Summary
Her beskriver vi en ny metode til at forårsage traumatisk hjerneskade i lukkede hoved i Drosophila melanogaster . Vores metode har den fordel at direkte levere gentagne påvirkninger med justerbar styrke til hovedet alene. Yderligere udforskning af hvirvelløse system vil bidrage til at belyse patogenesen af kronisk traumatisk encefalopati.
Abstract
Kronisk traumatisk encefalopati (CTE) er en etableret neurodegenerativ sygdom, der er tæt forbundet med eksponering for gentagne milde traumatiske hjerneskade (mTBI). De mekanismer, der er ansvarlige for dets komplekse patologiske ændringer, forbliver stort set uvæsentlige, på trods af en ny konsensus om at definere de neuropatologiske kriterier. Her beskriver vi en ny metode til at udvikle en model af CTE i Drosophila melanogaster ( Drosophila ) i et forsøg på at identificere nøglegener og veje, der fører til den karakteristiske hyperphosphorylerede tauakkumulering og neuronal død i hjernen. Justerbar styrke påvirkning for at forårsage mild lukket skade leveres direkte til flyvehovedet, idet hovedet udsættes for hurtig acceleration og deceleration. Vores metode eliminerer de potentielle problemer, der er forbundet med andre Drosophila mTBI-modeller ( f.eks. Kan dyredød induceres ved beskadigelse afAndre dele af kroppen eller til indre organer). Den mindre arbejdskraft- og omkostningskrævende dyrepleje, kort levetid og omfattende genetiske værktøjer gør frugtflyven ideel til at studere CTE-patogenese og gøre det muligt at udføre storskala, genomgående fremadrettede genetiske og farmakologiske skærme. Vi forventer, at den igangværende karakterisering af modellen vil skabe vigtige mekaniske indsigter om sygdomsforebyggelse og terapeutiske tilgange.
Introduction
Kronisk traumatisk encefalopati (CTE) er for nylig blevet anerkendt som en særskilt neurodegenerativ lidelse, adskilt fra andre tauopatier som Alzheimers sygdom 1 . I modsætning til Alzheimers sygdom og andre almindelige tauopatier - hvis vigtigste risikofaktorer er stigende alder og en familiehistorie af demens, indebærer CTE, som det angives af dets navn, en nær tilknytning til en historie med hjernetrauma, som sandsynligvis ses hos kontaktsporter, Såsom boksere og fodboldspillere, såvel som i militære veteraner 2 , 3 , 4 , 5 . Det antages at blive initieret af gentagne hjerteblok og underkoncussive slag til hovedet. Patienter kan frembyde symptomer og tegn som kognitive underskud, humørsvingninger og adfærdsændringer og bevægelsesdysfunktion, som overlapper signifikant med Alzheimers sygdom, frontotemporalDemens, Lewy body demens og Parkinsons sygdom 6 . I modsætning hertil afslører post mortem undersøgelser af hjernevæv et klart mønster af hyperphosphoryleret tau akkumulering omkring små blodkar ved dybden af cortical sulci, en pathognomonic funktion ikke observeret i de andre degenerative tilstande 7 . Hidtil er der meget lidt kendt om patogenesen, der fører til sygdoms manifestation. Dette skyldes i høj grad manglen på en trofast dyremodel. Kun for nylig er der blevet produceret gnavermodeller 5 , 8 . Disse modelorganismer har ulemperne ved kost-intensiv pleje og et relativt lang levetid, som ikke er velegnede til neurodegenerative sygdomsundersøgelser.
