Summary
В этом методе мы представляем биохимические процедуры для быстрого и эффективного выделения промежуточных филаментных (IF) белков из нескольких тканей мыши. Изолированные IFs можно использовать для изучения изменений посттрансляционных модификаций с помощью масс-спектрометрии и других биохимических анализов.
Abstract
Промежуточные филаменты (IFs) вместе с актиновыми филаментами и микротрубочками образуют цитоскелет - критический структурный элемент каждой клетки. Нормальные функционирующие ИФ обеспечивают клетки механической и стрессовой устойчивостью, в то время как нефункциональный цитоскелет IF ставит под угрозу здоровье клеток и связан со многими заболеваниями человека. Посттрансляционные модификации (ПТМ) критически регулируют динамику ПЧ в ответ на физиологические изменения и в стрессовых условиях. Таким образом, способность контролировать изменения в сигнатуре ПТФ ПЧ может способствовать лучшему функциональному пониманию и, в конечном счете, кондиционированию системы ПЧ в качестве ответчика на стресс при клеточном повреждении. Тем не менее, большое количество IF-белков, которые кодируются более чем 70 отдельными генами и экспрессируются тканезависимым образом, является основной проблемой при определении относительной важности различных ПТМ. С этой целью методы, которые позволяют контролировать ПТМ на белках ПЧНа общесистемном уровне, а не на отдельных членов семьи, может ускорить прогресс исследований в этой области. Здесь мы представляем биохимические методы для выделения полной, детергент-растворимой и устойчивой к моющим средствам фракции IF-белков из 9 различных тканей мыши (мозг, сердце, легкие, печень, тонкая кишка, толстая кишка, поджелудочная железа, почка и селезенка). Далее мы демонстрируем оптимизированный протокол для быстрой изоляции IF-белков с использованием лизирующей матрицы и автоматической гомогенизации различных тканей мыши. Автоматизированный протокол полезен для профилирования ИФ в экспериментах с большим объемом выборки (например, в моделях болезней с участием нескольких животных и экспериментальных групп). Полученные в результате образцы могут быть использованы для различных анализов ниже по течению, включая масс-спектрометрическое профилирование PTM. Используя эти методы, мы предоставляем новые данные, чтобы показать, что белки IF в различных тканях мыши (мозг и печень) подвергаются параллельным изменениям в отношении их экспрессийУровня и ПТМ во время старения.
Introduction
IFS - это семейство белков, которые у людей кодируются 73 генами и подразделяются на шесть основных типов: типы I-IV являются цитоплазматическими ( например, эпителиальные и волосяные кератины (K), миоцит-десмин, нейрофиламенты, глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) и другие); Тип V - ядерные слои; И тип VI являются ПЧ в глазной линзе 1 . С точки зрения их молекулярной организации, белки IF имеют три общие области: высококонсервативный спиральный «стержневой» домен и шаровые «голова» и «хвостовой» домен. IF-тетрамеры белка собираются с образованием коротких нитевидных предшественников, которые в конечном счете внедряются в зрелые волокна, которые формируют динамические цитоскелетные и нуклеоскелетные структуры, участвующие в механической защите 2 , чувствительность к стрессу 3 , 4 , регуляцию транскрипции 5 и рост и другие критические клеточные функции"> 1 , 6 , 7 .
Функциональное значение IF-системы подчеркивается наличием многих заболеваний человека, вызванных missense мутациями в IF-генах, включая невропатии, миопатии, расстройства хрупкости кожи, метаболические дисфункции и синдромы преждевременного старения 8 . Некоторые мутации гена IF не вызывают, но предрасполагают их носителей к прогрессированию болезни, таким как простые эпителиальные кератины при болезни печени 9 . Последнее связано с критическими стресс-защитными функциями ИФ в эпителии. IFS в общем случае являются одними из наиболее распространенных клеточных белков в базальных условиях, но дополнительно сильно индуцируются при различных типах стресса 10 . Например, недавние исследования, оценивающие изменения в широком диапазоне протеомов у нематод C. elegans, показали, что множественные IFs сильно активируются и склонны к агрегатамВо время старения организма 11 , 12 . Поскольку поддержание надлежащей структуры IF важно для устойчивости клеток к различным формам стресса 10 , агрегация IF также может способствовать функциональному снижению во время старения. Однако исследования на организменном уровне, изучающие множественные IF-протеины млекопитающих в разных тканях, подвергающихся стрессу, отсутствуют.
IFs - это высокодинамичные структуры, которые адаптируются к требованиям сотовой связи. Кератины, например, подвергаются независимой от биосинтеза циклизации между растворимым (неволокнистым) и нерастворимым (нитевидным) пулом 13 протеинов. При нормальных физиологических условиях приблизительно 5% общий объем пула K8 / K18 может быть экстрагирован в буфере без моющих средств по сравнению с приблизительно 20%, который может быть солюбилизирован в неионном детергенте Nonidet P-40, который биохимически сравним с Triton- X100 14 , 15 . Во время митоза наблюдается заметное увеличение растворимости эпителия K8 и K18 14 простого типа, которое менее выражено в эпидермальных кератинах, но более выражено у виментина и других IF-белков III типа 15 , 16 . Свойства растворимости IF-белков жестко регулируются путем фосфорилирования, ключевой посттрансляционной модификации (PTM) для перегруппировки филаментов и их растворимости 17 , 18 , 19 , 20 . Большинство ПЧ подвергаются широкому регулированию рядом ПТМ на консервативных участках, что приводит к функциональным изменениям 17 .
