Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Анализ промотора c-KIT-лиганда с использованием иммунопреципитации хроматина

Published: June 27, 2017 doi: 10.3791/55689
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, The University of Texas MD Anderson Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

Взаимодействия ДНК-белок необходимы для нескольких биологических процессов. Во время оценки клеточных функций анализ взаимодействия ДНК-белка является необходимым для понимания регуляции генов. Хроматиновая иммунопреципитация (ChIP) является мощным инструментом для анализа таких взаимодействий in vivo.

Abstract

Множественные клеточные процессы, включая репликацию и восстановление ДНК, рекомбинацию ДНК и экспрессию генов, требуют взаимодействия между белками и ДНК. Поэтому взаимодействия ДНК-белок регулируют многочисленные физиологические, патофизиологические и биологические функции, такие как клеточная дифференциация, клеточная пролиферация, контроль клеточного цикла, стабильность хромосом, регуляция эпигенетического гена и трансформация клеток. В эукариотических клетках ДНК взаимодействует с белками гистонов и негистонов и конденсируется в хроматин. Для анализа взаимодействия ДНК-белок можно использовать несколько технических средств, таких как анализ сдвига подвижности электрофореза (гель) (EMSA) и отпечаток ДНКазы I. Однако эти методы анализируют взаимодействие белка и ДНК in vitro , а не внутри клеточного контекста. Хроматиновая иммунопреципитация (ChIP) представляет собой метод, который захватывает белки в их специфических сайтах связывания ДНК, тем самым позволяя идентифицировать взаимодействие ДНК-белкаS в контексте их хроматина. Это делается путем фиксации взаимодействия ДНК-белка с последующей иммунопреципитацией представляющего интерес белка. Впоследствии характерен геномный сайт, связанный с белком. Здесь мы описываем и обсуждаем ChIP и демонстрируем его аналитическое значение для идентификации индуцированного Трансформирующим фактором роста фактора β-β (TGF-β) фактора транскрипции SMAD2 в SMAD-связывающие элементы (SBE) в промоторной области тирозин- Белковая киназа Kit (c-KIT) рецепторный лиганд фактор стволовых клеток (SCF).

Introduction

В ядре эукариот ДНК взаимодействует с белками гистонов и белками негистона и конденсируется в хроматин. В физиологическом, патофизиологическом и клеточном биологическом контексте клеточные функции пространственно и временно контролируются с помощью согласованной с хроматином генной экспрессии. ДНК-белковые взаимодействия играют существенную роль в регуляции клеточных процессов, таких как репликация ДНК, рекомбинация и восстановление, а также экспрессия белка. Поэтому анализ взаимодействия ДНК-белок является незаменимым инструментом в оценке экспрессии генов и функции клеток.

Существует несколько методов для оценки взаимодействия ДНК-белка in vitro , такого как анализ сдвига подвижности электрофореза (гель) (EMSA) и отпечаток 1 , 2 ДНКазы I. Однако эти методы не анализируют взаимодействие белка и ДНК в хроматинном и клеточном контексте. ChIP iКоторая захватывает белки, связанные с их специфическими сайтами связывания ДНК, и тем самым облегчает идентификацию взаимодействий ДНК-белок в контексте хроматина. Метод был первоначально разработан Gimour и Lis для оценки связывания РНК-полимеразы II с определенными генами в Escherichia coli и Drosophila melanogaster 3 , 4 . Это делается путем фиксации ДНК-белковых комплексов с последующим проведением экстракции хроматина и срезанием ДНК в фрагменты пар 200 пар (bp). Впоследствии связанный ДНК-связывающий белок выделяют иммунопреципитацией. После разворота сшивки ДНК-белка ДНК очищают и анализируют. Для анализа сайтов связывания белка могут быть использованы несколько методов и зависят от последовательности нуклеиновой кислоты сайта связывания белка в гена-мишени 5 . В случаях, когда последовательность ДНК известна, стандартный PolYermase Chain Reactions (PCR) можно применять, используя определенные пары праймеров, фланкирующие известный сайт связывания. Также можно использовать количественную ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) 6 . В случаях, когда последовательность неизвестна, ChIP можно комбинировать с микрочипами ДНК (ChIP-on-chip), секвенированием ДНК (ChIP-seq) или методами клонирования 7 , 8 , 9 .

Путь TGF-β обладает мощными функциями подавления опухолей и является ключевым путем дифференциации клеток. Он активируется посредством связывания лиганда TGF-β1 с его рецепторным комплексом, что приводит к серинфосфорилированию SMAD2 / 3 транскрипционных факторов. После их ассоциации с общим медиатором SMAD4 SMAD-комплекс транслоцирует ядро ​​и связывается с SBE в промоторной области генов-мишеней, где он регулирует гены, контролирующие клеточный цикл, апоптоз и клеточный дифференциална. Транскрипционный ответ на стимуляцию TGF-β является клеточным типом и контекстом 10 . Недавно мы описали цикл положительной обратной связи между TGF-β и c-KIT-каналом 11 . В этой модели активированный TGF-β1 SMAD2 связывается с промотором лиганда c-KIT и индуцирует его экспрессию и секрецию. Впоследствии лиганд c-KIT активирует рецептор c-KIT авто- и паракриническим способом. Активация рецептора c-KIT приводит к STAT3 Tyr 705 -фосфорилированию через JAK1 / 2. После STAT3-активации и ядерной транслокации STAT3 связывается с геном TGF-β1-лиганда и регулирует его экспрессию.

