Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

בידוד של חלבונים ביניים חלבונים מ רקמות עכבר מרובות לחקר ההזדקנות הקשורים שינויים טרנסלוציוניים

Published: May 18, 2017 doi: 10.3791/55655
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Cell Biology and Physiology, School of Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

בשיטה זו, אנו מציגים תהליכים ביוכימיים לבידוד מהיר ויעיל של חלבונים בינוניים (IF) חלבונים מרקמות עכבר מרובות. IFs מבודד ניתן להשתמש כדי ללמוד שינויים שינויים שלאחר translational ידי ספקטרומטריית מסה בדיקות ביוכימיים אחרים.

Abstract

סיבים בינוניים (IFs), יחד עם חוטים actin ו microtubules, טופס cytoskeleton - מרכיב מבניים קריטיים של כל תא. תפקוד תקין IFs מספקים תאים עם עמידות מכנית ומתח, בעוד cytoskeleton IF מתפקדת פשרות בריאות הסלולר כבר קשור עם מחלות אנושיות רבות. שינויים לאחר טרנספורמציה (PTM) מסדירים בצורה ביקורתית את הדינאמיקה של IF בתגובה לשינויים פיזיולוגיים ובתנאי לחץ. לכן, היכולת לפקח על השינויים בחתימת ה- PTM של IFs יכולה לתרום להבנה תפקודית טובה יותר, ובסופו של דבר מיזוג, של מערכת ה- IF כמגיב מתח במהלך פגיעה סלולרית. עם זאת, מספר גדול של חלבונים IF, אשר מקודדים על ידי יותר מ -70 גנים בודדים לידי ביטוי באופן תלוי רקמות, הוא אתגר גדול במיון את החשיבות היחסית של PTM שונים. לשם כך, שיטות המאפשרים ניטור של PTMs על חלבונים IFעל רמה אורגניזם רחב, ולא עבור בני משפחה מבודדים של המשפחה, יכול להאיץ את התקדמות המחקר בתחום זה. כאן, אנו מציגים שיטות ביוכימיות לבידוד של החלק הכולל, דטרגנט מסיסים, וחלק עמידים דטרגנט של חלבונים IF מ 9 רקמות עכבר שונות (המוח, הלב, הריאות, הכבד, המעי הדק, המעי הגס, הלבלב, הכליות, ו טְחוֹל). אנחנו עוד להדגים פרוטוקול אופטימיזציה לבידוד מהיר של חלבונים IF באמצעות מטריקס lysing ו homogenization אוטומטי של רקמות עכבר שונות. פרוטוקול אוטומטי שימושי עבור אפיון פרופילים IFS בניסויים עם נפח מדגם גבוה (כגון מודלים המחלה מעורבים בעלי חיים מרובים קבוצות ניסיוניות). הדגימות שנוצרו יכול להיות מנוצל עבור ניתוחים במורד שונים, כולל ספקטרומטריית מסה מבוססי ספקטרומטריית מסה. באמצעות שיטות אלה, אנו מספקים נתונים חדשים כדי להראות כי אם חלבונים ברקמות עכבר שונות (המוח והכבד) עוברים שינויים מקבילים לגבי expres שלהםSion רמות ו PTMs במהלך ההזדקנות.

Introduction

IFs הם משפחה של חלבונים שבני אדם מקודדים על ידי 73 גנים ומסווגים לשישה סוגים עיקריים: סוגים I-IV הם cytoplasmic ( כגון אפיתל וקראטינים של שיער (K), דגימת מיוציטים, נוירופילמנטים, חלבון חומצי פיבריללי גלילי (GFAP) ואחרים); סוג V הם lamins גרעיני; וסוג VI הם IFs בעדשת העין 1 . מבחינת האבולוציה המולקולרית שלהם, אם לחלבונים יש שלושה תחומים נפוצים: תחום משוכלל של מוט "סליל", ותחום "ראש" ו"זנב "גלובלי. אם tetramers חלבון להרכיב טופס מבשרי קצר, אשר משולבים בסופו של דבר לתוך חוטים בוגרים כי מבנה מבנים cytoskeletal דינמי מבנים נוקלאוסקלטליים המעורבים בהגנה מכנית 2 , מתח חישה 3 , 4 , תקנה של שעתוק 5 וצמיחה, פונקציות חיוניות אחרות קריטי"> 1 , 6 , 7 .

החשיבות הפונקציונלית של מערכת ה- IF מודגשת על ידי קיומו של מחלות אנושיות רבות הנגרמות על ידי מוטציות של גנים IF, כולל נוירופתיות, מיופתים, הפרעות בשבריריות העור, הפרעות בתפקוד מטבולי ותסמונות מוקדמות של הזדקנות מוקדמת. כמה מוטציות גן IF לא לגרום, אבל predispose נשאים שלהם התקדמות המחלה, כגון קרטין אפיתל פשוט מחלת כבד 9 . זה האחרון בשל הפונקציות הקריטיות להגנה על הלחץ של IFs באפיתליה. IFs באופן כללי הם בין חלבונים הסלולר שופע ביותר בתנאים הבסיסיים, אבל הם עוד יותר המושרה חזק במהלך סוגים שונים של מתח 10 . לדוגמה, מחקרים שנערכו לאחרונה מעריכים את השינויים ב- protea-wide ב- nematode C. elegans שהראו כי מספר רב של IFS הם בעלי רמה גבוהה ונוטים לצבורOn במהלך ההזדקנות האורגניזמים 11 , 12 . מאחר ותחזוקת מבנה IF תקין היא חיונית להתנגדות סלולרית לצורות שונות של לחץ 10 , אם הצבירה עשויה גם היא לתרום לירידה תפקודית במהלך ההזדקנות. עם זאת, מחקרים ברמת האורגניזמים בודקים מספר רב של יונקים חלבונים IF על פני רקמות שונות בלחץ הם חסרים.

IFs הם מבנים דינמיים מאוד להסתגל כדי לענות על דרישות הסלולר. Keratins, למשל, עוברים רכיבה עצמאית ביוסינתזה בין בריכת חלבון מסיס (לא פילמנטית) ו מסיס (נימי) חלבון 13 . בתנאים פיזיולוגיים רגילים כ -5% ניתן להפיק את מאגר K8 / K18 הכולל במאגר ללא חומרי ניקוי, בהשוואה לכ -20% שניתן להסיסם בחומר הניקוי הלא יוניד Nonidet P-40, אשר ניתן להשוותו ביוכימית ל- Triton- X100 14 , 15 . במהלך מיטוזה יש עלייה ניכרת את מסיסות של סוג פשוט אפיתל K8 ו K18 14 , אשר ניכרת פחות אפידרמיס keratins אבל נראה יותר ב vimentin ו III סוג אחר IF חלבונים 15 , 16 . תכונות מסיסות של חלבונים IF הם מוסדרים בחוזקה על ידי זרחון, שינוי שלאחר טרנסלוציאציה המפתח (PTM) עבור סידור נימה מסיסות 17 , 18 , 19 , 20 . רוב ה- IFs עוברים תקנה נרחבת על ידי מספר PTMs באתרים משומרים, וכתוצאה מכך שינויים פונקציונליים 17 .

