Summary
Multiparameter fluorescentie immunohistochemie kan worden gebruikt om het aantal, relatieve verdeling en lokalisatie van immuuncellenpopulaties in de tumor micro-omgeving te beoordelen. Dit manuscript beschrijft het gebruik van deze techniek om T-cel subpopulaties in orofaryngeale kanker te analyseren.
Abstract
De vierkleurige fluorescentie immunohistochemie (IHC) techniek is een methode om celpopulaties van belang te kwantificeren, rekening houdend met hun relatieve verdeling en hun lokalisatie in het weefsel. Deze techniek is uitgebreid toegepast om het immuun infiltraat in verschillende tumortypen te bestuderen. De tumor micro-omgeving wordt geïnfiltreerd door immuuncellen die aangetrokken zijn tot de tumorplaats. Verschillende immuuncellenpopulaties hebben gevonden verschillende rollen in de micro-omgeving van de tumor en hebben een andere invloed op het resultaat van de ziekte. Dit manuscript beschrijft het gebruik van multiparameter fluorescentie IHC op orofaryngeale plaveiselcarcinoom (OPSCC) als voorbeeld. Deze techniek kan uitgebreid worden naar andere weefselmonsters en celtypes van belang. In de gepresenteerde studie analyseerden we het intraepitheliale en stromale compartiment van een grote OPSCC cohort (n = 162). We richten ons op totale T-lymfocyten (CD3 + ), immunosuppressieve regulatOry T-cellen (Tregs, dat wil zeggen FoxP3 + ) en T helper 17 (Th17) cellen ( dwz IL-17 + CD3 + ) met behulp van een nucleaire tegensterking om tumorepitheel van stroma te onderscheiden. Een groot aantal T-cellen bleek gecorreleerd te zijn met verbeterd ziektevrij overleving bij patiënten met een laag aantal intratumorale IL-17 + niet-T-cellen. Dit suggereert dat IL-17 + niet-T-cellen kunnen worden gecorreleerd met een slechte immuunrespons in OPSCC, die in overeenstemming is met de correlatie die wordt beschreven tussen IL-17 en slecht overleving bij kankerpatiënten. Momenteel worden nieuwe multiparameter fluorescentie IHC technieken ontwikkeld met maximaal 7 verschillende fluorochromen en zal de nauwkeuriger karakterisering en lokalisatie van immuuncellen in de tumor micro-omgeving mogelijk maken.
Introduction
Orofaryngeale plaveiselcelcarcinomen (OPSCC's) zijn een heterogene groep van plaveiselcellencankers die afkomstig zijn uit de orofarynx. Risicofactoren voor OPSCC omvatten humane papillomavirus (HPV) infectie en alcohol en tabak gebruik 1 , 2 . De rol van het immuunrespons en hoe dit in een klinische omgeving gebruikt wordt, wordt net begonnen te worden onderzocht. De tumor micro-omgeving wordt geïnfiltreerd door immuuncellen die aangetrokken zijn tot de kankerplaats. Hoewel een hoge CD8 + cytotoxische T-celfrequentie is gecorreleerd met verbeterde overleving bij OPSCC-patiënten 3 , is de rol van andere T-cel subsets, waaronder Tregs en Th17 cellen, nog steeds onduidelijk 4 . Terwijl Th1 en Th17 cellen moeten helpen bij de immuunrespons gericht op tumorcellen, zijn Tregs bekend om hun vermogen om de activiteit van andere T-cellen 5 te onderdrukken. Echter, de aanwezigheid van TRegs is gebleken te correleeren met zowel gunstige als ongunstige reacties in verschillende tumor typen 6 . Aangezien niet alle immuuncellen in het bloed aanwezig zijn, infiltreert de tumor in dezelfde mate, het bestuderen van de lokale tumor micro-omgeving biedt de meest betrouwbare maatregel van de immuunrespons gericht tegen de tumor. Het doel van deze studie is om de correlatie tussen de aantallen en typen immuuncellen en de klinische uitkomst te bepalen. We gebruikten vier kleuren fluorescentie IHC imaging om het aantal en lokalisatie van verschillende T-cel subpopulaties in menselijke OPSCC te analyseren.