Здесь мы демонстрируем существенную роль анализа ChIP для идентификации связывания SMAD2 с промотором лиганда c-KIT-рецептора и для идентификации активатора (и) активатора сигнала (of) транскрипции 3 (связывание STAT3 с TGF-β1- ген).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка решений

  1. Приготовьте следующие свежие решения для каждого эксперимента.
    1. Для раствора для фиксации подготовьте 37% формальдегида и сохраните его при комнатной температуре. Разбавьте его в 1х фосфат-буферном солевом растворе (PBS) до конечной концентрации 1,42%.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Формальдегид классифицируется как раздражающий, коррозионный, мутагенный, тератогенный и канцерогенный. Не глотать. Не вдыхать газ / пары / пар / спрей. При недостаточной вентиляции надевайте соответствующее респираторное оборудование. Избегать попадания на кожу и глаза. Хранить вдали от несовместимых веществ, таких как окислители, восстановители, кислоты, щелочи и влажность.
    2. Для раствора для остановки глицина подготовьте 0,125 М глицин в 1x растворе PBS и сохраните его при комнатной температуре.
    3. Для раствора для очистки клеток подготовьте 1x раствор PBS в dH 2 O и храните его на льду. Непосредственно перед использованием добавьте ингибитор протеиназы фенилметилсульфонилфторид (PMSF) tКонечная концентрация 0,5 мМ.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: PMSF классифицируется как коррозионный и токсичный; Надевайте защитную одежду и используйте ее в вентилируемом помещении.
    4. Непосредственно перед использованием буфера для лизиса клеток (20 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 85 мМ KCl и 0,5% NP40) добавляют 1X коктейль ингибитора протеазы (PIC, 100% исходный раствор в диметилсульфоксиде (ДМСО): 104 мМ 4- ( 2-аминоэтил) бензолсульфонилфторида (AEBSF), 80 мкМ апротинина, 4 мМ-наилучтина, 1,4 мМ E-64, 2 мМ лейпептина и 1,5 мМ пепстатина А) и 0,5 мМ PMSF.
    5. Непосредственно перед использованием буфера для лизиса ядер (50 мМ Tris-Cl, pH 8,0, 10 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) и 1% SDS) добавляют 1X PIC и 0,5 мМ PMSF.

2. Фиксация и резка клеток

  1. Выращивайте клетки до 70-80% слияния на пластинах для культивирования тканей 10 см. Стимулируйте клетки в экспериментальных целях.
  2. Удалите среду для культивирования ткани, добавьте 5 мл фиксирующего раствора и инкубируйтеКлетки в течение 10 мин при комнатной температуре на трясущейся платформе.
  3. Удалите раствор для фиксации и дважды промойте клетки 10 мл ледяной 1x PBS.
  4. Удалите 1x PBS, добавьте 5 мл раствора для остановки глицина и инкубируйте клетки в течение 5 минут при комнатной температуре на трясущейся платформе.
  5. Удалите раствор для остановки глицина и дважды промойте клетки 10 мл ледяной 1x PBS.
  6. Удалите 1x PBS, добавьте 2 мл раствора для очистки клеток и извлеките ячейки с помощью скребка для клеток. Перенесите собранные клетки в коническую трубку на льду.
  7. Центрифугируйте образцы в течение 10 минут при 600 xg и 4 ° C.
  8. Удалите надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в 1 мл 1X-литиевого буфера для лизиса и инкубируйте на льду в течение 30 мин. Альтернативно, замораживайте осадок в жидком азоте и храните его при -80 ° C.
  9. Как только осадок ресуспендируют в буфере для лизиса клеток, переносите клеточную суспензию в гомогенизатор ледяного дозатора и прокачайте 10 ударов с использованием пестицида типа BE для разрушения ячейки.
  10. Перенесите клеточную суспензию в микроцентрифужную пробирку и центрифугируйте образцы в течение 10 минут при 2400 xg и 4 ° C.
  11. Удалите супернатант, ресуспендируйте гранулу в 350 мкл буфера для переваривания ядер и инкубируйте образцы в течение 5 мин при 37 ° С.
  12. Добавляют микрококковую нуклеазу (1 U / мкл) и перемешивают путем встряхивания. Инкубируйте образцы при 37 ° С в течение 5-20 мин; Смешивать образцы каждые 2 мин путем инверсии.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Время и концентрация ферментов различаются между клеточными линиями и могут потребовать оптимизации в случаях субоптимального ферментативного сдвига.
  13. В качестве альтернативы, можно добиться сдвига хроматина с помощью ультразвука с использованием имеющихся в продаже ультразвуков.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Условия ультразвуковой обработки требуют оптимизации. Пример протокола оптимизации приведен ниже, используя объем выборки 300 мкл и мощность обработки образца 25%.
    1. Следуя шагу 2.10, отбрасывают супернатант и ресуспендируют nЯдерный осадок в 1,0 мл коммерческого буфера для сдвига.
    2. Аликвоту 300 мкл ресуспендированного ядерного осадка в три 1,7 мл микроцентрифужных пробирки. Поместите их на лед.
    3. Сдвиньте 3 аликвоты фиксированного хроматина при 25% мощности, используя 3 разных условия для определения оптимальных условий обработки ультразвуком:
      5 импульсов по 20 с каждый с 30 с покоя на льду между каждым импульсом.
      10 импульсов по 20 с каждый, при этом 30 секунд остался на льду между каждым импульсом.
      20 импульсов по 20 с каждый, при этом 30 секунд остался на льду между каждым импульсом.
    4. Перейдите к шагу 2.15, как описано ниже.
  14. После инкубации с микрококковой нуклеазой добавьте 7 мкл ледяной 0,5 М ЭДТА, чтобы остановить реакцию.
  15. Центрифугируйте образцы с расщепленной ДНК в течение 10 мин при 16200 xg и 4 ° C.
  16. Перенесите отрезанный ДНК-содержащий супернатант в свежую микроцентрифужную пробирку. Аликвоту 50 мкл в отдельную микроцентрифужную пробирку для подтверждения suРезкое разрушение ДНК (раздел 3). Используйте оставшийся объем немедленно для иммунопреципитации (раздел 4) или храните его при -80 ° C.

