Summary
Aqui, descrevemos uma nova abordagem para infligir lesões cerebrais traumáticas de cabeça fechada em Drosophila melanogaster . Nosso método tem a vantagem de entregar diretamente impactos repetitivos com força ajustável para a cabeça sozinho. Uma maior exploração do sistema de invertebrados ajudará a iluminar a patogênese da encefalopatia traumática crônica.
Abstract
A encefalopatia traumática crônica (CTE) é uma doença neurodegenerativa estabelecida que está intimamente associada à exposição a lesões cerebrais traumáticas leves repetitivas (mTBI). Os mecanismos responsáveis por suas complexas mudanças patológicas permanecem bastante evasivos, apesar de um consenso recente para definir os critérios neuropatológicos. Aqui, descrevemos um novo método para desenvolver um modelo de CTE em Drosophila melanogaster ( Drosophila ), na tentativa de identificar os genes e caminhos chave que levam ao acúmulo de tau hiperfosforilizado característico e a morte neuronal no cérebro. Os impactos de resistência ajustável para infligir feridas fechadas leves são entregues diretamente na cabeça da mosca, submetendo a cabeça a aceleração e desaceleração rápidas. Nosso método elimina os problemas potenciais inerentes a outros modelos de mTBI de Drosophila ( por exemplo, a morte de animais pode ser induzida por danos aOutras partes do corpo ou órgãos internos). O menor cuidado de animais com uso intensivo de mão-de-obra e custo, vida curta e extensas ferramentas genéticas tornam a mosca da fruta ideal para estudar a patogênese do CTE e possibilitar a realização de telas genéticas e farmacológicas avançadas em grande escala, genômicas. Prevemos que a caracterização contínua do modelo gerará importantes insights mecanísticos sobre prevenção de doenças e abordagens terapêuticas.
Introduction
A Encefalopatia Traumática Crônica (CTE) recentemente foi reconhecida como um distúrbio neurodegenerativo distinto, separado de outras tauopatias, como a doença de Alzheimer 1 . Ao contrário da doença de Alzheimer e outras tauopatias comuns - cujos fatores de risco mais importantes estão avançando em idade e história familiar de demência, o CTE, como indicado pelo seu nome, implica uma estreita associação com história de trauma cerebral, muito provavelmente visto em atletas de esportes de contato, Como boxers e jogadores de futebol, bem como em veteranos militares 2 , 3 , 4 , 5 . É pensado para ser iniciado por golpes repetidos de concussão e subconcussão na cabeça. Os pacientes podem apresentar sintomas e sinais como déficits cognitivos, mudanças de humor e comportamento e disfunção do movimento, que se sobrepõem significativamente com a doença de Alzheimer, frontotemporalDemência, demência do corpo de Lewy e doença de Parkinson 6 . Em contrapartida, os exames pós-mortem do tecido cerebral revelam um padrão distinto de acumulação de tau hiperfosforilada em torno de pequenos vasos sanguíneos nas profundezas dos sulcos corticais, uma característica patognomônica não observada nas outras condições degenerativas 7 . No entanto, até agora, muito pouco se sabe sobre a patogênese que leva à manifestação da doença. Isto é em grande parte devido à falta de um modelo animal fiel - apenas recentemente foram gerados modelos de roedores 5 , 8 . Esses organismos modelo apresentam as desvantagens dos cuidados intensivos em custos e uma vida útil relativamente longa, que não são adequadas para estudos de doenças neurodegenerativas.