We richten ons op totale T-lymfocyten (CD3 + ), Th17-cellen en immunosuppressieve FoxP3 + Tregs, waarvan de differentieringsweg nauw verwant is aan Th17-cellen. Th17 cellen worden gekenmerkt door de combinatie van CD3 en IL-17. Het cytokine IL-17 kan ook worden geproduceerd door niet-T-cellen 7 . We bepalen de verdeling van intra-epitheelHeliale en stromale T-cellen, Tregs, Th17 en IL-17 + niet-T-cellen in een grote reeks OPSCC-gevallen en analyseerde de correlaties met de overleving van de patiënt. Multicolor fluorescentie IHC werd gebruikt om de expressie van CD3, Foxp3 en IL-17 te identificeren, in combinatie met een DAPI-tegensterkte. Deze analyse is toegestaan voor de makkelijke en duidelijke identificatie van beide tumorcellen (met behulp van DAPI nucleaire kleuring) en de infiltrerende T-celpopulaties (met behulp van een combinatie van verschillende markers). Na de voorbereiding en het kleuren van de monsters werden een fluorescerende microscoop en beeldsoftware gebruikt om de verschillende fluorescerende kleuren te gebruiken en het aantal en type cellen die aanwezig zijn in zowel het tumorepitheel als het tumorgeassocieerde stroma te bepalen.
Een alternatieve analyse om de immuuncellenpopulaties te kwantificeren en fenotype is flowcytometrie analyse of cytometrie op basis van de tijd van de vlucht (CyTOF) analyse van tumor of perifere monsters (dat wil zeggen bloed of ascites). Hiermee gebruik makenTechniek, alle informatie over lokalisatie en relatieve verdeling van de verschillende celtypes is verloren. Het gebruik en de analyse van perifere monsters geeft ook geen informatie over welke cellen de tumor micro-omgeving kunnen infiltreren. Bloed- en ascite immuun-celanalyses zijn aangetoond dat het fenotype en de frequentie van immuuncelinfectie van het tumorweefsel 8 , 9 niet weerspiegelen.
Een ander alternatief is het gebruik van heldere veld microscopie. Een voordeel van deze techniek over fluorescentie beeldvorming is de afwezigheid van weefsel autofluorescentie. Hoewel sommige monsters meer autofluorescentie bevatten, met name erythrocyten, maar ook andere celsoorten, inclusief neutrofiele granulocyten, kunnen deze gebieden gemakkelijk worden verwijderd in de analyse van bijna alle monsters. Immunofluorescentie biedt het voordeel om meerdere markers in één monster te analyseren door gebruik te maken van een paneel gerichte fluoresceerNt golflengten. Dit is momenteel onmogelijk in dezelfde mate voor lichte veldmicroscopie door het gebrek aan voldoende etiketten en in de handel verkrijgbare antilichaam-isotypen voor een bepaald antigeen.
De multicolor-fluorescentie-IHC-techniek die hier beschreven is, is in veel verschillende soorten kanker en antilichamen gecombineerd om verschillende immuuncellenpopulaties te bestuderen, evenals tumorceluitgedrukte moleculen, zoals humane leukocytantigenen (HLA) en PD-L1 10 , 11 , 12 . Het protocol is vastgesteld en gevalideerd met behulp van veel verschillende soorten monsters en antilichamen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Patientmonsters werden behandeld volgens de medische ethische richtlijnen die zijn beschreven in de Gedragscode voor Proper Secondary Use of Human Weefsel van de Nederlandse Federatie Biomedische Wetenschappelijke Verenigingen (www.federa.org).
1. Maak een dia op
- Verkrijg geresecteerd weefselmateriaal (elke vorm van weefsel) van een pathologie afdeling na het verkrijgen van medische ethische commissie toestemming om gereserveerd materiaal te gebruiken.
OPMERKING: Voor het huidige experiment werden voorbehandelde tumormonsters verkregen uit primaire orofaryngeale tumoren gediagnosticeerd in het Leids Universitair Medisch Centrum Leiden, Nederland tussen 1970 en 2011, geselecteerd zoals eerder beschreven (n = 162) 13 . De grootte van het weefsel was slechts beperkt door de vereiste voor een voldoende hoeveelheid tumorweefsel om op een betrouwbare manier 4 microscopische beelden in de tumor te nemen. - Bevestig het weefsel in 4% gebufferde formaline gedurende minimaal 12 uur. Verwijder het weefsel in agRaded-serie ethanol. Was het in xyleen en plaats het in paraffinewas met behulp van een geautomatiseerde weefselprocessor.