Цель этого метода заключается в том, чтобы ввести исследователей, которые являются новичками в области ИФ, к биохимическим экстракционным и аналитическим методам исследования IF-протеинов в нескольких тканях мыши. КонкретныйМы сосредотачиваемся на выделении белков IF, используя метод экстракции с использованием соли и оценку изменений в PTM с помощью масс-спектрометрии и PTM-нацеливающих антител. Эти методы основаны на ранее опубликованных процедурах 21, но включают модификации для извлечения различных типов белка IF, чтобы выявить общий механизм регуляции в IF-семействе. Например, ацетилирование K8 в определенном лизиновом остатке регулирует организацию нитей, тогда как гиперацетилирование способствует нерастворимости K8 и образованию агрегатов 22 . Недавние глобальные исследования протеомного профилирования дополнительно показали, что большинство тканеспецифичных IF-белков также являются мишенями для ацетилирования и что большинство сайтов ацетилирования IF ограничено высококонсервативным доменом палочек. Это подчеркивает необходимость в методах, подходящих для глобального профилирования системы IF. Мы также вводим быстрый метод выделения белков IF из нескольких тканей с использованием автоматической гомогенизации в optiЛизиновая матрица. Полученные препараты пригодны для последующего анализа ПТМ с помощью масс-спектрометрии и других методов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол одобрен и выполняется в соответствии с Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованием (IACUC) в Университете Северной Каролины.
1. Препараты
- Приготовьте буфер Triton-X (1% Triton X-100, 5 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), добавьте объем в забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), pH 7,4). Для приготовления 500 мл: перемешивают по 5 мл каждого из тритонов Х-100 и 500 мМ ЭДТА в 490 мл PBS, pH 7,4. Хранить буферный раствор Triton-X при температуре 4 ° C.
- Готовят буфер с высоким содержанием соли (10 мМ Трис-HCl, рН 7,6, 140 мМ NaCl, 1,5 М KCl, 5 мМ ЭДТА, 0,5% Тритон Х-100, вытягивают объем в дважды дистиллированной (dd) H 2 O). Для приготовления 500 мл: перемешать 10 мл 0,5 М Трис-HCl (рН 7,6), 14 мл 5 М NaCl, 55,9 г KCl, 5 мл 0,5 М ЭДТА и 2,5 мл Тритона Х-100, доводят объем до 500 Мл с использованием двойной дистиллированной воды). Хранить раствор с высоким содержанием соли в буфере при температуре 4 ° C.
- Непосредственно перед использованием добавьте соответствующее количество Triton-X и High Salt Buffer (
- Готовят 5 мМ ЭДТА в 1х PBS, pH 7,4. Для приготовления 500 мл: перемешивают 5 мл 0,5 М ЭДТА в 495 мл 1 × PBS, pH 7,4.
- Изолируйте различные органы мыши (мозг, сердце, легкие, печень, поджелудочная железа, толстая кишка, кишечник, почка, селезенка), используя утвержденные протоколы, соответствующие ветеринарным рекомендациям и институциональным стандартам. 23 . Процедура сбора ткани должна длиться не более 5 минут, чтобы сохранить целостность РНК и белка протеазо-богатых тканей ( например, сначала нужно обработать поджелудочную железу).
- Отрежьте небольшое количество ткани (~ 5-20 мг) и поместите в раствор для хранения РНК, для последующей экстракции РНК, синтеза кДНК и количественного ПЦР-анализа в реальном времени для экспрессии гена IF. Поместите пробирки для хранения раствора РНК с тканью при температуре 4 ° C в течение ночи и следуйте протоколу производителя для дальнейшего sТоре и изоляции.
- Разрежьте остальную часть ткани на более мелкие фрагменты ( например, 0,5 см) и поместите в криопробирку. Замораживайте и храните флаконы при -80 ° C или жидком азоте для длительного хранения.
2. IF-анализ экспрессии генов
- Экстрагируют РНК из тканей, сохраненных в реагенте-хранилище РНК. Используйте любой подходящий / предпочтительный метод экстракции РНК в соответствии с протоколом производителя.
- Определите количественную концентрацию РНК и используйте 2 мкг РНК для получения кДНК с использованием подходящего набора обратной транскрипции в соответствии с протоколом производителя.
- С использованием генерируемых кДНК и мышиных IF-генов праймеров были созданы реакции qPCR, в том числе три технические повторения каждого образца, а также контрольные пробелы в соответствии с протоколом производителя.
- Количественная экспрессия IF-гена в виде изменения складки при сравнении различных условий ( например, молодняка или старой ткани).
3. PРепарация лизатов общей ткани для иммуноблота
- Гомогенизируйте 25 мг ткани в 1 мл 2х невосстанавливающего буферного раствора SDS. Опустите бромфеноловый синий краситель из буфера для образцов, если необходимо провести колориметрический анализ белка для количественной оценки концентрации белка.
- Добавить 5% (об. / Об.) 2-меркаптоэтанола (2-ME) для получения восстановленных образцов. В 200 мкл невосстанавливающих образцов добавить 10 мкл 2-ME.
- Определить концентрацию белка с помощью анализа белков, совместимых с моющим средством и восстановителем. Если краситель уже включен в буфер для образца, количество протеина можно оценить после запуска геля с помощью ряда методик, включая краситель 24 на основе кумасси.
- Вортекс все образцы и тепло при 95 ° С в течение 5 мин.
- Выполняют вестерн-блоттинг как в восстановительных, так и в невосстанавливающих условиях. Кратковременная экспозиция мембраны (<1 мин) для выявления мономерных видов и более (> 1 мин) для выявления комплексов с высокой молекулярной массойNg IF белки. Если вы наблюдаете агрегацию, исследуйте весь гель / мембрану (включая днища гелевых лунок).
- Проведите параллельный гель и пятно с белковым пятном в качестве контроля нагрузки 24 . В моделях болезней или экспериментах с травмами в качестве контроля нагрузки следует использовать общее окрашивание белка, в отличие от иммуноблотов для «домашних» белков ( например, актина, GAPDH), поскольку последние изменяются при различных стрессовых состояниях.
