. Anal. 31 (2), 251-261 (2003).
- Sporty, J. L., Kabir, M. M., Turteltaub, K. W., Ognibene, T., Lin, S. J., Bench, G. Single sample extraction protocol for the quantification of NAD and NADH redox states in Saccharomyces cerevisiae. J. Sep. Sci. 31 (18), 3202-3211 (2008).
- Rabinowitz, J. D., Kimball, E. Acidic acetonitrile for cellular metabolome extraction from Escherichia coli. Anal. Chem. 79 (16), 6167-6173 (2007).
- Somerville, G. A., Powers, R. Growth and preparation of Staphylococcus epidermidis for NMR metabolomic analysis. Methods Mol. Biol. 1106, 71-91 (2014).
- Roux, A., Todd, D. A., Velazquez, J. V., Cech, N. B., Sonenshein, A. L. CodY-Mediated regulation of the Staphylococcus aureus Agr system integrates nutritional and population density signals. J. Bacteriol. 196 (6), 1184-1196 (2014).
- Guillet, J., Hallier, M., Felden, B. Emerging functions for the Staphylococcus aureus RNome. PLoS Pathog. 9 (12), 1003767 (2013).
- Sauer, U., et al. Metabolic flux ratio analysis of genetic and environmental modulations of Escherichia coli central carbon metabolism. J. Bacteriol. 181 (21), 6679-6688 (1999).
- Niittylae, T., Chaudhuri, B., Sauer, U., Frommer, W. B. Comparison of Quantitative Metabolite Imaging Tools and Carbon-13 Techniques for Fluxomics. Methods Mol. Biol. 553 (1), 355-372 (2009).
- de Carvalho, L. P. S., Fischer, S. M., Marrero, J., Nathan, C., Ehrt, S., Rhee, K. Y. Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates. Chem. Biol. 17 (10), 1122-1131 (2010).
- Weisenberg, S. A., Butterfield, T. R., Fischer, S. M., Rhee, K. Y. Suitability of silica hydride stationary phase, aqueous normal phase chromatography for untargeted metabolomic profiling of Enterococcus faecium and Staphylococcus aureus. J. Sep. Sci. 32 (13), 2262-2265 (2009).