Em comparação com homólogos de mamíferos, animais invertebrados, como Drosophila, são uma excelente alternativa, com sua manutenção econômica,Ferramentas extensivas para dissecar determinantes genéticos e vida útil relativamente curta 9 . Notavelmente, a mosca e os cérebros humanos compartilham caminhos molecular e celular evolutivamente conservados, bem como semelhanças anatômicas 10 , 11 , 12 . Dois modelos engenhosos de Drosophila para estudar lesão cerebral traumática foram relatados anteriormente 13 , 14 . O primeiro dispositivo "High Impact Trauma" (HIT) projetado por Katzenberger e colegas continha moscas de movimento livre em um frasco de plástico que estava ligado à extremidade livre de uma mola metálica 13 , 15 . Quando o frasco de plástico foi inclinado verticalmente e liberado, ele atingiu uma almofada de poliuretano e transmitiu trauma para as moscas enquanto eles saltavam para a parede do frasco e se recuperaram. Em contraste, Barekat e colegas desenharam um método de entrega diferente, nósNa plataforma de homogeneizador Omni Bead Ruptor-24 14 . As moscas foram incapacitadas com CO 2 e colocadas em um tubo de rosca de rosca de 2 mL que foi fixado ao homogeneizador e submetido a condições de agitação pré-programadas. Um dos benefícios do uso do sistema de homogeneizador de tecido é que o experimentador poderia modular a intensidade do ferimento, a duração da lesão e o número de episódios de lesões. No entanto, ambos os regimes sofrem a mesma desvantagem: lesões primárias na cabeça são inflacionadas aleatoriamente em termos de localização e força de impacto. Além disso, ambos os métodos resultaram em mortalidade considerável, causada por danos colaterais inevitáveis a outras partes do corpo e órgãos internos. Aqui, descrevemos um novo método para induzir o mTBI nas moscas da fruta. Nosso aparelho consiste em um pêndulo balístico a gás. Comparado com os modelos Drosophila existentes 14 , 15 , nosso método tem a vantagem única de fornecer medidasImpacto de urable, dirigido apenas para a cabeça de mosca de movimento livre, permitindo o controle preciso de vários fatores, como a gravidade do impacto, o intervalo de tempo entre os impactos e o número total de impactos sofridos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Montagem do Dispositivo de Strike ( Figura 1 )
- Remova o êmbolo de uma seringa de tuberculina de 1 ml. Corte o barril na marca de 1 mL.
- Remova uma barreira de aerossol (3 mm de altura x 4 mm de diâmetro) de uma ponta de pipeta de 200 μL e use-a como pêndulo. Coloque o pêndulo dentro do tambor da seringa. Toque suavemente o cano para mover o pêndulo para a extremidade da ponta, com o lado plano cobrindo a abertura do bico.
- Conecte a extremidade da ponta do barril a uma tubulação de plástico que esteja conectada ao regulador de fluxo de dióxido de carbono (CO 2 ) de uma estação de anestesia de Drosophila .
- Segure o tambor verticalmente e aperte-o em um suporte de suporte de braçadeira padrão para que o pêndulo permaneça na parte inferior do barril.
- Modifique uma ponta de pipeta de 200 μL para fazer o suporte da mosca.
- Corte 4 mm da ponta para fazer uma abertura de 0,8 mm de diâmetro, permitindo que apenas a cabeça da mosca seja exposta.
NOTA: o thoRax e todas as outras partes do corpo da mosca permanecerão dentro da ponta da pipeta.
- Corte 4 mm da ponta para fazer uma abertura de 0,8 mm de diâmetro, permitindo que apenas a cabeça da mosca seja exposta.
- Modifique uma ponta de pipeta de 1000 μL e uma tampa de agulha de seringa de 1 mL para fazer o conector.
- Cortar 44 mm da abertura da ponta. Pegue um comprimento de 6 mm de uma tampa da agulha de seringa de 1 mL e empurre-o firmemente no segmento restante da ponta da pipeta de 1.000 μL.
2. Operação do Dispositivo de Strike
- Anestesiar uma única mosca feminina adulta de 2 dias usando CO 2 em uma almofada de mosca.
- Mude-o com cuidado para o suporte da mosca usando uma escova fina. Toque o suporte suavemente para que a cabeça da mosca seja vista fora do extremo da ponta. Se a probabilidade de mosca estiver exposta fora da ponta, remova-a suavemente dentro da ponta com uma agulha de seringa de 1 mL embotada.
NOTA: Certifique-se de manter a probabilidade de mosca dentro do suporte. Caso contrário, a mosca pode morrer por uma lesão de proboscis de sucção. - Aperte a mosca hoPara o tambor da seringa com o conector para que a cabeça da mosca esteja voltada para baixo.
- Ajuste a pressão do gás a 100 kPa. Ajuste o caudal de acordo com o desenho da experiência.
- Ligue e desligue rapidamente o interruptor alternativo do regulador de fluxo para que o pêndulo acerque a cabeça da mosca uma vez.
- Levante o suporte da mosca e mova-o sobre uma almofada de mosca. Inverta o suporte da mosca e toque suavemente o lado para deixar a mosca sair. Deixe a mosca em um frasco vazio para se recuperar.
3. Rastreamento de movimento assistido por vídeo
- Encha uma placa de Petri de 6 cm de diâmetro com elastômero de silício transparente para fazer a arena de rastreamento. Deixe um espaço de 3 mm entre o silício e a tampa do prato para permitir que as moscas caminhem livremente, mas não voam.