4. Приготовление растворимых в воде и высокосолевых экстрактов ТФ
- Добавить 1 мл ледяного буфера Triton X-100 в гомогенизатор для стеклянной трубки и поместить его на лед.
- Удалите небольшой кусочек ткани (~ 25 мг) из хранилища жидкого азота и поместите непосредственно в стеклянный гомогенизатор. Используйте политетрафторэтиленовый пестик для гомогенизации (50 ударов) и избегайте образования пузырьков. Регулярно поддерживайте гомогенизатор и лизат.
- Переносят лизат в 1,5 мл микронаНа центрифуге при 20000 мкг в течение 10 мин в предварительно охлажденной центрифуге (4 ° С).
- Соберите фракцию супернатанта в отдельную пробирку. Это фракция, растворимая в тритоне X, которую можно использовать для иммунопреципитации (ip) и анализа растворимого в воде пула белков IF. Обратите внимание, что шаги 4.1-4.4 могут быть повторены для достижения более чистого экстракта IF из ткани головного мозга.
- Добавьте 1 мл буфера с высоким содержанием соли в тканевый осадок, переносите в чистый гомогенизатор и окуните 100 ударов. Перенесите гомогенат обратно в микроцентрифужную пробирку и поместите пробирку на вращающийся шейкер в холодную комнату на 1 час.
- Центрифуга гомогенатов при 20000 мкг в течение 20 мин при 4 ° C. Отбросьте супернатант.
- Добавить 1 мл охлажденного льдом буфера PBS / ЭДТА в гранулу и гомогенизировать осадок (20 инсультов) в чистом гомогенизаторе в качестве конечной стадии очистки *. Перенесите в новую пробирку и центрифугируйте при 20000 мкг в течение 10 мин при 4 ° С, чтобы получить белок IF-(HSE).
* Необязательно, на этом этапе вместо гомогенизации вихрь. - Отбросьте супернатант и растворите гранулы в 300 мкл буфера для образца без SDS, который был предварительно нагрет. Сначала раскалывают гранулу пипетированием и вортексом, а затем нагревают образцы в течение 5 мин при 95 ° С.
- Вихрь и пипетка по мере необходимости для обеспечения растворения осадка. Для полного растворения гранул может потребоваться несколько минут.
- Хранить все образцы при -20 ° C до анализа.
5. Автоматизированный лизис тканей для экстракции белка IF в экспериментах с большими объемами
- Для выделения РНК поместите буфер для лизиса (600 мкл буфера на 25 мг ткани) в пробирку, содержащую матрицу лизиса D (использует маленькие керамические сферы) и дважды в течение 25 с в тканевом лизере. Отдельный лизат от матрицы путем центрифугирования при 20000 мкг и перейти к следующему этапу в отдельности.
- Для извлечения белка, место TritНа X-100 (или буфере для образцов SDS, если готовят общий лизат) в лизирующей трубке с лизирующей матрицей SS (используйте один шарик из нержавеющей стали). После тестирования нескольких матриц это было выбрано, потому что оно производит экстракты белка IF, которые имеют такое же качество, что и традиционный метод douncing. Обратите внимание, что автоматизированный метод не оптимален для поджелудочной железы и селезенки, и для этих тканей должен использоваться стандартный протокол гомогенизации.
- Для продолжения подготовки экстракта с высоким содержанием соли удалите шарик из нержавеющей стали с помощью магнита и центрифугируйте пробирки при 20 000 xg в течение 10 минут при 4 ° C.
- Перейдите к шагу 4.4 (выше) ручного протокола.
- Хранить все образцы при -20 ° C до анализа.
6. Иммуно-обогащение посттрансляционно модифицированных белков IF
- Подготовьте PBST буфер (0,02% Tween-20 в PBS). Чтобы сделать 50 мл, добавьте 10 мкл Tween-20 к 50 мл PBS, pH 7,4.
- Подготовка антитела PTMРаствора (1-10 мкг антитела в 200 мкл PBST). В целом, 3 мкг антитела / реакции являются хорошим стартовым условием, которое может быть дополнительно оптимизировано в случае необходимости.
- Для каждой реакции аликвоту 50 мкл магнитных шариков в микроцентрифужную пробирку помещают на магнит и аспирируют раствор для хранения шариков.
- Сопрягайте шарики с антителом иммунопреципитата, повторно суспендируя в растворе антитела и инкубируя на ротаторе (с концевым концом, для обеспечения смешивания небольших объемов) при комнатной температуре в течение 20 мин.
- Поместите пробирки на раствор магнита и аспирации антител.
- Промыть конъюгированные с антителом гранулы один раз в 200 мкл PBST и удалить промывочный буфер.
- Добавляют 0,6-1 мл тканевого лизата к шарикам, перемешивают осторожным пипетированием и инкубируют в течение 3 часов на ротаторе в холодильной камере.
- Поместите пробирки на магнит, удалите лизат и вымойте бусы пять раз с помощью 200 мкл PBST. После последней стадии промывки собрать гранулы в 100 _6; L PBS (без Tween-20) и перенос в чистую новую пробирку. Поместите трубку на магнит.
- Аспирируйте PBS и добавьте 100 мкл невосстанавливающего буфера для образцов. Удалите 50 мкл и добавьте 2-ME (5%) для получения восстановительных образцов. Нагревают образцы до 95 ° С в течение 5 мин.
- Отделите ip фракцию от шариков на магните и соберите ее в новую пробирку.
- Хранить образцы при -20 ° C до анализа.
7. Подготовка образцов IF-белка для масс-спектрометрического анализа
- Запланируйте консультацию с экспертом по протеомике до начала исследования, поскольку при анализе масс-спектрометрии имеется значительное время и затраты.
