Summary
Multiparameterfluorescensimmunohistokemi kan anvendes til at vurdere antallet, den relative fordeling og lokalisering af immuncellepopulationer i tumormikromiljøet. Dette manuskript beskriver brugen af denne teknik til analyse af T-celle subpopulationer i orofaryngealkræft.
Abstract
Den firefarvede fluorescens immunhistokemi (IHC) teknik er en metode til at kvantificere cellepopulationer af interesse under hensyntagen til deres relative fordeling og deres lokalisering i vævet. Denne teknik er blevet anvendt i stor udstrækning for at studere immuninfiltreret i forskellige tumortyper. Tumormiljømiljøet infiltreres af immunceller, som tiltrækkes af tumorstedet. Forskellige immuncellepopulationer har vist sig at spille forskellige roller i tumormikromiljøet og at have en anden indflydelse på sygdommens udfald. Dette manuskript beskriver brugen af multiparameter fluorescens IHC på oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC) som et eksempel. Denne teknik kan udvides til andre vævsprøver og celletyper af interesse. I den præsenterede undersøgelse analyserede vi det intraepiteliale og stromale rum i en stor OPSCC kohorte (n = 162). Vi fokuserede på samlede T-lymfocytter (CD3 + ), immunosuppressive regulatOry-T-celler (Tregs, dvs. FoxP3 + ) og T-hjælper 17 (Th17) celler ( dvs. IL-17 + CD3 + ) ved anvendelse af et nukleært modstykke for at skelne tumorepitel fra stroma. Et stort antal T-celler viste sig at være korreleret med forbedret sygdomsfri overlevelse hos patienter med et lavt antal intratumorale IL-17 + ikke-T-celler. Dette antyder, at IL-17 + ikke-T-celler kan korreleres med en dårlig immunrespons i OPSCC, hvilket er i overensstemmelse med korrelationen beskrevet mellem IL-17 og dårlig overlevelse hos cancerpatienter. I øjeblikket udvikles nye multifarameterfluorescens IHC-teknikker ved anvendelse af op til 7 forskellige fluorokromer og vil muliggøre mere præcis karakterisering og lokalisering af immunceller i tumormikromiljøet.
Introduction
Oropharyngeal squamous cell carcinomas (OPSCCs) er en heterogen gruppe af pladecellercancer med oprindelse i oropharynx. Risikofaktorer for OPSCC omfatter humant papillomavirus (HPV) infektion og alkohol og tobaksbrug 1 , 2 . Immunresponsens rolle og hvordan man bruger det i en klinisk indstilling, er lige begyndt at blive udforsket. Tumormiljømiljøet infiltreres af immunceller, der tiltrækkes til kræftstedet. Skønt en høj CD8 + cytotoksisk T-cellefrekvens er korreleret med forbedret overlevelse hos OPSCC-patienter 3 , er rollen af andre T-celle-subsæt, herunder Tregs og Th17-celler, stadig uklar 4 . Mens Th1- og Th17-celler skal hjælpe med immunresponsmålrettede tumorceller, er Tregs velkendte for deres evner til at undertrykke aktiviteten af andre T-celler 5 . Tilstedeværelsen af TRegs har vist sig at korrelere med både gunstige og ugunstige responser i forskellige tumortyper 6 . Da ikke alle immunceller, der er til stede i blodet, infiltrerer tumoren i samme grad, giver undersøgelsen af det lokale tumormikromiljø det mest pålidelige mål for immunrespons rettet mod tumoren. Formålet med denne undersøgelse er at bestemme sammenhængen mellem antal og typer af immunceller og det kliniske resultat. Vi anvendte firefarvet fluorescens IHC-billeddannelse til at analysere antallet og lokaliseringen af forskellige T-celle subpopulationer i human OPSCC.