- Anestesiar quatro moscas do grupo sham ou tratado cada vez e colocá-las na arena. Deixe as moscas a 22 ° C durante 1 h.
- Posicione uma câmera de dispositivo acoplado por carga (CCD) acima das arenas e grave durante 5 min.
- Analise as trajetórias de movimento gravadas usando o software Ctrax (disponível gratuitamente na Caltech) 16 . Exporte os dados rastreados em um formato compatível com a linguagem de programação (por exemplo, Matlab) e analise os dados com base na distância percorrida por quadro 17 . Calcule a distância média a pé para cada mosca e combine-a com todas as outras moscas / grupos gravados para obter uma distância cumulativa média percorrida pela população de arquivos no mesmo grupo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Para estabelecer um modelo CTE usando Drosophila adulta, determinamos a eficácia do nosso dispositivo ao infligir um único ferimento na cabeça fechada. Para eliminar as variações relativas ao genótipo, ao sexo ou à idade, utilizamos moscas fêmeas Canton-S WT de 2 dias na experiência. Poderíamos facilmente controlar a força do pêndulo, regulando a taxa de fluxo de CO 2 a uma pressão de gás constante de 100 kPa. As moscas expostas a uma única greve com a taxa de fluxo mais alta (15 L / min) exibiram defeitos externos mínimos ( Figura 2 ). Ambos os olhos externos e o lado da boca pareciam intactos. No entanto, descobrimos que uma taxa de fluxo de 15 L / min foi agudamente letal, resultando em menos de 10% de taxa de sobrevivência dentro de 24 h ( Figura 3A ). Em contraste, a exposição a uma greve de 10 ou 7,5 L / min resultou em 61,1% e 96,3% de sobrevida, respectivamente, enquanto em 5,0 e 2,5 L / min taxas de fluxo, todas as moscas sobreviveram a popa24 horas ( Figura 3A ). Portanto, nós padronizamos nossos futuros estudos para a taxa de fluxo de 5,0 L / min CO 2 . Após uma greve a 5,0 L / min, as moscas gradualmente recuperaram sua mobilidade em 4 minutos ( Figura 3B ). Durante as próximas 2 d, sua função locomotora, medida pela capacidade de caminhar, retornou lentamente ao normal ( Figura 3C ). Como avaliação preliminar, esses fenótipos são remanescentes daqueles apresentados por pessoas que sofreram concussão ou níveis leves de trauma 18 . Os pacientes que sofrem de lesão cerebral traumática geralmente apresentam uma deterioração progressiva dos movimentos musculares e morte prematura.
Para avaliar os efeitos a longo prazo de lesões cerebrais múltiplas, aplicamos um protocolo mTBI de cinco greves consecutivas no caudal 5.0 L / min, com períodos de recuperação de 24 h entre cada ataque. Investigar E o impacto do mTBI na função de movimento, usamos um sistema de rastreamento de movimento assistido por vídeo para analisar o comportamento do motor da mosca. Após o envelhecimento das moscas 20 dias após o tratamento, o grupo tratado com mTBI mostrou atividade de caminhada reduzida e distância percorrida em comparação com o grupo simulado ( Figura 4 A & B ; grupo simulado: 6,49 ± 0,72, n = 28 versus grupo tratado: 4,3 ± 0,47, n = 32; p <0,05). Para investigar se as lesões cerebrais repetidas têm algum efeito crônico na sobrevivência, determinamos a vida útil das moscas que sofreram o protocolo mTBI. Mostrado na Figura 4C , em comparação com o grupo simulado (n = 129), as moscas tratadas (n = 100) tiveram uma vida útil mediana substancialmente reduzida (36,9 ± 2,7 Vs. 26,3 ± 0,9 d) e redução significativa da vida útil máxima (49,3 ± 2,4 Vs. 34,7 ± 1,4 d).