- Примите особые меры предосторожности, чтобы избежать загрязнения. Обрабатывать все гели с чистыми перчатками и инкубировать в чистых контейнерах, промывать только с использованием ddH 2 O (избегать мыла).
- Прогоните 20-50 мкл образца HSE (из разделов 4 и 5) на геле SDS-PAGE в соответствии со стандартными условиями. Пятно с окрашиванием белка в течение 1 часа. Промойте несколько раз и промокните в ddH 2 O в течение ночи. Полосы белка IF должны быть хорошо видны после удаления пятен.
- Поместите гель между пластиковыми защитными прокладками, отсканируйте и отметьте полосы, которые будут вырезаны и отправлены на анализ.
- Акцизные полосы белка IF используют новую чистую бритву.
- Поместите полоски геля в чистые пробирки для микроцентрифугирования и переносите в установку для масс-спектрометрии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Новый быстрый метод для высокой экстракции на основе солей IF-белков из нескольких тканей мыши с использованием лизирующей матрицы.
Традиционный метод 25 , 26 выделения большей части фракции белка промежуточных филаментов из эпителиальной ткани был модифицирован здесь, чтобы включить 9 различных органов и более быструю процедуру для тканевого лизиса. Хотя для традиционного метода требуется 3 шага ручной гомогенизации, модифицированная процедура имеет только 1 ручной этап гомогенизации, что сокращает процедуру на несколько часов, особенно при обработке более 6 образцов. На рисунке 1A показан типичный результат HSEs из 9 тканей мыши, а таблица ожидаемых белков в ткани и молекулярная масса каждого белка показана на рисунке 1B
Печень K8 и K18 сильно активируется и подвергается повышенному фосфорилированию и ацетилированию лизина в печени от старых мышей.
На рисунке 2 показаны типичные результаты нескольких анализов, описанных в этом протоколе. Панель А изображает анализ экспрессии двух основных IF-генов в печени, кератина 8 ( KRT8 )И кератин 18 ( KRT18 ), которые кодируют IF-белки K8 и K18, соответственно. Эпителиальные кератины сильно активируются при различных стрессовых состояниях. В показанном результате это происходит во время старения, так как KRT8 значительно активируется в печени 24-летних мышей по сравнению с 3-мя мышами. Результаты на уровне протеина более поразительны, так как наблюдаются резкое увеличение мономера К8, а также комплексов с высокой молекулярной массой в старой (24 м) печени. Краситель на основе кумасси здесь служит контролем загрузки, чтобы обеспечить равномерную загрузку белка через образцы. Обратите внимание, что при общем количестве тканевых лизатов легко перегрузить белок на гель, как в этом случае. Загрузка меньшего объема или разбавление образца в буфере додецилсульфата натрия (SDS) уменьшит эту проблему (особенно, если она кажется вязкой и трудной для пипетирования). Панель C изображает типичный результат экстракта печени с высоким содержанием соли, полученного с использованием автоматизированного протокола, demНастойчиво подчеркивая сильное обогащение кератинов 8 и 18 гелем. Красные линии демаркируют область, которая была вырезана и представлена для масс-спектрометрического анализа. На панели D результаты масс-спектрометрического анализа образцов на панели C показывают, что K8 и K18 в старой печени имеют множественные сайты фосфорилирования и ацетилирования, которые не присутствуют в молодой печени.
GFAP сильно активируется, и лизин ацетилируют в мозге старых мышей.
Рисунок 3 демонстрирует, что методы, используемые для извлечения IFs из эпителия, могут также использоваться на неэпителиальной ткани. Кроме того, результаты показывают общую закономерность зависимой от старения регуляции IF-генов и белков. Результатом КПЦР на фиг. 2А показана 5-кратная индукция мРНК GFAP в мозге 24-летних мышей по сравнению с 3-м старыми мышами. Рисунок 2BПоказывает полные белки, присутствующие в фракции Тритона Х-100 и обогащенной ИФБ HSE. Обратите внимание на увеличение интенсивности полосы при 50 кДа, отмеченное стрелкой (соответствующей GFAP) в старом мозге. Анализ вестерн-блоттинга на фиг. 2C дополнительно показывает усиление GFAP и значительное присутствие мономера GFAP и потенциально высокомолекулярного комплекса в фракции Triton X-100 (обе маркированы стрелками). Анализ вестерн-блоттинга тех же образцов с помощью пан-ацетилизинового антитела показывает, что антитело распознает полосу при ~ 50 кДа в HSE старого мозга мыши и ~ 250 кДа в фракции Triton X-100 ( фиг. 2D ). Иммуно-обогащение ацетилированных белков фракциями Тритона Х-100 выявляет повышенное присутствие белка GFAP в лизате, полученном из старого мозга. Показано, что восстанавливающие и невосстанавливающие условия выделяют мономер GFAP и комплексы с высокой молекулярной массой. Масс-спектрометрический анализ (аналогичный фиг.1
