Summary
이 방법에서는 여러 개의 마우스 조직에서 중간 필라멘트 (IF) 단백질을 신속하고 효율적으로 분리하기위한 생화학 적 절차를 제시합니다. 분리 된 IF는 질량 분광법 및 기타 생화학 적 분석법에 의한 번역 후 변형의 변화를 연구하는데 사용될 수 있습니다.
Abstract
중급 필라멘트 (IF)는 액틴 필라멘트 및 미세 소관과 함께 모든 세포의 중요한 구조 요소 인 세포 뼈대를 형성합니다. 정상 기능 IFs는 세포에 기계적 및 응력 복원력을 제공하는 반면 기능 장애 IF 세포 뼈대는 세포 건강을 손상시키고 많은 인간 질병과 관련이 있습니다. 생체 변화 및 스트레스 조건에 따라 IF 역학을 비판적으로 조절합니다. 따라서 IF의 PTM 시그니처의 변화를 모니터링하는 능력은 세포 손상 동안 스트레스 리스폰 더로서의 IF 시스템의 더 나은 기능적 이해 및 궁극적으로 컨디셔닝에 기여할 수 있습니다. 그러나, 70 개 이상의 개별 유전자에 의해 암호화되고 조직에 의존적 인 방법으로 표현되는 많은 수의 IF 단백질은 다른 PTM의 상대적인 중요성을 분류하는 데있어 주요한 과제입니다. 이를 위해 IF 단백질에서 PTM을 모니터링 할 수있는 방법고립 된 가족 구성원이 아닌 유기체 차원에서이 분야의 연구 진행을 가속화 할 수 있습니다. 여기에 우리는 9 개의 다른 마우스 조직 (뇌, 심장, 폐, 간, 소장, 대장, 췌장, 신장 및 간세포)에서 IF 단백질의 전체, 세제 가용성 및 세제 내성 분획을 분리하는 생화학 적 방법을 제시합니다 비장). 우리는 lysing 매트릭스와 다른 마우스 조직의 자동화 균질화를 사용하여 IF 단백질의 신속한 분리를위한 최적화 된 프로토콜을 입증합니다. 자동화 된 프로토콜은 높은 샘플 양 (예 : 여러 동물 및 실험 그룹이 포함 된 질병 모델)이있는 실험에서 IF를 프로파일 링하는 데 유용합니다. 결과 샘플은 질량 분석 기반 PTM 프로파일 링을 포함한 다양한 다운 스트림 분석에 활용할 수 있습니다. 이 방법들을 이용하여, 우리는 다른 마우스 조직 (뇌 및 간)에있는 IF 단백질이 그들의 표현과 관련하여 평행 한 변화를 겪는다는 것을 보여주는 새로운 데이터를 제공한다시온 (sion) 수준 및 PTMs.
Introduction
IFs는 인간에서 73 개의 유전자로 코드화되며 여섯 가지 주요 유형으로 분류되는 단백질 군입니다. 유형 I-IV는 세포질 ( 예 : 상피와 모발 케라틴 (K), 근육 세포 데민 (amocyte desmin), 신경 섬유 (neurofilaments), 신경 교세포 성 산성 단백질 (GFAP) 다른 사람); type V는 핵 라미네이트입니다. 및 VI 형은 눈 렌즈 ( 1) 에서 IF이다. 분자 구조면에서 보면, IF 단백질은 크게 보존 된 코일 형 코일 "막대"도메인과 구형 "머리"및 "꼬리"도메인의 세 가지 공통 도메인을 가지고 있습니다. IF 단백질 4 량체는 조립되어 짧은 필라멘트 전구체를 형성하며 궁극적으로는 성숙 필라멘트에 결합되어 기계적 보호에 관련된 동적 세포 골격 및 핵 골격 구조를 형성 2 , 스트레스 센싱 3 , 4 , 전사 5 조절 및 성장 및 기타 중요한 세포 기능"> 1 , 6 , 7 .
IF 시스템의 기능적 중요성은 신경 병증, 근육 병증, 피부 허약 장애, 대사 기능 장애 및 조기 노화 증후군을 포함하여 IF 유전자의 미스 돌연변이로 인한 많은 인간 질병의 존재에 의해 강조됩니다. 일부 IF 유전자 돌연변이는 간 질환 9 의 단순한 상피 각질과 같은 병의 진행을 야기하지는 않지만 캐리어를 질병에 걸리기 쉽게 만든다. 후자는 상피 세포에서 IF의 중요한 스트레스 - 보호 기능에 기인한다. IFs는 일반적으로 기저 조건 하에서 가장 풍부한 세포 단백질 중 하나이지만, 다양한 유형의 스트레스 중에 더욱 강하게 유도됩니다 10 . 예를 들어 선충류 C. elegans 의 프로테옴 전반에 걸친 변화를 평가 한 최근의 연구에 따르면 여러 IF가 고도로 상향 조절되고 응집되기 쉬운 것으로 나타났습니다유기체 노화 동안 11 , 12 . 적절한 IF 구조의 유지가 다양한 형태의 스트레스에 대한 세포 내성에 필수적이기 때문에, IF 응집 또한 노화 동안 기능 저하에 기여할 수있다. 그러나 스트레스를받는 여러 조직에서 여러 포유류 IF 단백질을 검사하는 유기체 수준의 연구가 부족합니다.
