Summary
在这里，我们描述了一种在黑腹果蝇中引起封闭头部创伤性脑损伤的新方法。我们的方法的优点是可以直接将可重复的冲击强度提供给头部。无脊椎动物系统的进一步探索将有助于阐明慢性创伤性脑病的发病机制。
Abstract
慢性创伤性脑病（CTE）是一种既定的神经退行性疾病，与暴露于重度轻度创伤性脑损伤（mTBI）密切相关。尽管最近有一个界定神经病理学标准的共识，但其复杂的病理变化的机制仍然很难捉摸。在这里，我们描述了一种在黑腹果蝇 （ 果蝇 ）中开发CTE模型的新方法，旨在鉴定导致大脑中特征性过度磷酸化tau积累和神经元死亡的关键基因和途径。对可能受到轻微封闭伤害的强度影响直接传递给飞头，使头部快速加速和减速。我们的方法消除了其他果蝇 mTBI模型固有的潜在问题（ 例如，动物死亡可能是由于损伤引起的身体其他部位或内脏）。较少的劳动力和成本密集的动物护理，短寿命和广泛的遗传工具使果蝇成为研究CTE发病机理的理想选择，并且可以进行大规模，全基因组的前期遗传和药理筛选。我们预计，模型的持续表征将为疾病预防和治疗方法产生重要的机械观点。
Introduction
慢性创伤性脑病（CTE）最近被认为是一种独特的神经变性疾病，与其他tau病，如阿尔茨海默病1分离 。与阿尔茨海默病和其他常见的tau蛋白病（其最重要的危险因素是年龄增长和痴呆家族史）不同，CTE如其名称所示，意味着与脑外伤历史密切相关，很可能与体育运动员接触，例如拳击手和足球运动员，以及2,3,4,5的退伍军人。它被认为是通过反复的震荡和冲击打击脑袋。患者可能会出现症状和体征，如认知缺陷，情绪和行为变化以及运动功能障碍，其与阿尔茨海默病，额颞叶痴呆，路易体痴呆和帕金森病6 。相比之下，脑组织的死后检查显示在皮层sulci深度周围的小血管周围的超磷酸化tau积累的不同模式，在其他退化病症中未观察到的病理特征7 。然而，到目前为止，关于导致疾病表现的发病机制知之甚少。这在很大程度上是由于缺乏一个忠实的动物模型 - 只是最近才有了5,8的鼠类模型。这些模型生物体具有成本密集型护理和相对较长使用寿命的缺点，不太适用于神经退行性疾病研究。
与哺乳动物相比，无脊椎动物如果蝇是一种很好的替代方案，具有成本效益的维护，广泛的解剖遗传决定因素的工具，寿命相对较短9 。值得注意的是，飞行和人类大脑分享进化上保守的分子和细胞通路，以及解剖学相似性10,11,12 。已经报道了两个巧妙的果蝇模型来研究创伤性脑损伤。由Katzenberger及其同事设计的第一个“高冲击创伤”（HIT）装置将塑料瓶中的自由移动的苍蝇与金属弹簧13,15的自由端相连。当塑料小瓶倾斜直立并释放时，它会撞到聚氨酯垫，并在苍蝇弹到小瓶壁并反弹时给野生动物施加创伤。相比之下，Barekat和同事们设计了一种不同的送货方式使用Omni Bead Ruptor-24匀浆机平台14 。苍蝇与CO 2失活，并置于2mL螺旋管中，将其固定在均化器上并进行预编程的摇动条件。使用组织匀浆器系统的一个好处是，实验者可以调节受伤的强度，受伤持续时间和伤害发作次数。然而，这两个制度都有同样的缺点：头部的主要伤害在冲击位置和强度方面是随机的。此外，这两种方法导致相当大的死亡率，这是由身体和内脏其他部位的不可避免的附带损害造成的。在这里，我们描述了一种在果蝇中诱导mTBI的新方法。我们的装置由气体推进的弹道冲击器组成。与现有的果蝇模型14,15相比，我们的方法具有独特的优势可引起影响，仅针对自由移动的飞头，从而允许准确控制各种因素，如影响严重性，影响之间的时间间隔以及持续影响的总数。
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Protocol
打击装置装配（ 图1 ）
- 从1 mL结核菌素注射器中取出柱塞。切成1毫升标记的桶。
- 从200μL移液器吸头上取下气溶胶屏障（直径3mm，直径4 mm），并将其用作冲击器。将冲击器放在注射器筒内。轻轻敲击枪管将冲击器移动到前端，平面覆盖喷嘴开口。
- 将枪管末端连接到连接到果蝇麻醉站的二氧化碳（CO 2 ）流量调节器的塑料管上。
- 将桶垂直握住，并将其夹紧到标准的夹持架上，以便冲击器停留在机筒的底部。
- 修改200μL移液器吸头，使飞针座。
- 从尖端切割4毫米直径为0.8毫米的开口，只允许飞头暴露。
注意：飞行器的所有其他部分的rax和rak将留在移液器吸头内。
- 从尖端切割4毫米直径为0.8毫米的开口，只允许飞头暴露。
- 修改1,000μL移液器针头和1 mL注射器针头帽，使连接器。
- 从尖端的开口切掉44毫米。取6毫米长的1毫升注射器针头帽，并将其紧紧地推入1,000μL移液器吸头的剩余部分。
2.打击装置的操作
- 麻醉一只2日龄的成年雌性飞蝇，使用二氧化碳在飞盘上。
- 使用细微的刷子将其轻轻转移到飞轮支架上。轻轻敲击支架，以便在尖端外部看到飞头。如果将飞翔长鼻暴露在尖端外部，用钝的1 mL注射器针轻轻地将其收回到尖端内。