- Snijd 4 μm dikke formaline-vast, paraffine-ingebedde (FFPE) weefselsecties op glazen glijbanen met behulp van een microtome. Plaats het weefselblok in de microtonweefselhouder met behulp van standaardprocedures.
- Snijd linten van weefsel en leg ze op de oppervlakte van een waterbad met gedeïoniseerd water bij 45 ºC. Gebruik een glijbaan die geschikt is voor immunohistochemische kleuring om een gedeelte uit te vissen door de glijbaan direct in het water in het water te plaatsen. Zet de glijbaan voorzichtig omhoog, neem de sectie uit het water en steek het op de glijbaan.
- Laat de glijbanen overnacht drogen bij 37 ° C.
- Deparaffinize de FFPE glijbanen door ze volledig in vers 100% xyleen te dompelen, drie keer voor 5 minuten elk. Rehydrateer de glijbanen door ze gedurende 5 minuten elk twee keer in verse 100% ethanol, 70% ethanol en 50% ethanol te onderdompelen.
2. Voer Antigen Herwinning
- Was de glijbanen in gedeïoniseerd water gedurende 5 minuten.
- Voorverhit Tris-ethylendiaminetetraazijnzuur (EDTA) buffer (10 mM Tris plus 1 mM EDTA, pH 9,0) tot kooktemperatuur met behulp van een magnetron. Voer antigeenherriepen door de dia's in de voorverwarmde EDTA-buffer te onderdompelen en de buffer bij deze temperatuur gedurende 10 minuten in de magnetron te houden.
OPMERKING: Elke magnetron met een vermogen van 900 W kan gebruikt worden. - Laat de glijbanen gedurende 2 uur in de buffer afkoelen.
3. Slijpvliesbladen
- Was de slides tweemaal met 5 minuten fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Teken een cirkel rond het weefsel met een hydrofobe pen om te voorkomen dat de verdunde antilichamen van de glijbaan morsen. Wassen opnieuw met PBS; Dit is optioneel.
- Incubeer het weefsel met primaire antilichamen (anti-CD3 1:50, anti-FoxP3 1: 200 en anti-IL-17 1:50) verdund in 1% w / v runder serum aLbumine (BSA) in PBS bij kamertemperatuur overnacht.
OPMERKING: Het volume per dia hangt af van de grootte van het weefsel, maar het is gewoonlijk 50 - 150 μL. Vervang de primaire antilichamen met antilichamen van dezelfde isotype-klasse met een onbekende specificiteit voor de negatieve controle-glijbanen bij dezelfde verdunning als de CD3-, CD8- en FoxP3-antilichamen ( dwz konijn Ig-isotype controle antilichaam, IgG1 isotype controle antilichaam en geiten IgG isotype controle antilichaam). - Was de glijbanen driemaal met PBS gedurende 5 minuten elk.
- Incubeer het weefsel met een combinatie van fluorescent gemerkte secundaire antilichamen die de primaire antilichaamsproducten en / of isotypen richten ( dwz 1: 200 ezel anti-geiten IgG Alexa 488, ezel anti-konijn IgG A546 en ezel anti-muis A647) verdund in 1% BSA in PBS bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
OPMERKING: Het volume per dia hangt af van de grootte van het weefsel, maar is typisch 50-150 μl.- NaVoeg het secundaire antilichaam toe, houd de dia's zoveel mogelijk tegen het licht beschermd door ze in een donkere doos op te slaan of door de doos in aluminiumfolie te verpakken.
4. Tissue Slides monteren en tegenwerken
- Was de slides drie keer in PBS gedurende 5 minuten elk.
- Monteer de glijbanen met behulp van een waterig anti-fade montage medium met een nucleaire tegenstaining ( bijv. DAPI). Analyseer de glijbanen zo snel mogelijk met behulp van een fluorescerende microscoop (binnen twee weken). Bewaar de glijbanen in het donker bij 4 ° C tot analyse.