IF는 세포의 요구를 충족시키기 위해 적응하는 매우 역동적 인 구조입니다. 예를 들어, 케라틴은 용해성 (비 섬유 성)과 불용성 (섬유 성) 단백질 풀 사이의 생합성과 무관 한 순환을 거친다. 정상적인 생리 조건에서 총 K8 / K18 풀의 약 5 %는 트리톤 (non-ionic) 세제 인 Nonidet P-40에서 가용화 될 수있는 약 20 %와 비교하여 세제가없는 완충액에서 추출 될 수 있습니다. X100 14 , 15 . 유사 분열 중에는 표피 각질에서 덜 명백하지만 vimentin 및 기타 III 형 IF 단백질에서 더 뚜렷한 단순형 상피 K8 및 K18 14 의 용해도가 현저히 증가합니다 15,16. IF 단백질의 용해도 특성은 필라멘트 재 배열 및 용해성을위한 주요 번역 후 변형 (PTM) 인 인산화에 의해 엄격하게 조절됩니다 17 , 18 , 19 , 20 . 대부분의 IF는 보존 된 장소에서 다수의 PTM에 의해 광범위한 규제를 받아 기능적 변화가 일어납니다 17 .
이 방법의 목적은 여러 가지 마우스 조직에서 IF 단백질 연구를위한 생화학 적 추출 및 분석 방법에 대해 IF 분야에 처음으로 연구자를 소개하는 것입니다. 특유한우리는 고염 추출법을 사용하여 IF 단백질을 분리하고 질량 분광기 및 PTM 표적 항체를 통해 PTM의 변화를 평가하는 데 초점을 맞 춥니 다. 이 방법은 이전에 발표 된 절차를 바탕으로하지만 IF 가족 전체의 규제에 대한 일반적인 메커니즘을 밝히기 위해 다양한 IF 단백질 유형을 추출하기위한 수정을 포함합니다. 예를 들어 특정 라이신 잔기의 K8 아세틸 화는 필라멘트 구성을 조절하는 반면과 아세틸 화는 K8 불용성 및 응집체 형성을 촉진합니다 22 . 최근의 세계적 proteomic 프로파일 링 연구는 또한 대부분의 조직 특이적인 IF 단백질이 또한 아세틸 화의 표적이며 대부분의 IF 아세틸 화 부위가 고도로 보존 된로드 도메인에 국한됨을 보여 주었다. 이는 IF 시스템의 글로벌 프로파일 링에 적합한 방법의 필요성을 강조합니다. 우리는 또한 opti에서 자동 균질화를 사용하여 여러 조직에서 IF 단백질을 단리하는 신속한 방법을 소개합니다mized lysing matrix. 생성 된 준비물은 질량 분광법 및 기타 방법을 통한 다운 스트림 PTM 분석에 적합합니다.
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Protocol
이 프로토콜은 노스 캐롤라이나 대학 (University of North Carolina)의 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)에 따라 승인되고 수행됩니다.
1. 준비 사항
- 트리톤 -X 버퍼 (1 % 트리톤 X-100, 5mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 인산염 완충 생리 식염수 (PBS), pH 7.4)를 준비한다. 500 mL를 만들려면 Triton X-100과 500 mM EDTA 각각 5 mL를 PBS 490 mL, pH 7.4에 넣으십시오. 4 ℃에서 Triton-X 완충 용액을 보관하십시오.
- 고 염분 완충액 (10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 140 mM NaCl, 1.5 M KCl, 5 mM EDTA, 0.5 % Triton X-100, 이중 증류수 (dd) H 2 O에서 부피를 높임)를 준비한다. 500 mL를 만들 때 : 0.5 M Tris-HCl (pH 7.6) 10 mL, 5 M NaCl 14 mL, KCl 55.9 g, 0.5 M EDTA 5 mL 및 트리톤 X-100 2.5 mL를 넣고 부피를 500 mL). 4 ° C에서 고 염분 완충 용액을 보관하십시오.
- 사용하기 바로 전에 적절한 양의 Triton-X와 High Salt Buffer (
- 1X PBS, 산도 7.4에서 5 MM EDTA를 준비합니다. 500 mL를 만들려면 0.5 M EDTA 5 mL를 1X PBS (pH 7.4) 495 mL로 저어줍니다.
- 수의과 지침 및 기관 표준을 준수하는 승인 된 프로토콜을 사용하여 다른 마우스 장기 (뇌, 심장, 폐, 간, 췌장, 결장, 내장, 신장, 비장)를 분리하십시오. 조직 수집 절차는 protease가 풍부한 조직 ( 예 : 췌장을 먼저 처리해야 함)의 RNA 및 단백질 완전성을 보존하기 위해 5 분 이상 걸리지 않아야합니다.
- IF 유전자 발현을위한 후속 RNA 추출, cDNA 합성 및 정량적 실시간 PCR 분석을 위해 소량의 조직 (~ 5 ~ 20mg)을 잘라내어 RNA 보관 용액에 넣으십시오. 밤새 4 ° C에서 조직과 RNA 저장 솔루션 튜브를 배치하고 추가로 s의 제조 업체 프로토콜을 따르십시오torage 및 격리 단계.