מטרת שיטה זו היא להציג חוקרים חדשים בתחום IF למיצוי ביוכימי ושיטות אנליטיות לחקר חלבונים אם על פני רקמות עכבר מרובות. ספֵּצִיפִי, אנו מתמקדים בבידוד של חלבונים IF באמצעות שיטת מיצוי מלח גבוהה והערכת שינויים ב- PTM באמצעות ספקטרומטריית מסה ועל-ידי נוגדנים המכוונים ל- PTM. שיטות אלה מבוססות על הליכים שפורסמו בעבר, אך כוללים שינויים לחילוץ סוגים שונים של חלבונים IF כדי לחשוף מנגנון נפוץ לרגולציה בכל רחבי המשפחה. לדוגמה, acetylation K8 ב שאריות ליזין מסוים מסדיר ארגון נימה, בעוד hyperacetylation מקדם K8 מסיסות ויצירת המצרפי 22 . מחקרים גלובליים חדשים proteomic Profiledic יש גם גילה כי רוב הרקמה ספציפית IF חלבונים גם מטרות acetylation וכי רוב אתרי acetylation IF מוגבלים לתחום מוט משומר מאוד. זה מדגיש את הצורך בשיטות המתאימות פרופיל גלובלית של מערכת IF. כמו כן, אנו מציגים שיטה מהירה של בידוד חלבונים IF מ רקמות מרובות באמצעות homogenization אוטומטי Optiמטריצה ​​lysing. ההכנות כתוצאה מתאימים לניתוח PTM במורד הזרם באמצעות ספקטרומטריית מסה ושיטות אחרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול מאושר ומבוצע על פי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש ועדת (IACUC) באוניברסיטת צפון קרוליינה.

1. הכנות

  1. הכן חיץ טריטון- X (1% Triton X-100, 5 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), להעלות את נפח פוספט שנאגרו מלוחים (PBS), pH 7.4). כדי להפוך 500 מ"ל: מערבבים 5 מ"ל כל טריטון X-100 ו 500 מ"מ EDTA לתוך 490 מ"ל של PBS, pH 7.4. חנות Triton-X פתרון חיץ ב 4 ° C.
  2. הכן מאגר מלח גבוהה (10 מ"מ טריס HCl, pH 7.6, 140 מ"מ NaCl, 1.5 M KCl, 5 מ"מ EDTA, 0.5% Triton X-100, להעלות את נפח כפול מזוקקים (DD) H 2 O). כדי להפוך 500 מ"ל: מערבבים 10 מ"ל של 0.5 M Tris-HCl (pH 7.6), 14 מ"ל של 5 M NaCl, 55.9 גרם KCl, 5 מ"ל של 0.5 M EDTA, ו 2.5 מ"ל של טריטון X-100, להתאים את עוצמת הקול ל 500 מ"ל באמצעות מים מזוקקים פעמיים). חנות מלח גבוהה פתרון הצפת ב 4 ° C.
  3. רק לפני השימוש, להשלים כמות נאותה של Triton-X ו- High Salt Buffer (
  4. הכן 5 מ"מ EDTA ב 1x PBS, pH 7.4. כדי להפוך 500 מ"ל: מערבבים 5 מ"ל של 0.5 M EDTA לתוך 495 מ"ל של 1x PBS, pH 7.4.
  5. לבודד את איברי העכבר השונים (מוח, לב, ריאה, כבד, לבלב, המעי הגס, המעי, הכליות, הטחול) באמצעות פרוטוקולים מאושרים אשר תואמים את ההנחיות הוטרינריות ואת הסטנדרטים המוסדיים 23 . הליך איסוף רקמות צריך לקחת לא יותר מ 5 דקות כדי לשמר את ה- RNA ואת שלמות החלבון של רקמות עשירות פרוטאז ( למשל הלבלב צריך להיות מעובד הראשון).
  6. גזור כמות קטנה של רקמות (~ 5-20 מ"ג) ומקום פתרון אחסון RNA, עבור מיצוי RNA הבאים, סינתזה cDNA, כמותי בזמן אמת PCR ניתוח לביטוי IF IF. מקום RNA פתרונות אחסון אחסון עם רקמות על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה וללכת פרוטוקול ליצרן נוסף sTorage ו בידוד צעדים.
  7. חותכים את שאר הרקמה לשברים קטנים יותר ( למשל 0.5 ס"מ) ומקום cryovial. הצמד להקפיא בקבוקונים החנות ב -80 מעלות צלזיוס או חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.

2. אם ביטוי גנים ניתוח

  1. חלץ RNA מ רקמות נשמר ב RNA פתרון מגיב אחסון. השתמש בכל שיטת מיצוי RNA מתאימה / מועדפת בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  2. לכמת ריכוז RNA ולהשתמש 2 מיקרוגרם של RNA לייצר cDNA באמצעות ערכת שעתוק מתאימה לאחור לפי פרוטוקול של היצרן.
  3. באמצעות cDNA שנוצר ועכבר אם הגן ספציפי primers להגדיר תגובות qPCR, כולל שלושה משכפל טכני של כל מדגם, כמו גם שליטה ריקה על פי פרוטוקול של היצרן.
  4. לכמת IF ביטוי גנים כמו שינוי לקפל השוואת תנאים שונים ( למשל, צעירים לעומת רקמות ישנות).

3. עמ 'פיצוי של סך lysates רקמות עבור Immunoblot

  1. Homogenize 25 מ"ג של רקמה 1 מ"ל של 2x לא צמצום חיץ מדגם SDS. להשמיט צבע bromophenol כחול מן המאגר המדגם אם assay חלבון colorimetric היא להתבצע כדי לכמת ריכוז חלבון.
  2. הוסף 5% (V / V) של 2-mercaptoethanol (2-ME) לעשות דגימות מופחת. ΜL 200 של דגימות לא הפחתת, להוסיף 10 μL של 2-ME.
  3. קביעת ריכוז החלבון באמצעות assergant- וצמצום assay חלבון תואם סוכן. אם צבע נכלל כבר במאגר המדגם, כמות החלבון ניתן להעריך לאחר ריצה ג'ל באמצעות מספר טכניקות, כולל קומסי מבוסס כתם 24 .
  4. וורטקס כל דגימות חום ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  5. ביצוע סופג המערבי תחת שני צמצום ולא צמצום התנאים. חשיפה קרום בקצרה (<1 דקות) כדי לחשוף מינים מונומריים, ועוד (> 1 דקות) כדי לחשוף מתחמי המסה המולקולרי גבוה מכילNg אם חלבונים. אם צבירה ניטור, לבחון ג 'ל כולו / קרום (כולל תחתית של בארות ג' ל).
  6. הפעל ג'ל מקביל הכתם עם כתם חלבון כמו בקרת טעינה 24 . במודלי מחלה או ניסויים פציעה סך כתם חלבון יש להשתמש כביקורת העמסה, בניגוד immunoblots עבור "משק בית" חלבונים ( למשל אקטין, GAPDH) כי השינוי האחרון בתנאי לחץ שונים.