5. Analyseer Gebleekte Weefsel Slides
- Verkrijg vier afbeeldingen van elke dia met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een 20 - 25X objectief. Neem afbeeldingen op willekeurige plaatsen in het totale tumorgebied dat in de dia is opgenomen om een representatieve fractie van de tumor vast te leggen.
OPMERKING: een standaardvergroting van 250x moet worden gebruikt. Enige fluorescerende oR laserscanningsmicroscoop kan worden gebruikt, mits het de filters en lasers heeft die nodig zijn om de gebruikte fluorochromen te visualiseren.- Voor visualisatie van Alexa 488, gebruik een excitatie maximum van 490 en een emissie maximum van 525; Voor visualisatie van Alexa 546, gebruik een excitatie maximum van 556 en een emissie maximum van 573; Voor visualisatie van Alexa 647, gebruik een excitatie maximum van 650 en een emissie maximum van 665; En voor visualisatie van DAPI, gebruik een excitatie maximum van 358 en een emissie maximum van 461.
- Sla de afbeeldingen op als beeldbestanden ( dwz jpeg en tiff) in de software die beschikbaar is voor de gebruiker.
- Discrimineren tussen tumorepitheel- en tumorstroma-gebieden op basis van de nucleaire en cellulaire vormen van tumorepitheel versus stromale cellen na raadpleging van een patholoog.
- Om het totale stromale oppervlak te bepalen, teken een lijn rond alle door de stromale cellen (in plaats van tumorcellen) bezet gebied (en) en recorD het oppervlak gebruiken met behulp van de beeldanalysesoftware die door de microscoopfabrikant wordt geleverd.
- Klik op het tabblad Overlay onder de afbeelding; Kies de vorm "Closed Poly-line" en klik erop. Beperk de grens tussen tumorepitheliale en stromale velden door het gebied rond te klikken tot u het eerste punt weer bereikt. Dit geeft een maatregel voor dat gebied.
OPMERKING: Nadat de vorm is gesloten, verschijnt er een nummer naast de vorm die het oppervlak van het geselecteerde beeld omringt (A = x μm 2 ).
- Klik op het tabblad Overlay onder de afbeelding; Kies de vorm "Closed Poly-line" en klik erop. Beperk de grens tussen tumorepitheliale en stromale velden door het gebied rond te klikken tot u het eerste punt weer bereikt. Dit geeft een maatregel voor dat gebied.
- Trek deze oppervlakte af van het totale beeldoppervlak (in beeldeigenschappen) om het epitheliale oppervlak te berekenen. Exclusief vasculaire, necrotische en autofluorescerende gebieden door een lijn rond hen te tekenen, de grootte van het voorziene gebied op te nemen en af te trekken van het epitheliale oppervlak.
- Sla alle oppervlaknummers op in een spreadsheetbestand om de gemiddelde oppervlakten en de berekeningen te berekenenCeltallen per dia.
- Bepaal met behulp van de beeldanalysesoftware of de cellen single-, double- of triple-positief zijn door de fluorescentie van alle vier kanalen te controleren.
- Tel de single-, double- en triple-positive cellen in elke afbeelding met behulp van ImageJ.
- Download ImageJ. Open een afbeelding door op "File" en "Open" te klikken en de te analyseren afbeelding te selecteren. Klik met de rechtermuisknop op het "Point Tool" (een rood vierkant in het midden van vier lijnen) en selecteer het "Multi-Point Tool." Dubbelklik op het "Multi-Point Tool" en tel het aantal verschillende celtypen in de afbeelding door een ander tellernummer voor elk celtype te selecteren.
OPMERKING: Tel alle cellen van elk ander celtype, zoals aangegeven door de aanwezigheid van een, twee of alle drie fluorescerende kleuren. Sluit DAPI uit, aangezien deze nucleaire tegenstamper aanwezig is in alle cellen en gebruikt wordt om tumorcellen van immuuncellen te discrimineren. Elk celtype wordt geteldMet een ander tellernummer. Tel de celgetallen van elk celtype afzonderlijk in de tumorepitheliale en stromale gebieden door telkens een ander tellernummer te kiezen. Tellen geen cellen binnen bloedvaten en grotendeels autofluorescerende gebieden. - Noteer het aantal cellen dat in elke teller voor elke afbeelding in een spreadsheetbestand is geanalyseerd.