- 조직의 나머지 부분을 작은 조각 ( 예 : 0.5cm)으로 자르고 냉동 보관하십시오. 장기 보관을 위해 -80 ° C 또는 액체 질소에서 바이 얼을 고정하고 저장하십시오.
2. IF 유전자 발현 분석
- RNA 저장 용액 시약으로 보존 된 조직에서 RNA를 추출합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 적합한 / 바람직한 RNA 추출 방법을 사용하십시오.
- RNA 농도를 정량하고 RNA의 2 μg을 사용하여 제조 업체의 프로토콜에 따라 적절한 역전사 키트를 사용하여 cDNA를 생성합니다.
- 생성 된 cDNA 및 마우스 IF 유전자 특이 적 프라이머를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 블랭크 컨트롤뿐만 아니라 각 샘플의 3 가지 기술 복제를 포함하여 qPCR 반응을 셋업 하였다.
- IF 유전자 발현을 다른 조건 ( 예 : 젊은 조직 대 오래된 조직)을 비교 한 배수 변화로 정량화하십시오.
3. PImmunoblot에 대한 전체 조직 용 해물의 배상
- 2x 비 환원성 SDS 시료 완충액 1 mL에 조직 25 mg을 균질화한다. 단백질 농도를 정량하기 위해 비색계 단백질 분석을 수행해야하는 경우 샘플 버퍼에서 bromophenol blue 염료를 생략하십시오.
- 환원 된 시료를 만들기 위해 2- 메르 캅토 에탄올 (2-ME) 5 % (v / v)를 첨가하십시오. 비 환원 시료 200 μL에 2-ME 10 μL를 첨가합니다.
- 세제 및 환원제 호환 단백질 분석을 사용하여 단백질 농도를 결정하십시오. 염료가 이미 시료 완충액에 포함되어있는 경우, 쿠마시 (Coomassie) 기반 얼룩 24를 비롯한 다양한 기술을 통해 겔을 실행 한 후 단백질 양을 추정 할 수 있습니다.
- 95 ° C에서 5 분간 가열 한 후 모든 시료를 소용돌이 친다.
- 환원 조건과 비 환원 조건 모두에서 웨스턴 블 랏팅을 수행하십시오. 막을 단시간에 (<1 분) 노출시켜 단량체 종을 나타내며, 더 길게 (> 1 분) 고 분자량 복합체를 나타냄.IF 단백질. 응집체를 모니터링하는 경우 전체 겔 / 멤브레인 (겔 웰의 바닥 포함)을 검사하십시오.
- 병렬 젤을 실행하고 단백질 얼룩과 함께 로딩 컨트롤 24 로 얼룩. 질병 모델이나 상해 실험에서, 총 단백질 얼룩은 로딩 대조군으로 사용되어야한다. 대조군은 다른 스트레스 조건 하에서 변화하기 때문에 '하우스 키핑'단백질 ( 예 : 액틴, GAPDH)에 대한 면역 블록과 대조적이다.
4. 조직 특이적인 IF의 세제 가용성 및 고염 추출물의 제조
- 빙냉 Triton X-100 완충액 1 mL를 유리 튜브 균질화기에 넣고 얼음 위에 놓습니다.
- 액체 질소 저장 장치에서 작은 조각 (~ 25mg)을 꺼내고 유리 균질기에 직접 놓습니다. 균질화 (50 스트로크) 및 거품 생성을 피하기 위해 폴리 테트라 플루오르 에틸렌 유봉을 사용하십시오. 항상 균질 기와 lysate를 보관하십시오.
- lysate를 1.5 mL micr로 옮긴다.미리 냉각 된 원심 분리기 (4 ° C)에서 10 분 동안 20,000 xg에서 얼음과 원심 분리기에 튜브를 원심 분리하십시오.
- 상등액 분획을 별도의 튜브에 수집합니다. 이것은 Triton X-soluble fraction으로 면역 침전 (IP) 및 IF 단백질의 세제 가용성 풀 분석에 사용할 수 있습니다. 뇌 조직에서 더 깨끗한 IF 추출물을 얻으려면 4.1-4.4 단계를 반복해야합니다.
- 조직 펠렛에 1 mL의 High Salt Buffer를 넣고 깨끗한 균질기로 옮겨 100 스트로크를 내 보낸다. 균질 물을 다시 마이크로 원심 분리 관으로 옮기고 차가운 방에있는 회전 진탕기에 1 시간 동안 튜브를 놓습니다.
- 4 ℃에서 20 분 동안 20,000 xg에서 균질 물을 원심 분리한다. 뜨는 물을 버린다.
- 펠렛에 얼음처럼 차가운 PBS / EDTA 버퍼 1 ML을 추가하고 최종 정리 단계 *로 깨끗한 균질 기에서 펠렛 (20 스트로크)를 균질. 새로운 튜브로 옮기고 4 ℃에서 10 분 동안 20,000 xg에서 원심 분리하여 IF 단백질 -풍부한 고염 추출물 (HSE).
