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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Une approche fondée Spectrométrie liquide tandem chromatographie-masse pour l'analyse des Métabolite Published: March 28, 2017 doi: 10.3791/55558
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 1
1Department of Biology, Georgetown University, 2Division of Infectious Diseases, Weill Cornell Medical College, 3Department of Medicine, Weill Cornell Medical College

Summary

Nous décrivons ici un protocole pour l'extraction des métabolites à partir de Staphylococcus aureus et leur analyse ultérieure par Chromatographie liquide et spectrométrie de masse.

Abstract

Dans un effort pour contrecarrer les bactéries pathogènes, les hôtes limitent souvent la disponibilité des nutriments sur le site de l'infection. Cette limitation peut modifier les abondances des métabolites clés qui répondent facteurs réglementaires, l'ajustement du métabolisme cellulaire. Ces dernières années, un certain nombre de protéines et d'ARN ont émergé comme des régulateurs importants de l'expression des gènes de virulence. Par exemple, la protéine CodY répond à des niveaux d'acides aminés à chaîne ramifiée et GTP et est largement conservée dans bas G + C des bactéries Gram-positives. En tant que régulateur global dans Staphylococcus aureus, CodY contrôle l'expression de douzaines de gènes de virulence et métaboliques. Nous présumons que S. aureus utilise CodY, en partie, de modifier son état métabolique dans un effort d'adaptation aux conditions de limitation de nutriments potentiellement rencontrés dans l'environnement hôte. Ce manuscrit décrit un procédé pour l' extraction et l' analyse des métabolites provenant de S. aureus en utilisant la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de massespectrométrie, un protocole qui a été développé pour tester cette hypothèse. La méthode met également en évidence les meilleures pratiques qui assureront la rigueur et la reproductibilité, comme le maintien de l'état d'équilibre biologique et l'aération constante sans l'utilisation des cultures de chémostat continue. Par rapport aux USA200 sensibles à la méthicilline de S. aureus souche parentale isoler UAMS-1, le mutant isogénique codY présentait une augmentation significative des acides aminés dérivés de l' aspartate (par exemple, threonine et isoleucine) et des diminutions de leurs précurseurs (par exemple, l' aspartate et O -acetylhomoserine ). Ces résultats sont en bonne corrélation avec les données de transcription obtenus avec l' analyse de l' ARN-seq: gènes dans ces voies ont été régulés à la hausse entre 10 et 800 fois dans le mutant nul codY. Le couplage des analyses globales du transcriptome et métabolome peut révéler comment les bactéries modifient leur métabolisme lorsqu'ils sont confrontés à un stress environnemental ou alimentaire, fournissant un aperçu potentiel dans les Physchangements siologiques associés à l'épuisement des nutriments a connu au cours de l'infection. Ces découvertes peuvent ouvrir la voie à la mise au point de nouveaux anti-infectieux et thérapeutiques.

Introduction

Les bactéries pathogènes doivent faire face à de nombreux défis dans l'environnement hôte. En plus d'attaque directe par les cellules immunitaires, l'hôte séquestrant également des nutriments essentiels pour la survie et la réplication bactérienne, générant une immunité nutritionnelle 1, 2. Pour survivre à ces environnements hostiles, les bactéries pathogènes déploient des facteurs de virulence. Certains de ces facteurs permettent aux bactéries d'échapper à la réponse immunitaire; D' autres facteurs comprennent sécrétées enzymes digestives, telles que l' hyaluronidase, thermonucléase, et la lipase, ce qui peut permettre aux bactéries de reconstituer les éléments nutritifs manquants en consommant des constituants dérivés de tissus 3, 4, 5. En effet, les bactéries ont développé des systèmes de réglementation qui lient l'état physiologique de la cellule à la production de facteurs de virulence 6, 7, up class = "xref"> 8, 9, 10.