הכנת תמציות מסיסות דטרגנט ומלח גבוה של IFs ספציפי רקמות

  1. הוסף 1 מ"ל של קר טריטון X-100 חיץ לתוך homogenizer צינור זכוכית ומניחים אותו על הקרח.
  2. הסר פיסה קטנה של רקמות (~ 25 מ"ג) מן אחסון חנקן נוזלי מקום ישירות homogenizer זכוכית. השתמש העלי polytetrafluethethylene כדי homogenize (50 משיכות) ולהימנע ביצוע בועות. שמור על homogenizer ו lysate קר בכל עת.
  3. העברת lysate ל micr 1.5 מ"לצינור ocentrifuge על קרח צנטריפוגה ב XG 20,000 במשך 10 דקות בצנטריפוגה טרום צונן (4 מעלות צלזיוס).
  4. אסוף את החלק supernatant לתוך צינור נפרד. זהו החלק הטריטון מסיס X, אשר יכול לשמש immunoprecipitation (IP) וניתוח של הבריכה מסיס אבקת של חלבונים IF. שים לב כי צעדים 4.1-4.4 ניתן לחזור על מנת להשיג תמצית IF נקי מ רקמת המוח.
  5. הוסף 1 מ"ל של מאגר מלח גבוהה ל גלולה רקמות, להעביר homogenizer נקי dounce 100 משיכות. מעבירים את homogenate בחזרה לצינור microcentrifuge ומניחים את הצינור על שייקר מסתובב בחדר קר במשך 1 ח.
  6. צנטריפוגה homogenates ב 20,000 xg במשך 20 דקות ב 4 ° C. מחק את supernatant.
  7. הוסף 1 מ"ל של חיץ קר PBS / EDTA חיץ כדי גלולה homogenize גלולה (20 משיכות) ב homogenizer נקי כצעד ניקוי סופי *. העברה צינור חדש צנטריפוגה ב XG 20,000 במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להשיג את החלבון IF-תמצית מלח גבוהה עשירה (HSE).
    * לחלופין, מערבולת במקום homogenization בשלב זה.
  8. מחק supernatant ו לפזר את כדורי μL 300 של חיץ מדגם SDS לא צמצום כי כבר מחומם מראש. לשבור את גלולה בתחילה על ידי pipetting ו vortexing, ולאחר מכן לחמם את דגימות 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס.
  9. וורטקס ו pipet לפי הצורך על מנת להבטיח את גלולה הוא מומס. זה עלול לקחת כמה דקות כדי לפזר את כדורי.
  10. חנות כל דגימות ב -20 מעלות צלזיוס עד הניתוח.

5. אוטומטי תמוגה רקמות עבור אם חלבונים לחלץ ב גבוהה נפח ניסויים

  1. עבור מיצוי רנ"א, חיץ מקום תמוגה (חיץ μL 600 לכל 25 מ"ג של רקמה) בצינור המכיל lysing מטריצה ​​D (משתמשת קרמיקה קטנים) ואת הדופק פעמיים במשך 25 של lyser רקמות. נפרד lysate מן המטריצה ​​על ידי צנטריפוגה ב XG 20,000 ו להמשיך לשלב הבא בבידוד.
  2. עבור מיצוי חלבונים, מקום Tritעל X-100 (או חיץ מדגם SDS אם הכנת lysate הכולל) בצינור lysing עם lysing מטריצה ​​SS (שימוש יחיד חרוז נירוסטה). לאחר בדיקת מטריצות מרובות, זה נבחר כי הוא מייצר אם תמציות חלבון כי הם באיכות דומה כמו השיטה douncing המסורתית. שים לב כי השיטה האוטומטית אינה אופטימלית ללבלב וטחול, ואת פרוטוקול homogenization סטנדרטי צריך לשמש רקמות אלה.
  3. כדי להמשיך בהכנה של מלח גבוהה לחלץ, להסיר את חרוז נירוסטה מן הצינור באמצעות מגנט, ו צנטריפוגה צינורות ב XG 20,000 דקות 10 ב 4 ° C.
  4. המשך עם שלב 4.4 (לעיל) של פרוטוקול ידני.
  5. חנות כל דגימות ב -20 מעלות צלזיוס עד הניתוח.

6. אימונו-העשרה של חלבונים IF לאחר טרנספורמציה השתנה

  1. הכן חיץ PBST (0.02% Tween-20 ב PBS). כדי להפוך 50 מ"ל, להוסיף 10 μL של Tween-20 ל 50 מ"ל של PBS, pH 7.4.
  2. הכן נוגדנים PTMפתרון (1-10 מיקרוגרם של נוגדן μL 200 של PBST). באופן כללי, 3 מיקרוגרם של נוגדנים / תגובה הוא מצב התחלה טובה שיכולה להיות אופטימיזציה נוספת אם יש צורך.
  3. עבור כל תגובה, aliquot 50 μL של חרוזים מגנטיים לתוך צינור microcentrifuge, במקום על מגנט לשאוב את פתרון אחסון חרוז.
  4. Conjugate החרוזים כדי הנוגדנים immunoprecipitation ידי השעיית מחדש בפתרון נוגדן ו דוגרים על rotator (סוף סוף, כדי להבטיח ערבוב של כרכים קטנים) בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
  5. מניחים את הצינורות על מגנט לשאוב נוגדן פתרון.
  6. יש לשטוף את החרוזים נוגדנים מצומדות פעם 200 PBST μL ולהסיר חיץ לשטוף.
  7. הוסף 0.6-1 מ"ל של lysate רקמה החרוזים, לערבב על ידי pipetting עדין דגירה במשך 3 שעות על מסובבת בחדר קר.
  8. מניחים צינורות על מגנט, להסיר lysate, לשטוף את החרוזים חמש פעמים עם 200 μL של PBST. לאחר השלב האחרון כביסה, לאסוף את חרוזים ב 100 _6; L של PBS (לא Tween-20) ולהעביר צינור חדש נקי. מניחים את הצינור על המגנט.
  9. לשאוב את PBS ולהוסיף 100 μL של חיץ מדגם שאינו צמצום. הסר 50 μL ולהוסיף 2-ME (5%) לעשות דגימות הפחתת. מחממים את הדגימות ל 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  10. להפריד את שבב ה- IP מן חרוזים על המגנט ולאסוף אותו לתוך צינור חדש.
  11. חנות דוגמאות ב -20 מעלות צלזיוס עד הניתוח.