Vi fokuserede på samlede T-lymfocytter (CD3 + ), Th17-celler og immunosuppressive FoxP3 + Tregs, hvis differentieringsveje er nært beslægtet med Th17-celler. Th17-celler er kendetegnet ved kombinationen af CD3 og IL-17. Cytokinet IL-17 kan også fremstilles af ikke-T-celler 7 . Vi fastslog fordelingen af intraepitHelial- og strom-T-celler, Tregs, Th17 og IL-17 + ikke-T-celler i en stor serie af OPSCC-tilfælde og analyserede korrelationerne med patientoverlevelse. Multicolor fluorescens IHC blev brugt til at identificere ekspressionen af CD3, Foxp3 og IL-17 i kombination med en DAPI-modstregning. Dette assay tillod for nem og klar identifikation af begge tumorceller (ved anvendelse af DAPI-nuklearfarvning) og de infiltrerende T-cellepopulationer (ved anvendelse af en kombination af forskellige markører). Efter prøvepræparation og farvning blev et fluorescerende mikroskop og billeddannelsessoftware anvendt til at adskille de forskellige fluorescerende farver, der blev brugt, og til at bestemme antallet og typen af celler, der er til stede i både tumorepitelet og den tumorassocierede stroma.
Et alternativt assay til at kvantificere og fænotype immuncellepopulationer er flowcytometrianalyse eller cytometri ved flygtid (CyTOF) analyse af tumor eller perifere prøver ( dvs. blod eller ascites). Brug detteTeknik, tabes al information om lokalisering og relativ fordeling af de forskellige celletyper. Anvendelsen og analysen af perifere prøver giver heller ikke oplysninger om hvilke celler der er i stand til at infiltrere tumormikromiljøet. Blod- og asciteimmuncelleanalyser har vist sig ikke at reflektere fænotypen og hyppigheden af immuncelleinfiltrering af tumorvævet 8 , 9 .
Et andet alternativ er brugen af lysfeltmikroskopi. En fordel ved denne teknik over fluorescensbilleddannelse er fraværet af vævsautofluorescens. Selvom nogle prøver indeholder mere autofluorescens-især erythrocytter, men også andre celletyper, herunder neutrofile granulocytter, kan disse områder let fjernes i analysen af næsten alle prøver. Immunofluorescens giver fordelen ved at analysere flere markører i en prøve ved anvendelse af et panel med målrettet fluoresceNt bølgelængder. Dette er i øjeblikket umuligt i samme omfang for lysfeltmikroskopi på grund af manglen på et tilstrækkeligt antal mærker og kommercielt tilgængelige antistofisotyper for et bestemt antigen.
Den multicolor fluorescens IHC-teknik, der er beskrevet her, er blevet anvendt i mange forskellige kræfttyper og antistofkombinationer til at studere forskellige immuncellepopulationer såvel som tumorcelle-udtrykte molekyler, såsom humane leukocytantigener (HLA) og PD-L1 10 , 11 , 12 . Protokollen er blevet etableret og valideret ved hjælp af mange forskellige typer af prøver og antistoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Patientprøver blev behandlet i henhold til de medicinske etiske retningslinjer, der er beskrevet i adfærdskodeksen for korrekt sekundær anvendelse af humant væv fra den nederlandske sammenslutning af biomedicinske videnskabelige samfund (www.federa.org).
1. Klargør dias
- Hent resekteret vævsmateriale (enhver form for væv) fra en patologi afdeling efter at have fået medicinsk etisk udvalg tilladelse til at anvende resekteret materiale.
BEMÆRK: For det nuværende eksperiment blev forbehandlingstumprøver opnået fra primære oropharyngeale tumorer diagnosticeret i Leiden Universitetsmedicinske Center, Leiden, Holland mellem 1970 og 2011, valgt som beskrevet tidligere (n = 162) 13 . Vævets størrelse blev kun begrænset af kravet om en tilstrækkelig mængde tumorvæv til pålideligt at tage 4 mikroskopiske billeder inde i tumoren. - Fastgør vævet i 4% pufret formalin i mindst 12 timer. Dehydrere vævet i agRadede serier ethanol. Vask det i xylen og indlejrer det i paraffin voks ved hjælp af en automatiseret tissue processor.