Un nombre croissant de Justificatif CodY comme à régulateur critique reliant le métabolisme et la virulence. Bien que d' abord découvert dans Bacillus subtilis comme un répresseur du gène 11, Cody est maintenant connu perméase dipeptide (dpp) à produire par la quasi - totalité du faible G + C des bactéries Gram-positives 12, 13 et régule des douzaines de gènes impliqués dans le carbone et le métabolisme de l' azote 14, 15, 16, 17, 18, 19. Chez les espèces pathogènes, CodY contrôle également l'expression de certains des plus importants gènes de virulence 20, 21,. ef "> 22, 23, 24, 25, 26, 27 CodY est activée en tant que protéine de liaison à l' ADN par deux classes de ligands: acides aminés à chaîne ramifiée (BCAA, isoleucine, leucine et valine [VLI]) et GTP . Lorsque ces nutriments sont abondants, Cody refoule (ou dans certains cas, stimule) la transcription. Comme ces nutriments deviennent limitées, l'activité CodY est progressivement réduite, résultant en une réponse transcriptionnelle à gradient qui réachemine des précurseurs à travers différentes voies métaboliques liés au métabolisme central 28, 29, 30.
Chromatographie liquide en tandem couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) est une technique puissante qui peut précisément identifier et quantifier les métabolites intracellulaires de petites molécules 31. Lorsqu'il est associé à transcanalyse riptome (par exemple, l' ARN-Seq), ce flux de travail d' analyse peut donner un aperçu des changements physiologiques qui se produisent en réponse au stress environnemental ou nutritionnel. Ici, nous présentons une méthode pour l' extraction des métabolites à partir de cellules de Staphylococcus aureus et une analyse ultérieure par LC-MS. Cette approche a été utilisée pour démontrer les effets pléiotropiques de CodY sur la physiologie de S. aureus.

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Protocol

1. Préparation de tampon Solutions

  1. Préparer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS; pH 7,4) par dilution d'une solution mère de 10 x PBS à une concentration finale de 1 x avec ultrapure (distillée et désionisée) de l'eau.
  2. Préparer la solution de trempe en combinant 2 ml d'acétonitrile, 2 ml de methanol, 1 ml de H 2 O ultrapure, et 19 ul (0,1 mM de concentration finale) d'acide formique.
  3. Préparez solvant LC-MS A par addition d'acide formique (0,2% [v / v] de concentration finale) de l'eau ultrapure.
  4. Préparer solvant LC-MS B par addition d'acide formique (0,2% [v / v] de concentration finale) à de l'acétonitrile.
    NOTE: Toutes les solutions doivent être préparées en utilisant les réactifs la plus haute pureté disponible (généralement qualité de chromatographie liquide à haute performance). Les solutions doivent être préparées avant chaque expérience et stockés sur la glace avant utilisation.

2. Mise en place de l' état d' équilibre de croissance de S. aureus

  1. Streak S. aureusouches s d'intérêt pour l' isolement sur gélose de soja tryptique (TSA) à partir d' un stock de glycérol congelé. Incuber à 37 ° C pendant 16-24 h.
  2. Ensemencer 4 ml de bouillon de soja tryptique (TSB) ou un autre milieu approprié dans des tubes d'incubation en verre stériles avec des colonies uniques de chaque souche. Incuber inclinée (~ angle de 70 °) avec la rotation à 60 rotations à 37 ° C par minute (rpm) pendant 16 à 20 h.
    NOTE: cultures pendant la nuit sont sujettes à des gradients d'oxygène lors de l'utilisation des méthodes standard, y compris celles qui sont décrites à l'étape 2.2, qui affectent la physiologie cellulaire. Nous employons donc une stratégie multiple back-dilution pour assurer l'état d'équilibre biologique (voir les étapes 2.4-3.2 ci-dessous).
  3. Utiliser un spectrophotomètre pour mesurer la densité optique des cultures à l' étape 2.2 à 600 nm (DO 600). Utiliser un milieu stérile comme une référence optique (blanc). Diluer ces cellules à une DO 600 de 0,05 dans 50 ml de milieu TSB stérile (pré-chauffée à 37 ° C) dans séparé, 250 ml flacons DeLong.
  4. Incubate les cultures à 37 ° C dans un bain-marie avec agitation par secousses à 280 tours par minute.
  5. Toutes les 30 minutes, prendre des mesures OD 600; comme les densités optiques augmentent, il peut être nécessaire de diluer les cultures avec du BST afin qu'ils restent dans la plage d'absorbance linéaire du spectrophotomètre.
  6. Lorsque les cultures de l' étape 2.5 atteindre une DO 600 de ~ 0,8 à 1,0, les sous - culture dans 50 ml de TSB 37 ° C jusqu'à une DO 600 de 0,01 à 0,05 et répéter les étapes 2.4 et 2.5.