7. הכנה של דוגמאות חלבון IF עבור ניתוח ספקטרומטריית מסה

  1. תזמון התייעצות עם מומחה proteomics לפני תחילת המחקר שכן יש זמן משמעותי ועלות מעורב עם ניתוח ספקטרומטריית מסה.
  2. קח אמצעי זהירות מיוחדים כדי למנוע זיהום. ידית את כל הג'לים עם כפפות נקי דגירה במיכלים נקיים, שטף רק באמצעות dDH 2 O (למנוע סבון).
  3. הפעל 20-50 μL של מדגם HSE (מסעיפים 4 ו -5) על ג'ל SDS-PAGE על פי התנאים הסטנדרטיים.
    4. כתם עם כתם חלבון עבור 1 שעות. יש לשטוף מספר פעמים ו de-stain ב DDH 2 O לילה. IF להקות חלבון צריך להיות גלוי בקלות לאחר דה מכתים.
  4. מניחים את הג'ל בין מגיני גיליון פלסטיק, לסרוק ולסמן את להקות כי יהיה נכרת ונשלח לניתוח.
  5. הבלו את להקות חלבון IF באמצעות תער נקי חדש.
  6. מניחים את להקות ג'ל צינורות microcentrifuge נקי להעביר למסוף ספקטרומטר מסה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שיטה חדשה מהירה עבור מיצוי מבוסס מלח גבוהה של חלבונים IF מ רקמות העכבר מרובים באמצעות מטריקס lysing.

השיטה המסורתית 25 , 26 של בידוד חלק הארי של חלבון חלבונים ביניים חלק מרקמת אפיתל שונה כאן לכלול 9 איברים שונים הליך מהיר יותר עבור תמוגה רקמות. בעוד 3 צעדים homogenization ידני נדרשים לשיטה המסורתית, ההליך שונה רק 1 צעד homogenization ידני, אשר מקצר את ההליך על ידי מספר שעות, במיוחד כאשר עיבוד יותר מ 6 דגימות. איור 1A מראה תוצאה אופיינית של HSEs מ 9 רקמות העכבר, בעוד השולחן של חלבונים צפוי ברקמת המשקל המולקולרי של כל חלבון מוצג באיור 1B

כבד K8 ו K18 הם upregulated חזק ועוברים זרחון מוגברת acetylation ליזין בכבד עכברים ישנים.

איור 2 מציג תוצאות אופייניות מכמה מן הניתוחים המתוארים בפרוטוקול זה. פאנל A מתאר ניתוח ביטוי של שני הגנים העיקריים IF בכבד, קראטין 8 ( KRT8 )ו קרטין 18 ( KRT18 ), אשר לקודד את החלבונים IF K8 ו K18, בהתאמה. קרטינים אפיתל הם upregulated חזק תחת תנאי מתח שונים. בתוצאה המוצגת, זה קורה במהלך ההזדקנות, שכן KRT8 הוא upregulated באופן משמעותי בכבד של עכברים 24 מ 'הישן לעומת 3 מ' עכברים ישנים. התוצאות ברמת החלבון בולטות יותר, כפי שנצפה על ידי העלייה הדרמטית במונומר K8, כמו גם במתחמי המסה המולקולריים הגבוהים בכבדים הישנים (24 ​​מ '). קומאסי מבוסס חלבון כתם כאן משמש בקרת הטעינה כדי להבטיח טעינה שווה של חלבון על פני דגימות. שים לב עם סך lysates רקמות קל לעבד חלבון על ג'ל, כפי שהוא במקרה זה. טעינת נפח קטן יותר או דילול המדגם נוסף במאגר נתרן dodecyl sulfate (SDS) חיץ יהיה להקל על בעיה זו (במיוחד אם זה נראה צמיג וקשה pipet). לוח C מתאר תוצאה אופיינית מן הכבד מלח גבוהה חלץ שהושג באמצעות פרוטוקול אוטומטי, demOnstrating את העשרה חזקה של קרטינים 8 ו 18 על הג'ל. הקווים האדומים מסמנים את השטח שנחסש והוגש לניתוח ספקטרומטריית מסה. בלוח D התוצאות של ניתוח המסה spec של דגימות בלוח ג מראה כי K8 ו K18 בכבד הישן יש זרחון מרובים אתרי acetylation שאינם נמצאים הכבד הצעיר.

GFAP הוא upregulated חזק ו lysine acetylated במוח מן עכברים ישנים.

איור 3 מדגים כי השיטות המשמשות לחלץ IFs מ epithelia יכול לשמש גם על רקמת לא אפיתל. יתר על כן, התוצאות חושפות דפוס כללי עבור upregulation תלוי הזדקנות של גנים וחלבונים IF. התוצאה qPCR באיור 2A מגלה אינדוקציה פי 5 של GRAP mRNA במוח של עכברים 24 מ 'לעומת 3 מ' עכברים ישנים. איור 2 במגלה חלבונים סה"כ נוכח חלק טריטון X-100 ו- HSE מועשר IF. הערה הגידול בעוצמת הלהקה ב 50 kDa מסומן על ידי החץ (המקביל GFAP) במוח הישן. ניתוח כתם המערבי בתרשים 2C עוד מגלה את upregulation של GFAP ונוכחות משמעותית של מונומר GFAP פוטנציאל מורכבות המסה המולקולרית גבוהה בחלק טריטון X-100 (שניהם מסומנים על ידי החצים). ניתוח כתם המערבי של דגימות אותו עם פאן אצטיל ליזין נוגדן מראה כי הנוגדן מזהה הלהקה ב ~ 50 kDa ב HSE של המוח עכבר הישן ב ~ 250 kDa ב טריטון X-100 שבר ( איור 2 ד ). אימונו - העשרה של חלבונים אצטילטד מ Triton X-100 שברים מגלה נוכחות מוגברת של חלבון GFAP ב lysate המתקבל מן המוח הישן. צמצום ולא צמצום התנאים מוצגים להדגיש מונומר GFAP ו מתחמי המסה המולקולריים גבוהה. ניתוח ספקטרומטריית מסה (בדומה לתרשים 1)