1 "class =" xfigimg "src =" / files / ftp_upload / 55602 / 55602fig1.jpg "/>
Figura 1 . Diagrama do Dispositivo Strike. O dispositivo usou materiais que estão prontamente disponíveis em um laboratório de Drosophila : 1) 200 μL de ponta de pipeta, 2) 1 mL de seringa de tuberculina, 3) pêndulo, 4) tubo de conexão enganchado a uma estação de anestesia de Drosophila e 5) conector para apertar a ponta Na seringa. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 2 . Lesões traumáticas de cabeça fechada leves. Uma única batida no maior fluxo de gás não causou dano externo evidente à cabeça, corpo ou apêndices. ( A &B ) Voa infligida por greve. ( C & D ) Sham voa. As moscas falsas sofreram exatamente os mesmos procedimentos que o grupo tratado, incluindo transferências dentro e fora do suporte da mosca, exceto que nenhum pêndulo foi colocado no barril da seringa quando o fluxo de CO 2 foi aplicado. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 3 . O efeito de uma greve única. ( A ) O índice de sobrevivência às 24 h (SI 24 ), definido pela porcentagem de moscas que sobreviveram dentro de 24 h após uma greve, é representado em grapete versus a taxa de fluxo de gás. Moscas que foram atingidas uma vez com a atividade locomotora recuperada pelo fluxo de gás 5.0 L / min comEm 4 min ( B ), e sua mobilidade lentamente restaurada ao normal durante um período de 2 dias ( C) . Barra de erro, erro padrão da média (SEM). Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 4 . Desenvolvimento do modelo mTBI em Drosophila . As greves repetidas ao longo de cinco dias resultaram em atividade locomotora significativamente prejudicada ( A & B ) e vida útil reduzida ( C ). As faixas de passeio representativas gravadas ao longo de 5 min para 4 moscas simuladas e tratadas são mostradas em A. Barras de erro, SEM. * P <0,05, teste U de Mann-Whitney com correção de Bonferroni. Moscas totais: grupo tratado n = 100, grupo simuladoN = 129. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modelos de animais que modelam fielmente as características de CTE, incluindo alterações neurofisiológicas, características neuropatológicas e déficits neurocomportamentais, são essenciais para descobrir mecanismos de doenças e para desenvolver alvos diagnósticos e terapêuticos. É compreensível que nenhum modelo animal de uma doença humana seja perfeito na imitação de todos os pontos finais clinicamente relevantes. No entanto, acreditamos que um modelo CTE robusto deve satisfazer os seguintes três requisitos: (1) o impacto deve ser aplicado diretamente a uma cabeça que tenha proteção de couro cabeludo e crânio intacta; (2) a cabeça não deve ser imobilizada durante a exposição ao impacto, de modo que seja permitida aceleração-desaceleração rápida e movimentos rotativos e de cabeça linear; E (3) o projeto experimental deve incluir regimes individuais e repetitivos, e as conseqüências de impacto devem ser de natureza leve, sem causar dano visível, como edema de tecido, contusão ou hemorragia franca.
OuO modelo da mosca da fruta é distinguido de outros métodos que infligem lesões cerebrais traumáticas em moscas 13 , 14 , 15 . Tanto o modelo Bead Ruptor como o dispositivo HIT infligem feridas com localização e força de impacto aleatório. Em ambos os métodos, números variáveis de moscas contidas em um frasco de plástico padrão ou em um tubo de rosca de 2 mL contatam a parede do recipiente e se recuperam várias vezes durante cada ataque ou ferimento. Uma vez que as moscas são livremente móveis dentro do recipiente, as lesões primárias infligidas são consideravelmente diferentes para as moscas individuais, pois diferentes partes de seus corpos e / ou cabeças estão feridas com forças diferentes. Assim, não é surpreendente que, usando esses modelos, as moscas sofrem de disfunção barreira intestinal. Isso foi diretamente correlacionado com a taxa de mortalidade em ambos os regimes 13 , 14 , indicando fortemente que nAs alterações neuronais foram responsáveis pela morte induzida por trauma em ambos os sistemas. Em contraste, nosso método é capaz de fornecer repetidamente impactos de cabeça direta no mesmo local. O corpo está protegido de qualquer exposição direta, eliminando possíveis advertências de que a morte pode ser causada por danos a outras partes do corpo ou a órgãos internos. Além disso, a taxa de fluxo do gás CO 2 usado para impulsionar o peso pode ser regulada para atingir uma força controlada e ajustável. Mais importante ainda, a cabeça da mosca não é limitada no momento da greve, permitindo um processo de aceleração-desaceleração muito rápido que imita a forma mais comum de mTBI que ocorre na população humana 19 .
Embora seja ideal para instalar um interruptor on / off automático para controlar o regulador de fluxo de CO 2 , o interruptor manual atual não parece afetar a reprodutibilidade da força do impactor porque o design do nosso dispositivo é todoOws a força a ser rapidamente exercida uma vez que o pêndulo atinge a cabeça.