* 선택적으로,이 단계에서 균질화 대신에 와동. - 뜨는을 버리고 사전 가열 된 비 환원성 SDS 샘플 버퍼 300 μL에 알약을 용해. 초기에 pipetting과 vortexing으로 pellet을 분리 한 후 95 ℃에서 5 분간 시료를 가열한다.
- 펠렛이 녹아있는 것을 확인하기 위해 필요에 따라 와동과 피펫을 사용하십시오. 알약을 완전히 녹이기까지 몇 분이 걸릴 수 있습니다.
- 분석 전까지 -20 ° C에서 모든 시료를 보관하십시오.
5. 대량 실험에서 IF 단백질 추출을위한 자동화 된 조직 용해
- RNA 추출의 경우 lysing matrix D (작은 세라믹 구를 사용)와 tissue lyser에서 25 초 동안 두 번 맥박하는 튜브에 lysis buffer (조직 25mg 당 600μL 완충액)를 놓습니다. 20,000 xg에서 원심 분리하여 매트릭스에서 용 해물을 분리하고 다음 단계로 격리하십시오.
- 단백질 추출을 위해, Trit 배치용해 매트릭스 SS (단일 스테인리스 스틸 비드 사용)가 포함 된 용해 튜브에서 X-100 (또는 총 용 해물을 준비하는 경우 SDS 샘플 버퍼)에 넣습니다. 여러 매트릭스를 테스트 한 후 전통적인 douncing 방법과 비슷한 품질의 IF 단백질 추출물을 생산하기 때문에이 매트릭스를 선택했습니다. 자동 방법은 췌장 및 비장에 최적이 아니므로 표준 균질화 프로토콜을 이러한 조직에 사용해야합니다.
- High Salt Extract를 준비하려면 자석을 사용하여 스테인레스 강 비드를 튜브에서 꺼내고 4 ℃에서 20,000 xg로 10 분간 원심 분리합니다.
- 수동 프로토콜의 4.4 단계 (위)를 계속 진행하십시오.
- 분석 전까지 -20 ° C에서 모든 시료를 보관하십시오.
6. 번역 후 변형 된 IF 단백질의 면역 강화
- PBST 완충액 (PBS에 0.02 % 트윈 -20)을 준비합니다. 50 mL를 만들려면 PBS, pH 7.4의 50 mL에 Tween-20 10 μL를 넣으십시오.
- PTM 항체 준비용액 (PBST 200 μL 중 항체 1 ~ 10 μg). 일반적으로 3 μg의 항체 / 반응은 필요한 경우 더 최적화 할 수있는 좋은 시작 조건입니다.
- 각각의 반응에 대해 50μL의 자기 비드를 미세 원심 분리기 튜브에 분주하고 자석 위에 놓고 비드 보관 용액을 대기음을냅니다.
- 항체 용액에 다시 부유하고 20 분 동안 실온에서 회 전자 (end-over-end, 소량의 혼합을 보장하기 위해)에서 배양하여 면역 침전 항체에 구슬을 접합시킨다.
- 튜브를 자석에 놓고 항체 용액을 대기시 키십시오.
- 200 μL PBST에 한 번 항체 - 복합 비드를 린스하고 세척 버퍼를 제거하십시오.
- 차가운 방에 rotator에서 3 시간 동안 부드러운 pipetting 및 부화로 비즈에 조직 lysate 0.6-1 ML을 추가하십시오.
- 자석에 튜브를 놓고 용해 액을 제거하고 PBST 200 μL로 5 번 구슬을 씻으십시오. 마지막 세척 단계 후, 100에서 비즈를 수집 _6, L의 PBS (트윈 -20)없이 깨끗한 새 튜브로 옮긴다. 튜브를 자석 위에 놓습니다.
- PBS를 대기음으로하고 비 환원 시료 완충액 100 μL를가합니다. 50 μL를 제거하고 2-ME (5 %)를 첨가하여 환원 시료를 만듭니다. 샘플을 95 ℃에서 5 분간 가열합니다.
- 자석에있는 구슬에서 ip 분수를 분리하고 새로운 관으로 그것을 모으십시오.
- 분석 할 때까지 -20 ° C에서 시료를 보관하십시오.
7. 질량 분석을위한 IF 단백질 시료의 준비
- 질량 분석법 분석과 관련하여 상당한 시간과 비용이 소요되므로 연구를 시작하기 전에 프로테오믹스 전문가와 상담하십시오.
- 오염을 피하기 위해 특별한 예방 조치를 취하십시오. 깨끗한 장갑으로 모든 젤을 처리하고 ddH 2 O (비누 방지)만을 사용하여 씻은 깨끗한 용기에 품습니다.
- 표준 조건에 따라 SDS - PAGE 젤에 HSE 샘플 (섹션 4와 5에서) 20 ~ 50 μL를 실행합니다. 1 시간 동안 단백질 얼룩이있는 얼룩이 있습니다. 여러 번 헹구고 ddH 2 O에서 얼룩 제거하십시오. IF 단백질 밴드는 탈 염색 후 쉽게 볼 수 있어야합니다.
- 플라스틱 시트 보호 장치 사이에 젤을 놓고 분석하기 위해 잘라내어 보낼 밴드를 스캔하고 표시하십시오.