איור 1
איור 1: תמוגה אוטומטית ומיצוי של חלבונים IF מ רקמות העכבר מרובים. ( א ) ג 'ל מבוסס ג' ל הכתם של HSEs מן הרקמות העכבר המיועד. הרקמות המוצגות התקבלו מאותו עכבר מבוגר (3 מ ') CBA זכר. הדגימות עובדו כמתואר בסעיף 5. המוח : שים לב כי NFL, NFM, ו NFH הם phosphorylated 27 ו נודדים לאט יותר מהצפוי, ב ~ 70, 145, ו 200 kDa, בהתאמה. לב : בנוסף הלהקה 53 kDa המקביל desmin ו vimentin), דגימות הלב מכילים גם ~ 42 kDa הלהקה, ככל הנראה המייצג אקטין, אשר ידוע שיתוף לטהר עם desmin 28 . LArge intestine: זהותו של הלהקות הבולטות מעל 25 kDa כי הם שחולצו עם K8 / K18 אינם ידועים, אבל להקות אלה אינם נוכחים אם הרקמות מעובדים באמצעות השיטה homogenizer dounce המסורתית. לבלב וטחול : שים לב כי homogenization אוטומטי אינו מתאים לבידוד של קרטינים מ לבלב ו vimentin מהטחול, ככל הנראה בגלל הרגישות של lysate לעלייה קלה בטמפרטורה במהלך הדופק של ליזר רקמות. ( ב ) לוח המציג את סוגי החלבון העיקריים IF נוכח ברקמות השונות ואת המשקל המולקולרי החזוי שלהם כנקודת התייחסות לפאנל A. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: מולקולהAr והבדלים ביוכימיים בכבד קרטינים מעכברים צעירים ומבוגרים. ( א ) ניתוח של KRT8 ו KRT8 mRNA באמצעות נוהל סטנדרטי (פרוטוקול 1) מגלה אינדוקציה משמעותית בתמליל KRT8 בכבד עכברים ישנים. N = 6 עבור כל תנאי (3 זכר ו 3 נקבה CBA עכברים היו בשימוש לכל קבוצה). ** p <0.01; חד-כיווני חד-כיווני. ( B ) סך lysates כבד התקבלו 3 צעירים (3 חודשים) ו 3 הישן (24 חודשים) זכר עכברים CBA באמצעות פרוטוקול 2 ואת הדגימות נותחו תחת תנאים שאינם צמצום. נוגדן TS1 שימש כדי לחקור את הביטוי K8 ו מבוסס קומאסי מבוסס חלבון כתם שימש בקרת הטעינה. ( ג ) תמציות מלח גבוהה של כבדי עכבר צעירים וזקנים, המתאים עכברים # 1 ו # 4, בהתאמה מהלוח ב. שני החצים מצביעים על K8 ו K18 על הג'ל ואת התיבה האדומה מציין את החלק של הג'ל שהיה נכרת והוגש לניתוח ספקטרומטריית מסה. ( ד אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: הבדלים מולקולריים וביוכימיים GFAP מהמוח של עכברים צעירים וישנים. ( א ) ניתוח של mRNA GFAP באמצעות הליך סטנדרטי (פרוטוקול 1) מגלה אינדוקציה משמעותית במוח מן עכברים ישנים. N = 6 עבור כל תנאי (3 זכר ו 3 נקבה CBA עכברים היו בשימוש לכל קבוצה). ** p <0.01; חד-כיווני חד-כיווני. ( ב ) כתם חלבון מבוסס קומסי של טריטון X-100 ו שברים HSE מ רקמת המוח של צעיר (3 חודשים) ו הישן (בן 24 חודשים) העכבר. שים לב לעלייה ~ 50 kDa GFAP הלהקה ב- HSE מן המוח הישן (חץ). ( ג ) GFאימונובלוט AP (עכבר חד שבטי, שיבוט GA5) של אותם דגימות כמו פאנל B. ( D ) אימונובלוט אצטיל ליזין (ארנב פוליקלונאל, Abcam ab80178) של דגימות אותו כמו בלוח ב '( ה ) GFAP כתם לאחר immunoprecipitation עם אצטיל- נוגדן ליזין. דוגמאות נותחו תחת הפחתת (NR) וצמצום (R) תנאים וחצים הצבע כדי להגדיל את הנוכחות של GFAP ב immunoprecipitate מן המוח הישן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיטות המאפשרות אפיון ביוכימי של חלבונים IF יכול להיות שימושי כדי להבין תופעות פתופיזיולוגיות רבות במערכות יונקים, שכן אם חלבונים הם גם סמנים מאפננים של מתח הסלולר והרקמה 29 . העיקרון שמאחורי השיטה הנוכחית מבוסס על ההליכים הראשונים שפותחו בשנות השבעים והשמונים על מנת לבודד, להפריד ולבנות מחדש חלבונים IF מתאים ורקמות, בדרך כלל באמצעות פתרונות מלח נמוכה וגבוהה וחומרי ניקוי Triton-X100 25 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 . לקבלת תובנה היסטורית של מחקרים שתמכו בידוד ביוכימי של חלבונים IF ראה ביקורות האחרונות 36 , 37 . השיטה הנוכחיתמבוסס על פרוטוקולים מאוחרים יותר שפותחו עבור המחקר של קרטין אפיתל פשוט 26 . היתרון של השיטה הוא שזה יכול לשמש צעד ראשוני כדי לאפשר לחוקרים חדשים בתחום IF לבודד ביעילות חלבונים IF מרוב הרקמות יונקים. היא מייצגת מדריך חזותי של הליכים הקשורים כי נמצאים בשימוש נרחב על ידי חוקרים בתחום ללמוד אם ויסות חלבון 21 , 38 .

טכניקה זו יכולה לשמש כדי ללמוד את הרגולציה ואת הפונקציה של IFs במנגנוני תקשורת מתח בין רקמות יונקים 39 , 40 . זה הופך להיות מעריך כי הלחץ ברקמה אחת יכולה להשפיע על תפקודם של רקמות אחרות, למשל בתנאים של לחץ תזונתי 41 , חלבון misfolding 42 , מטבולית מתח 43 , ו oth- שינויים. ראוי לציין, שרוב העבודה נעשית כעת בתחום זה ב Drosophila ו- C. elegans מודלים, בעוד מחקרים על התגובות ללחץ נרחב במערכות יונקים חסרים. כמו הרגולטור העיקרי של הלחץ הסלולרי 10 , מערכת IF יכול לפתוח רמזים לתגובות הלחץ ברמת האורגניזם, אשר יכול להיות השלכות משמעותיות המחלה. ככזה, פרוטוקול הנוכחי ניתן להשתמש כדי ללמוד מנגנוני פתופיזיולוגי העולמי מודלים עכבר שונים של מתח, פציעה ומחלות.