- Verdeel het totale aantal cellen voor elk celtype over het totale oppervlak van tumorepitheel en tumorstroma geanalyseerd.
- Download ImageJ. Open een afbeelding door op "File" en "Open" te klikken en de te analyseren afbeelding te selecteren. Klik met de rechtermuisknop op het "Point Tool" (een rood vierkant in het midden van vier lijnen) en selecteer het "Multi-Point Tool." Dubbelklik op het "Multi-Point Tool" en tel het aantal verschillende celtypen in de afbeelding door een ander tellernummer voor elk celtype te selecteren.
- Tel de single-, double- en triple-positive cellen in elke afbeelding met behulp van ImageJ.
- Om het totale stromale oppervlak te bepalen, teken een lijn rond alle door de stromale cellen (in plaats van tumorcellen) bezet gebied (en) en recorD het oppervlak gebruiken met behulp van de beeldanalysesoftware die door de microscoopfabrikant wordt geleverd.
6. Statistische analyse
OPMERKING: Alle statistische analyses moeten worden besproken met een statisticus om de kwaliteit van de gegevens te verzekeren. Voor algemene statistieken gebruik een medische statistische handleiding 14 .
- Test de correlaties tussen celfrequenties met behulp van een Spearman's rangcorrelatie rho-test.
- Test de statistische verschillen in de aantallen positieve celLs tussen patiëntengroepen met behulp van de Wilcoxon Mann-Whitney test.
- Test de correlaties tussen celtallen en ziektevrije overleving ( dwz tijd van diagnose tot lokale of verre herhaling van dood of ziekte) door de patiënten in groepen te verdelen op basis van een aantal cellen met behulp van de Kaplan-Meier-curve generatie en log Ranganalyse 15 .
- Voer multivariate analyses uit met behulp van Cox proportionele hazard regressie analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een reeks FFPE-voorbehandelings tumor monsters verkregen uit primaire orofaryngeale tumoren gediagnosticeerd in Leiden University Medical Center, Leiden, Nederland tussen 1970 en 2011, geselecteerd zoals eerder beschreven (n = 162), werd gekleurd met behulp van het beschreven protocol 13 . Eén of vier willekeurige afbeeldingen van elke dia werden geanalyseerd ( Figuur 1 ). Sommige autofluorescente cellen zijn aangegeven, die duidelijk onderscheiden kunnen worden door hun volledige gele verschijning. Cellen echt dubbel of driemaal positief alleen vlek positief voor een bepaald antilichaam bij de verwachte lokalisatie, die bij dit celmembraan of de kern ligt, in dit geval. Negatieve controle slides vertoonden geen specifieke kleuring boven de autofluorescentie van de achtergrondweefsels ( Figuur 2 en Figuur 4 ), waarbij wordt bevestigd dat het signaal specifiek is voor de doelen die door de primaireantilichamen. Alle tumormonsters bleken geïnfiltreerd te zijn door CD3 + T-cellen naar verschillende mate. FoxP3 + Tregs heeft altijd CD3 uitgedrukt en was een van de belangrijkste infiltrerende T-celpopulaties. CD3-cellen die IL-17 (Th17-cellen) uitdrukken, waren een kleine populatie van de infiltrerende T-cellen. IL-17 uitgedrukt door CD3 - cellen was een andere overvloedige infiltrerende celpopulatie. IL-17 + FoxP3 + cellen bestonden niet meer dan 0,01% van alle FoxP3 + cellen.
Alle statistische tests waren dubbelzijdig en p-waarden onder 0,05 werden significant beschouwd 14 . De correlaties tussen intra-epitheliale of totale cijfers en overleving worden gepresenteerd, aangezien de correlaties tussen stromale of totale cijfers en de overleving van patiënten vergelijkbaar waren. Een groot aantal infiltrerende totale CD3 + T-cellen vertoonde een trend naar een correlatie met verbeterde ziektevrije overleving (0,086, Figuur 5A ) in vergelijking met een laag aantal T-cellen ( dwz laagste kwartiel). Bij het specifiek bestuderen van patiënten met een laag aantal IL-17 + -cellen, werd een groot aantal totale infiltrerende T-cellen gecorreleerd met verbeterde ziektevrije overleving (p = 0,012, figuur 5B ). Het prognostische effect van tumor-infiltrerende T-cellen is verloren in de groep patiënten met een groot aantal tumor-infiltrerende IL-17 + cellen (data niet getoond). Zo kan het effect van tumor-infiltrerende T-cellen in OPSCC verband houden met het lage aantal aanwezige IL-17 + -cellen.