Рисунок 1: Автоматизированный лизис и экстракция IF-белков из нескольких тканей мыши. ( A ) Гель-пятно HOMs на основе кумасси от обозначенных тканей мыши. Показанные ткани были получены от той же взрослой мыши (3 м) взрослого самца CBA. Образцы обрабатывались, как описано в разделе 5. Мозг : обратите внимание, что NFL, NFM и NFH в значительной степени фосфорилированы 27 и мигрируют медленнее, чем ожидалось, при ~ 70, 145 и 200 кДа, соответственно. Сердце : в дополнение к полосе 53 кДа, соответствующей десмину и виментину), образцы сердца также содержат полосу ~ 42 кДа, наиболее вероятно представляющую актин, который, как известно, совместно очищается десминами 28 . LArge intestine: Идентичность видных полос выше 25 кДа, которые совместно экстрагированы с K8 / K18, неизвестны, но эти полосы отсутствуют, если ткани обрабатываются с использованием традиционного метода гомогенизатора dounce. Поджелудочная железа и селезенка: Обратите внимание, что автоматическая гомогенизация не подходит для выделения кератинов из поджелудочной железы и виментина из селезенки, по-видимому, из-за чувствительности лизата к незначительному повышению температуры во время импульса в тканевом лизере. ( B ) Таблица, показывающая основные типы белка IF, присутствующие в разных тканях, и их предсказанная молекулярная масса в качестве эталона для панели A. Пожалуйста , нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: МолекулаИ биохимические различия в кератинах печени у молодых и старых мышей. ( A ) Анализ мРНК KRT8 и KRT8 с использованием стандартной процедуры (Протокол 1) показывает значительную индукцию в транскрипте KRT8 в печени от старых мышей. N = 6 для каждого условия (для каждой группы использовались 3 самцы и 3 самки CBA). ** p <0,01; Односторонний дисперсионный анализ. ( B ) Всего лизаты печени были получены у 3 молодых (3 месяца) и 3 старых (24 месяцев) самцов мышей линии CBA с использованием Протокола 2, и образцы были проанализированы в невосстанавливающих условиях. Для исследования экспрессии K8 использовали TS1-антитело, а в качестве контроля нагрузки использовали окрашивание белка на основе кумасси. ( C ) Высокие солевые экстракты из молодой и старой печени мыши, соответствующие мышам № 1 и № 4, соответственно, из панели B. Две стрелки указывают на K8 и K18 на геле, а красная рамка указывает на часть геля, которая была Вырезаны и представлены для масс-спектрометрического анализа. ( D Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Молекулярные и биохимические различия в GFAP из мозга молодых и старых мышей. ( A ) Анализ мРНК GFAP с использованием стандартной методики (Протокол 1) выявил существенную индукцию в мозге у старых мышей. N = 6 для каждого условия (для каждой группы использовались 3 самцы и 3 самки CBA). ** p <0,01; Односторонний дисперсионный анализ. ( B ) Белок белка Triton X-100 и фракции HSE из мозговой ткани молодых (3 месяца) и старой (24 месяца) мышиного белка на основе кумасси. Обратите внимание на увеличение полосы GFAP ~ 50 кДа в HSE от старого мозга (стрелка). ( C ) GFAP иммуноблот (мышиный моноклональный, GA5-клон) тех же образцов, что и панель B. ( D ) Иммуноблот ацетил-лизина (поликлональный кролик Abcam ab80178) тех же образцов, что и на панели B. ( E ) GFAP-блот после иммунопреципитации ацетил- Лизин. Образцы анализировали в условиях невосстановительного (NR) и восстановительного (R) состояний, и стрелки указывают на увеличение присутствия GFAP в иммунопреципитате из старого мозга. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Методы, которые позволяют биохимическую характеристику IF-белков, могут быть полезны для понимания многочисленных патофизиологических явлений в системах млекопитающих, поскольку IF-белки являются маркерами и модуляторами клеточного и тканевого стресса 29 . Принцип, лежащий в основе нынешнего метода, основан на первоначальных процедурах, разработанных в 1970-х и 1980-х годах для изоляции, отделения и воссоздания белков IF из клеток и тканей, как правило, с использованием низких и высоких солевых растворов и моющего средства Triton-X100 25 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 . Для исторической проницательности исследований, которые подтвердили биохимическую изоляцию IF-протеинов, см. Последние обзоры 36 , 37 . Текущий методОснована на более современных протоколах, разработанных для изучения простых эпителиальных кератинов 26 . Преимущество метода состоит в том, что он может служить в качестве начального шага, чтобы позволить исследователям, которые являются новыми для IF-области, эффективно изолировать IF-протеины от большинства тканей млекопитающих. Он представляет собой наглядное руководство по связанным процедурам, которые широко используются исследователями в данной области для изучения регуляции белка IF- 21 , 38 .
Этот метод может быть использован для изучения регуляции и функции IFs в механизмах стрессовой связи между тканями млекопитающих 39 , 40 . Становится очевидным, что стресс в одной ткани может влиять на работу других тканей, например, в условиях пищевого стресса 41 , неправильного распада белка 42 , метаболического стресса 43 и другихEr изменений. Следует отметить, что большая часть работы, выполняемой в настоящее время в этой области, осуществляется на моделях Drosophila и C. elegans , а исследования по широким стрессовым реакциям в системах млекопитающих отсутствуют. В качестве основного регулятора клеточного стресса 10 , система ИФ может разблокировать ключи к ответным реакциям на уровне организма, которые могут иметь важные последствия для болезни. Таким образом, текущий протокол может быть использован для изучения глобальных патофизиологических механизмов в различных моделях стресса, травмы и заболевания у мышей.