מגבלה אחת של הטכניקה הנוכחית היא כי תמציות מלח גבוהות נחשבים ההכנות "גס" אם הם מכילים גם חלבונים הקשורים IF אחרים, כגון plectin למשל 44 . כפי שמוצג בעבר, HSEs יכול להיות denatured ב 8 M אוריאה חיץ להשיג חלבונים IF טהור מאוד כי הם מסוגלים במבחנה מחדש הרכבה במאגר פוספט 44 . לאחר שני מחזורים כאלה שלפירוק מחדש הרכבה, stoichiometry של חלבונים IF (מבודד תאים Hella) נשאר זהה, ואילו טיפול אוריאה הוסרו plectin 44 . במהלך טיהור desmin, אקטין ניתן להסיר ידי solubilization של HSE בחומצה אצטית 45 . בין אם יש לכלול שלבי טיהור נוספים, תלוי במטרה הסופית של הניסוי. לדוגמה, אם המטרה היא לאפיין את מצב הרכבה וליצור IFs מחדש vitro, שלב אוריאה נדרש להשיג חלבונים IF טהור מאוד. מצד שני, אם המטרה היא לזהות קשרים תלויי הקשר בין IFs לבין חלבונים תאיים אחרים, אז ההכנות "גולמי" ניתן להשתמש. חלבונים אינטראקציה יכולה להיות מזוהה על ידי ספקטרומטריית מסה באמצעות או לעיכול ג'ל עבור מטרות שפע שפע הנראה על ידי כתם ג 'ל, או ב-פתרון digest עבור מטרות שפע נמוכה. מחקרים קודמים באמצעות immunoprecipitation של IFS מסיסים detersent ו HSEsהמכיל חלבונים IF זיהו פונקציונלית אינטראקציה ספציפית ספציפית בין קרטינים 8/18 ו הלם חום חלבון 70 (Hsp70), אשר potentiated לאחר מתח חום 46 , חלבון מתאם 14-3-3 לאחר זרחון 47 , K8 / K8 / בתנאים פיזיולוגיים רגילים. הפרוטוקול הנוכחי יכול לאפשר מחקרים דומים על חלבונים IF אחרים.

השימוש במטריצה ​​lysing הוא שינוי מפתח מן השיטות הקודמות צריך לאפשר מיצוי מהיר של IFs מרקמות מרובות, למעט הלבלב והטחול. אוטומציה של השלבים הראשונים יכול להיות שימושי במיוחד עבור נפח גבוה ניסויים העכבר. לדוגמה, בידוד חלבונים IF מ 3 רקמות שונות מ 10 עכברים לכל תנאי ( למשל נורמלי צורה כלשהי של מתח מערכתי או מחלה) ידרוש עיבוד של 60 רקמות בודדות. באמצעות השיטה הידנית המסורתית זה woUld צריך להיעשות אצוות יכול לקחת כמה ימים. עם זאת, באמצעות שיטה אוטומטית עם מטריצה ​​lysing, ההליך יכול להיעשות רק כמה שעות. צעדים קריטיים של ההליך כוללים: הבטחת המדגם נשאר קר לאורך כל התהליך; הדגירה במאגר מלח גבוהה עבור 1 שעות (שלב 4.5); באמצעות חיץ חם ו vortexing נרחב כדי להבטיח resuspension מלאה של גלולה לפני ניתוח (שלב 4.8); ו לוקחים את כל אמצעי הזהירות כדי למנוע זיהום של דגימות להיות מנותח על ידי ספקטרומטריית מסה (שלב 7.2).

החיסרון העיקרי לזיהוי המוני ספקטרומטריית מסה של אתרי PTM הוא שזה עובד טוב מאוד עבור PTMs מסוימים - זרחון acetylation ליזין להיות דוגמאות הממשלה - אבל אחרים, כגון sumoylation הם הרבה יותר מאתגר 49 . עם זאת, proteomics הוא כלי רב עוצמה לחקר הרגולציה חלבון ברקמות נורמלי וחולה. Agnetti et al. הידור מקיףסקירה עדכנית של טכניקות proteomic חיתוך קצה כיום בשימוש ללמוד PTM שונים בהקשר של חלבונים לידי ביטוי רקמות 50 . מטרת השיטה הנוכחית היא ליצור דוגמאות שניתן ליישם עבור סוגים שונים של ניתוחים. לדוגמה, Sumoylation חוץ גופית יכול להתבצע על חיסון IF חיסונים IF, sumoylation הכולל ניתן להעריך על IFs מבודדים בהכנות HSE באמצעות נוגדנים ספציפיים סומו 18 , 21 . לכן, היישום של שיטה זו אינה מוגבלת ליצירת דגימות רק עבור ניתוח ספקטרומטריית מסה, אבל ניתן להשתמש כדי לחקור תכונות IF מרובים באמצעות מגוון רחב של טכניקות במורד הזרם.