- 새로운 깨끗한 면도기를 사용하여 IF 단백질 밴드를 제거하십시오.
- 젤 밴드를 깨끗한 미세 원심 분리 튜브에 넣고 질량 분석기로 옮깁니다.
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Representative Results
lysing matrix를 이용한 다중 마우스 조직으로부터 IF 단백질의 고염 기반 추출을위한 새로운 신속한 방법.
상피 조직으로부터 중간 필라멘트 단백질 분획의 대량을 분리하는 전통적인 방법 25 , 26 은 9 개의 다른 기관을 포함하고 조직 용해를위한보다 신속한 절차를 포함하도록 여기에서 변형되었다. 기존의 방법에는 3 가지 수동 균질화 단계가 필요하지만 수정 된 절차는 수동 균질화 단계가 하나뿐이므로 몇 가지 절차를 단축 할 수 있으며 특히 6 개 이상의 시료를 처리 할 때 더욱 그렇습니다. 그림 1A 는 9 마우스 조직의 HSE의 전형적인 결과를 보여 주지만 조직의 예상 단백질 표와 각 단백질의 분자량은 그림 1B 에 표시되어 있습니다
간 K8 및 K18은 강하게 상향 조절되고 오래된 마우스의 간에서 인산화 및 라이신 아세틸 화를 증가시킨다.
그림 2 는이 프로토콜에 설명 된 몇 가지 분석의 일반적인 결과를 보여줍니다. 패널 A는 간, 케라틴 8 ( KRT8 )의 두 주요 IF 유전자의 발현 분석을 묘사하고 있으며,및 IF 단백질 K8 및 K18을 각각 코딩하는 케라틴 18 ( KRT18 )을 포함한다. 상피 각질은 다양한 스트레스 조건 하에서 강력하게 상향 조절됩니다. 표시된 결과에서, 이것은 KRT8 이 3 m 쥐와 비교하여 24 m 쥐의 간에서 상당히 상향 조절되기 때문에 노화 동안 발생합니다. 단백질 수준의 결과는 오래된 (24 m) 간에서 고 분자량 복합체뿐만 아니라 K8 단량체의 극적인 증가에 의해 관찰 된 것처럼 더 현저하다. 여기에 Coomassie 기반의 단백질 얼룩은 샘플을 가로 지르는 단백질의 동일한 로딩을 보장하는 로딩 컨트롤 역할을합니다. 총 티슈 용 해물은이 경우와 같이 젤에 단백질을 과부하시키는 것이 쉽습니다. 작은 부피를로드하거나 샘플을 sodium dodecyl sulfate (SDS) 완충액으로 더 희석하면이 문제가 완화됩니다 (특히 점성이 나고 피펫 화가 어려운 경우). 패널 C는 자동화 된 프로토콜을 사용하여 얻어진 간 간장 추출물의 전형적인 결과를 도시 한 것으로,젤에 케라틴 8과 18이 풍부하게 축적되어 있음을 보여줍니다. 빨간색 선은 excised하고 mass spectrometry 분석을 위해 제출 된 영역을 구분합니다. 패널 D에서 패널 C의 샘플의 질량 분석 결과는 오래된 간에서의 K8 및 K18이 어린 간에서 존재하지 않는 다중 인산화 및 아세틸 화 부위를 갖는 것을 보여준다.
GFAP는 오래 전 생쥐의 두뇌에서 강하게 상향 조절되고 라이신 아세틸 화됩니다.
도 3은 상피로부터 IF를 추출하는데 사용 된 방법이 비 - 상피 조직에도 사용될 수 있음을 입증한다. 또한, 결과는 IF 유전자 및 단백질의 노화 - 의존성 상향 조절에 대한 일반적인 패턴을 나타낸다. 도 2a 의 qPCR 결과는 3 m 마우스와 비교하여 24 m 마우스의 뇌에서 GFAP mRNA의 5 배 유도를 나타낸다. 도 2BTriton X-100 분획 및 IF가 농축 된 HSE에 존재하는 총 단백질을 밝힙니다. 오래된 뇌의 화살표 (GFAP에 해당)로 표시된 50kDa에서의 밴드 강도의 증가에 주목하십시오. 도 2C의 웨스턴 블랏 분석은 GFAP의 상향 조절 및 GFAP 단량체 및 잠재적 인 고 분자량 복합체의 존재를 Triton X-100 분획물 (둘 모두 화살표로 표시)에 추가로 나타냈다. Pan-acetyl lysine 항체를 이용한 동일한 샘플의 Western blot 분석은 항체가 구형 마우스 뇌의 HSE에서 약 50 kDa의 밴드와 Triton X-100 분획에서 약 250 kDa의 밴드를 인식한다는 것을 보여줍니다 ( 그림 2D ). Triton X-100 분획으로부터 아세틸 화 된 단백질을 면역 풍부하게 축적하면 오래된 뇌에서 얻은 분해물에서 GFAP 단백질의 존재가 증가하는 것으로 나타납니다. GFAP 단량체 및 고 분자량 복합체를 강조하기 위해 환원 및 비 환원 조건이 제시되어있다. 질량 분광 분석 ( 그림 1 과 유사)