- Skær 4 μm tyk formalin-fast, paraffin-indlejret (FFPE) vævssektioner på glasskinner med et mikrotom. Placer vævsblokken i mikrotonvævsholderen ved hjælp af standardprocedurer.
- Klip bånd af væv og læg dem på overfladen af et vandbad indeholdende deioniseret vand ved 45 ºC. Brug et dias, der er egnet til immunhistokemisk farvning for at fiske ud af en sektion ved at placere diaset i vandet direkte under sektionen. Træk forsigtigt glideren op i en vinkel, tag sektionen ud af vandet og klæb det på glideren.
- Lad gliderne tørre natten over ved 37 ° C.
- Deparaffinize FFPE diasene ved at nedsænke dem helt i frisk 100% xylen, tre gange i 5 minutter hver. Rehydrer diasene ved at nedsænke dem to gange i frisk 100% ethanol, 70% ethanol og 50% ethanol i 5 minutter hver.
2. Udfør antigen hentning
- Vask gliderne i deioniseret vand i 5 minutter.
- Forvarm tris-ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) puffer (10 mM Tris plus 1 mM EDTA, pH 9,0) til kogetemperatur under anvendelse af en mikrobølgeovn. Udfør antigengenvinding ved at nedsænke diasene i den forvarmede EDTA buffer og holde bufferen ved denne temperatur i 10 minutter i mikrobølgeovnen.
BEMÆRK: Enhver mikrobølgeovn med en effekt på 900 W kan bruges. - Lad gliderne køle ned i bufferen i 2 timer.
3. Stain Tissue Slides
- Vask gliderne to gange med fosfatbuffet saltvand (PBS) i 5 minutter hver.
- Tegn en cirkel rundt om vævet med en hydrofob pen for at forhindre, at de fortyndede antistoffer spildes fra glideren. Vask igen med PBS; Dette er valgfrit.
- Inkuber vævet med primære antistoffer (anti-CD3 1:50, anti-FoxP3 1: 200 og anti-IL-17 1:50) fortyndet i 1% w / v bovint serum aLbumin (BSA) i PBS ved stuetemperatur natten over.
BEMÆRK: Volumen pr dias afhænger af vævets størrelse, men det er typisk 50 - 150 μL. Substitue de primære antistoffer med antistoffer af samme isotype klasse med en ukendt specificitet for de negative kontrolskinner ved samme fortynding som CD3-, CD8- og FoxP3-antistofferne ( dvs. kanin-Ig-isotype-kontrolantistof, mus-IgG1-isotype-kontrolantistof og ged IgG isotype kontrolantistof). - Vask diaserne tre gange med PBS i 5 minutter hver.
- Inkuber vævet med en kombination af fluorescensmærkede sekundære antistoffer rettet mod de primære antistoffarter og / eller isotyper ( dvs. 1: 200 æsel-anti-geit IgG Alexa 488, æsel-anti-kanin IgG A546 og æsel-anti-mus A647) fortyndet i 1% BSA i PBS ved stuetemperatur i 1 time.
BEMÆRK: Volumen pr dias afhænger af vævets størrelse, men er typisk 50 - 150 μl.- EfterTilføj sekundært antistof, hold gliderne beskyttet mod lys så meget som muligt ved at gemme dem i en mørk kasse eller ved at pakke kassen i aluminiumsfolie.
4. Monter og modstå vævsdyser
- Vask diaserne tre gange i PBS i 5 minutter hver.
- Monter gliderne ved hjælp af et vandigt anti-fade monteringsmedium indeholdende et nukleært modstykke ( f.eks. DAPI). Analysér diaserne med et fluorescerende mikroskop så hurtigt som muligt (inden for to uger). Gem diaserne i mørke ved 4 ° C indtil analyse.
5. Analysér farvede vævsdyser
- Få fire billeder af hvert objektglas ved hjælp af et fluorescensmikroskop udstyret med et 20 - 25X objektiv. Tag billeder på tilfældige steder i hele det samlede tumorområde inkluderet i diaset for at indfange en repræsentativ del af tumoren.