3. Configuration de prélèvement des échantillons

  1. Préparer un lit de glace sèche broyée dans un récipient approprié (par exemple, un plat en verre, seau à glace, ou plus froide).
  2. Comme les densités optiques des cultures approchent du point de récolte désiré, ajouter 1 ml d'une solution de trempe dans une boîte de Petri de 35 mm non traitée et pré-refroidir sur de la glace sèche pour ≥5 min.
    REMARQUE: Le « point de récolte désirée » varie en fonction des objectifs expérimentaux. Par exemple, si l'on examine metabolites pendant la croissance aérobie, les indicateurs clés de cet état comprennent l' excrétion d' acétate et re-assimilation de l'acétate au cours de la phase de croissance exponentielle post-32, 33. En général, ce point doit être à un stade de croissance spécifique (par exemple, phase exponentielle). Les 600 valeurs de DO spécifiques associées à ce stade peuvent varier entre les différentes souches bactériennes et milieux de croissance.
  3. Placer une fritte de filtre en acier inoxydable (pré-refroidi à -20 ° C) dans un bouchon de caoutchouc et le placer au sommet d'une fiole à vide fixée à un vide interne ou d'une pompe à vide.
  4. Appliquer le vide et placer une membrane en ester de cellulose mixte (0,22 um de taille de pores) sur le dessus.
    NOTE: Il est essentiel d'utiliser un filtre avec un diamètre égal à celui de la fritte et au centre correctement ce filtre pour faire en sorte que l'échantillon est tiré à travers le filtre plutôt que sur le bord. Le mouillage de la membrane avec H glacée, stérile 2 O peut aideravec le positionnement de la membrane.

4. échantillons de récolte

  1. A une DO600 de ~ 0,4-0,5, utilisez une pipette sérologique pour enlever 13 ml de la culture du flacon et d'appliquer l'échantillon au filtre.
  2. Après l'ensemble de l'échantillon a été filtré, immédiatement laver le filtre avec ≥5 ml de PBS glacé pour laver les métabolites associés moyennes.
  3. Couper le vide et en utilisant une paire de pinces stériles pour retirer le filtre de la fritte. Inverser le filtre (côté de la cellule vers le bas) dans la solution de trempe pré-refroidi.
    NOTE: Il est important d'effectuer les étapes ci - dessus rapidement (c. -à-en quelques secondes) et dès que le liquide a été retiré pour assurer l'extinction rapide des cellules, arrêter l' activité métabolique.
  4. Incuber le filtre dans une solution de refroidissement rapide sur la glace sèche pendant ≥20 min.
  5. En utilisant des pinces stériles, inverser le filtre (mise à côté de la cellule) dans la boîte de Pétri et en utilisant une micropipette pour rincer les cellules hors de til membrane dans la solution de refroidissement.
  6. Remis en suspension les cellules dans une solution de trempe et ensuite transférer la suspension cellulaire à un tube 2 ml résistant aux chocs stérile contenant ~ 100 ul de billes de silice de 0,1 mm. Conservez ce sur la glace sèche ou à -80 ° C.