Em resumo, nosso sistema oferece um novo regime para melhor imitar o mTBI, apresentando uma nova plataforma para modelar CTE. Como outros modelos de Drosophila que se mostraram valiosos na decifração de distúrbios neurodegenerativos humanos 9 , 20 , prevê-se que a caracterização detalhada contínua do modelo em termos de perda neuronal, hiperfosforilação de tau, proteinopatia TDP-43 e resposta neuroinflamatória ao mTBI infligido Gerar importantes insights mecanicistas sobre os processos de doença CTE e ajudarão a responder algumas das questões críticas no campo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Este trabalho foi apoiado pelo fundo de iniciação da faculdade de medicina da Universidade Johns Hopkins para LC
Acknowledgments
Os autores não têm nada a divulgar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aerosol Barrier | USA Scientific | 1120-8810 | Used as an impactor |
| 200 μL Pipette Tip | USA Scientific | 1111-0706 | Used as a fly head holder |
| 1000 μL Pipette Tip | USA Scientific | 1122-1830 | Used as a connector |
| 1 mL Tuberculin Syringe | Becton Dickinson | 309625 | |
| 60 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | Used as a tracking arenas |
| Flow Regulator | Genesee Scientific | 59-122WC | |
| Standard Clamp Holder/stand | EISCO Scientific | CH0688 | |
| Fine Brush | Genesee Scientific | 59-204 | |
| Flypad | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Sylgard Silicone Elastomer | Dow Corning | 4019862 | |
| CCD Camera | Microsoft | HD-5000 | |
| Ctrax Walking Fly Tracker | Caltech | Ctrax 0.2.11 | |
| MATLAB Image Processing Toolbox | MATLAB | R2015b |
References
- McKee, A. C., et al. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathol. 131, 75-86 (2016).
- Martland, H. S. Punch drunk. JAMA. 91 (15), 1103-1107 (1928).
- Millspaugh, J. A. Dementia pugilistica. US Naval Med Bull. 35, 297-303 (1937).
- Omalu, B. I., et al. Chronic traumatic encephalopathy in a national football league player: part II. Neurosurgery. 59 (5), 1086-1092 (2006).
- Goldstein, L. E., et al. Chronic traumatic encephalopathy in blast-exposed military veterans and a blast neurotrauma mouse model. Sci Transl Med. 4 (134), (2012).
- Mez, J., Stern, R. A., McKee, A. C. Chronic traumatic encephalopathy: where are we and where are we going? Curr Neurol Neurosci Rep. 13 (12), 407 (2013).
- McKee, A. C., et al. The spectrum of disease in chronic traumatic encephalopathy. Brain. 136 (Pt 1), 43-64 (2013).
- Petraglia, A. L., et al. The spectrum of neurobehavioral sequelae after repetitive mild traumatic brain injury: a novel mouse model of chronic traumatic encephalopathy. J Neurotrauma. 31 (13), 1211-1224 (2014).
- Hirth, F. Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (4), 504-523 (2010).
- Littleton, J. T., Ganetzky, B. Ion channels and synaptic organization: analysis of the Drosophila genome. Neuron. 26 (1), 35-43 (2000).
- Appel, L. F., et al. The Drosophila Stubble-stubbloid gene encodes an apparent transmembrane serine protease required for epithelial morphogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 90 (11), 4937-4941 (1993).
- Piyankarage, S. C., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. Nanoliter hemolymph sampling and analysis of individual adult Drosophila melanogaster. Anal Chem. 84 (10), 4460-4466 (2012).
- Katzenberger, R. J., et al. A Drosophila model of closed head traumatic brain injury. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (44), E4152-E4159 (2013).
- Barekat, A., et al. Using Drosophila as an integrated model to study mild repetitive traumatic brain injury. Sci Rep. 6, 25252 (2016).
- Katzenberger, R. J., et al. A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila. J Vis Exp. (e52905), (2015).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Straw, A. D., Dickinson, M. H., et al. Motmot, an open-source toolkit for realtime video acquisition and analysis. Source Code Biol Med. 4 (5), 1-10 (2009).
- Talavage, T. M., et al. Functionally-detected cognitive impairment in high school football players without clinically-diagnosed concussion. J Neurotrauma. 31 (4), 327-338 (2014).
- Theadom, A., et al. Frequency and impact of recurrent traumatic brain injury in a population-based sample. J Neurotrauma. 32 (10), 674-681 (2015).
- Drobysheva, D., et al. An optimized method for histological detection of dopaminergic neurons in Drosophila melanogaster. J Histochem Cytochem. 56 (12), 1049-1063 (2008).