אם חלבונים מוסדרים באופן נרחב על ידי PTMs רבים באתרים משומרים, וכתוצאה מכך שינוי מסיסות, הרכבה נימה, אינטראקציות חלבון 17 . לאחרונה ההתקדמות הטכנולוגית יש unveiled tהוא גודל מדהים, המורכבות, ומשמעות המחלה של שינויים לאחר translational (PTM) על חלבונים סלולריים 51 , 52 , 53 . שיפור בשיטות האיתור של PTM, כגון זרחן 54 ואצטילציה 51 , הניבו קטלוגים עצומים של נתונים, אך הבנת המשמעות הביולוגית שלהם - פיצוח "קוד ה- PTM" - הוא אתגר גדול שנותר 55 , 56 . אחת הדרכים להעריך את התפקידים הפונקציונליים והמשמעות היחסית של כל PTM היא לקבוע עד כמה היא נשמרת על פני מספר חברים של חלבון IF המשפחה. לדוגמה, זיהוי של אתר phospho-tyrosine חדש על K8 גילה כי אתר זה נכלל בתוך מוטיב QYE למצוא למעשה את כל חלבונים IF cytoplasmic קריטי להסדרת מסיסות חלבון IF ו filament dy57 . חשוב לציין, מוטציה של שאריות טירוזין משומר על GFAP לחומצה אספרגית טעונה שלילית "phosphomimic" (Y242D) גורם למחלת אלכסנדר 58 . הנתונים המייצגים המוצגים כאן מדגימים כיצד שני סוגים שונים של חלבונים ספציפיים ל- IF (K8 ו- GFAP) עוברים דפוס דומה של upregulation ואסטילציה מוגברת במהלך ההזדקנות, אשר עשויה להיות השפעה של חילוף חומרים שונה 22 , 51 . דוגמה זו ממחישה את התועלת של השיטה בהבנת הפונקציה של חלבונים IF בקנה מידה פיזיולוגי עולמי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי NIH מעניקה NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS], ו P30 DK034987 [ל UNC- קפלה היל]. המחברים מודים Deekshita Ramanarayanan לעזרה עם qPCR וניסוי כתם המערבי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynabeads Protein G ThermoFisher Scientific 10009 immunoprecipitation beads
PBS ThermoFisher Scientific 10010049 for buffers
Purelink RNA mini kit ThermoFisher Scientific 12183018 RNA extraction from tissue
Purelink DNAse set ThermoFisher Scientific 12185010A on column DNA digestion
Dynamag-2 ThermoFisher Scientific 12321D magnet for use with dynabeads
GelCode Blue Stain Reagent ThermoFisher Scientific 24592 mass spectrometry-compatible gel stain
Pierce ECL Western Blotting Substrate ThermoFisher Scientific 32106 for use in western blot
High Capacity cDNA reverse transcription kit ThermoFisher Scientific 4368813 for use in gene expression analysis
Proflex 3 x 32-well PCR System ThermoFisher Scientific 4484073 PCR system
PVDF transfer membrane  ThermoFisher Scientific 88520 for western blot
Power Up SYBR master mix ThermoFisher Scientific A25778 for qPCR analysis
RNAlater ThermoFisher Scientific AM7020 solution for tissue storage prior to RNA isolation
Novex 4-20% Tris Glycine Gel ThermoFisher Scientific XP04205BOX Precast protein gel
Anti-Keratin 8 antibody (TS1) ThermoFisher Scientific MA514428 for western blot detection of K8
Anti-Vimentin ThermoFisher Scientific MA511883 for western blot detection of vimentin
Tris Glycine Transfer Buffer (25x) ThermoFisher Scientific LC3675 for wet transfer of protein gels
2x SDS Sample Buffer ThermoFisher Scientific LC2676 for preparing protein gel samples
Tris Glycine SDS Running Buffer (10x) ThermoFisher Scientific LC26755 for running protein gels
Lysing beads - Matrix D MP Biomedicals 116913100 Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction
Lysing beads - Matrix SS MP Biomedicals 116921100 Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction
NanoDrop Lite Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-LITE measurement of protein and nucleic acid
Precellys 24 homogenizer Bertin Instruments EQ03119 Automated tissue homogenizer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eriksson, J. E., et al. Introducing intermediate filaments: from discovery to disease. J Clin Invest. 119 (7), 1763-1771 (2009).
  2. Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function. J Biol Chem. 290 (28), 17145-17153 (2015).
  3. Perez-Sala, D., et al. Vimentin filament organization and stress sensing depend on its single cysteine residue and zinc binding. Nat Commun. 6, 7287 (2015).
  4. Dialynas, G., et al. Myopathic lamin mutations cause reductive stress and activate the nrf2/keap-1 pathway. PLoS Genet. 11 (5), e1005231 (2015).
  5. Hobbs, R. P., et al. Keratin-dependent regulation of Aire and gene expression in skin tumor keratinocytes. Nat Genet. , (2015).
  6. Chung, B. M., Rotty, J. D., Coulombe, P. A. Networking galore: intermediate filaments and cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 600-612 (2013).
  7. Gruenbaum, Y., Aebi, U. Intermediate filaments: a dynamic network that controls cell mechanics. F1000 Prime Rep. 6, (2014).
  8. Omary, M. B. "IF-pathies": a broad spectrum of intermediate filament-associated diseases. J Clin Invest. 119 (7), 1756-1762 (2009).
  9. Omary, M. B., Ku, N. O., Strnad, P., Hanada, S. Toward unraveling the complexity of simple epithelial keratins in human disease. J Clin Invest. 119 (7), 1794-1805 (2009).
  10. Toivola, D. M., Strnad, P., Habtezion, A., Omary, M. B. Intermediate filaments take the heat as stress proteins. Trends Cell Biol. 20 (2), 79-91 (2010).
  11. Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging. C. elegans. Cell. 161 (4), 919-932 (2015).
  12. David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in. C. elegans. PLoS Biol. 8 (8), (2010).
  13. Windoffer, R., Beil, M., Magin, T. M., Leube, R. E. Cytoskeleton in motion: the dynamics of keratin intermediate filaments in epithelia. J Cell Biol. 194 (5), 669-678 (2011).
  14. Chou, C. F., Riopel, C. L., Rott, L. S., Omary, M. B. A significant soluble keratin fraction in 'simple' epithelial cells. Lack of an apparent phosphorylation and glycosylation role in keratin solubility. J Cell Sci. 105 ( Pt. 2, 433-444 (1993).
  15. Omary, M. B., Ku, N. O., Liao, J., Price, D. Keratin modifications and solubility properties in epithelial cells and in vitro). Subcell Biochem. 31, 105-140 (1998).
  16. Lowthert, L. A., Ku, N. O., Liao, J., Coulombe, P. A., Omary, M. B. Empigen BB: a useful detergent for solubilization and biochemical analysis of keratins. Biochem Biophys Res Commun. 206 (1), 370-379 (1995).
  17. Snider, N. T., Omary, M. B. Post-translational modifications of intermediate filament proteins: mechanisms and functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 163-177 (2014).
  18. Snider, N. T., Weerasinghe, S. V., Iniguez-Lluhi, J. A., Herrmann, H., Omary, M. B. Keratin hypersumoylation alters filament dynamics and is a marker for human liver disease and keratin mutation. J Biol Chem. 286 (3), 2273-2284 (2011).
  19. Eriksson, J. E., et al. Specific in vivo phosphorylation sites determine the assembly dynamics of vimentin intermediate filaments. J Cell Sci. 117 (Pt. 6, 919-932 (2004).
  20. Sahlgren, C. M., et al. Mitotic reorganization of the intermediate filament protein nestin involves phosphorylation by cdc2 kinase). J Biol Chem. 276 (19), 16456-16463 (2001).