5. Extraction Métabolite

  1. Décongeler les échantillons sur de la glace humide et de perturber les cellules dans un homogénéisateur avec quatre salves de 30 s à 6000 tours par minute, avec deux périodes de refroidissement min sur de la glace sèche entre les cycles.
  2. Clarifier les lysats pendant 15 min dans un pré-refroidi, réfrigéré microcentrifugeuse à vitesse maximale ( par exemple, 18.213 xg à ≤4 ° C).
  3. Transférer le surnageant dans un microtube propre.
  4. En utilisant une micropipette, transférer une petite portion de l'échantillon dans un tube de microcentrifugeuse pour la quantification de la teneur en peptide résiduel à l'étape 6; stocker le reste à -80 ° C.
    REMARQUE: le volume de l'échantillon réservé varie, en fonction du dosage BCA utilisé dans l'étape 6.1. Cel'échantillon doit être stocké sur la glace humide pour une analyse immédiate ou congelée à -80 ° C.

6. Acide bicinchoninique (BCA) Dosage

  1. Effectuer un dosage BCA comme recommandé par le fabricant du kit, en utilisant des échantillons provenant de l'étape 5.4 pour déterminer la concentration de peptide résiduel pour chaque échantillon.

7. LC-MS

  1. Mélanger 75 ul de S. aureus extrait avec 75 ul de LC-MS solvant B, préparé à l' étape 1.4.
  2. Vortex de mélanger et de spin à 13 000 g pendant 5 min.
  3. Placer 100 uL de surnageant dans un flacon de Chromatographie en phase liquide (LC) et coiffer. Assurez-vous que l'absence de bulles d'air emprisonnées dans l'échantillon.
  4. Charger les flacons LC sur le LC-MS et échantillonneur automatique modifier la liste en cours d'exécution dans le logiciel « Offline Worklist Editor. »
    1. Remplir le champ "Nom de l' échantillon" (par exemple, de type sauvage-1), "Position de l' échantillon" (par exemple, P1-A1), "Méthode" (par exemple, l' acide formique Acid négatif Méthode), et "Fichier de données" (par exemple, de type sauvage-1) colonnes. Cliquez sur le bouton bouton « Enregistrer Worklist ». Ouvrez le logiciel « Poste de travail d'acquisition de données de spectrométrie de masse » et entrée la liste de travail précédemment enregistré. Cliquez sur le bouton « Démarrer Worklist Exécuter » pour démarrer la mesure LC-MS continue.
  5. Séparer les échantillons sur une colonne, relier la colonne à un temps de spectromètre de vol (TOF), et coupler le spectromètre TOF avec le système de LC. Utilisez un gradient de phase mobile comme suit: 0-2 min, 85% de solvant B; 3-5 min, 80% de solvant B; 6-7 min, 75% de solvant B; 8-9 min, 70% de solvant B; 10 à 11,1 min, 50% de solvant B; 11,1 à 14 min, 20% de solvant B; et de 14,1 à 24 min, 5% de solvant B; mettre fin à une période de ré-équilibration 10 min à 85% de solvant B et un débit de 0,4 ml min -1.
  6. En utilisant une pompe isocratique, infuser une solution de masse de référence avec la course pour permettre l'étalonnage de l' axe masse simultanée.
    REMARQUE: Cette étapeest basé sur le manuel standard du spectromètre TOF.
    1. Utiliser le mélange d'acide acétique et D4 hexakis (1H, 1H, 3H-tétrafluoropropoxy) phosphazine que la solution de masse de référence pour effectuer l'étalonnage en temps réel. Utiliser la pompe isocratique avec le débit d'écoulement de 2,5 ml min -1 pour la perfusion.