BEMÆRK: En standard forstørrelse på 250X skal anvendes. Enhver fluorescerende oR laserscanningsmikroskop kan anvendes, forudsat at det har filtre og lasere, der er nødvendige for at visualisere de anvendte fluorokromer.- Til visualisering af Alexa 488, brug en excitations maksimal på 490 og en emissionsmaksimum på 525; Til visualisering af Alexa 546, brug en excitations maksimal på 556 og et emissions maksimum på 573; Til visualisering af Alexa 647, brug en excitation maksimalt 650 og et emissionsmaksimum på 665; Og til visualisering af DAPI, brug en exciterings maksimal på 358 og et emissionsmaksimum på 461.
- Gem billederne som billedfiler ( dvs. jpeg og tiff) i den software, der er tilgængelig for brugeren.
- Diskriminere mellem tumorepitel og tumorstromområder baseret på de nukleare og cellulære former for tumorepithelial versus stromaceller efter høring af en patolog.
- For at bestemme det totale stromalareal skal du trække en linje rundt om alle områder, der optages af stromalceller (i stedet for tumorceller) og recorD overfladearealet ved hjælp af billedanalyseprogrammet leveret af mikroskopfabrikanten.
- Klik på fanen "Overlay" under billedet; Vælg "Closed Poly-line" form og klik på den. Afgræns grænsen mellem tumorepithelial og stromalfelter ved at klikke rundt på området, indtil de når det første punkt igen. Dette giver en foranstaltning for dette område.
BEMÆRK: Når formen er lukket, vises et tal ved siden af formen, der omgiver overfladen af det valgte billede (A = x μm 2 ).
- Klik på fanen "Overlay" under billedet; Vælg "Closed Poly-line" form og klik på den. Afgræns grænsen mellem tumorepithelial og stromalfelter ved at klikke rundt på området, indtil de når det første punkt igen. Dette giver en foranstaltning for dette område.
- Træk dette overfladeareal fra det samlede billedoverfladeareal (tilvejebragt i billedegenskaber) for at beregne epiteloverfladen. Ekskluderer vaskulære, nekrotiske og autofluorescerende områder ved at tegne en linje omkring dem, optage størrelsen på det tilvejebragte område og trække det fra epiteloverfladen.
- Gem alle overfladearealnumre i en regnearkfil for at beregne de gennemsnitlige overfladearealer ogCelle tal pr dias.
- Ved hjælp af billedanalysesoftwaren skal du bestemme om cellerne er single-, double- eller triple-positive ved at kontrollere fluorescensen af alle fire kanaler.
- Tæl de single-, double- og triple-positive celler i hvert billede ved hjælp af ImageJ.
- Download ImageJ. Åbn et billede ved at klikke på "File" og "Open" og vælge det billede, der skal analyseres. Højreklik på "Point Tool" (et rødt firkant i midten af fire linjer) og vælg "Multi Point Tool". Dobbeltklik på "Multi-Point Tool" og tæl antallet af forskellige celletyper i billedet ved at vælge et andet tæller nummer for hver celletype.
BEMÆRK: Tæl alle cellerne i hver anden celletype, som identificeret ved tilstedeværelsen af en, to eller alle tre fluorescerende farver. Ekskluder DAPI, da denne nukleare modstand er til stede i alle celler og bruges til at diskriminere tumorceller fra immunceller. Hver celletype tællesVed hjælp af et andet tæller nummer. Tæl celletalene for hver celletype separat i tumorepitel- og stromalområderne ved at vælge et andet tællerantal hver gang. Tæl ikke celler i blodkar og stort set autofluorescerende områder. - Optag antallet af celler, der analyseres i hver modbakke for hvert billede i en regnearkfil.
- Opdel det samlede antal celler for hver celletype over det totale overfladeareal af tumorepitel og tumorstroma analyseret.