Figuur 1: FFPE Orofarynale Kankerweefsel Gevest door Vier-Kleur Fluorescentie IHC. Representatieve afbeelding van een immunofluorescente vlek voor CD3 ( A , rood), IL-17 ( B Ong>, groen) en FoxP3 ( C , blauw), evenals het samengevoegde beeld gecombineerd met DAPI (grijs) ( D ). Twee autofluorescente cellen worden aangeduid met de pijlen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Negatieve controle voor CD3. Representatief beeld van FFPE orofaryngeale kankerweefsel, gekleurd zoals beschreven in het protocol, waarbij het anti-CD3-antilichaam met een konijn Ig-isotype controle antilichaam met onbekende specificiteit wordt vervangen. Geen vlekken voor konijn Ig ( A , rood) gecombineerd met kleuring voor IL-17 ( B , groen), FoxP3 ( C , blauw) en DAPI ( D , grijs) wordt getoond.2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 3: Negatieve controle voor IL-17. Representatieve afbeelding van FFPE orofaryngeale kankerweefsel, gekleurd zoals beschreven in het protocol, waarbij het anti-IL-17-antilichaam wordt vervangen door een antilichaam van geiten Ig-isotype met onbekende specificiteit. Geen vlekken voor geitenlg ( B , groen) gecombineerd met kleuring voor CD3 ( A , rood), FoxP3 ( C , blauw) en DAPI ( D , grijs) wordt getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
FIgure 4: Negatieve controle voor FoxP3. Representatieve afbeelding van FFPE orofaryngeale kankerweefsel, gekleurd zoals beschreven in het protocol, waarbij het anti-FoxP3 antilichaam wordt vervangen door een IgG1 isotype controle antilichaam met onbekende specificiteit. Geen kleuring voor muis IgG1 ( C , blauw) gecombineerd met kleuring voor CD3 ( A , rood), IL-17 ( B , groen) en DAPI ( D , grijs) wordt getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Kaplan-Meier Survival Curves. Voor patiënten met een ondermediaan aantal IL-17 + cellen / mm 2 worden ziektevrije overlevingskurven getoond voor een zeer laag (dat wil zeggen laagste kwartiel) versus hoog aantal totaL T cellen ( A ) en een lage ( dwz onder mediaan) versus hoog aantal totale T cellen ( B ) in het totale tumor gebied. Reproduceerd met toestemming van het Cancer Immunology Immunotherapie Journal 13 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voor het beschreven protocol is een van de meest kritische stappen om de juiste verdunning van de gebruikte primaire antilichamen te bepalen. De verdunning van de gemerkte secundaire antilichamen was 1: 200, zoals aanbevolen door de fabrikant van deze specifieke Alexa-gemerkte antilichamen. De verdunning van de primaire antilichamen moet dan worden bepaald door een seriële verdunning, bij voorkeur met gebruikmaking van twee verschillende monsters van het beoogde weefseltype (in dit geval OPSCC). De optimale werkverdunning is de verdunning waarbij een duidelijk signaal wordt verkregen, zonder achtergrondgeluid en bij afwezigheid van een signaal voor de negatieve controle bij dezelfde concentratie. Wijzigingen kunnen worden aangebracht met betrekking tot het type secundaire antilichamen en het gebruikte montagemedium, afhankelijk van het type microscoop dat beschikbaar is en de voorkeur van de onderzoeker. Als de beoogde resultaten niet worden bereikt, raden we aan om te kijken naar het type glazen glijbanen die worden gebruikt, omdat sommige problemen veroorzaken bij achtergrondsignalen Voor bepaalde soorten kleurplaten ( bijv. Perma Blue). Ten tweede kunnen sommige antigenen worden verstoord door het gebruik van warmte-geïnduceerde epitoopherwinning. In dat geval kan de onderzoeker de verwarmingsstap van de buffer vervangen door andere technieken, zoals door enzym geïnduceerde epitoopherwinning. Ten derde, als u de hydrofobe pen gebruikt, dient de markering niet te dicht bij het weefsel te worden gemaakt, omdat dit voorkomt dat de kleuroplossing goed werkt. Wat het aantal afdelingen per monster betreft en het vereiste aantal beelden per sectie, is het aan de onderzoeker en de specifieke onderzoeksvraag om het aantal te bepalen dat nodig is om de onderzoeksvraag te beantwoorden met voldoende statistische kracht. Voor onze analyse hebben we één sectie per monster en vier afbeeldingen per sectie gebruikt. Ten slotte moet bij het gebruik van immunofluorescerende kleuring zorgvuldig worden gebruikt wanneer nagellak wordt gebruikt om de deklaagjes te verzegelen, aangezien alcohol in de nagellakoplossing het fluorescerende signaal kan beïnvloeden.
Ve_content "> Het protocol dat hier wordt beschreven, heeft geen invloed op de analyse van high-throughput. We hebben geprobeerd deze stap te automatiseren, maar de subjectieve interpretatie van cellulaire grootte en morfologie compliceert de automatisering van de analyse met de beschikbare softwarepakketten. En het vlekwerk kan in grote mate geautomatiseerd worden, de telling van de cellen werd handmatig uitgevoerd.We konden de correlaties bestuderen tussen de geïnfiltreerde T-cel subsets en de klinische uitkomst met behulp van het beschreven protocol. Een groot aantal T-cellen bleek gecorreleerd te zijn met verbeterd ziektevrij overleving bij patiënten met een laag aantal intratumorale IL-17 + niet-T-cellen. Dit suggereert dat IL-17 + niet-T-cellen verband houden met een slechte immuunrespons in OPSCC, die in overeenstemming is met de correlatie die wordt beschreven tussen IL-17 en slecht overleving bij kankerpatiënten 16 .
VertonOved software programma's zijn nu commercieel beschikbaar om deze stap te automatiseren en vervangen door de handmatige celwaarneming en -telling, wat tot betrouwbare, objectieve, reproduceerbare en snelle resultaten leidt.
Bovendien is de beschikbaarheid van commerciële kits die het multiplexeren van fluorescerende immunohistochemische markers mogelijk maken, momenteel aan de opkomst 17 . Dit zal de multiplexing van maximaal 7 verschillende immuunmarkers / biomarkers in combinatie met een nucleaire tegenstapel mogelijk maken. Wij geloven echter dat het hier beschreven protocol nog efficiënter en makkelijker zal worden toegepast in laboratoria zonder complexe en dure infrastructuur-, microscopen- en softwarepakketten voor multispectrale kleurenanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen commercieel of financieel belangenconflict.
Acknowledgments
Simone Punt werd ondersteund door subsidie UL2010-4801 van de Nederlandse Kankervereniging. Wij bedanken alle co-auteurs van het originele papier dat dit JoVE-protocol is gebaseerd op: Emilie A. Dronkers, Marij JP Welters, Renske Goedemans, Senada Koljenović, Elisabeth Bloemena, Peter JF Snijders, Arko Gorter en Sjoerd van Der Burg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor | Milestone and Histostar | Automated tissue processor | |
| Histostar | Thermo Scientific | Tissue block embedding machine | |
| Formaldehyde | Baker | ||
| Xylol | Merck | ||
| Ethanol | Merck | ||
| milliQ water | Elaga Purelab Chorus | ||
| Paraffin wax/Paraclean | Klinipath | 5079A | |
| Microtome tissue holder | Leica | RM225 | |
| Flex IHC side | Dako | Tissue slide | |
| Tris | Merk-Milipore | 1,083,821,000 | |
| EDTA | Baker | 1073 | |
| PBS | Bio-Rad | BUF036A | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Rabbit anti-CD3 | Abcam | ab828 | Titrate required antibody dilution |
| Mouse IgG1 anti-FoxP3 | Abcam | ab20034 | Titrate required antibody dilution |
| Goat IgG anti-IL-17 | R&D Systems | AF-317-NA | Titrate required antibody dilution |
| Rabbit Ig isotype control antibody | Abcam | ab27472 | Use at same final concentration as anti-CD3 |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | ab91353 | Use at same final concentration as anti-FoxP3 |
| Goat IgG isotype control antibody | ThermoFisher Scientific | 02-6202 | Use at same final concentration as anti-IL-17 |
| Donkey anti-rabbit IgG A546 | ThermoFisher Scientific | A10040 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-mouse-A647 | ThermoFisher Scientific | A31571 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-goat IgG A488 | ThermoFisher Scientific | A11055 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| VectaShield containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objective | Zeiss | 420852-9972-720 | |
| LSM Zen Software | Zeiss | version 2009 | |
| LSM Image Browser | Zeiss | version 4.2.0.121 | Available to download at www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html. |
| SPSS | IBM Corp. | version 20.0 | |
| ImageJ | version 1.50i | Available to download at http://rsb.info.nih.gov/ij. |
References
- Westra, W. H. The changing face of head and neck cancer in the 21st century: the impact of HPV on the epidemiology and pathology of oral cancer. Head Neck Pathol. 3 (1), 78-81 (2009).
- Rietbergen, M. M., et al. Human papillomavirus detection and comorbidity: critical issues in selection of patients with oropharyngeal cancer for treatment De-escalation trials. Ann Oncol. 24 (11), 2740-2745 (2013).
- Wallis, S. P., Stafford, N. D., Greenman, J. Clinical relevance of immune parameters in the tumor microenvironment of head and neck cancers. Head Neck. 37 (3), 449-459 (2015).
- Ye, J., Livergood, R. S., Peng, G. The role and regulation of human Th17 cells in tumor immunity. Am J Pathol. 182 (1), 10-20 (2013).
- Amedei, A., et al. Ex vivo analysis of pancreatic cancer-infiltrating T lymphocytes reveals that ENO-specific Tregs accumulate in tumor tissue and inhibit Th1/Th17 effector cell functions. Cancer Immunol Immunother. 62 (7), 1249-1260 (2013).
- Whiteside, T. L. What are regulatory T cells (Treg) regulating in cancer and why? Semin Cancer Biol. 22 (4), 327-334 (2012).
- Punt, S., et al. Angels and demons: Th17 cells represent a beneficial response, while neutrophil IL-17 is associated with poor prognosis in squamous cervical cancer. Oncoimmunology. 4 (1), e984539 (2015).
- Bamias, A., et al. Significant differences of lymphocytes isolated from ascites of patients with ovarian cancer compared to blood and tumor lymphocytes. Association of CD3+CD56+ cells with platinum resistance. Gynecol Oncol. 106 (1), 75-81 (2007).
- Gasparoto, T. H., et al. Patients with oral squamous cell carcinoma are characterized by increased frequency of suppressive regulatory T cells in the blood and tumor microenvironment. Cancer Immunol Immunother. 59 (6), 819-828 (2010).
- Jordanova, E. S., et al. Human leukocyte antigen class I, MHC class I chain-related molecule A, and CD8+/regulatory T-cell ratio: which variable determines survival of cervical cancer patients? Clin Cancer Res. 14 (7), 2028-2035 (2008).
- van Esch, E. M., et al. Alterations in classical and nonclassical HLA expression in recurrent and progressive HPV-induced usual vulvar intraepithelial neoplasia and implications for immunotherapy. Int J Cancer. 135 (4), 830-842 (2014).
- Heeren, A. M., et al. Prognostic effect of different PD-L1 expression patterns in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the cervix. Mod Pathol. 29 (7), 753-763 (2016).
- Punt, S., et al. A beneficial tumor microenvironment in oropharyngeal squamous cell carcinoma is characterized by a high T cell and low IL-17(+) cell frequency. Cancer Immunol Immunother. 65 (4), 393-403 (2016).
- Kirkwood, B. R., Sterne, J. A. C. Essential Medical Statistics. , 2nd ed, Wiley-Blackwell. (2003).
- Kleinbaum, D. G., Klein, M. Survival Analysis: A Self-Learning Text. , 2nd ed, Springer. (2005).
- Fabre, J., et al. Targeting the Tumor Microenvironment: The Protumor Effects of IL-17 Related to Cancer Type. Int J Mol Sci. 17 (9), (2016).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. J Immunother Cancer. 3 (47), (2015).