8. Lot Correction des Comtes d'ions

  1. Désigner un échantillon pour servir d'échantillon de référence pour la correction de lot (par exemple, de type sauvage, répliquer 1).
  2. Calculer la somme des comptages d'ions pour tous les métabolites dans l'échantillon de référence. Répétez ce calcul pour tous les échantillons.
  3. Diviser le nombre total d'ions de chaque échantillon par le nombre total d'ions de l'échantillon de référence pour générer un rapport.
  4. Diviser le nombre d'ions pour chaque métabolite dans un échantillon par le rapport échantillon / référence pour obtenir un nombre d'ions par lots corrigée pour chaque metabolite.

9. Peptide Normalization

  1. réivide les valeurs de comptage d'ions en mode discontinu corrigé pour chaque échantillon obtenu à l'étape 8 par la concentration du peptide déterminé avec le dosage BCA à l'étape 6 pour obtenir une valeur normalisée pour chaque metabolite.
    NOTE: Les chiffres normalisés, d'ions corrigé en discontinu par lots pour chaque métabolite obtenu à l' étape 9.1 peut être comparée directement entre les souches et soumis à une analyse statistique (par exemple, un U de Mann-Whitney -test). En variante, un métabolite connu pour être stable, soit par le traitement ou la génétique peut être utilisé comme un normalisateur pour détecter des changements dus à la décomposition des métabolites. L'inclusion d'une quantité connue de la L-norvaline ou de l' acide gluraric dans le tampon d'extraction peut être utilisée pour corriger la perte au cours du traitement de l' échantillon 34.

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Representative Results

Nous avons analysé les pools de métabolites intracellulaires dans S. aureus pendant la croissance in vitro dans un milieu riche et complexe,. Comme preuve de principe, nous avons des profils de métabolites comparés entre les méthicilline S. aureus sensible à l' ostéomyélite isoler UAMS-1 (type sauvage [WT]) et une souche isogénique manque le régulateur transcriptionnel global CodY (Δ codY) 26. L'état d' équilibre, les cultures exponentielles des souches WT et CODY ont été établies dans du milieu TSB, comme décrit dans l' étape 2 du protocole. Le comportement de croissance de type sauvage et les cultures mutants de CODY étaient similaires, avec des différences légères dans le rendement de la croissance et le taux (figure 1). En utilisant l' ARN-Seq et de la technologie des puces à ADN, nous et d' autres a révélé que plusieurs gènes codant pour des enzymes impliquées dans la biosynthèse des acides aminés dérivés de l' aspartate ont été dé-réprimées dans le mutant c du codYar rapport à des cellules WT lors de la croissance in vitro dans du TSB (figure 2) 25, 27, 30. De plus, brnQ1 et brnQ2, qui code pour perméases d'acides aminés à chaîne ramifiée, sont surexprimés dans le mutant nul codY- 30, 35.

Pour déterminer la mesure dans laquelle les abondances intracellulaires à l'état stationnaire de métabolites associés à cette voie sont modifiés dans le mutant nul, nous avons réalisé le profilage des métabolites sur la base LC-MS. WT et mutantes cellules codY- nulles ont été cultivées jusqu'à l' état d' équilibre biologique et ont été prélevés comme décrit dans l' étape 4 du protocole. Nous avons déterminé les abondances de métabolite en intégrant la zone pic ionique intensité pour chaque métabolite résolu à l'aide d'un chromatographiquement logiciel d'analyse (voir la liste des matériaux). Nous avons corrigé pour diffrences dans la biomasse en normalisant les abondances des métabolites de la concentration du peptide résiduel de chaque échantillon. Nous avons en outre corrigé pour les effets de ces valeurs de lots potentiels entre les échantillons en calculant le nombre d'ions moyenne pour tous les métabolites de chaque échantillon et en utilisant l'exemple de type sauvage en tant que valeur de référence. Cette approche a permis des comparaisons inter-échantillons de abondances de métabolites à travers les conditions. Les comparaisons entre les métabolites dans un échantillon donné peuvent de même être obtenus en transformant d'abord les abondances des métabolites normalisés de comptages d'ions de quantités molaires en utilisant la méthode d'addition standard.