- Download ImageJ. Åbn et billede ved at klikke på "File" og "Open" og vælge det billede, der skal analyseres. Højreklik på "Point Tool" (et rødt firkant i midten af fire linjer) og vælg "Multi Point Tool". Dobbeltklik på "Multi-Point Tool" og tæl antallet af forskellige celletyper i billedet ved at vælge et andet tæller nummer for hver celletype.
- Tæl de single-, double- og triple-positive celler i hvert billede ved hjælp af ImageJ.
- For at bestemme det totale stromalareal skal du trække en linje rundt om alle områder, der optages af stromalceller (i stedet for tumorceller) og recorD overfladearealet ved hjælp af billedanalyseprogrammet leveret af mikroskopfabrikanten.
6. Statistisk analyse
BEMÆRK: Alle statistiske analyser skal diskuteres med en statistiker for at sikre datakvaliteten. For generel statistik, brug en medicinsk statistik vejledning 14 .
- Test korrelationerne mellem cellefrekvenser ved hjælp af en Spearman rangkorrelation rho test.
- Test de statistiske forskelle i antallet af positive cellerLs mellem patientgrupper ved brug af Wilcoxon Mann-Whitney testen.
- Test korrelationerne mellem celleantal og sygdomsfri overlevelse ( dvs. tidspunktet fra diagnosen indtil lokal eller fjern tilbagevenden af død eller sygdom) ved at dividere patienterne i grupper baseret på et afskåret antal celler ved hjælp af Kaplan-Meier-kurvegenerering og log Ranganalyse 15 .
- Udfør multivariate analyser ved hjælp af Cox proportionel fareregressionsanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En række FFPE-forbehandlings-tumorprøver opnået fra primære oropharyngeale tumorer, der blev diagnosticeret i Leiden University Medical Center, Leiden, Holland mellem 1970 og 2011, valgt som beskrevet tidligere (n = 162) blev farvet ved anvendelse af den beskrevne protokol 13 . En til fire tilfældige billeder af hvert dias blev analyseret ( figur 1 ). Nogle autofluorescerende celler er angivet, hvilket klart kan skelnes mellem deres fuldstændige gule udseende. Celler virkelig dobbelt- eller tredobbelte-positive kun plet positive for et bestemt antistof ved den forventede lokalisering, som er ved cellemembranen eller kernen, i dette tilfælde. Negative kontrol dias viste ikke nogen specifik farvning over baggrundsvæv autofluorescens ( Figur 2 og Figur 4 ), hvilket bekræfter, at alt signal er specifikt for de mål, der er anerkendt af den primæreantistoffer. Alle tumorprøver blev fundet infiltreret af CD3 + T-celler i varierende omfang. FoxP3 + Tregs udtrykte altid CD3 og var en af de store infiltrerende T-cellepopulationer. CD3-celler, der udtrykker IL-17 (Th17-celler), var en mindre population af de infiltrerende T-celler. IL-17 udtrykt af CD3 - celler var en anden rigelig infiltrerende cellepopulation. IL-17 + FoxP3 + -celler omfattede ikke mere end 0,01% af alle FoxP3 + -celler.
Alle statistiske tests var tosidige, og p-værdier under 0,05 blev betragtet som signifikante 14 . Sammenhængen mellem intra-epithelial eller totalt celleantal og overlevelse er præsenteret, da korrelationerne mellem stromal eller totalt celleantal og patient overlevelse var ens. Et stort antal infiltrerende totale CD3 + T-celler viste en tendens i retning af en korrelation med forbedret sygdomsfri overlevelse (0,086, Figur 5A ) i sammenligning med et lavt antal T-celler ( dvs. laveste kvartil). Når man specifikt studerede patienter med et lavt antal IL-17 + -celler, var et stort antal totale infiltrerende T-celler korreleret med forbedret sygdomsfri overlevelse (p = 0,012, figur 5B ). Den prognostiske virkning af tumorinfiltrerende T-celler blev tabt i gruppen af patienter med et stort antal tumor-infiltrerende IL-17 + -celler (data ikke vist). Effekten af tumorinfiltrerende T-celler i OPSCC kan således være relateret til det lave antal af IL-17 + -celler, der er til stede.