Sammenlignet med pattedyrs modstykker er hvirvelløse dyr som Drosophila et fremragende alternativ med deres omkostningseffektive vedligeholdelse,Omfattende værktøjer til dissektering af genetiske determinanter og relativt kort levetid 9 . Bemærkelsesværdigt deler flyve og menneskelige hjerner evolutionært konserverede molekylære og cellulære veje såvel som anatomiske ligheder 10 , 11 , 12 . To geniale Drosophila modeller til at studere traumatisk hjerneskade er blevet rapporteret tidligere 13 , 14 . Den første "High Impact Trauma" (HIT) -enhed designet af Katzenberger og kolleger indeholdt frie bevægelige fluer i et plastik hætteglas, der var bundet til den frie ende af en metalfjeder 13 , 15 . Når plastikflasken hældtes oprejst og frigjort, ramte den en polyurethanplade og gav traume til fluerne, da de sprang til hætteglassets væg og genopstod. I modsætning hertil designet Barekat og kolleger en anden leveringsmetode osI Omni Bead Ruptor-24 homogeniseringsplatformen 14 . Fluer var uarbejdsdygtige med CO 2 og anbragt i et 2 ml skruetæksrør, der blev fastgjort til homogenisatoren og underkastet forprogrammerede rystningsbetingelser. En fordel ved at bruge vævshomogenisatorsystemet er, at eksperimentet kunne modulere intensiteten af skade, varighed af skade og antal skader. Imidlertid har begge regimer den samme ulempe: primære skader på hovedet er tilfældigt påført i forhold til placeringssted og styrke. Derudover resulterede begge metoder i betydelig dødelighed forårsaget af uundgåelig sikkerhedsskade på andre dele af kroppen og indre organer. Her beskriver vi en ny metode til at inducere mTBI i frugt fluer. Vores apparat består af en gasdrevet ballistisk slaghjul. Sammenlignet med de eksisterende Drosophila- modeller 14 , 15 har vores metode den unikke fordel ved at levere målingUrable påvirkning, der kun er rettet mod det frie bevægelige flyvehoved, hvilket gør det muligt at foretage nøjagtig kontrol af forskellige faktorer, såsom slaglængde, tidsintervallet mellem påvirkninger og det samlede antal påvirkede påvirkninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Montering af strejkeapparatet ( figur 1 )
- Fjern stemplet fra en 1 ml tuberkulinsprøjte. Skær tønde på 1 ml mærket.
- Fjern en aerosolbarriere (3 mm højde x 4 mm diameter) fra en 200 μL pipettespids, og brug den som en slaghjul. Placer støtfangeren inde i sprøjtecylinderen. Tryk forsigtigt på tønderen for at bevæge slaghjulet til spidsenden, med den flade side, der dækker dyseåbningen.
- Fastgør tønde-spidsenden til plastrør, der er forbundet med koldioxid (CO 2 ) flowregulatoren på en Drosophila anæstesi station.
- Hold tønderen lodret og klem den fast i en standard klemholderholder, så støddæmperen befinder sig i bunden af tønderen.
- Modificer en 200 μL pipettespids for at gøre flyholderen.
- Skær 4 mm fra spidsen for at lave en åbning på 0,8 mm, så kun flyhovedet bliver udsat.
BEMÆRK: ThoRax og alle de andre dele af fluehuset vil blive inde i pipettespidsen.
- Skær 4 mm fra spidsen for at lave en åbning på 0,8 mm, så kun flyhovedet bliver udsat.
- Modificer en 1000 μL pipettip og en 1 ml sprøjtenåledeksel for at gøre stikket.
- Afskåret 44 mm fra spidsens åbning. Tag en 6 mm længde af en 1 ml sprøjte nålehætte og skub det tæt ind i det resterende segment af 1000 μL pipettespidsen.
2. Betjening af strejkeenheden
- Bedøve en enkelt 2-dages gammel kvindelig flue med CO 2 på en flyveplade.
- Overfør det forsigtigt til flyveholderen ved hjælp af en fin børste. Tryk let på holderen, så flyhovedet ses uden for spidsenden. Hvis flyveproblemet udsættes uden for spidsen, skal du forsigtigt tage den tilbage inde i spidsen med en stump 1 ml sprøjtenål.
BEMÆRK: Sørg for at holde flyveproblemet inde i holderen. Ellers kan flyve dø af en sugende proboscis skade. - Stram flyvehøjenLeder til sprøjtecylinderen med stikket, så flyvehovedet vender nedad.
- Indstil gastrykket ved 100 kPa. Juster strømningshastigheden ifølge eksperimentdesign.
- Drej strømregulatorens drejekontakt hurtigt og sluk, så slagmotoren rammer flyvehovedet en gang.
- Løft flyholderen og flyt den over en flyveplade. Vend flyveholderen og tryk forsigtigt på siden for at lade flyve ud. Lad flyve i et tomt hætteglas for at komme sig.
3. Video-assisteret bevægelsessporing
- Fyld en petriskål med 6 cm diameter med transparent siliciumelastomer for at gøre sporingsarenaen. Lad et 3 mm mellemrum mellem siliconen og opvaskedækslet for at tillade fluerne at gå frit, men ikke flyve.
- Bedøve fire fluer fra enten den skam eller behandlede gruppe hver gang og læg dem i arenaen. Lad flyene være ved 22 ° C i 1 time.