Nous avons comparé les niveaux d'intermédiaires clés dans la voie de l' aspartate dans UAMS-1 et son mutant nul codY-. Comme on le voit sur la figure 3, les produits finaux de cette voie (par exemple, threonine et (iso) leucine) sont plus abondants dans les cellules mutantes de Cody, tandis que les précurseurs (par exemple,aspartate et o -acétyl homosérine) sont plus abondants dans les cellules WT. La régulation à la hausse combinée de BrnQ perméases 36 et la voie de biosynthèse ILV conduit probablement à l' augmentation de l' isoleucine et la leucine 30. Bien que les différences sont relativement faibles (<4 fois), LC-MS-base de la quantification et la correction des lots révèlent robustes et des changements statistiquement significatifs qui sont compatibles avec des altérations de la transcription à médiation par CodY.

Figure 1
Figure 1: le comportement de croissance de S. aureus UAMS-1 et un mutant isogénique -null codY dans du TSB. Pour prolonger le temps les cellules passées en croissance exponentielle à l' état stationnaire, les cultures ont été diluées à dos une densité optique de 0,05 dans du milieu frais après les pré-cultures ont atteint une DO600 de ~ 1. Les échantillons pour l'analyse des métabolites LC-MS ont été recueilliesà partir de cultures expérimentales à une densité optique de 0,5 ~ (flèches). Les données présentées sont représentatives de trois répétitions biologiques.

Figure 2
Figure 2: Schéma de métabolites choisis dérivés de l' aspartate. Les gènes dont les produits et operons catalyser la synthèse des acides aminés aspartate de la famille sont indiqués en italique; l'augmentation de l'abondance de la transcription dans un mutant -null codY par rapport au type sauvage, tel que déterminé par l' analyse de l' ARN-Seq 29, est également noté. DHP, le 2,6-diaminoheptanedioate (2,6-diaminopimélate).

figure 3
Figure 3: Les abondances des métabolites dans la famille aspartate sont modifiés dans un mutant codY. Le journal 2 changements de -fold de métabolites sélectionnés dans lacodY- mutant nul par rapport à UAMS-1 (WT) sont présentées. Ce changement a été déterminé en divisant l'abondance moyenne de trois répétitions biologiques de la souche nulle codY- par l'abondance moyenne de trois répétitions biologiques de la souche WT. L'écart-type entre les répétitions biologiques pour chaque métabolite est <35%. Les lignes en pointillés indiquent un log 2 variation de 1,5 fois, le seuil utilisé dans cette expérience.

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Discussion

Tous les métabolites de petites molécules sont reliés entre eux par leurs origines communes dans les voies métaboliques centrales. Au cours de la croissance exponentielle, les cellules bactériennes sont à l'état d'équilibre biologique et métabolique, donnant un aperçu de l'état physiologique dans des conditions spécifiques. CodY surveille la suffisance des éléments nutritifs en répondant à ILV et GTP. Comme ILV et GTP baisse des piscines, l' activité est susceptible CodY réduit progressivement, en ajustant l'expression de ses gènes cibles pour adapter à l' augmentation de l' épuisement des nutriments 30. Une souche déficiente en CodY se comporte comme si ILV et GTP sont épuisés à partir de l'environnement , mais ne présente une différence très douce dans le comportement de croissance par rapport à la souche CodY-compétent (Figure 1). Ainsi, la comparaison des piscines à l'équilibre de ses métabolites dans ces souches nous offre une occasion unique de révéler la mesure dans laquelle le métabolisme est reconfiguré lorsque les nutriments sont rares. Il convient de noter que UOr expériences enquêtent sur les abondances de métabolites lorsque l'activité est maximisée CodY (ILV et GTP sont les plus abondants en phase exponentielle). Cependant, d'autres questions peuvent être abordées dans d'autres phases de croissance. Par exemple, l'activité de cycle phase exponentielle, l'acide tricarboxylique (TCA) est très faible; en phase post-exponentielle, le cycle de TCA 36 est activé. Un certain nombre de phénotypes, y compris abondances de métabolite, dépendent de cette activation. En outre, le système de détection de quorum agr devient actif pendant la transition de la croissance exponentielle à la phase stationnaire 37. Collecte d'échantillons en phase post-exponentielle ou stationnaire peut être plus pertinente pour les études portant sur ces sujets. Indépendamment du moment où les échantillons sont récoltés, il est important de recueillir, laver et transférer les échantillons dans le tampon d'extraction le plus rapidement possible ( par exemple, dans s) afin de minimiser le chiffre d' affaires des métabolites qui se produit lorsque l' état d' équilibre est perturbé.