注意：请确保将持针器内的飞龙鼻子保持在内。否则，飞蝇可能会因吸吮的长鼻子受伤而死亡。 - 拧紧飞翔使用连接器将其装入注射器筒，使飞头朝下。
- 将气体压力设置在100 kPa。根据实验设计调整流量。
- 快速打开和关闭流量调节器拨动开关，以便冲击器撞击飞头一次。
- 抬起飞翼，将其移动到飞盘上。反转飞轮架，轻轻敲击侧面让飞出。将飞行物留在空的小瓶中恢复。
视频辅助运动跟踪
- 用透明硅弹性体填充6厘米直径的陪替氏培养皿，制作跟踪舞台。在硅和盘盖之间留出3毫米的空间，以便苍蝇自由行走，但不能飞行。
- 每次从假手术或治疗组麻醉四只苍蝇，并将它们放置在舞台上。将苍蝇放在22°C 1小时。
- 将电荷耦合设备（CCD）摄像机放置在场地上方并记录5分钟。
- 使用Ctrax软件（可从Caltech免费获得）分析记录的移动轨迹16 。以编程语言（例如Matlab）导出跟踪数据 - 兼容格式，并根据每帧移动距离分析数据17 。计算每次飞行的平均步行距离，并将其与所有其他记录的苍蝇/组合，以获得由同一组中的文件群体行进的平均累积距离。
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Representative Results
为了建立使用成年果蝇的CTE模型，我们确定了我们的装置在单次闭合性头部受伤时的有效性。为了消除与基因型，性别或年龄有关的变化，我们在实验中使用了2日龄的Canton-S WT雌性苍蝇。通过在100 kPa的恒定气压下调节CO 2的流量，可以很容易地控制冲击器的强度。以最高流速（15L / min）暴露于单次冲击的苍蝇显示出最小的外部缺陷（ 图2 ）。外部眼睛和嘴巴都完好无损。然而，我们发现15 L / min的流速是急性致死的，24小时内存活率低于10％（ 图3A ）。相比之下，暴露于10或7.5升/分钟的冲击分别导致了61.1％和96.3％的存活率，而在5.0和2.5L / min的流速下，所有的蝇都在后面存活呃24小时（ 图3A ）。因此，我们将未来的研究标准化为5.0 L / min CO 2流量。在5.0L / min的一次击打后，苍蝇在4分钟内逐渐恢复其移动性（ 图3B ）。在接下来的2天，他们的机车功能，以步行能力测量，缓慢恢复正常（ 图3C ）。作为初步评估，这些表型让人联想到脑震荡或轻度创伤水平的患者呈现18 。患有创伤性脑损伤的患者经常伴有肌肉运动和过早死亡的逐渐恶化。
为了评估多发性脑损伤的长期影响，我们以5.0 L / min流速应用了连续5次冲击的mTBI方案，每次罢工时间为24小时。调查 mTBI对运动功能的影响，我们使用视频辅助运动跟踪系统来分析飞行电机的行为。在治疗后20天老化之后，与假手术组相比，mTBI治疗组的行走活动和行走距离减少（ 图4 A ＆ B ;假手术组：6.49±0.72，n = 28对治疗组：4.3± 0.47，n = 32; p <0.05）。为了研究重复脑损伤是否对生存有长期的影响，我们确定了耐受mTBI方案的苍蝇的寿命。如图4C所示，与假手术组（n = 129）相比，处理的苍蝇（n = 100）具有显着降低的中位数寿命（36.9±2.7Vs.26.3±0.9d），并且显着减少最大寿命（49.3±2.4 34.7±1.4 d）。
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图1 。打击装置图。该设备使用在果蝇实验室中可以使用的材料：1）200μL移液器吸头，2）1 mL结核菌素注射器，3）冲击器，4）连接管钩挂在果蝇麻醉站，5）连接器拧紧尖端到注射器上请点击此处查看此图的较大版本。
图2 。轻度闭合性头部创伤性损伤。最高气流的一次罢工并没有对头部，身体或附属物造成明显的外部损伤。 （ A ＆B ）打砸飞。 （ C ＆ D ）假蝇。假手术完全按照与治疗组相同的程序进行，包括在飞行器上和关闭飞行器的转移，但是当应用CO 2流量时，没有冲击器放置在注射器筒中。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3 。单打的效果。 （ A ）24小时后的生存指数（SI 24 ），由在罢工后24小时内幸存的苍蝇的百分比确定，与气体流速相比较。用5.0L / min气流冲击一次的苍蝇回收了运动活动在4分钟（ B ），他们的移动性在2 d的时间内缓慢恢复正常（ C） 。误差栏，平均值的标准误差（SEM）。 请点击此处查看此图的较大版本。
图4 。 果蝇中 mTBI模型的开发 。五天以上的反复罢工导致运动活动明显受损（ A＆B ），寿命缩短（ C ）。在5分钟内记录4次假手术治疗苍蝇的代表性步行轨迹显示在A.误差棒，SEM中。 * p <0.05，Mann-Whitney U检验与Bonferroni校正。总苍蝇：治疗组n = 100，假手术组n = 129. 请点击这里查看此图的较大版本。