  21. Snider, N. T., Omary, M. B. Assays for Posttranslational Modifications of Intermediate Filament Proteins. Methods Enzymol. 568, 113-138 (2016).
  22. Snider, N. T., et al. Glucose and SIRT2 reciprocally mediate the regulation of keratin 8 by lysine acetylation. J Cell Biol. 200 (3), 241-247 (2013).
  23. Danneman, P., Suckow, M. A., Brayton, C., Suckow, M. A. The laboratory mouse. , 2nd edn, CRC Press. (2013).
  24. Weiss, W., Weiland, F., Gorg, A. Protein detection and quantitation technologies for gel-based proteome analysis. Methods Mol Biol. 564, 59-82 (2009).
  25. Achtstaetter, T., Hatzfeld, M., Quinlan, R. A., Parmelee, D. C., Franke, W. W. Separation of cytokeratin polypeptides by gel electrophoretic and chromatographic techniques and their identification by immunoblotting. Methods Enzymol. 134, 355-371 (1986).
  26. Ku, N. O., et al. Studying simple epithelial keratins in cells and tissues. Methods Cell Biol. 78, 489-517 (2004).
  27. Julien, J. P., Mushynski, W. E. Multiple phosphorylation sites in mammalian neurofilament polypeptides. J Biol Chem. 257 (17), 10467-10470 (1982).
  28. Hubbard, B. D., Lazarides, E. Copurification of actin and desmin from chicken smooth muscle and their copolymerization in vitro to intermediate filaments. J Cell Biol. 80 (1), 166-182 (1979).
  29. Ku, N. O., Strnad, P., Bantel, H., Omary, M. B. Keratins: Biomarkers and modulators of apoptotic and necrotic cell death in the liver. Hepatology. 64 (3), 966-976 (2016).
  30. Huiatt, T. W., Robson, R. M., Arakawa, N., Stromer, M. H. Desmin from avian smooth muscle. Purification and partial characterization. J Biol Chem. 255 (14), 6981-6989 (1980).
  31. Zackroff, R. V., Goldman, R. D. In vitro assembly of intermediate filaments from baby hamster kidney (BHK-21) cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (12), 6226-6230 (1979).
  32. Franke, W. W., Schmid, E., Osborn, M., Weber, K. The intermediate-sized filaments in rat kangaroo PtK2 cells. II. Structure and composition of isolated filaments. Cytobiologie. 17 (2), 392-411 (1978).
  33. Small, J. V., Sobieszek, A. Studies on the function and composition of the 10-NM(100-A) filaments of vertebrate smooth muscle. J Cell Sci. 23, 243-268 (1977).
  34. Dahl, D., Bignami, A. Glial fibrillary acidic protein from normal human brain. Purification and properties. Brain Res. 57 (2), 343-360 (1973).
  35. Steinert, P. M., Idler, W. W., Zimmerman, S. B. Self-assembly of bovine epidermal keratin filaments in vitro. J Mol Biol. 108 (3), 547-567 (1976).
  36. Goldman, R. D., Cleland, M. M., Murthy, S. N., Mahammad, S., Kuczmarski, E. R. Inroads into the structure and function of intermediate filament networks. J Struct Biol. 177 (1), 14-23 (2012).
  37. Oshima, R. G. Intermediate filaments: a historical perspective. Exp Cell Res. 313 (10), 1981-1994 (2007).
  38. Mashukova, A., Forteza, R., Salas, P. J. Functional Analysis of Keratin-Associated Proteins in Intestinal Epithelia: Heat-Shock Protein Chaperoning and Kinase Rescue. Methods Enzymol. 569, 139-154 (2016).
  39. Schinzel, R., Dillin, A. Endocrine aspects of organelle stress-cell non-autonomous signaling of mitochondria and the ER. Curr Opin Cell Biol. 33, 102-110 (2015).
  40. Taylor, R. C., Berendzen, K. M., Dillin, A. Systemic stress signalling: understanding the cell non-autonomous control of proteostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 211-217 (2014).
  41. Lemieux, G. A., et al. Kynurenic acid is a nutritional cue that enables behavioral plasticity. Cell. 160 (1-2), 119-131 (2015).
  42. Oosten-Hawle, P., Porter, R. S., Morimoto, R. I. Regulation of organismal proteostasis by transcellular chaperone signaling. Cell. 153 (6), 1366-1378 (2013).
  43. Ulgherait, M., Rana, A., Rera, M., Graniel, J., Walker, D. W. AMPK modulates tissue and organismal aging in a non-cell-autonomous manner. Cell Rep. 8 (6), 1767-1780 (2014).
  44. Aynardi, M. W., Steinert, P. M., Goldman, R. D. Human epithelial cell intermediate filaments: isolation, purification, and characterization. J Cell Biol. 98 (4), 1407-1421 (1984).
  45. Shea, J. M., et al. Purification of desmin from adult mammalian skeletal muscle. Biochem J. 195 (2), 345-356 (1981).
  46. Liao, J., Lowthert, L. A., Ghori, N., Omary, M. B. The 70-kDa heat shock proteins associate with glandular intermediate filaments in an ATP-dependent manner. J Biol Chem. 270 (2), 915-922 (1995).
  47. Liao, J., Omary, M. B. 14-3-3 proteins associate with phosphorylated simple epithelial keratins during cell cycle progression and act as a solubility cofactor. J Cell Biol. 133 (2), 345-357 (1996).
  48. Ku, N. O., Fu, H., Omary, M. B. Raf-1 activation disrupts its binding to keratins during cell stress. J Cell Biol. 166 (4), 479-485 (2004).
  49. Hendriks, I. A., Vertegaal, A. C. A comprehensive compilation of SUMO proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (9), 581-595 (2016).
  50. Agnetti, G., Lindsey, M. L., Foster, D. B. Manual of cardiovascular proteomics. , Springer. (2016).
  51. Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 536-550 (2014).
  52. Herhaus, L., Dikic, I. Expanding the ubiquitin code through post-translational modification. EMBO Rep. 16 (9), 1071-1083 (2015).
  53. Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cell. 24 (5), 535-542 (2013).
  54. Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (6), 427-439 (2010).
  55. Creixell, P., Linding, R. Cells, shared memory and breaking the PTM code. Mol Syst Biol. 8, 598 (2012).
  56. Minguez, P., et al. Deciphering a global network of functionally associated post-translational modifications. Mol Syst Biol. 8, (2012).
  57. Snider, N. T., Park, H., Omary, M. B. A conserved rod domain phosphotyrosine that is targeted by the phosphatase PTP1B promotes keratin 8 protein insolubility and filament organization. J Biol Chem. 288 (43), 31329-31337 (2013).
  58. Gorospe, J. R., et al. Molecular findings in symptomatic and pre-symptomatic Alexander disease patients. Neurology. 58 (10), 1494-1500 (2002).

Tags

ביוכימיה גליון 123 חוטים בינוניים שינוי לאחר טרנסלציוני ספקטרומטריית מסה אימונופרסיפיטציה הזדקנות מתח מודלים של בעלי חיים חלוקה של רקמות
בידוד של חלבונים ביניים חלבונים מ רקמות עכבר מרובות לחקר ההזדקנות הקשורים שינויים טרנסלוציוניים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Battaglia, R. A., Kabiraj, P.,… More

Battaglia, R. A., Kabiraj, P., Willcockson, H. H., Lian, M., Snider, N. T. Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications. J. Vis. Exp. (123), e55655, doi:10.3791/55655 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter