Summary
In deze methode presenteren wij biochemische procedures voor snelle en efficiënte isolatie van intermediaire filament (IF) eiwitten uit meerdere muisweefsels. Geïsoleerde IF's kunnen worden gebruikt om veranderingen te onderzoeken in post-translatie modificaties door massaspectrometrie en andere biochemische analyses.
Abstract
Intermediaire filamenten (IF's), samen met actinfilamenten en microtubules, vormen het cytoskelet - een kritisch structureel element van elke cel. Normaal functioneren IF's leveren cellen met mechanische en spanningsbestendigheid, terwijl een dysfunctioneel IF-cytoskelet de cellulaire gezondheid compromiseert en met veel mensenziekten is geassocieerd. Post-translationele modificaties (PTM's) regelen de IF-dynamiek kritiek op fysiologische veranderingen en onder stressomstandigheden. Daarom kan het vermogen om veranderingen in de PTM-handtekening van IF's te volgen, bijdragen aan een beter functioneel begrip en uiteindelijk conditioneren van het IF-systeem als een stressrespons tijdens cellulaire verwondingen. Het grote aantal IF-eiwitten, die door meer dan 70 individuele genen worden gecodeerd en op weefselafhankelijke wijze worden uitgedrukt, is echter een grote uitdaging om het relatieve belang van verschillende PTM's te sorteren. Daartoe zijn methoden die de controle op PTM's op IF-eiwitten mogelijk makenOp organisme-breed niveau, in plaats van voor geïsoleerde leden van de familie, kan de vooruitgang op het gebied van onderzoek op dit gebied versnellen. Hier presenteren we biochemische methoden voor het isoleren van de totale, detergensoplosbare en detergensbestendige fractie van IF-eiwitten uit 9 verschillende muisweefsels (hersenen, hart, long, lever, dunne darm, dikke darm, pancreas, nier en milt). We tonen verder een geoptimaliseerd protocol voor snelle isolatie van IF-eiwitten door gebruik te maken van lysende matrix en geautomatiseerde homogenisatie van verschillende muisweefsels. Het geautomatiseerde protocol is nuttig voor het profileren van IF's in experimenten met een hoog monstervolume (zoals bij ziektemodellen waarbij meerdere dieren en experimentele groepen betrokken zijn). De resulterende monsters kunnen worden gebruikt voor verschillende downstream analyses, met inbegrip van massaspectrometrie-gebaseerde PTM profilering. Met behulp van deze methoden geven wij nieuwe gegevens aan om te tonen dat IF-eiwitten in verschillende muizenweefsels (hersenen en leveren) parallelle veranderingen ondergaan met betrekking tot hun expressiesZioniveaus en PTM's tijdens veroudering.
Introduction
IF's zijn een familie van eiwitten die bij mensen worden gecodeerd door 73 genen en zijn ingedeeld in zes hoofdvormen: typen I-IV zijn cytoplasmatisch ( bijv. Epitheliale en haarkeratinen (K), myocyt desmin, neurofilamenten, glialfibrillair zuur eiwit (GFAP), en anderen); Type V zijn de kernlamellen; En type VI zijn IF's in de ooglens 1 . In termen van hun moleculaire organisatie hebben IF-eiwitten drie gemeenschappelijke domeinen: een hoogwaardig geconsolideerd "spiraal" -domein, en bolvormige "hoofd- en" staartdomeinen. Als eiwittetrameren elkaar samenvoegen om korte filamentprecursoren te vormen, die uiteindelijk worden opgenomen in volwassen filamenten die dynamische cytoskeletale en nucleoskeletale structuren vormen die betrokken zijn bij mechanische bescherming 2 , stresswaarneming 3 , 4 , regulatie van transcriptie 5 en groei en andere kritische cellulaire functies"> 1 , 6 , 7 .
Het functionele belang van het IF-systeem wordt gemarkeerd door het bestaan van vele menselijke ziekten veroorzaakt door missense-mutaties in IF-genen, waaronder neuropathieën, myopathieën, huidverstoringsstoornissen, metabolische disfuncties en vroegtijdige verouderende syndromen 8 . Sommige IF-genmutaties veroorzaken niet, maar veronderstellen hun dragers op ziekteprogressie, zoals de eenvoudige epitheliale keratinen bij de leverziekte 9 . Deze laatste is te danken aan de kritische stress-beschermende functies van IF's in epithelia. IF's in het algemeen behoren tot de meest voorkomende cellulaire eiwitten onder basale condities, maar worden verder sterk geïnduceerd tijdens verschillende soorten stress 10 . Bijvoorbeeld, recente studies die de eiwitbreedse veranderingen in de nematode C. elegans hebben aangetoond, aangetoond dat meerdere IF's sterk geherreguleerd en gevoelig zijn voor aggregatieAan tijdens organismeveroudering 11 , 12 . Aangezien het behoud van een juiste IF-structuur essentieel is voor cellulaire resistentie tegen verschillende vormen van stress 10 , kan IF aggregatie ook bijdragen aan de functionele daling tijdens veroudering. Echter, organismen op het niveau van studies die meerdere zoogdier IF-eiwitten onderzoeken over verschillende weefsels die stress ondervinden, ontbreken.
IF's zijn zeer dynamische structuren die zich aanpassen aan mobiele eisen. Keratinen ondergaan bijvoorbeeld een biosynthese-onafhankelijke cyclus tussen oplosbaar (niet-filamente) en onoplosbaar (filamentvormig) eiwitpool 13 . Bij normale fysiologische omstandigheden kan ongeveer 5% het totale K8 / K18-pool worden geëxtraheerd in detergentvrije buffer, in vergelijking met ongeveer 20% die kan worden opgelost in het nonionische wasmiddel Nonidet P-40, dat biochemisch vergelijkbaar is met Triton- X100 14 , 15 . Tijdens mitose is er een opmerkelijke toename van de oplosbaarheid van enkel-type epitheel K8 en K1814, die minder zichtbaar is in epidermale keratinen, maar meer duidelijk in vimentine en andere type III IF-eiwitten 15 , 16 . Oplosbaarheidseigenschappen van IF-eiwitten worden strikt gereguleerd door fosforylering, een sleutel post-translationele modificatie (PTM) voor filamentherrangschikking en oplosbaarheid 17 , 18 , 19 , 20 . De meeste IF's ondergaan uitgebreide regelgeving door een aantal PTM's op geconserveerde locaties, wat resulteert in functionele veranderingen 17 .
Het doel van deze methode is om onderzoekers te introduceren die nieuw zijn op het IF-gebied naar biochemische extractie en analytische methoden voor de studie van IF-eiwitten over meerdere muisweefsels. SpecifiekBondgenoot, concentreren we ons op isolatie van IF-eiwitten door gebruik te maken van een extractiemethode met hoge zout en beoordeling van veranderingen in PTM's via massaspectrometrie en door PTM-targetende antilichamen. Deze werkwijzen zijn gebaseerd op eerder gepubliceerde procedures 21, maar omvatten wijzigingen voor het extraheren van verschillende IF-eiwitsoorten om gemeenschappelijk mechanisme voor regulering over de IF-familie te ontdekken. Bijvoorbeeld reguleert K8-acetylering bij een specifiek lysine-residu filamentorganisatie, terwijl hyperacetylatie K8-onoplosbaarheid en aggregaatvorming 22 bevordert. Recent recente wereldwijde proteomische profileringsstudies hebben bovendien aangetoond dat de meeste weefselspecifieke IF-eiwitten ook doelstellingen voor acetylering zijn en dat de meeste IF-acetyleringsplaatsen beperkt zijn tot het sterk geconserveerde staafdomein. Dit wijst op de noodzaak van methoden die geschikt zijn voor wereldwijde profilering van het IF-systeem. We introduceren ook een snelle methode om IF-eiwitten van meerdere weefsels te isoleren met behulp van geautomatiseerde homogenisatie in optiGematiseerde lysingsmatrix. De resulterende preparaten zijn geschikt voor stroomafwaartse PTM analyse via massaspectrometrie en andere methoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol is goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met het Institutioneel Diervoeder- en Gebruikskomitee (IACUC) aan de Universiteit van Noord-Carolina.
1. Voorbereidingen
- Bereid Triton-X buffer (1% Triton X-100, 5 mM ethylendiaminetetraazijnzuur (EDTA) op, haal volume op in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4). Om 500 ml te maken: roer 5 ml elk van Triton X-100 en 500 mM EDTA in 490 ml PBS, pH 7,4. Bewaar Triton-X buffer oplossing bij 4 ° C.
- Bereid een hoge zoutbuffer op (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 140 mM NaCl, 1,5 M KCl, 5 mM EDTA, 0,5% Triton X-100, haal volume in dubbel gedestilleerd (dd) H20) op. Om 500 ml te maken: roer 10 ml 0,5 M Tris-HCl (pH 7,6), 14 ml 5 M NaCl, 55,9 g KCl, 5 ml 0,5 M EDTA en 2,5 ml Triton X-100, stel volume aan op 500 ML met dubbel gedistilleerd water). Bewaar de hoge zoutbufferoplossing bij 4 ° C.
- Net voor gebruik, vul een passende hoeveelheid Triton-X en High Salt Buffer (
- Bereid 5 mM EDTA in 1x PBS, pH 7,4. Om 500 ml te maken: roer 5 ml 0,5 M EDTA in 495 ml 1x PBS, pH 7,4.
- Isolatie van verschillende muisorganen (hersenen, hart, long, lever, pancreas, dikke darm, darm, nier, milt) met behulp van goedgekeurde protocollen die voldoen aan veterinaire richtlijnen en institutionele normen 23 . De weefselinzamelprocedure moet maximaal 5 minuten duren om RNA en eiwitintegriteit van protease-rijke weefsels te behouden ( bijv. Moet de eerste alvleesklier worden verwerkt).
- Knip een klein stukje weefsel (~ 5-20 mg) en plaats in RNA-opslagoplossing voor latere RNA-extractie, cDNA-synthese en kwantitatieve real-time PCR analyse voor IF-expressie. Plaats RNA-opslagoplossingsbuizen met weefsel bij 4 ° C overnacht en volg fabrikant protocol voor verdere sTorage en isolatie stappen.
- Snijd de rest van het weefsel in kleinere fragmenten ( bijv. 0,5 cm) en plaats in cryovial. Snap-freeze en houd flesjes op -80 ° C of vloeibaar stikstof voor langere opslag.
2. Als genexpressieanalyse
- Extract RNA uit weefsels bewaard in het RNA opslagoplossingsreagens. Gebruik een geschikte / geprefereerde RNA-extractie methode volgens het protocol van de fabrikant.
- Kwantificeer RNA concentratie en gebruik 2 μg RNA om cDNA te genereren met behulp van een geschikte reverse transcriptie kit volgens het protocol van de fabrikant.
- Met behulp van de gegenereerde cDNA en muis IF-gen-specifieke primers zetten qPCR reacties op, waaronder drie technische replicaten van elk monster, evenals blanco controle volgens het protocol van de fabrikant.
- Bepaal IF-genuitdrukking als vouwverandering, waarbij verschillende condities worden vergeleken ( bijv. Jong versus oud weefsel).
3. PReparatie van Total Tissue Lysates voor Immunoblot
- Homogeniseer 25 mg weefsel in 1 ml 2x niet-reducerende SDS monsterbuffer. Verwijder bromfenol blauwe kleurstof uit de monsterbuffer indien een colorimetrische eiwitassay moet worden uitgevoerd om eiwitconcentratie te kwantificeren.
- Voeg 5% (v / v) 2-mercaptoethanol (2-ME) toe om verminderde monsters te maken. Voeg 200 μL van de niet-reducerende monsters toe, voeg 10 μL 2-ME toe.
- Bepaal eiwitconcentratie met behulp van detergent- en reductiemiddel-compatibele eiwitanalyse. Als kleurstof al in de monsterbuffer is opgenomen, kan de eiwithoeveelheid geschat worden na het uitvoeren van een gel via een aantal technieken, waaronder Coomassie-gebaseerde vlek 24 .
- Vortex alle monsters en verhit bij 95 ° C gedurende 5 minuten.
- Voer westerse blotting uit onder zowel reducerende als niet-reducerende omstandigheden. Blootstelling membraan kort (<1 min) om monomere soorten te onthullen en langer (> 1 min) om complexen met hoge molecuulmassa te onthullen bevattenNg IF eiwitten. Controleer bij aggregatie aggregatie hele gel / membraan (inclusief de bodem van de gelputten).
- Doe een parallelle gel en vlek met een eiwitvlek als een laadbeheersing 24 . Bij ziektebeelden of letselonderzoeken moet totale eiwitvlek worden gebruikt als laadbeheersing, in tegenstelling tot immunoblots voor 'huishoudelijke' eiwitten ( bijv. Actine, GAPDH) omdat deze onder verschillende stressomstandigheden veranderen.
4. Bereiding van detergentoplosbare en hoogzoutextracten van weefselspecifieke IF's
- Voeg 1 ml ijskoude Triton X-100 buffer in een glazen buishomogenizer toe en plaats het op ijs.
- Verwijder een klein stukje weefsel (~ 25 mg) uit vloeibare stikstofopslag en plaats direct in de glazen homogenisator. Gebruik een polytetrafluorethyleenpestel om homogeniseren (50 slag) en vermijd bellen. Houd de homogenisator en koude koud te allen tijde.
- Breng lysaat over naar een 1,5 ml micrOcentrifuge-buis op ijs en centrifuge bij 20.000 xg gedurende 10 minuten in een voorgekoelde centrifuge (4 ° C).
- Verzamel de supernatantfractie in een aparte buis. Dit is de Triton X-oplosbare fractie, die kan worden gebruikt voor immunoprecipitatie (ip) en analyse van het detergensoplosbare pool van IF-eiwitten. Merk op dat stap 4.1-4.4 herhaald kan worden om een reiniger IF-extract uit breinweefsel te bereiken.
- Voeg 1 ml High Salt Buffer toe aan het weefselpelletje, overbrengen naar een schone homogenisator en doei 100 strepen. Breng het homogenaat terug naar de microcentrifugebuis en plaats de buis gedurende 1 uur op een roterende shaker in de koude ruimte.
- Centrifugeer de homogenaten bij 20.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Gooi de supernatant weg.
- Voeg 1 ml ijskoude PBS / EDTA buffer aan de pellet toe en laat de pellet (20 slag) in een schone homogenisator homogeniseren als een laatste opruimingsstap *. Vervoer naar een nieuwe buis en centrifuge bij 20.000 xg gedurende 10 minuten bij 4 ° C om de IF-eiwit-Rijk hoog zoutextract (HSE).
* Optioneel vortex in plaats van homogenisatie in deze stap. - Verwijder de supernatant en ontbind de pellets in 300 μL niet-reducerende SDS monsterbuffer die vooraf verwarmd is. Breng de pellet aanvankelijk door pipettering en vortexing, en verhit daarna de monsters gedurende 5 minuten bij 95 ° C.
- Vortex en pipet als nodig om ervoor te zorgen dat de pellet is opgelost. Het kan enkele minuten duren om de pellets volledig op te lossen.
- Bewaar alle monsters bij -20 ° C tot analyse.
5. Geautomatiseerde Weefsel Lysis voor IF Proteïne Extractie in Experimenten met grote hoeveelheden
- Voor RNA-extractie, plaats lysisbuffer (600 μL buffer per 25 mg weefsel) in een buis die lyseringsmatrix D bevat (gebruikt kleine keramische bolle) en puls twee keer gedurende 25 s in de weefsellyser. Afzonderlijk lysaat uit de matrix door centrifugeren bij 20.000 xg en ga door naar de volgende stap in isolatie.
- Voor eiwit extractie, plaats TritOp X-100 (of SDS monsterbuffer bij het bereiden van totaal lysaat) in een lyserbuis met lysende matrix SS (gebruik een enkele roestvrijstalen kralen). Na het testen van meerdere matrices, werd dit geselecteerd omdat het IF-eiwit extracten produceert die in gelijke kwaliteit zijn als de traditionele dotsmethode. Merk op dat de geautomatiseerde methode niet optimaal is voor pancreas en milt, en het standaard homogenisatieprotocol dient voor deze weefsels te worden gebruikt.
- Om verder te gaan met de bereiding van High Salt Extract, verwijder de roestvrijstalen kralen uit de buis met een magneet en centrifugeer de buizen bij 20.000 xg gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
- Ga verder met stap 4.4 (boven) van het handmatig protocol.
- Bewaar alle monsters bij -20 ° C tot analyse.
6. Immuno-verrijking van post-translationeel gemodificeerde IF-eiwitten
- Bereid PBST buffer (0,02% Tween-20 in PBS) op. Om 50 ml te maken, voeg 10 μL Tween-20 tot 50 ml PBS toe, pH 7,4.
- Bereid PTM antilichaam opOplossing (1-10 μg antilichaam in 200 μl PBST). In het algemeen is 3 μg antilichaam / reactie een goede startconditie die eventueel verder geoptimaliseerd kan worden.
- Voor elke reactie, plaats 50 μL magnetische kralen in een microcentrifugebuis, plaats op de magneet en aspireer de kraalopslagoplossing.
- Conjugate de kralen aan het immunoprecipitatie antilichaam door opnieuw suspensie in de antilichaamoplossing en incubatie op rotator (eind-over-end, om te zorgen voor het mengen van kleine volumes) bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
- Plaats de buizen op de magneet en haal de antilichaamoplossing aan.
- Spoel de antilichaam-geconjugeerde kralen eenmaal in 200 μl PBST en verwijder wasbuffer.
- Voeg 0,6-1 ml van het weefsellysaat toe aan de kralen, meng door zacht pipetten en incubeer gedurende 3 uur op de rotator in een koude kamer.
- Plaats buizen op de magneet, verwijder lysaat, en doe de kralen vijf keer met 200 μL PBST. Na de laatste wasstap verzamelen de kralen in 100 _6; L van PBS (geen Tween-20) en overbrengen naar een schone nieuwe buis. Plaats de buis op de magneet.
- Aspireren PBS en voeg 100 μL niet-reducerende monsterbuffer toe. Verwijder 50 μL en voeg 2-ME (5%) toe aan het reduceren van monsters. Verhit de monsters tot 95 ° C gedurende 5 minuten.
- Scheid de ip fractie van de kralen op de magneet en pak het in een nieuwe buis.
- Bewaar monsters bij -20 ° C tot analyse.
7. Bereiding van IF-eiwitmonsters voor massaspektrometrie-analyse
- Scheduleer een raadpleging met een proteomics expert voorafgaand aan het starten van een studie, aangezien er significante tijd en kosten betrokken zijn bij massaspectrometrie analyse.
- Neem speciale voorzorgsmaatregelen om besmetting te vermijden. Hanteer alle gels met schone handschoenen en incubeer in schone houders, alleen wassen met ddH 2O (vermijd zeep).
- Run 20-50 μL van het HSE-monster (uit secties 4 en 5) op een SDS-PAGE gel volgens de standaard omstandigheden. Vlek met een eiwitvlek gedurende 1 uur. Spoel meerdere keren af en ontvlam overnacht in ddH 2 O. De IF-eiwitbanden moeten gemakkelijk na het ontkleuren zichtbaar zijn.
- Plaats de gel tussen de plastic beschermers, scan en markeer de bands die worden uitgesneden en verzonden voor analyse.
- Accijns de IF-eiwitbanden met behulp van een nieuwe schone scheermes.
- Plaats de gelbanden in schone microcentrifugebuizen en overbrengen naar een massaspectrometrie faciliteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een nieuwe snelle methode voor het op hoge zout gebaseerde extractie van IF-eiwitten uit meerdere muisweefsels met behulp van lyseringsmatrix.
De traditionele methode 25 , 26 van het isoleren van het grootste deel van de tussenliggende filament eiwitfractie uit epitheliaal weefsel werd hier gewijzigd om 9 verschillende organen en een snellere procedure voor weefsellysis te omvatten. Terwijl 3 manuele homogenisatie stappen nodig zijn voor de traditionele methode, heeft de gewijzigde procedure slechts 1 handmatige homogenisatiestap, die de procedure gedurende enkele uren verkorten, vooral bij het verwerken van meer dan 6 monsters. Figuur 1A toont een typisch resultaat van HSE's uit 9 muisweefsels, terwijl de tabel van verwachte eiwitten in het weefsel en het molecuulgewicht van elk eiwit wordt getoond in figuur 1B
Lever K8 en K18 worden sterk gereguleerd en ondergaan verhoogde fosforylering en lysineacetylering in levers van oude muizen.
Figuur 2 toont typische resultaten uit een aantal van de analyses die in dit protocol worden beschreven. Paneel A toont expressieanalyse van de twee belangrijkste IF-genen in de lever, keratine 8 ( KRT8 )En keratine 18 ( KRT18 ), die respectievelijk de IF-eiwitten K8 en K18 coderen. Epitheliale keratinen worden sterk onder controle onder verschillende stressomstandigheden. In het getoonde resultaat treedt dit op bij veroudering , aangezien KRT8 significant wordt gereguleerd in de levers van 24 m oude muizen in vergelijking met 3 m oude muizen. De resultaten op het eiwitniveau zijn meer opvallend, zoals waargenomen door de dramatische toename van K8 monomeer evenals complexen met hoge molecuulmassa in de oude (24m) levers. Coomassie-gebaseerde eiwitvlek dient hier als een laadcontrole om gelijke belading van eiwit over monsters te waarborgen. Merk op dat met het totaal van weefsellysaten het gemakkelijk is om eiwit op een gel te overbelasten, zoals in dit geval. Als u een kleinere volume laadt of het monster verder verdampt in buffer met natriumdodecylsulfaat (SDS), wordt dit probleem verlicht (vooral als het viskerig en moeilijk te piperen is). Panel C toont een typisch resultaat van een lever Hoge Zout Extract verkregen met behulp van het geautomatiseerde protocol, demOnsterren van de sterke verrijking van keratinen 8 en 18 op de gel. De rode lijnen afbakenen het gebied dat werd uitgesneden en ingediend voor massaspectrometrie analyse. In panel D blijkt uit de massespecanalyse van de monsters in paneel C dat K8 en K18 in de oude lever meerdere fosforylerings- en acetyleringsplaatsen hebben die niet aanwezig zijn in de jonge lever.
GFAP wordt sterk gereguleerd en lysine geacetyleerd in de hersenen van oude muizen.
Figuur 3 toont aan dat de methoden die worden gebruikt om IF's uit epithelia te extraheren ook kunnen worden gebruikt op niet-epitheliaal weefsel. Bovendien onthullen de resultaten een algemeen patroon voor veroudering-afhankelijke upregulatie van IF-genen en eiwitten. Het qPCR resultaat in Figuur 2A onthult een 5-voudige inductie van GFAP mRNA in de hersenen van 24 m oude muizen in vergelijking met 3 m oude muizen. Figuur 2BOnthult totale eiwitten aanwezig in de Triton X-100 fractie en de IF-verrijkte HSE. Let op de toename van de bandintensiteit bij 50 kDa gemarkeerd door de pijl (overeenkomend met GFAP) in de oude hersenen. Western blot analyse in Figuur 2C onthult verder de upregulatie van GFAP en significante aanwezigheid van GFAP monomeer en potentiaal hoogmoleculair complex in de Triton X-100 fractie (beide gemarkeerd door pijlen). Western blot analyse van dezelfde monsters met een pan-acetyl lysine antilichaam laat zien dat het antilichaam een band herkent bij ~ 50 kDa in de HSE van de oude muisbrein en bij ~ 250 kDa in de Triton X-100 fractie ( Figuur 2D ). Immuno-verrijking van geacetyleerde eiwitten uit de Triton X-100 fracties laat een verhoogde aanwezigheid van GFAP eiwit zien in het lysaat dat is verkregen uit de oude hersenen. Verminderende en niet-reducerende omstandigheden tonen aan dat GFAP monomeer en complexen met een hoge molecuulmassa worden gemarkeerd. Massaspectrometrie analyse (vergelijkbaar met Figuur 1
Figuur 1: Geautomatiseerde lysis en extractie van IF eiwitten uit meerdere muisweefsels. ( A ) Coomassie-gebaseerde gelvlek van HSE's uit de aangewezen muisweefsels. De getoonde weefsels werden verkregen uit dezelfde volwassen (3 m oude) mannelijke CBA muis. Monsters werden verwerkt zoals beschreven in sectie 5. Hersenen : let op dat NFL, NFM en NFH zwaar gefosforyleerd zijn 27 en migreren langzamer dan verwacht, respectievelijk ~ 70, 145 en 200 kDa. Hart : In aanvulling op de 53 kDa band die overeenkomt met desmin en vimentin) bevatten hartmonsters ook een ~ 42 kDa band, die waarschijnlijk actin vertegenwoordigt, dat bekend is met co-zuiveren met desmin 28 . LArge darm: De identiteit van de prominente banden boven 25 kDa die gecoëxtraheerd worden met K8 / K18 zijn niet bekend, maar deze banden zijn niet aanwezig als de weefsels worden verwerkt met behulp van de traditionele Dounce Homogenizer methode. Pancreas and Spleen : Merk op dat de geautomatiseerde homogenisatie niet geschikt is voor het isoleren van keratinen uit pancreas en vimentin uit milt, vermoedelijk vanwege de gevoeligheid van het lysaat naar de lichte stijging van de temperatuur tijdens de pulse in de weefsellyser. ( B ) Tabel met de belangrijkste IF-eiwit types die aanwezig zijn in de verschillende weefsels en hun voorspelde molecuulgewicht als referentie voor paneel A. Gelieve hier te klikken om een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 2: MoleculAr en biochemische verschillen in leverkeratinen van jonge en oude muizen. ( A ) Analyse van KRT8 en KRT8 mRNA onder toepassing van standaard procedure (Protocol 1) onthult significante inductie in KRT8 transcript in de levers van oude muizen. N = 6 voor elke aandoening (3 mannelijke en 3 vrouwelijke CBA-muizen werden per groep gebruikt). ** p <0,01; One-way ANOVA. ( B ) Totale leverlysaten werden verkregen uit 3 jonge (3 maanden oud) en 3 oude (24 maanden oude) mannelijke CBA-muizen onder gebruikmaking van protocol 2 en de monsters werden onder niet-reducerende omstandigheden geanalyseerd. TS1 antilichaam werd gebruikt om te proberen voor K8 expressie en Coomassie-gebaseerde eiwitvlek werd gebruikt als een belastingcontrole. ( C ) Hoge zoutextracten van jonge en oude muislevers, respectievelijk muizen # 1 en # 4 respectievelijk van paneel B. De twee pijlen wijzen naar K8 en K18 op de gel en de rode doos geeft het deel van de gel aan die was Uitgesneden en ingediend voor massaspectrometrie analyse. ( D Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 3: Moleculaire en biochemische verschillen in GFAP van de hersenen van jonge en oude muizen. ( A ) Analyse van GFAP mRNA onder toepassing van standaard procedure (Protocol 1) onthult significante inductie in de hersenen van oude muizen. N = 6 voor elke aandoening (3 mannelijke en 3 vrouwelijke CBA-muizen werden per groep gebruikt). ** p <0,01; One-way ANOVA. ( B ) Coomassie-gebaseerde eiwitvlek van Triton X-100 en HSE-fracties uit hersenweefsel van jonge (3 maanden oude) en oude (24 maanden oude) muis. Let op de toename van de ~ 50 kDa GFAP band in HSE van de oude hersenen (pijl). ( C ) GFAP-immunoblot (monoklonaal monoklonaal; GA5-kloon) van dezelfde monsters als paneel B. ( D ) Acetyl-lysine immunoblot (konijnpolyclonaal; Abcam ab80178) van dezelfde monsters als in paneel B. ( E ) GFAP-blot na immunoprecipitatie met acetyl- Lysine antilichaam. Monsters werden geanalyseerd onder niet-reducerende (NR) en reducerende (R) condities en pijlen wijzen op de aanwezigheid van GFAP in het immunoprecipitaat van de oude hersenen te verhogen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Methoden die biochemische karakterisering van IF-eiwitten mogelijk maken, kunnen nuttig zijn om talloze pathofysiologische verschijnselen in zoogdierstelsels te begrijpen, aangezien IF-eiwitten beide markers en modulatoren zijn van cellulair en weefselspanning 29 . Het principe achter de huidige methode is gebaseerd op de initiële procedures die in de jaren 1970 en 1980 zijn ontwikkeld om IF-eiwitten uit cellen en weefsels te isoleren, te scheiden en te reconstrueren, in het algemeen met lage en hoge zoutoplossingen en Triton-X100 detergent 25 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 . Voor historisch inzicht in de studies die de biochemische isolatie van IF-eiwitten ondersteunen, zie recente recensies 36 , 37 . De huidige methodeIs gebaseerd op meer recente protocollen die zijn ontwikkeld voor de studie van eenvoudige epitheliale keratinen 26 . Het voordeel van de methode is dat het kan dienen als een eerste stap om onderzoekers die nieuw zijn op het IF-veld in staat te stellen om IF-eiwitten effectief te isoleren uit de meeste zoogdierweefsels. Het is een visuele gids van gerelateerde procedures die veel gebruikt worden door onderzoekers in het veld om IF-eiwitregeling 21 , 38 te bestuderen.
Deze techniek kan worden gebruikt om de regulering en functie van IF's in stresscommunicatiemechanismen tussen zoogdierweefsels 39 , 40 te bestuderen. Het wordt goed gewaardeerd dat stress in een weefsel het functioneren van andere weefsels kan beïnvloeden, bijvoorbeeld onder omstandigheden van voedingsspanning 41 , eiwit misfolding 42 , metabolische stress 43 en othEr verandert. Op de hoogte is het grootste deel van het werk dat momenteel op dit gebied wordt verricht, in de modellen Drosophila en C. elegans , terwijl er sprake is van studies over wijdverbreide stressresponsen bij zoogdierstelsels. Als de belangrijkste regulator van cellulaire stress 10 , kan het IF-systeem leidraad oplichten op stress op het niveau van organisme-niveau, die belangrijke ziekte-implicaties kan hebben. Als zodanig kan het huidige protocol worden gebruikt om mondiale pathofysiologische mechanismen in diverse muismodellen van stress, letsel en ziekte te bestuderen.
Een beperking van de huidige techniek is dat de hoge zoutextracten als "ruw" worden beschouwd als preparaten aangezien zij ook andere IF-geassocieerde eiwitten bevatten, zoals plectine bijvoorbeeld 44 . Zoals eerder aangegeven, kunnen HSE's gedenatureerd worden in 8 M ureumbuffer om zeer pure IF-eiwitten te verkrijgen die in staat zijn om in vitro opnieuw te assembleren in fosfaatbuffer 44 . Na twee dergelijke cycli vanDemontage en herassemblage bleven de stoichiometrie van IF-eiwitten (geïsoleerd van HeLa-cellen) hetzelfde, terwijl de ureumbehandeling plectine 44 verwijderd. Tijdens desmin zuivering kan actine verwijderd worden door oplosbaarmaking van de HSE in azijnzuur 45 . Of er extra reinigingsstappen moeten worden opgenomen, hangt af van het uiteindelijke doel van het experiment. Bijvoorbeeld, als het doel is om de assemblage toestand te karakteriseren en in vitro gereconstitueerde IF's te genereren, is de ureumstap vereist om zeer zuivere IF-eiwitten te verkrijgen. Aan de andere kant, als het doel is om contextafhankelijke associaties tussen IF's en andere cellulaire eiwitten te identificeren, dan kunnen de "ruwe" preparaten worden gebruikt. Interactieve eiwitten kunnen worden geïdentificeerd door middel van massaspectrometrie, met gebruikmaking van ofwel in-gel digestie voor hoge overvloedige doelen die zichtbaar zijn door gelvlek of in oplossing oplossen voor lage overvloedige doelen. Vorige studies met behulp van immunoprecipitatie van detergensoplosbare IF's en HSE'sBevattende IF-eiwitten geïdentificeerd functioneel belangrijke specifieke interactie tussen keratinen 8/18 en warmteschokproteïne 70 (Hsp70), dat na warmtepanning 46 versterkt wordt, het adapter eiwit 14-3-3 na fosforylering 47 en K8 / K18 Raf-1 kinase Onder normale fysiologische omstandigheden 48 onder anderen. Het huidige protocol kan soortgelijke studies op andere IF-eiwitten mogelijk maken.
Het gebruik van de lyseringsmatrix is een belangrijke wijziging van eerdere methoden en moet snel uit extractie van IF's uit meerdere weefsels leiden, met uitzondering van pancreas en milt. De automatisering van de initiële stappen kan bijzonder nuttig zijn voor muizenproeven met grote volumes. Bijvoorbeeld, het isoleren van IF-eiwitten uit 3 verschillende weefsels van 10 muizen per aandoening ( bijv. Normaal en een of andere vorm van systemische stress of ziekte) vereist het verwerken van 60 individuele weefsels. Met behulp van de traditionele handmatige methode dit woUld moet in batches gedaan worden en kan enkele dagen duren. Met behulp van de geautomatiseerde methode met lysende matrix kan de procedure echter binnen enkele uren gebeuren. Kritieke stappen van de procedure zijn: het verzekeren dat het monster koud blijft gedurende de procedure; Incubatie in hoge zoutbuffer gedurende 1 uur (stap 4.5); Gebruik maken van hete buffer en uitgebreide vortexing om volledige resuspensie van de pellet te garanderen voor analyse (stap 4.8); En alle voorzorgsmaatregelen nemen om te voorkomen dat verontreiniging van monsters wordt geanalyseerd door middel van massaspectrometrie (stap 7.2).
Het grote nadeel van de massaspectrometrie gebaseerde identificatie van PTM sites is dat het zeer goed werkt voor bepaalde PTM's - fosforylering en lysine acetylering zijn primaire voorbeelden - maar anderen, zoals sumoylatie, zijn veel uitdagend 49 . Niettemin is proteomics een krachtig instrument voor het bestuderen van eiwitregulering in normale en zieke weefsels. Agnetti et al. Compleet gemaaktUp-to-date overzicht van de vooraanstaande proteomische technieken die momenteel in gebruik zijn om diverse PTM's te bestuderen in het kader van weefseluitgedrukte eiwitten 50 . Het doel van de huidige methode is het genereren van monsters die kunnen worden toegepast voor verschillende soorten analyses. Bijvoorbeeld, in vitro- sumoylering kan worden uitgevoerd op immuun-geprecipiteerde IF-eiwitten, en algemene sumoylering kan worden beoordeeld op geïsoleerde IF's in HSE-preparaten onder gebruikmaking van sumo-specifieke antilichamen 18 , 21 . Daarom is de toepassing van deze methode niet beperkt tot het alleen genereren van monsters voor massaspectrometrie analyse maar kan gebruikt worden om meerdere IF-eigenschappen te proberen met behulp van een verscheidenheid van stroomafwaartse technieken.
IF-eiwitten worden in grote mate gereguleerd door talrijke PTM's op geconserveerde plaatsen, resulterend in gewijzigde oplosbaarheid, filamentconstructie en eiwitinteracties 17 . Recente technologische vooruitgang heeft onthuld tHij ongelooflijke omvang, complexiteit en ziekte significantie van post-translationele modificaties (PTM's) op cellulaire eiwitten 51 , 52 , 53 . Verbetering van detectiemethoden voor gemeenschappelijke PTM's, zoals fosforylering 54 en acetylering 51 , hebben grote gegevenscatalogussen geleverd, maar het begrijpen van hun biologische betekenis - het kraken van de "PTM-code" - is een belangrijke overblijvende uitdaging 55 , 56 . Een manier om de functionele rollen en de relatieve significantie van elke PTM te beoordelen, is om te bepalen hoe goed het wordt bewaard over meerdere leden van de IF-eiwitfamilie. Bijvoorbeeld, identificatie van een nieuwe fosfo-tyrosine plaats op K8 onthulde dat deze site is opgenomen in een QYE motief dat in in hoofdzaak alle cytoplasmatische IF-eiwitten is gevonden en kritisch is voor het reguleren van de IF-eiwitoplosbaarheid en filamentdikNamieken 57 . Het is belangrijk dat mutatie van het geconserveerde tyrosine residu op GFAP naar een negatief geladen "fosfomimisch" asparaginezuur (Y242D) Alexanderziekte 58 veroorzaakt. De hier weergegeven representatieve gegevens tonen aan dat twee verschillende weefselspecifieke IF-eiwitsoorten (K8 en GFAP) een vergelijkbaar patroon van upregulatie en verhoogde acetylering ondergaan bij veroudering, die een effect kunnen zijn van veranderd metabolisme 22 , 51 . Dit voorbeeld illustreert het nut van de methode om de functie van IF-eiwitten op een wereldwijde fysiologische schaal te begrijpen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de NIH-subsidies NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS] en P30 DK034987 [naar UNC-Chapel Hill]. De auteurs bedanken Deekshita Ramanarayanan voor hulp bij qPCR en western blot experimenten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynabeads Protein G | ThermoFisher Scientific | 10009 | immunoprecipitation beads |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | for buffers |
| Purelink RNA mini kit | ThermoFisher Scientific | 12183018 | RNA extraction from tissue |
| Purelink DNAse set | ThermoFisher Scientific | 12185010A | on column DNA digestion |
| Dynamag-2 | ThermoFisher Scientific | 12321D | magnet for use with dynabeads |
| GelCode Blue Stain Reagent | ThermoFisher Scientific | 24592 | mass spectrometry-compatible gel stain |
| Pierce ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher Scientific | 32106 | for use in western blot |
| High Capacity cDNA reverse transcription kit | ThermoFisher Scientific | 4368813 | for use in gene expression analysis |
| Proflex 3 x 32-well PCR System | ThermoFisher Scientific | 4484073 | PCR system |
| PVDF transfer membrane | ThermoFisher Scientific | 88520 | for western blot |
| Power Up SYBR master mix | ThermoFisher Scientific | A25778 | for qPCR analysis |
| RNAlater | ThermoFisher Scientific | AM7020 | solution for tissue storage prior to RNA isolation |
| Novex 4-20% Tris Glycine Gel | ThermoFisher Scientific | XP04205BOX | Precast protein gel |
| Anti-Keratin 8 antibody (TS1) | ThermoFisher Scientific | MA514428 | for western blot detection of K8 |
| Anti-Vimentin | ThermoFisher Scientific | MA511883 | for western blot detection of vimentin |
| Tris Glycine Transfer Buffer (25x) | ThermoFisher Scientific | LC3675 | for wet transfer of protein gels |
| 2x SDS Sample Buffer | ThermoFisher Scientific | LC2676 | for preparing protein gel samples |
| Tris Glycine SDS Running Buffer (10x) | ThermoFisher Scientific | LC26755 | for running protein gels |
| Lysing beads - Matrix D | MP Biomedicals | 116913100 | Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction |
| Lysing beads - Matrix SS | MP Biomedicals | 116921100 | Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction |
| NanoDrop Lite Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-LITE | measurement of protein and nucleic acid |
| Precellys 24 homogenizer | Bertin Instruments | EQ03119 | Automated tissue homogenizer |
References
- Eriksson, J. E., et al. Introducing intermediate filaments: from discovery to disease. J Clin Invest. 119 (7), 1763-1771 (2009).
- Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function. J Biol Chem. 290 (28), 17145-17153 (2015).
- Perez-Sala, D., et al. Vimentin filament organization and stress sensing depend on its single cysteine residue and zinc binding. Nat Commun. 6, 7287 (2015).
- Dialynas, G., et al. Myopathic lamin mutations cause reductive stress and activate the nrf2/keap-1 pathway. PLoS Genet. 11 (5), e1005231 (2015).
- Hobbs, R. P., et al. Keratin-dependent regulation of Aire and gene expression in skin tumor keratinocytes. Nat Genet. , (2015).
- Chung, B. M., Rotty, J. D., Coulombe, P. A. Networking galore: intermediate filaments and cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 600-612 (2013).
- Gruenbaum, Y., Aebi, U. Intermediate filaments: a dynamic network that controls cell mechanics. F1000 Prime Rep. 6, (2014).
- Omary, M. B. "IF-pathies": a broad spectrum of intermediate filament-associated diseases. J Clin Invest. 119 (7), 1756-1762 (2009).
- Omary, M. B., Ku, N. O., Strnad, P., Hanada, S. Toward unraveling the complexity of simple epithelial keratins in human disease. J Clin Invest. 119 (7), 1794-1805 (2009).
- Toivola, D. M., Strnad, P., Habtezion, A., Omary, M. B. Intermediate filaments take the heat as stress proteins. Trends Cell Biol. 20 (2), 79-91 (2010).
- Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging. C. elegans. Cell. 161 (4), 919-932 (2015).
- David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in. C. elegans. PLoS Biol. 8 (8), (2010).
- Windoffer, R., Beil, M., Magin, T. M., Leube, R. E. Cytoskeleton in motion: the dynamics of keratin intermediate filaments in epithelia. J Cell Biol. 194 (5), 669-678 (2011).
- Chou, C. F., Riopel, C. L., Rott, L. S., Omary, M. B. A significant soluble keratin fraction in 'simple' epithelial cells. Lack of an apparent phosphorylation and glycosylation role in keratin solubility. J Cell Sci. 105 ( Pt. 2, 433-444 (1993).
- Omary, M. B., Ku, N. O., Liao, J., Price, D. Keratin modifications and solubility properties in epithelial cells and in vitro). Subcell Biochem. 31, 105-140 (1998).
- Lowthert, L. A., Ku, N. O., Liao, J., Coulombe, P. A., Omary, M. B. Empigen BB: a useful detergent for solubilization and biochemical analysis of keratins. Biochem Biophys Res Commun. 206 (1), 370-379 (1995).
- Snider, N. T., Omary, M. B. Post-translational modifications of intermediate filament proteins: mechanisms and functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 163-177 (2014).
- Snider, N. T., Weerasinghe, S. V., Iniguez-Lluhi, J. A., Herrmann, H., Omary, M. B. Keratin hypersumoylation alters filament dynamics and is a marker for human liver disease and keratin mutation. J Biol Chem. 286 (3), 2273-2284 (2011).
- Eriksson, J. E., et al. Specific in vivo phosphorylation sites determine the assembly dynamics of vimentin intermediate filaments. J Cell Sci. 117 (Pt. 6, 919-932 (2004).
- Sahlgren, C. M., et al. Mitotic reorganization of the intermediate filament protein nestin involves phosphorylation by cdc2 kinase). J Biol Chem. 276 (19), 16456-16463 (2001).
- Snider, N. T., Omary, M. B. Assays for Posttranslational Modifications of Intermediate Filament Proteins. Methods Enzymol. 568, 113-138 (2016).
- Snider, N. T., et al. Glucose and SIRT2 reciprocally mediate the regulation of keratin 8 by lysine acetylation. J Cell Biol. 200 (3), 241-247 (2013).
- Danneman, P., Suckow, M. A., Brayton, C., Suckow, M. A. The laboratory mouse. , 2nd edn, CRC Press. (2013).
- Weiss, W., Weiland, F., Gorg, A. Protein detection and quantitation technologies for gel-based proteome analysis. Methods Mol Biol. 564, 59-82 (2009).
- Achtstaetter, T., Hatzfeld, M., Quinlan, R. A., Parmelee, D. C., Franke, W. W. Separation of cytokeratin polypeptides by gel electrophoretic and chromatographic techniques and their identification by immunoblotting. Methods Enzymol. 134, 355-371 (1986).
- Ku, N. O., et al. Studying simple epithelial keratins in cells and tissues. Methods Cell Biol. 78, 489-517 (2004).
- Julien, J. P., Mushynski, W. E. Multiple phosphorylation sites in mammalian neurofilament polypeptides. J Biol Chem. 257 (17), 10467-10470 (1982).
- Hubbard, B. D., Lazarides, E. Copurification of actin and desmin from chicken smooth muscle and their copolymerization in vitro to intermediate filaments. J Cell Biol. 80 (1), 166-182 (1979).
- Ku, N. O., Strnad, P., Bantel, H., Omary, M. B. Keratins: Biomarkers and modulators of apoptotic and necrotic cell death in the liver. Hepatology. 64 (3), 966-976 (2016).
- Huiatt, T. W., Robson, R. M., Arakawa, N., Stromer, M. H. Desmin from avian smooth muscle. Purification and partial characterization. J Biol Chem. 255 (14), 6981-6989 (1980).
- Zackroff, R. V., Goldman, R. D. In vitro assembly of intermediate filaments from baby hamster kidney (BHK-21) cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (12), 6226-6230 (1979).
- Franke, W. W., Schmid, E., Osborn, M., Weber, K. The intermediate-sized filaments in rat kangaroo PtK2 cells. II. Structure and composition of isolated filaments. Cytobiologie. 17 (2), 392-411 (1978).
- Small, J. V., Sobieszek, A. Studies on the function and composition of the 10-NM(100-A) filaments of vertebrate smooth muscle. J Cell Sci. 23, 243-268 (1977).
- Dahl, D., Bignami, A. Glial fibrillary acidic protein from normal human brain. Purification and properties. Brain Res. 57 (2), 343-360 (1973).
- Steinert, P. M., Idler, W. W., Zimmerman, S. B. Self-assembly of bovine epidermal keratin filaments in vitro. J Mol Biol. 108 (3), 547-567 (1976).
- Goldman, R. D., Cleland, M. M., Murthy, S. N., Mahammad, S., Kuczmarski, E. R. Inroads into the structure and function of intermediate filament networks. J Struct Biol. 177 (1), 14-23 (2012).
- Oshima, R. G. Intermediate filaments: a historical perspective. Exp Cell Res. 313 (10), 1981-1994 (2007).
- Mashukova, A., Forteza, R., Salas, P. J. Functional Analysis of Keratin-Associated Proteins in Intestinal Epithelia: Heat-Shock Protein Chaperoning and Kinase Rescue. Methods Enzymol. 569, 139-154 (2016).
- Schinzel, R., Dillin, A. Endocrine aspects of organelle stress-cell non-autonomous signaling of mitochondria and the ER. Curr Opin Cell Biol. 33, 102-110 (2015).
- Taylor, R. C., Berendzen, K. M., Dillin, A. Systemic stress signalling: understanding the cell non-autonomous control of proteostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 211-217 (2014).
- Lemieux, G. A., et al. Kynurenic acid is a nutritional cue that enables behavioral plasticity. Cell. 160 (1-2), 119-131 (2015).
- Oosten-Hawle, P., Porter, R. S., Morimoto, R. I. Regulation of organismal proteostasis by transcellular chaperone signaling. Cell. 153 (6), 1366-1378 (2013).
- Ulgherait, M., Rana, A., Rera, M., Graniel, J., Walker, D. W. AMPK modulates tissue and organismal aging in a non-cell-autonomous manner. Cell Rep. 8 (6), 1767-1780 (2014).
- Aynardi, M. W., Steinert, P. M., Goldman, R. D. Human epithelial cell intermediate filaments: isolation, purification, and characterization. J Cell Biol. 98 (4), 1407-1421 (1984).
- Shea, J. M., et al. Purification of desmin from adult mammalian skeletal muscle. Biochem J. 195 (2), 345-356 (1981).
- Liao, J., Lowthert, L. A., Ghori, N., Omary, M. B. The 70-kDa heat shock proteins associate with glandular intermediate filaments in an ATP-dependent manner. J Biol Chem. 270 (2), 915-922 (1995).
- Liao, J., Omary, M. B. 14-3-3 proteins associate with phosphorylated simple epithelial keratins during cell cycle progression and act as a solubility cofactor. J Cell Biol. 133 (2), 345-357 (1996).
- Ku, N. O., Fu, H., Omary, M. B. Raf-1 activation disrupts its binding to keratins during cell stress. J Cell Biol. 166 (4), 479-485 (2004).
- Hendriks, I. A., Vertegaal, A. C. A comprehensive compilation of SUMO proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (9), 581-595 (2016).
- Agnetti, G., Lindsey, M. L., Foster, D. B. Manual of cardiovascular proteomics. , Springer. (2016).
- Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 536-550 (2014).
- Herhaus, L., Dikic, I. Expanding the ubiquitin code through post-translational modification. EMBO Rep. 16 (9), 1071-1083 (2015).
- Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cell. 24 (5), 535-542 (2013).
- Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (6), 427-439 (2010).
- Creixell, P., Linding, R. Cells, shared memory and breaking the PTM code. Mol Syst Biol. 8, 598 (2012).
- Minguez, P., et al. Deciphering a global network of functionally associated post-translational modifications. Mol Syst Biol. 8, (2012).
- Snider, N. T., Park, H., Omary, M. B. A conserved rod domain phosphotyrosine that is targeted by the phosphatase PTP1B promotes keratin 8 protein insolubility and filament organization. J Biol Chem. 288 (43), 31329-31337 (2013).
- Gorospe, J. R., et al. Molecular findings in symptomatic and pre-symptomatic Alexander disease patients. Neurology. 58 (10), 1494-1500 (2002).