- Placer en CCD-kamera (Charge Coupled Device) over arenaer og optag i 5 minutter.
- Analyser de registrerede bevægelsesbaner ved hjælp af Ctrax-software (frit tilgængelig fra Caltech) 16 . Eksporter de sporede data på et programmeringssprog (f.eks. Matlab) -kompatibelt format og analyser dataene baseret på den tilbagelagte afstand pr. Ramme 17 . Beregn den gennemsnitlige gåafstand for hver flyve og kombiner den med alle andre optagne fluer / grupper for at opnå en gennemsnitlig kumulativ afstand, der er tilbagelagt af bestanden af filer i samme gruppe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at etablere en CTE-model ved hjælp af voksen Drosophila , fastslog vi effektiviteten af vores enhed ved at forårsage en enkelt lukkede hovedskader. For at eliminere variationer relateret til genotype, køn eller alder anvendte vi 2-dages gamle Canton-S WT kvindelige fluer i eksperimentet. Vi kunne nemt styre slagstyrken ved at regulere strømningshastigheden af CO 2 ved et konstant gastryk på 100 kPa. Fluer udsat for en enkelt strejke ved den højeste strømningshastighed (15 l / min) udviste minimal eksterne defekter ( figur 2 ). Både de ydre øjne og mundstykket optrådte intakte. Ikke desto mindre fandt vi, at en strømningshastighed på 15 L / min var akut dødelig, hvilket resulterede i mindre end 10% overlevelsesrate inden for 24 timer ( figur 3A ). I modsætning hertil viste eksponering for en 10 eller 7,5 l / min strejke henholdsvis 61,1% og 96,3% overlevelse, mens alle fluer overlevede på 5,0 og 2,5 l / min strømningshastighederEr 24 timer ( figur 3A ). Derfor standardiserede vi vores fremtidige undersøgelser til 5,0 L / min CO 2 strømningshastigheden. Efter en strejke på 5,0 l / min flyver flyve gradvist deres mobilitet inden for 4 min ( figur 3B ). I løbet af de næste 2 d genoprettes deres lokomotivfunktion, målt ved gangfunktion, langsomt til normal ( figur 3C ). Som en foreløbig vurdering minder disse fænotyper om dem, der præsenteres af mennesker, der har oplevet hjernerystelse eller milde niveauer af traumer 18 . Patienter, der lider af traumatisk hjerneskade, forekommer ofte med en progressiv forringelse af muskelbevægelser og for tidlig død.
For at evaluere de langsigtede virkninger af flere hjerneskader anvendte vi en mTBI-protokol af fem på hinanden følgende strejker ved 5,0 l / min strømningshastighed med 24 timers opsvingstider mellem hver strejke. At undersøge E virkningen af mTBI på bevægelsesfunktion, brugte vi et videoassisteret motion tracking system til at analysere flymotoren adfærd. Efter ældning af fluerne 20 d efter behandling viste den mTBI-behandlede gruppe reduceret gangaktivitet og afstået afstand sammenlignet med sham-gruppen ( Figur 4 A & B ; sham-gruppe: 6,49 ± 0,72, n = 28 mod behandlet gruppe: 4,3 ± 0,47, n = 32; p <0,05). For at undersøge, om gentagne hjerneskade har kroniske virkninger på overlevelse, besluttede vi levetiden for fluer, der udgjorde mTBI-protokollen. Vist i figur 4C sammenlignet med sham-gruppen (n = 129) havde behandlede fluer (n = 100) en væsentligt reduceret median levetid (36,9 ± 2,7 Vs. 26,3 ± 0,9 d) og signifikant reduceret maksimal levetid (49,3 ± 2,4 Vs 34,7 ± 1,4 d).
1 "class =" xfigimg "src =" / filer / ftp_upload / 55602 / 55602fig1.jpg "/>
Figur 1 . Diagram over strejkeenheden. Enheden anvendte materialer, der er tilgængelige i et Drosophila- laboratorium: 1) 200 μL pipettespids, 2) 1 ml tuberkulinsprøjte, 3) slaghjul, 4) forbindelsesrør fastgjort til en Drosophila anæstesi station og 5) stik for at stramme spidsen På sprøjten. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2 . Mild Lukket Hoved Traumatisk Skade. En enkelt strejke ved den højeste gasstrøm har ikke påført indlysende ydre skader på hovedet, kroppen eller appendages. ( A &B ) Strike-inflicted fly. ( C & D ) Sham flyve. Sham-fluerne gennemgik nøjagtigt de samme procedurer som den behandlede gruppe, herunder overførsler på og fra flyveholderen, medmindre der ikke blev anbragt nogen slag i sprøjtebeholderen, når CO 2 -strømmen blev påført. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3 . Effekten af en enkelt strejke. ( A ) Overlevelsesindekset ved 24 timer (SI 24 ), defineret af procentdelen af fluer, der overlevede inden for 24 timer efter en strejke, er graferet i forhold til gasstrømningshastigheden. Fluer, der er blevet ramt en gang med 5,0 l / min gasstrøm genvundet bevægelsesaktivitet medI 4 min ( B ), og deres mobilitet genoprettes langsomt til normal over en periode på 2 d ( C) . Fejlstang, Standardfejl for middelværdien (SEM). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4 . Udvikling af mTBI-modellen i Drosophila . Gentagne strejker i løbet af fem dage resulterede i betydeligt svækket lokomotorisk aktivitet ( A & B ) og reduceret levetid ( C ). Repræsentative vandrestier registreret over 5 minutter til 4 sham og behandlede fluer er vist i A. Fejlstænger, SEM. * P <0,05, Mann-Whitney U-test med en Bonferroni-korrektion. Samlet fluer: behandlet gruppe n = 100, sham gruppeN = 129. Klik venligst her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dyremodeller, der trofastmodellerer CTE-funktioner, herunder neurofysiologiske ændringer, neuropatologiske karakteristika og neurobehavioral underskud, er afgørende for at afdække sygdomsmekanismer og til udvikling af diagnostiske og terapeutiske mål. Det er forståeligt, at ingen dyremodel af en human sygdom er perfekt til at efterligne alle klinisk relevante endepunkter. Vi mener imidlertid, at en robust CTE-model skal opfylde følgende tre krav: (1) Virkningen skal anvendes direkte på et hoved, der har en intakt hovedbunds- og kranietbeskyttelse; (2) hovedet bør ikke immobiliseres under stødeksponering, således at hurtig accelerations-deceleration og rotations- og lineære hovedbevægelser tillades; Og (3) det eksperimentelle design bør omfatte både enkelt- og repetitive regimer, og konsekvenserne skal være milde af naturen uden at forårsage synlige skader, såsom vævsødem, kontusion eller ærlig blødning.
OuR frugtflymodel adskiller sig fra andre metoder, der forårsager traumatisk hjerneskade i fluer 13 , 14 , 15 . Både Bead Ruptor-modellen og HIT-enheden medfører skade med tilfældig slagplacering og styrke. I begge metoder skal variabel antal fluer indeholdt i enten et standard plastikflaske eller et 2 ml skruehovedrør kontakt beholdervæggen og rebound flere gange under hver strejke eller skade. Da fluerne er frit bevægelige inde i beholderen, er de primære skader påført betydeligt forskellige for individuelle fluer, da forskellige dele af deres kroppe og / eller hoveder er skadet af forskellige kræfter. Det er således ikke overraskende, at fluerne under anvendelse af disse modeller led af dysfunktion i tarmbarriere. Dette var direkte korreleret med dødeligheden i begge regimer 13 , 14 , hvilket stærkt indikerer at nPå-neuronale ændringer var ansvarlige for traumeinduceret død i begge systemer. I modsætning hertil er vores metode i stand til gentagne gange at levere direkte hovedpåvirkninger til samme sted. Kroppen er beskyttet mod enhver direkte eksponering, hvilket eliminerer de potentielle forbehold, at døden kan skyldes skade på andre dele af kroppen eller til indre organer. Derudover kan strømningshastigheden af CO 2 -gassen, der anvendes til fremdrift af vægten, reguleres for at opnå kontrolleret, justerbar styrke. Vigtigst er flyvehovedet ikke begrænset på tidspunktet for strejken, hvilket giver mulighed for en meget hurtig accelerations-decelerationsproces, som efterligner den mest almindelige form for mTBI, der forekommer i den menneskelige befolkning 19 .
Selv om det ville være ideelt at installere en automatisk tænd / sluk-knap for at styre CO 2- flowregulatoren, synes den nuværende manuelle omskifter ikke at påvirke slagkraftenes reproducerbarhed, fordi designet af vores enhed alleOws kraften til at blive udøvet hurtigt, når slaghjulet rammer hovedet.
Sammenfattende giver vores system et nyt regime for bedre at efterligne mTBI, der introducerer en ny platform til model CTE. Ligesom andre Drosophila- modeller, der har vist sig værdifulde ved dechiffrering af humane neurodegenerative sygdomme 9 , 20 , forventes det, at den igangværende detaljerede karakterisering af modellen med hensyn til neuronalt tab, tau-hyperphosphorylering, TDP-43 proteinopati og neuroinflammatorisk respons på den påførte mTBI vil Generere vigtige mekaniske indsigter i CTE-sygdomsprocesser og vil hjælpe med at besvare nogle af de kritiske spørgsmål på området.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dette arbejde blev støttet af Johns Hopkins University School of Medicine fakultet startfonds til LC
Acknowledgments
Forfatterne har intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aerosol Barrier | USA Scientific | 1120-8810 | Used as an impactor |
| 200 μL Pipette Tip | USA Scientific | 1111-0706 | Used as a fly head holder |
| 1000 μL Pipette Tip | USA Scientific | 1122-1830 | Used as a connector |
| 1 mL Tuberculin Syringe | Becton Dickinson | 309625 | |
| 60 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | Used as a tracking arenas |
| Flow Regulator | Genesee Scientific | 59-122WC | |
| Standard Clamp Holder/stand | EISCO Scientific | CH0688 | |
| Fine Brush | Genesee Scientific | 59-204 | |
| Flypad | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Sylgard Silicone Elastomer | Dow Corning | 4019862 | |
| CCD Camera | Microsoft | HD-5000 | |
| Ctrax Walking Fly Tracker | Caltech | Ctrax 0.2.11 | |
| MATLAB Image Processing Toolbox | MATLAB | R2015b |
References
- McKee, A. C., et al. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathol. 131, 75-86 (2016).
- Martland, H. S. Punch drunk. JAMA. 91 (15), 1103-1107 (1928).
- Millspaugh, J. A. Dementia pugilistica. US Naval Med Bull. 35, 297-303 (1937).
- Omalu, B. I., et al. Chronic traumatic encephalopathy in a national football league player: part II. Neurosurgery. 59 (5), 1086-1092 (2006).
- Goldstein, L. E., et al. Chronic traumatic encephalopathy in blast-exposed military veterans and a blast neurotrauma mouse model. Sci Transl Med. 4 (134), (2012).
- Mez, J., Stern, R. A., McKee, A. C. Chronic traumatic encephalopathy: where are we and where are we going? Curr Neurol Neurosci Rep. 13 (12), 407 (2013).
- McKee, A. C., et al. The spectrum of disease in chronic traumatic encephalopathy. Brain. 136 (Pt 1), 43-64 (2013).
- Petraglia, A. L., et al. The spectrum of neurobehavioral sequelae after repetitive mild traumatic brain injury: a novel mouse model of chronic traumatic encephalopathy. J Neurotrauma. 31 (13), 1211-1224 (2014).
- Hirth, F. Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (4), 504-523 (2010).
- Littleton, J. T., Ganetzky, B. Ion channels and synaptic organization: analysis of the Drosophila genome. Neuron. 26 (1), 35-43 (2000).
- Appel, L. F., et al. The Drosophila Stubble-stubbloid gene encodes an apparent transmembrane serine protease required for epithelial morphogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 90 (11), 4937-4941 (1993).
- Piyankarage, S. C., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. Nanoliter hemolymph sampling and analysis of individual adult Drosophila melanogaster. Anal Chem. 84 (10), 4460-4466 (2012).
- Katzenberger, R. J., et al. A Drosophila model of closed head traumatic brain injury. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (44), E4152-E4159 (2013).
- Barekat, A., et al. Using Drosophila as an integrated model to study mild repetitive traumatic brain injury. Sci Rep. 6, 25252 (2016).
- Katzenberger, R. J., et al. A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila. J Vis Exp. (e52905), (2015).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Straw, A. D., Dickinson, M. H., et al. Motmot, an open-source toolkit for realtime video acquisition and analysis. Source Code Biol Med. 4 (5), 1-10 (2009).
- Talavage, T. M., et al. Functionally-detected cognitive impairment in high school football players without clinically-diagnosed concussion. J Neurotrauma. 31 (4), 327-338 (2014).
- Theadom, A., et al. Frequency and impact of recurrent traumatic brain injury in a population-based sample. J Neurotrauma. 32 (10), 674-681 (2015).
- Drobysheva, D., et al. An optimized method for histological detection of dopaminergic neurons in Drosophila melanogaster. J Histochem Cytochem. 56 (12), 1049-1063 (2008).