Одно из ограничений существующего метода состоит в том, что высокосолевые экстракты считаются «сырыми» препаратами IF, так как они также содержат другие IF-ассоциированные белки, такие как плектин, например 44 . Как показано ранее, HSEs можно денатурировать в 8 М мочевиновом буфере, чтобы получить высокочистые IF-белки, которые способны in vitro повторно собраться в фосфатном буфере 44 . После двух таких цикловРазборке и повторной сборке, стехиометрия IF-белков (выделенных из клеток HeLa) оставалась той же, тогда как обработка мочевины удаляла плектин 44 . Во время десминной очистки актин можно удалить путем солюбилизации HSE в уксусной кислоте 45 . Необходимость включения дополнительных этапов очистки зависит от конечной цели эксперимента. Например, если целью является охарактеризовать состояние сборки и создать реконструированные IFS in vitro, для получения высокочистых IF-белков требуется стадия мочевины. С другой стороны, если целью является выявление зависящих от контекста ассоциаций между IFS и другими клеточными белками, то могут использоваться «сырые» препараты. Взаимодействующие белки могут быть идентифицированы с помощью масс-спектрометрии с использованием либо в-гель-перевара для мишеней с высокой распространенностью, видимых гелевым пятном, либо в растворе для расщепления для мишеней с низкой численностью. Предыдущие исследования с использованием иммунопреципитации растворимых в моющих средствах IFs и HSEsСодержащие IF-белки, идентифицировали функционально важное специфическое взаимодействие между кератинами 8/18 и белком теплового шока 70 (Hsp70), которое потенцируется после теплового стресса 46 , адаптерного белка 14-3-3 после фосфорилирования 47 и K8 / K18 Raf-1-киназы В нормальных физиологических условиях 48, среди прочих. Текущий протокол может позволить подобные исследования по другим белкам IF.
Использование лизирующей матрицы является ключевой модификацией из предыдущих методов и должно обеспечивать быстрое выделение IFs из нескольких тканей, за исключением поджелудочной железы и селезенки. Автоматизация начальных шагов может быть особенно полезна для экспериментов с большими объемами мыши. Например, выделение белков IF из 3 различных тканей от 10 мышей на каждое условие ( например, нормальное и некоторая форма системного стресса или заболевания) потребует обработки 60 отдельных тканей. Использование традиционного ручного методаUld нужно делать партиями и может занять несколько дней. Однако, используя автоматизированный метод с матрицей лизинга, процедура может быть выполнена всего за несколько часов. Критические шаги процедуры включают: обеспечение того, чтобы образец оставался холодным в течение всей процедуры; Инкубацию в буфере с высоким содержанием соли в течение 1 ч (стадия 4.5); С использованием горячего буфера и интенсивного завихрения для обеспечения полного ресуспендирования гранулы перед анализом (шаг 4.8); И принимая все меры предосторожности, чтобы избежать загрязнения образцов, подлежащих анализу с помощью масс-спектрометрии (шаг 7.2).
Основным недостатком идентификации PTM сайтов на основе масс-спектрометрии является то, что она хорошо работает для некоторых PTM - фосфорилирование и ацетилирование лизина являются главными примерами, но другие, такие как сумоилирование, являются гораздо более сложными 49 . Тем не менее, протеомика является мощным инструментом для изучения регуляции белка в нормальных и больных тканях. Agnetti et al. Обобщил- современный обзор современных протеомных методов, используемых в настоящее время для изучения различных ПТМ в контексте ткане-экспрессируемых белков 50 . Целью текущего метода является создание образцов, которые можно применять для различных видов анализа. Например, in vitro можно проводить сумоилирование на иммуноакцитированных IF-белках, а суммоилирование можно оценить на изолированных IFs в препаратах HSE с использованием сумоспецифичных антител 18 , 21 . Поэтому применение этого метода не ограничено генерированием проб только для анализа масс-спектрометрии, но может быть использовано для исследования множественных свойств ПЧ с использованием различных технологий нисходящего потока.
IF белки широко регулируются многочисленными PTMs в консервативных сайтах, что приводит к измененной растворимости, сборке нитей и взаимодействию белка 17 . Последние технологические достижения представили tОн невероятную величину, сложность и значение болезни посттрансляционных модификаций (ПТМ) на клеточных белках 51 , 52 , 53 . Совершенствование методов обнаружения общих ПТМ, таких как фосфорилирование 54 и ацетилирование 51 , привело к появлению обширных каталогов данных, но понимание их биологического значения - растрескивание «кода ПТМ» - является основной оставшейся проблемой 55 , 56 . Одним из способов оценки функциональных ролей и относительной значимости каждого ПТМ является определение того, насколько хорошо он сохраняется у нескольких членов семейства белков IF. Например, идентификация нового сайта фосфотирозина на K8 показала, что этот сайт содержится в мотивах QYE, найденных по существу во всех цитоплазматических IF-белках и критических для регулирования растворимости белка IF и филамента dy57 . Важно отметить, что мутация консервативного остатка тирозина на GFAP в отрицательно заряженную «фосфомимическую» аспарагиновую кислоту (Y242D) вызывает болезнь Александра 58 . Представленные здесь репрезентативные данные демонстрируют, как два разных тканеспецифических белка IF-типа (K8 и GFAP) подвергаются сходной схеме усиления и увеличения ацетилирования во время старения, что может быть следствием измененного метаболизма 22 , 51 . Этот пример иллюстрирует полезность метода для понимания функции IF-белков в глобальном физиологическом масштабе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами NIH NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS] и P30 DK034987 [в UNC-Chapel Hill]. Авторы благодарят Deekshita Ramanarayanan за помощь в qPCR и вестерн-блот-экспериментах.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynabeads Protein G | ThermoFisher Scientific | 10009 | immunoprecipitation beads |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | for buffers |
| Purelink RNA mini kit | ThermoFisher Scientific | 12183018 | RNA extraction from tissue |
| Purelink DNAse set | ThermoFisher Scientific | 12185010A | on column DNA digestion |
| Dynamag-2 | ThermoFisher Scientific | 12321D | magnet for use with dynabeads |
| GelCode Blue Stain Reagent | ThermoFisher Scientific | 24592 | mass spectrometry-compatible gel stain |
| Pierce ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher Scientific | 32106 | for use in western blot |
| High Capacity cDNA reverse transcription kit | ThermoFisher Scientific | 4368813 | for use in gene expression analysis |
| Proflex 3 x 32-well PCR System | ThermoFisher Scientific | 4484073 | PCR system |
| PVDF transfer membrane | ThermoFisher Scientific | 88520 | for western blot |
| Power Up SYBR master mix | ThermoFisher Scientific | A25778 | for qPCR analysis |
| RNAlater | ThermoFisher Scientific | AM7020 | solution for tissue storage prior to RNA isolation |
| Novex 4-20% Tris Glycine Gel | ThermoFisher Scientific | XP04205BOX | Precast protein gel |
| Anti-Keratin 8 antibody (TS1) | ThermoFisher Scientific | MA514428 | for western blot detection of K8 |
| Anti-Vimentin | ThermoFisher Scientific | MA511883 | for western blot detection of vimentin |
| Tris Glycine Transfer Buffer (25x) | ThermoFisher Scientific | LC3675 | for wet transfer of protein gels |
| 2x SDS Sample Buffer | ThermoFisher Scientific | LC2676 | for preparing protein gel samples |
| Tris Glycine SDS Running Buffer (10x) | ThermoFisher Scientific | LC26755 | for running protein gels |
| Lysing beads - Matrix D | MP Biomedicals | 116913100 | Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction |
| Lysing beads - Matrix SS | MP Biomedicals | 116921100 | Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction |
| NanoDrop Lite Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-LITE | measurement of protein and nucleic acid |
| Precellys 24 homogenizer | Bertin Instruments | EQ03119 | Automated tissue homogenizer |
References
- Eriksson, J. E., et al. Introducing intermediate filaments: from discovery to disease. J Clin Invest. 119 (7), 1763-1771 (2009).
- Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function. J Biol Chem. 290 (28), 17145-17153 (2015).
- Perez-Sala, D., et al. Vimentin filament organization and stress sensing depend on its single cysteine residue and zinc binding. Nat Commun. 6, 7287 (2015).
- Dialynas, G., et al. Myopathic lamin mutations cause reductive stress and activate the nrf2/keap-1 pathway. PLoS Genet. 11 (5), e1005231 (2015).
- Hobbs, R. P., et al. Keratin-dependent regulation of Aire and gene expression in skin tumor keratinocytes. Nat Genet. , (2015).
- Chung, B. M., Rotty, J. D., Coulombe, P. A. Networking galore: intermediate filaments and cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 600-612 (2013).
- Gruenbaum, Y., Aebi, U. Intermediate filaments: a dynamic network that controls cell mechanics. F1000 Prime Rep. 6, (2014).
- Omary, M. B. "IF-pathies": a broad spectrum of intermediate filament-associated diseases. J Clin Invest. 119 (7), 1756-1762 (2009).
- Omary, M. B., Ku, N. O., Strnad, P., Hanada, S. Toward unraveling the complexity of simple epithelial keratins in human disease. J Clin Invest. 119 (7), 1794-1805 (2009).
- Toivola, D. M., Strnad, P., Habtezion, A., Omary, M. B. Intermediate filaments take the heat as stress proteins. Trends Cell Biol. 20 (2), 79-91 (2010).
- Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging. C. elegans. Cell. 161 (4), 919-932 (2015).
- David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in. C. elegans. PLoS Biol. 8 (8), (2010).
- Windoffer, R., Beil, M., Magin, T. M., Leube, R. E. Cytoskeleton in motion: the dynamics of keratin intermediate filaments in epithelia. J Cell Biol. 194 (5), 669-678 (2011).
- Chou, C. F., Riopel, C. L., Rott, L. S., Omary, M. B. A significant soluble keratin fraction in 'simple' epithelial cells. Lack of an apparent phosphorylation and glycosylation role in keratin solubility. J Cell Sci. 105 ( Pt. 2, 433-444 (1993).
- Omary, M. B., Ku, N. O., Liao, J., Price, D. Keratin modifications and solubility properties in epithelial cells and in vitro). Subcell Biochem. 31, 105-140 (1998).
- Lowthert, L. A., Ku, N. O., Liao, J., Coulombe, P. A., Omary, M. B. Empigen BB: a useful detergent for solubilization and biochemical analysis of keratins. Biochem Biophys Res Commun. 206 (1), 370-379 (1995).
- Snider, N. T., Omary, M. B. Post-translational modifications of intermediate filament proteins: mechanisms and functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 163-177 (2014).
- Snider, N. T., Weerasinghe, S. V., Iniguez-Lluhi, J. A., Herrmann, H., Omary, M. B. Keratin hypersumoylation alters filament dynamics and is a marker for human liver disease and keratin mutation. J Biol Chem. 286 (3), 2273-2284 (2011).
- Eriksson, J. E., et al. Specific in vivo phosphorylation sites determine the assembly dynamics of vimentin intermediate filaments. J Cell Sci. 117 (Pt. 6, 919-932 (2004).
- Sahlgren, C. M., et al. Mitotic reorganization of the intermediate filament protein nestin involves phosphorylation by cdc2 kinase). J Biol Chem. 276 (19), 16456-16463 (2001).
- Snider, N. T., Omary, M. B. Assays for Posttranslational Modifications of Intermediate Filament Proteins. Methods Enzymol. 568, 113-138 (2016).
- Snider, N. T., et al. Glucose and SIRT2 reciprocally mediate the regulation of keratin 8 by lysine acetylation. J Cell Biol. 200 (3), 241-247 (2013).
- Danneman, P., Suckow, M. A., Brayton, C., Suckow, M. A. The laboratory mouse. , 2nd edn, CRC Press. (2013).
- Weiss, W., Weiland, F., Gorg, A. Protein detection and quantitation technologies for gel-based proteome analysis. Methods Mol Biol. 564, 59-82 (2009).
- Achtstaetter, T., Hatzfeld, M., Quinlan, R. A., Parmelee, D. C., Franke, W. W. Separation of cytokeratin polypeptides by gel electrophoretic and chromatographic techniques and their identification by immunoblotting. Methods Enzymol. 134, 355-371 (1986).