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Discussion
忠实地建模CTE特征的动物模型，包括神经生理学改变，神经病理学特征和神经行为缺陷，对于揭示疾病机制和开发诊断和治疗目标至关重要。可以理解，人类疾病的动物模型在模拟所有临床相关终点方面是完美的。然而，我们认为，强大的CTE模型应该满足以下三个要求：（1）影响必须直接适用于具有完整的头皮和颅骨保护的头部; （2）在冲击暴露期间头部不应固定，以便允许快速加速 - 减速和旋转和线性头部运动; （3）实验设计应包括单一和重复的制度，影响后果本质上应该是温和的，不会造成明显的损伤，如组织水肿，挫伤或坦白出血。
欧r果蝇模型与其他在苍蝇13,14,15中造成创伤性脑损伤的方法不同。 Bead Ruptor模型和HIT装置均造成随机冲击位置和强度的伤害。在两种方法中，标准塑料小瓶或2毫升螺旋盖管中包含的可变数量的苍蝇与容器壁接触，并在每次罢工或伤害发作期间多次反弹。由于苍蝇在容器内可自由移动，所以对于个别苍蝇造成的主要伤害是相当大的，因为它们的身体和/或头部的不同部分受到不同的力的伤害。因此，使用这些模型，苍蝇遭受肠屏障功能障碍并不奇怪。这与方案13,14的死亡率直接相关，强烈地表明n神经元改变负责两个系统中的创伤诱导的死亡。相比之下，我们的方法能够重复地将直接头部冲击传递到同一位置。保护身体免受任何直接接触，消除潜在的注意事项，造成身体其他部位或器官损伤可能造成死亡。此外，用于推进重量的CO 2气体的流量可以被调节以实现受控的可调节的强度。最重要的是，飞镖头在罢工时不受限制，允许非常快速的加速 - 减速过程，模拟人类中发生的最常见的mTBI形式19 。
虽然安装一个自动开/关开关来控制二氧化碳流量调节器是理想的，但是当前的手动开关似乎并不影响冲击力的重现性，因为我们设备的设计全部一旦冲击器撞击头部，就会迅速施加力。
总而言之，我们的系统提供了一个更好的模拟mTBI的新型机制，引入了一个新的平台来建模CTE。像已经证明在破译人类神经退行性疾病9,20中有价值的其他果蝇模型一样，预计模型在神经元损失，tau高磷酸化，TDP-43蛋白病和对所造成的mTBI的神经炎症反应方面进行的详细表征将被预期对CTE疾病进程产生重要的机械洞察力，并有助于回答现场的一些关键问题。
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Disclosures
这项工作得到了约翰霍普金斯大学医学院教师创业基金会的支持
Acknowledgments
作者没有什么可以披露的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aerosol Barrier | USA Scientific | 1120-8810 | Used as an impactor |
| 200 μL Pipette Tip | USA Scientific | 1111-0706 | Used as a fly head holder |
| 1000 μL Pipette Tip | USA Scientific | 1122-1830 | Used as a connector |
| 1 mL Tuberculin Syringe | Becton Dickinson | 309625 | |
| 60 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | Used as a tracking arenas |
| Flow Regulator | Genesee Scientific | 59-122WC | |
| Standard Clamp Holder/stand | EISCO Scientific | CH0688 | |
| Fine Brush | Genesee Scientific | 59-204 | |
| Flypad | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Sylgard Silicone Elastomer | Dow Corning | 4019862 | |
| CCD Camera | Microsoft | HD-5000 | |
| Ctrax Walking Fly Tracker | Caltech | Ctrax 0.2.11 | |
| MATLAB Image Processing Toolbox | MATLAB | R2015b |
References
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