Figur 1: FFPE Oropharyngeal Cancer Tissue Farvet af Firefarve Fluorescens IHC. Repræsentativt billede af en immunofluorescerende plet til CD3 ( A , rød), IL-17 ( B Ong>, grøn) og FoxP3 ( C , blå), såvel som det fusionerede billede kombineret med DAPI (grå) ( D ). To autofluorescerende celler er angivet med pilene. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Negativ kontrol for CD3. Repræsentativt billede af FFPE oropharyngeal cancervæv, farvet som beskrevet i protokollen, ved at substituere anti-CD3-antistoffet med et kanin-Ig-isotype-kontrolantistof med ukendt specificitet. Ingen farvning for kanin Ig ( A , rød) kombineret med farvning for IL-17 ( B , grøn), FoxP3 ( C , blå) og DAPI ( D , grå) er vist.2large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Negativ kontrol for IL-17. Repræsentativt billede af FFPE oropharyngeal cancervæv, farvet som beskrevet i protokollen, idet anti-IL-17-antistoffet erstattes med et geit Ig-isotype-kontrolantistof med ukendt specificitet. Ingen farvning for gede Ig ( B , grøn) kombineret med farvning til CD3 ( A , rød), FoxP3 ( C , blå) og DAPI ( D , grå) vises. Klik her for at se en større version af denne figur.
FIgure 4: Negativ kontrol for FoxP3. Repræsentativt billede af FFPE oropharyngeal cancervæv, farvet som beskrevet i protokollen, ved at erstatte anti-FoxP3-antistoffet med et IgG1-isotype-kontrolantistof med ukendt specificitet. Ingen farvning for mus IgG1 ( C , blå) kombineret med farvning for CD3 ( A , rød), IL-17 ( B , grøn) og DAPI ( D , grå) er vist. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Kaplan-Meier Survival Curves. For patienter med et undermedianantal IL-17 + celler / mm 2 er sygdomsfrie overlevelseskurver vist for en meget lav ( dvs. lavest kvartil) versus højt antal totaL-celler ( A ) og en lav ( dvs. undermedian) versus højt antal totale T-celler ( B ) i det samlede tumorområde. Reproduceret med tilladelse fra Cancer Immunology Immunotherapy journal 13 . Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For den beskrevne protokol er et af de mest kritiske trin at bestemme den korrekte fortynding af de anvendte primære antistoffer. Fortyndingen af de mærkede sekundære antistoffer var 1: 200, som anbefalet af producenten af disse specifikke Alexa-mærkede antistoffer. Fortyndingen af de primære antistoffer bør derefter bestemmes ved en seriel fortynding, fortrinsvis under anvendelse af to forskellige prøver af den tilsigtede vævstype (i dette tilfælde OPSCC). Den optimale arbejdsfortynding er fortyndingen, hvor et klart signal opnås uden baggrundsstøj og i fravær af et signal til den negative kontrol ved samme koncentration. Modifikationer kan foretages med hensyn til typen af sekundære antistoffer og monteringsmedium, der anvendes, afhængigt af hvilken type mikroskop der er til rådighed og forskerens præference. Hvis de påtænkte resultater ikke opnås, anbefaler vi at undersøge typen af anvendte glasskinner, da nogle er kendt for at forårsage problemer med baggrundssignaler Til bestemte former for farvningsløsninger ( f.eks. Perma Blue). For det andet kan nogle antigener blive forstyrret ved brug af varmeinduceret epitopindhentning. I så fald kan forskeren erstatte buffertens opvarmningstrin med andre teknikker, såsom enzyminduceret epitopudvinding. For det tredje, hvis du bruger den hydrofobe pen, må markeringen ikke gøres for tæt på vævet, da dette vil forhindre, at farvningsopløsningen fungerer korrekt. Hvad angår antallet af sektioner pr. Prøve og det krævede antal billeder pr. Sektion, er det op til forskeren og det specifikke forskningsspørgsmål at bestemme det antal, der kræves for at besvare forskningsspørgsmålet med tilstrækkelig statistisk effekt. Til vores analyse brugte vi et afsnit pr. Prøve og fire billeder pr. Sektion. Endelig skal der tages forsigtighed ved brug af neglelak, når du bruger immunofluorescerende farvning, når du bruger neglelak til at forsegle dækslisterne, da alkohol i neglelaksløsningen kan påvirke fluorescerende signal.