그림 1 : 여러 개의 마우스 조직에서 IF 단백질의 자동화 된 용해 및 추출. ( A ) 지정된 마우스 조직에서 HSEs의 쿠마시 기반 젤 얼룩. 제시된 조직은 동일한 성인 (3 m) 수컷 CBA 마우스로부터 수득 하였다. Brain : NFL, NFM, NFH가 각각 인산화되어 27 ~ 70, 145, 200kDa에서 예상보다 느리게 이동한다는 것을 유의하십시오. 하트 : desmin과 vimentin에 해당하는 53 kDa 밴드 이외에), 심장 샘플에는 ~ 42 kDa 밴드가 포함되어 있으며, 대부분 desin 28 과 동시 정제하는 것으로 알려진 액틴을 나타내는 것으로 보입니다. 엘arge intestine : K8 / K18로 동시 추출 된 25 kDa 이상의 눈에 띄는 밴드의 정체는 알려져 있지 않지만 전통적인 dounce 균질 기 방법으로 조직을 처리하면이 밴드는 존재하지 않습니다. 췌장과 비장 : 자동화 된 균질화는 조직 라이저의 맥박 중 온도의 약간의 증가에 대한 용제의 민감성 때문에 비장에서 췌장 및 비 멘틴으로부터 케라틴을 분리하는 데는 적합하지 않습니다. ( B ) 다른 조직에 존재하는 주요 IF 단백질 유형과 패널 A에 대한 기준으로 예측 분자량을 보여주는 표.이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 분자젊은 및 노년 생쥐의 간 케 라틴의 ar 및 생화학 적 차이. ( A ) 표준 절차 (프로토콜 1)를 사용하여 KRT8 및 KRT8 mRNA의 분석은 오래된 생쥐의 간에서 KRT8 transcript에서 중요한 유도를 나타냅니다. 각 조건에 대해 n = 6 (그룹당 3 마리의 수컷 CBA 생쥐를 사용). ** p <0.01; 일원 분산 분석. ( B ) 프로토콜 2를 사용하여 3 마리 (3 개월) 및 3 세 (24 개월) 수컷 CBA 생쥐에서 전체 간 용 해물을 채취하고 샘플을 비 환원 조건하에 분석 하였다. TS1 항체를 사용하여 K8 발현을 조사하였고, 쿠마시 (Coomassie) - 기반 단백질 염색을 로딩 대조군으로 사용 하였다. ( C ) 마우스 B 구역의 마우스 # 1과 마우스 # 4 각각에 해당하는 젊은 및 오래된 마우스 간에서 추출한 높은 소금 추출물 두 개의 화살표는 젤에서 K8과 K18를 가리키고 빨간색 상자는 젤의 일부를 나타냅니다 excised 및 질량 분석을 위해 제출. ( D .이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 젊은 늙은 쥐의 뇌에서 GFAP의 분자 및 생화학 적 차이. ( A ) 표준 절차 (프로토콜 1)를 사용하여 GFAP mRNA의 분석은 오래된 생쥐에서 두뇌에 상당한 유도를 나타냅니다. 각 조건에 대해 n = 6 (그룹당 3 마리의 수컷 CBA 생쥐를 사용). ** p <0.01; 일원 분산 분석. ( B ) 트리톤 X-100의 쿠마시 기반 단백질 얼룩 및 어린 (3 개월) 및 늙은 (24 개월) 마우스의 뇌 조직으로부터의 HSE 분획. 오래된 뇌 (화살표)에서 HSE의 ~ 50 kDa GFAP 밴드의 증가에 주목하십시오. ( C ) GF( D ) 패널 B와 동일한 샘플의 아세틸 - 라이신 면역 블롯 (토끼 폴리 클론; Abcam ab80178)을 사용하여 분석 하였다. ( E ) 아세틸 -Lysine 면역 침전 후 GFAP 블롯을 패널 B와 동일한 샘플의 AP 면역 블롯 (마우스 단일 클론; GA5 클론) 라이신 항체. 샘플을 비 환원 (NR) 및 환원 (R) 조건하에 분석하고 화살표는 노화 된 두뇌의 면역 침전물에서 GFAP의 존재를 증가시키는 것을 지시한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
IF 단백질이 생체 화학적 특성을 나타낼 수있는 방법은 IF 단백질이 세포 및 조직 스트레스의 마커이자 모듈레이터이기 때문에 포유류 시스템에서 수많은 병태 생리 현상을 이해하는 데 유용합니다. 현재의 방법 뒤에있는 원리는 일반적으로 저염소 용액과 고염 용액을 사용하는 세포와 조직으로부터 IF 단백질을 분리, 분리 및 재구성하기위한 1970 년대와 1980 년대에 개발 된 초기 절차를 토대로하고 Triton-X100 세제 25 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 . IF 단백질의 생화학 적 분리를 뒷받침하는 연구에 대한 역사적인 통찰력을 위해서는 최근의 리뷰 36 , 37 를 참조하십시오. 현재 방법단순 상피 각질의 연구를 위해 개발 된보다 최근의 프로토콜을 기반으로합니다. 이 방법의 장점은 IF 분야에 익숙하지 않은 조사자가 대부분의 포유류 조직에서 IF 단백질을 효과적으로 분리 할 수있게하는 초기 단계로 작용할 수 있다는 것입니다. IF 단백질 규정 21 , 38 을 연구하기 위해 현장에서 조사자가 널리 사용하는 관련 절차에 대한 시각적 안내서를 나타냅니다.