Le procédé chromatographique décrit ici est particulièrement adapté à l'analyse des acides aminés polaires et non polaires et des composés centraux du métabolisme du carbone. Cependant, on peut utiliser d'autres méthodes spécifiques de classe pour quantifier des composés spécifiques d'intérêt ne chromatographiquement résolu par cette méthode. Par exemple, en modifiant le pH de la phase mobile chromatographique en remplaçant l' acide formique par l' acide acétique comme additif a été rapporté pour permettre la résolution de l' isoleucine et la leucine 38. Modification de la procédure d'extraction peut permettre la récupération de la même et la quantification des métabolites labiles qui sont sensibles à la méthode d'extraction utilisée ici. Par exemple, des composés tels que la cysteine qui sont sujettes à la formation de liaisons disulfure peuvent potentiellement être récupérés suivant dérivatisation avec le réactif de Ellman 39. Tampons d'extraction faisant barboter de l' azote gazeux peuvent conserver NAD + et NADHrapports, permettant une évaluation de l'état redox cellulaire 40. triphosphates nucléosidiques peuvent se décomposer dans les solutions de base ou unbuffered; acidification de la solution d'extraction peut améliorer la récupération de ces molécules 41.

Dans une croissance exponentielle de la culture bactérienne, l'épuisement d'un ou plusieurs nutriments conduit à la transition vers les phases post-exponentielle et stationnaire de croissance. Ces phases de croissance sont caractérisées par des états métaboliques distinctes 42. cultures à base chemostat génèrent un idéal état d'équilibre biologique pratiquement continue pour l'expression génique et des études physiologiques. Cependant, la méthode nécessite un équipement spécialisé, est techniquement exigeant et nécessite l'imposition d'une limitation des nutriments pour maintenir une population stable de cellules en flux. Cette dernière exigence provoque des perturbations de la transcription et physiologiques dues à des facteurs autres que la variable ou regulator en cours d'analyse. Pour faire en sorte que nos résultats en fonction de flacon sont représentatifs des cellules en croissance exponentielle à l'état d'équilibre et non d'une transition entre deux phases, nous employons une stratégie de dilution double en arrière avec un flacon cohérent: rapport de volume (légers changements dans les niveaux d'oxygène peuvent conduire à altération du métabolisme 36, 42). Après une dilution initiale de cultures d'une nuit, les cellules sont cultivées à une DO 600 de ~ 1,0, en arrière-dilué jusqu'à une DO 600 de ~ 0,05, et récoltées quand ils atteignent une DO 600 de ~ 0,5. Une telle méthode dilue également des molécules cytoplasmiques qui accumulent pendant la croissance pendant la nuit, y compris des ARN stables. En effet, RNAIII, l'effecteur du système de détection de quorum agr, est un tel ARN et régule l'expression de certains des mêmes gènes cibles que CodY 25, 43, 44. ARNIII accumulée peut masquer CodY-deprégulation de endent, conduisant à une sous-estimation par Cody (Sharma et Brinsmade, résultats non publiés) de la force de répression ou de stimulation.

Une limitation de cette analyse est qu'il fournit un aperçu instantané des abondances de métabolites dans la cellule; aucune conclusion ne peut être tirée des résultats en ce qui concerne les changements de flux à travers une voie donnée. Par exemple, l'abondance de la lysine et de la méthionine entre les deux souches examinées n'a pas changé, en dépit de-répression des enzymes de biosynthèse dans la souche codY- nulle (figures 2 et 3). La souche codY -null peut en fait être générer plus de lysine et de méthionine, mais ils peuvent être convertis en d' autres composés rapidement; ainsi, ces molécules ne s'accumulent pas. En utilisant 13 C ou 15 N-marquées sources de carbone ou d' azote nous permettraient de suivre des squelettes de carbone et d' azote dans les principales jonctions métaboliques 45 <sup>, 46.

Nous avons utilisé la méthode décrite pour élucider les changements dans les pools de métabolites dans S. aureus, B. subtilis 29, 47 Mycobacterium tuberculosis, et Enterococcus faecium 48, mais la méthode peut être appliquée à d' autres bactéries Gram-positives et Gram-négatives, y compris les autres agents pathogènes humains facilement cultivés en laboratoire. En effet, l'intégration des informations métabolomique et transcriptomique peut révéler des liens inattendus entre le métabolisme et la virulence, ce qui pourrait conduire à de nouvelles stratégies pour traiter les infections.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Ce travail a été financé en partie par un NIH Pathway to Independence Award (subvention GM 099893) et les fonds de démarrage du corps professoral à SRB, ainsi qu'une subvention de projet de recherche (subvention GM 042219). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte de données et l'interprétation, ou la décision de soumettre le travail pour publication.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material/Equipmenta
DeLong Culture Flask (250 mL) Belco 2510-00250
Sidearm Flask, 500 mL Pyrex 5340
3-hole Rubber Stopper, #7 Fisher 14-131E
Stainless Steel Filter holder/frit VWR 89428-936
Petri Dish, 35 mm Corning 430588 Not tissue culture treated
Mixed cellulose ester membrane, 0.22 μm pore size Millipore GSWP02500
Impact-resistant tubes, 2 mL USA Scientific 1420-9600
Silica Beads, 0.1 mm Biospec Products Inc 11079101Z
Precellys 24 homogenizer Bertin Instruments EQ03119-200-RD000.0
Micro BCA Protein Assay Kit Pierce (Thermo Scientific) 23235
Cogent Diamond hydride type C column Agilent 70000-15P-2
Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series Agilent G6230B
Quat Pump, 1290 Series Agilent G4204A 
Bin Pump, 1290 Series Agilent G4220A 
Valve Drive, 1290 Series Agilent G1107A 
Isocratic Pump, 1290 Series Agilent G1310B 
TCC, 1290 Series Agilent G1316C 
Sampler, 1290 Series Agilent G4226A 
Thermostat, 1290 Series Agilent G1330B 
Chemical
Tryptic Soy Broth Becton Dickinson 211825
Difco Agar, Granulated Becton Dickinson 214530 Solid media contains 1.5% [w/v] agar
Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10x Ambion AM9624 Dilute fresh to 1x with ultra-pure water
Acetonitrile Fisher Scientific A955-500 Optima LC-MS
Methanol Fisher Scientific A456-500 Optima LC-MS; toxic
Formic Acid Sigma Aldrich 94318 For mass spectrometry, 98%
Software
MassHunter Agilent G3337AA
Bacterial Strain Species Strain Genotype
SRB 337 Staphylococcus aureus USA200 MSSA UAMS-1 wild type
SRB 372 Staphylococcus aureus USA200 MSSA UAMS-1 ΔcodY::erm
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Une approche fondée Spectrométrie liquide tandem chromatographie-masse pour l&#39;analyse des Métabolite<em&gt; Staphylococcus aureus</em
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Samuels, D. J., Wang, Z., Rhee, K.… More

Samuels, D. J., Wang, Z., Rhee, K. Y., Brinsmade, S. R. A Tandem Liquid Chromatography–Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (121), e55558, doi:10.3791/55558 (2017).

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