- Ku, N. O., et al. Studying simple epithelial keratins in cells and tissues. Methods Cell Biol. 78, 489-517 (2004).
- Julien, J. P., Mushynski, W. E. Multiple phosphorylation sites in mammalian neurofilament polypeptides. J Biol Chem. 257 (17), 10467-10470 (1982).
- Hubbard, B. D., Lazarides, E. Copurification of actin and desmin from chicken smooth muscle and their copolymerization in vitro to intermediate filaments. J Cell Biol. 80 (1), 166-182 (1979).
- Ku, N. O., Strnad, P., Bantel, H., Omary, M. B. Keratins: Biomarkers and modulators of apoptotic and necrotic cell death in the liver. Hepatology. 64 (3), 966-976 (2016).
- Huiatt, T. W., Robson, R. M., Arakawa, N., Stromer, M. H. Desmin from avian smooth muscle. Purification and partial characterization. J Biol Chem. 255 (14), 6981-6989 (1980).
- Zackroff, R. V., Goldman, R. D. In vitro assembly of intermediate filaments from baby hamster kidney (BHK-21) cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (12), 6226-6230 (1979).
- Franke, W. W., Schmid, E., Osborn, M., Weber, K. The intermediate-sized filaments in rat kangaroo PtK2 cells. II. Structure and composition of isolated filaments. Cytobiologie. 17 (2), 392-411 (1978).
- Small, J. V., Sobieszek, A. Studies on the function and composition of the 10-NM(100-A) filaments of vertebrate smooth muscle. J Cell Sci. 23, 243-268 (1977).
- Dahl, D., Bignami, A. Glial fibrillary acidic protein from normal human brain. Purification and properties. Brain Res. 57 (2), 343-360 (1973).
- Steinert, P. M., Idler, W. W., Zimmerman, S. B. Self-assembly of bovine epidermal keratin filaments in vitro. J Mol Biol. 108 (3), 547-567 (1976).
- Goldman, R. D., Cleland, M. M., Murthy, S. N., Mahammad, S., Kuczmarski, E. R. Inroads into the structure and function of intermediate filament networks. J Struct Biol. 177 (1), 14-23 (2012).
- Oshima, R. G. Intermediate filaments: a historical perspective. Exp Cell Res. 313 (10), 1981-1994 (2007).
- Mashukova, A., Forteza, R., Salas, P. J. Functional Analysis of Keratin-Associated Proteins in Intestinal Epithelia: Heat-Shock Protein Chaperoning and Kinase Rescue. Methods Enzymol. 569, 139-154 (2016).
- Schinzel, R., Dillin, A. Endocrine aspects of organelle stress-cell non-autonomous signaling of mitochondria and the ER. Curr Opin Cell Biol. 33, 102-110 (2015).
- Taylor, R. C., Berendzen, K. M., Dillin, A. Systemic stress signalling: understanding the cell non-autonomous control of proteostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 211-217 (2014).
- Lemieux, G. A., et al. Kynurenic acid is a nutritional cue that enables behavioral plasticity. Cell. 160 (1-2), 119-131 (2015).
- Oosten-Hawle, P., Porter, R. S., Morimoto, R. I. Regulation of organismal proteostasis by transcellular chaperone signaling. Cell. 153 (6), 1366-1378 (2013).
- Ulgherait, M., Rana, A., Rera, M., Graniel, J., Walker, D. W. AMPK modulates tissue and organismal aging in a non-cell-autonomous manner. Cell Rep. 8 (6), 1767-1780 (2014).
- Aynardi, M. W., Steinert, P. M., Goldman, R. D. Human epithelial cell intermediate filaments: isolation, purification, and characterization. J Cell Biol. 98 (4), 1407-1421 (1984).
- Shea, J. M., et al. Purification of desmin from adult mammalian skeletal muscle. Biochem J. 195 (2), 345-356 (1981).
- Liao, J., Lowthert, L. A., Ghori, N., Omary, M. B. The 70-kDa heat shock proteins associate with glandular intermediate filaments in an ATP-dependent manner. J Biol Chem. 270 (2), 915-922 (1995).
- Liao, J., Omary, M. B. 14-3-3 proteins associate with phosphorylated simple epithelial keratins during cell cycle progression and act as a solubility cofactor. J Cell Biol. 133 (2), 345-357 (1996).
- Ku, N. O., Fu, H., Omary, M. B. Raf-1 activation disrupts its binding to keratins during cell stress. J Cell Biol. 166 (4), 479-485 (2004).
- Hendriks, I. A., Vertegaal, A. C. A comprehensive compilation of SUMO proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (9), 581-595 (2016).
- Agnetti, G., Lindsey, M. L., Foster, D. B. Manual of cardiovascular proteomics. , Springer. (2016).
- Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 536-550 (2014).
- Herhaus, L., Dikic, I. Expanding the ubiquitin code through post-translational modification. EMBO Rep. 16 (9), 1071-1083 (2015).
- Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cell. 24 (5), 535-542 (2013).
- Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (6), 427-439 (2010).
- Creixell, P., Linding, R. Cells, shared memory and breaking the PTM code. Mol Syst Biol. 8, 598 (2012).
- Minguez, P., et al. Deciphering a global network of functionally associated post-translational modifications. Mol Syst Biol. 8, (2012).
- Snider, N. T., Park, H., Omary, M. B. A conserved rod domain phosphotyrosine that is targeted by the phosphatase PTP1B promotes keratin 8 protein insolubility and filament organization. J Biol Chem. 288 (43), 31329-31337 (2013).
- Gorospe, J. R., et al. Molecular findings in symptomatic and pre-symptomatic Alexander disease patients. Neurology. 58 (10), 1494-1500 (2002).