Ve_content "> Protokollen beskrevet her involverer ikke høj gennemstrømningsanalyse. Vi har forsøgt at automatisere dette trin, men den subjektive fortolkning af cellestørrelse og morfologi komplicerer automatiseringen af analysen med de tilgængelige softwarepakker på det tidspunkt. Og farvning kan i høj grad automatiseres, blev tællingen af cellerne udført manuelt.Vi var i stand til at studere korrelationerne mellem de infiltrerende T-celle undergrupper undersøgt og klinisk udfald ved hjælp af den beskrevne protokol. Et stort antal T-celler viste sig at være korreleret med forbedret sygdomsfri overlevelse hos patienter med et lavt antal intratumorale IL-17 + ikke-T-celler. Dette antyder, at IL-17 + ikke-T-celler kan være relateret til en dårlig immunrespons i OPSCC, hvilket er i overensstemmelse med korrelationen beskrevet mellem IL-17 og dårlig overlevelse hos cancerpatienter 16 .
ImprOved software programmer er nu blevet kommercielt tilgængelige for at automatisere dette trin og erstatter i øjeblikket den manuelle celle observation og tælling, hvilket vil føre til mere pålidelige, objektive, reproducerbare og hurtige resultater.
Derudover er tilgængeligheden af kommercielle kits, der tillader multiplexering af fluorescerende immunohistokemiske markører, for tiden på vej 17 . Dette vil muliggøre multiplexering af op til 7 forskellige immune markører / biomarkører i kombination med et nukleært modstykke. Vi mener imidlertid, at protokollen, der rapporteres her, stadig vil blive mere effektivt og let anvendt i laboratorier, der mangler komplekse og dyre infrastrukturer, mikroskoper og softwarepakker til multispectral farvningsanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen kommerciel eller økonomisk interessekonflikt.
Acknowledgments
Simone Punt blev støttet af grant UL2010-4801 fra det hollandske Cancer Society. Vi vil gerne takke alle medforfatterne af det originale papir, at denne JoVE-protokol er baseret på: Emilie A. Dronkers, Marij JP Welters, Renske Goedemans, Senada Koljenović, Elisabeth Bloemena, Peter JF Snijders, Arko Gorter og Sjoerd van Der Burg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor | Milestone and Histostar | Automated tissue processor | |
| Histostar | Thermo Scientific | Tissue block embedding machine | |
| Formaldehyde | Baker | ||
| Xylol | Merck | ||
| Ethanol | Merck | ||
| milliQ water | Elaga Purelab Chorus | ||
| Paraffin wax/Paraclean | Klinipath | 5079A | |
| Microtome tissue holder | Leica | RM225 | |
| Flex IHC side | Dako | Tissue slide | |
| Tris | Merk-Milipore | 1,083,821,000 | |
| EDTA | Baker | 1073 | |
| PBS | Bio-Rad | BUF036A | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Rabbit anti-CD3 | Abcam | ab828 | Titrate required antibody dilution |
| Mouse IgG1 anti-FoxP3 | Abcam | ab20034 | Titrate required antibody dilution |
| Goat IgG anti-IL-17 | R&D Systems | AF-317-NA | Titrate required antibody dilution |
| Rabbit Ig isotype control antibody | Abcam | ab27472 | Use at same final concentration as anti-CD3 |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | ab91353 | Use at same final concentration as anti-FoxP3 |
| Goat IgG isotype control antibody | ThermoFisher Scientific | 02-6202 | Use at same final concentration as anti-IL-17 |
| Donkey anti-rabbit IgG A546 | ThermoFisher Scientific | A10040 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-mouse-A647 | ThermoFisher Scientific | A31571 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-goat IgG A488 | ThermoFisher Scientific | A11055 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| VectaShield containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objective | Zeiss | 420852-9972-720 | |
| LSM Zen Software | Zeiss | version 2009 | |
| LSM Image Browser | Zeiss | version 4.2.0.121 | Available to download at www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html. |
| SPSS | IBM Corp. | version 20.0 | |
| ImageJ | version 1.50i | Available to download at http://rsb.info.nih.gov/ij. |
References
- Westra, W. H. The changing face of head and neck cancer in the 21st century: the impact of HPV on the epidemiology and pathology of oral cancer. Head Neck Pathol. 3 (1), 78-81 (2009).
- Rietbergen, M. M., et al. Human papillomavirus detection and comorbidity: critical issues in selection of patients with oropharyngeal cancer for treatment De-escalation trials. Ann Oncol. 24 (11), 2740-2745 (2013).
- Wallis, S. P., Stafford, N. D., Greenman, J. Clinical relevance of immune parameters in the tumor microenvironment of head and neck cancers. Head Neck. 37 (3), 449-459 (2015).
- Ye, J., Livergood, R. S., Peng, G. The role and regulation of human Th17 cells in tumor immunity. Am J Pathol. 182 (1), 10-20 (2013).
- Amedei, A., et al. Ex vivo analysis of pancreatic cancer-infiltrating T lymphocytes reveals that ENO-specific Tregs accumulate in tumor tissue and inhibit Th1/Th17 effector cell functions. Cancer Immunol Immunother. 62 (7), 1249-1260 (2013).
- Whiteside, T. L. What are regulatory T cells (Treg) regulating in cancer and why? Semin Cancer Biol. 22 (4), 327-334 (2012).
- Punt, S., et al. Angels and demons: Th17 cells represent a beneficial response, while neutrophil IL-17 is associated with poor prognosis in squamous cervical cancer. Oncoimmunology. 4 (1), e984539 (2015).
- Bamias, A., et al. Significant differences of lymphocytes isolated from ascites of patients with ovarian cancer compared to blood and tumor lymphocytes. Association of CD3+CD56+ cells with platinum resistance. Gynecol Oncol. 106 (1), 75-81 (2007).
- Gasparoto, T. H., et al. Patients with oral squamous cell carcinoma are characterized by increased frequency of suppressive regulatory T cells in the blood and tumor microenvironment. Cancer Immunol Immunother. 59 (6), 819-828 (2010).
- Jordanova, E. S., et al. Human leukocyte antigen class I, MHC class I chain-related molecule A, and CD8+/regulatory T-cell ratio: which variable determines survival of cervical cancer patients? Clin Cancer Res. 14 (7), 2028-2035 (2008).
- van Esch, E. M., et al. Alterations in classical and nonclassical HLA expression in recurrent and progressive HPV-induced usual vulvar intraepithelial neoplasia and implications for immunotherapy. Int J Cancer. 135 (4), 830-842 (2014).
- Heeren, A. M., et al. Prognostic effect of different PD-L1 expression patterns in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the cervix. Mod Pathol. 29 (7), 753-763 (2016).
- Punt, S., et al. A beneficial tumor microenvironment in oropharyngeal squamous cell carcinoma is characterized by a high T cell and low IL-17(+) cell frequency. Cancer Immunol Immunother. 65 (4), 393-403 (2016).
- Kirkwood, B. R., Sterne, J. A. C. Essential Medical Statistics. , 2nd ed, Wiley-Blackwell. (2003).
- Kleinbaum, D. G., Klein, M. Survival Analysis: A Self-Learning Text. , 2nd ed, Springer. (2005).
- Fabre, J., et al. Targeting the Tumor Microenvironment: The Protumor Effects of IL-17 Related to Cancer Type. Int J Mol Sci. 17 (9), (2016).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. J Immunother Cancer. 3 (47), (2015).