이 기술은 포유 동물 조직 간의 스트레스 전달 메커니즘에서 IFs의 조절과 기능을 연구하는데 사용될 수있다 39 , 40 . 한 조직의 스트레스가 다른 조직의 기능에 영향을 줄 수 있음을 잘 알고 있습니다. 예를 들어 영양 스트레스 41 , 단백질 잘못 변형 42 , 대사 스트레스 43 ,변경됩니다. 현재이 분야에서 수행되고있는 대부분의 작업은 Drosophila 와 C. elegans 모델에서 이루어 지지만 포유류 시스템에서 광범위한 스트레스 반응에 대한 연구는 부족합니다. 세포 스트레스 10 의 주요 조절 자로서 IF 시스템은 생물학적 수준의 스트레스 반응에 대한 단서를 열 수 있으며, 이는 중요한 질병 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 현재의 프로토콜은 스트레스, 부상 및 질병의 다양한 마우스 모델에서 글로벌 병리학 적 메커니즘을 연구하는데 사용될 수있다.
현재 기술의 한 가지 한계는 고염 추출물이 예를 들어 44 와 같은 다른 IF 관련 단백질을 포함하고 있기 때문에 "조잡한"IF 제제로 간주된다는 것입니다. 이전에 제시된 바와 같이, HSE는 8M 우레아 완충액에서 변성되어 인산염 완충액 44 에서 in vitro 재조합이 가능한 고순도 IF 단백질을 얻을 수 있습니다. 그런 두 사이클 후에해체 및 재조합에서, IF 단백질 (HeLa 세포로부터 분리 된)의 화학량 론은 동일하게 유지되는 반면, 요소 처리는 플렉틴 44를 제거 하였다. Desmin 정제 과정에서 액틴은 아세트산 45에 HSE를 가용화하여 제거 할 수 있습니다. 추가 정제 단계가 포함되어야하는지 여부는 실험의 궁극적 인 목표에 달려 있습니다. 예를 들어, 조립 상태를 특성화하고 in vitro 재조합 IF를 생성하는 것이 목표 인 경우, 요소 단계는 고순도 IF 단백질을 얻는 데 필요합니다. 반면 IF와 다른 세포 단백질 사이의 문맥 의존적 연관성을 확인하는 것이 목표라면 "조잡한"제제를 사용할 수 있습니다. 상호 작용하는 단백질은 젤 얼룩으로 볼 수있는 높은 농도의 표적에 대한 겔 내 다이제스트 또는 낮은 농도의 표적에 대한 용액 내 다이제스트를 사용하여 질량 분광법으로 확인할 수 있습니다. 세제 가용성 IF 및 HSE의 면역 침전을 이용한 이전 연구단백질을 함유하는 IF 단백질은 케라틴 8/18과 열충격 단백질 70 (Hsp70) 사이의 기능적으로 중요한 특이 적 상호 작용을 확인하였으며, 이는 열 스트레스 46 이후에 강화되었으며, 인산화 후 어댑터 단백질 14-3-3, 그리고 K8 / K18 Raf-1 키나아제 정상적인 생리 조건 하에서 48 . 현재의 프로토콜은 다른 IF 단백질에 대한 유사한 연구를 가능하게합니다.
lysing matrix의 사용은 이전 방법의 핵심적인 변경이며 췌장과 비장을 제외하고 여러 조직에서 IF를 신속하게 추출 할 수 있어야합니다. 초기 단계의 자동화는 대용량 마우스 실험에 특히 유용 할 수 있습니다. 예를 들어, 조건 당 10 마리의 생쥐 ( 예 : 정상 및 일부 형태의 전신 스트레스 또는 질병)로부터 3 개의 다른 조직으로부터 IF 단백질을 분리하면 60 개의 개별 조직을 가공해야합니다. 전통적인 수동 방법을 사용하여이 작업을 수행합니다.uld는 일괄 처리해야하며 며칠이 걸릴 수 있습니다. 그러나, 매트릭스를 용해하는 자동화 된 방법을 사용하면 몇 시간 내에 절차를 완료 할 수 있습니다. 절차의 핵심 단계는 다음과 같습니다. 고염 완충액에서 1 시간 동안 인큐베이션 (단계 4.5); 분석 전 (단계 4.8) 펠렛의 완전한 재현을 보장하기 위해 핫 버퍼 및 광범위한 와류를 사용; 질량 분석법으로 분석 할 시료의 오염을 피하기 위해 모든 예방 조치를 취합니다 (단계 7.2).
질량 분석법에 기반한 PTM 사이트의 주된 단점은 인산화와 라이신 아세틸 화가 가장 중요한 특정 PTM에서 매우 잘 작동한다는 것입니다. 그러나 SUMOylation과 같은 다른 것들은 훨씬 더 어려움이 있습니다. 그럼에도 불구하고 프로테오믹스는 정상 조직과 질병 조직에서 단백질 조절을 연구하는 강력한 도구입니다. Agnetti et al. 포괄적 인 것을 모은조직 발현 단백질의 맥락에서 다양한 PTM을 연구하기 위해 현재 사용중인 최첨단 proteomic 기술의 최신 개요 50 . 현재 방법의 목적은 여러 유형의 분석에 적용 할 수있는 샘플을 생성하는 것입니다. 예를 들어, in vitro sumoylation은 면역 침전 된 IF 단백질에서 수행 될 수 있으며, 전체 sumoylation은 sumo 특이 적 항체를 사용하는 HSE 제제의 단리 된 IFs에서 평가할 수 있습니다 18 , 21 . 따라서이 방법의 적용은 질량 분석을위한 샘플 생성에만 국한되지 않고 다양한 다운 스트림 기술을 사용하여 여러 가지 IF 특성을 조사하는 데 사용될 수 있습니다.
IF 단백질은 보존 된 부위에서 수많은 PTM에 의해 광범위하게 조절되어 용해도, 필라멘트 조립 및 단백질 상호 작용이 변화합니다 17 . 최근의 기술 발전으로 인해그는 세포 단백질 51 , 52 , 53 에 대한 번역 후 변형 (post-translational modification, PTMs)의 놀라운 중요성, 복잡성 및 질병의 중요성을 보여줍니다. 인산화와 아세틸 화와 같은 일반적인 PTM에 대한 검출 방법의 개선은 방대한 양의 데이터를 산출 해 냈지만 "PTM 코드"를 부수는 생물학적 의미를 이해하는 것은 중요한 과제이다. 각 PTM의 기능적 역할과 상대적 중요성을 평가하는 한 가지 방법은 IF 단백질 군의 여러 구성원간에 얼마나 잘 보존되는지를 결정하는 것입니다. 예를 들어, K8에 대한 새로운 phospho-tyrosine 부위의 동정은이 부위가 본질적으로 모든 세포질 IF 단백질에서 발견되는 QYE 모티프 내에 포함되어 있고 IF 단백질 용해도 및 필라멘트 염색을 조절하는 데 중요하다는 것을 밝혀냈다명명 57 . 중요한 것은, GFAP에서 보존 된 티로신 잔기가 음으로 하전 된 "포스 포 미믹"아스파르트 산 (Y242D)으로 돌연변이되면 알렉산더 질환이 유발된다는 것이다. 여기에 표시된 대표적인 데이터는 두 가지 조직 특이 IF 단백질 유형 (K8 및 GFAP)이 신진 대사의 변화 일 수있는 노화 과정에서 유사한 상향 조절 및 아세틸 화 패턴을 어떻게 보이는지 보여줍니다 22 , 51 . 이 예제는 전 지구적인 생리 학적 규모에서 IF 단백질의 기능을 이해하는 데있어이 방법의 유용성을 보여줍니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS] 및 P30 DK034987 [UNC-Chapel Hill에]의 NIH 교부금으로 지원되었습니다. 저자는 qPCR 및 웨스턴 블랏 실험에 대한 도움을 주신 Deekshita Ramanarayanan에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynabeads Protein G | ThermoFisher Scientific | 10009 | immunoprecipitation beads |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | for buffers |
| Purelink RNA mini kit | ThermoFisher Scientific | 12183018 | RNA extraction from tissue |
| Purelink DNAse set | ThermoFisher Scientific | 12185010A | on column DNA digestion |
| Dynamag-2 | ThermoFisher Scientific | 12321D | magnet for use with dynabeads |
| GelCode Blue Stain Reagent | ThermoFisher Scientific | 24592 | mass spectrometry-compatible gel stain |
| Pierce ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher Scientific | 32106 | for use in western blot |
| High Capacity cDNA reverse transcription kit | ThermoFisher Scientific | 4368813 | for use in gene expression analysis |
| Proflex 3 x 32-well PCR System | ThermoFisher Scientific | 4484073 | PCR system |
| PVDF transfer membrane | ThermoFisher Scientific | 88520 | for western blot |
| Power Up SYBR master mix | ThermoFisher Scientific | A25778 | for qPCR analysis |
| RNAlater | ThermoFisher Scientific | AM7020 | solution for tissue storage prior to RNA isolation |
| Novex 4-20% Tris Glycine Gel | ThermoFisher Scientific | XP04205BOX | Precast protein gel |
| Anti-Keratin 8 antibody (TS1) | ThermoFisher Scientific | MA514428 | for western blot detection of K8 |
| Anti-Vimentin | ThermoFisher Scientific | MA511883 | for western blot detection of vimentin |
| Tris Glycine Transfer Buffer (25x) | ThermoFisher Scientific | LC3675 | for wet transfer of protein gels |
| 2x SDS Sample Buffer | ThermoFisher Scientific | LC2676 | for preparing protein gel samples |
| Tris Glycine SDS Running Buffer (10x) | ThermoFisher Scientific | LC26755 | for running protein gels |
| Lysing beads - Matrix D | MP Biomedicals | 116913100 | Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction |
| Lysing beads - Matrix SS | MP Biomedicals | 116921100 | Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction |
| NanoDrop Lite Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-LITE | measurement of protein and nucleic acid |
| Precellys 24 homogenizer | Bertin Instruments | EQ03119 | Automated tissue homogenizer |
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