3. Подтверждение эффективности сдвига

  1. Добавьте 150 мкл нуклеазонного свободного dH 2 O и 10 мкл 5 М NaCl в 50 мкл аликвоты отрезанного хроматина со стадии 2.16.
  2. Инкубируйте образцы при 65 ° C в течение 4 ч для отмены поперечных связей.
  3. Добавить 2 мкл РНКазы А (10 мкг / мкл) и инкубировать образцы при 37 ° С в течение 15 мин.
  4. Добавьте 10 мкл протеиназы К (0,5 мкг / мкл) и инкубируйте образцы при 42 ° С в течение 90 мин.
  5. Для очистки ДНК выполните экстракцию фенолом / хлороформом 12 .
    1. Добавьте воду без нуклеазы до конечного объема 200 мкл. Добавить 200 мкл фенола: хлороформ: изоамиловый спирт (25: 24: 1) в образец и вихрь в течение 20 с.
    2. Центрифуга при комнатной температуреВ течение 5 мин при 16000 × g. Осторожно удалите верхнюю водную фазу и перенесите ее в свежую трубку. Обязательно не переносите какой-либо фенол во время пипетирования.
    3. Добавьте 0,1 объема 3 М ацетата натрия (NH 4 OAc), рН 5,2, и перемешайте, несколько раз щелкнув трубкой пальцем. Добавьте 2,5 объема ледяного 100% -ного этанола и перемешайте путем встряхивания в течение 5 с. Инкубируйте образец O / N при -20 ° C или в течение как минимум 1 часа при -80 ° C.
    4. Центрифугируйте образец в течение 30 минут при 4 ° C и 16 000 xg для осаждения кДНК.
    5. Осторожно удалите супернатант, не разрушая гранулу. Добавить 1 мл RT, 70% этанола и перевернуть трубку несколько раз.
    6. Центрифугируйте образец в течение 2 минут при 4 ° C и 16000 x g. Осторожно удалите супернатант.
    7. Высушите осадок в течение 5-10 мин при комнатной температуре. Ресуспендируют гранулу в 30 мкл dH 2 O.
  6. Используйте аликвоту 5 и 10 мкл очищенной ДНК для гель-электрофореза с 1% TAEАгарозном геле.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Успешное разрушение хроматина приводит к шаблону ДНК 200-1,55 п.о. Если сдвиг не удался, определите оптимальные условия сдвига для конкретных клеток, изменив время инкубации этапа сдвига (шаг 2.12) до 5, 10 и 15 мин.
  7. Используйте оставшийся образец для анализа концентрации ДНК в образце. Обратное вычисление концентрации ДНК в прорезанном образце хроматина (этап 2.16); Используйте те же количества ДНК для каждой группы лечения для иммунопреципитации (раздел 4).

4. Иммунопреципитация

  1. Объединить 10-25 мкг срезанного сшитого хроматина (этап 2.16) с 25 мкл магнитных шариков из белков типа CHIP, 10 мкл буфера для разведения иммунопреципитации (исходный раствор: 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 16,7 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 1,2 мМ ЭДТА и 167 мМ NaCl) и 1 мкл ПОС.
  2. Через 4 часа инкубации добавьте 1-10 мкг антитела (концентрация антителаЗависит от аффинности антитела; Он должен быть первоначально использован для рекомендаций производителя и экспериментально оптимизирован в случае необходимости) в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку и добавить dH 2 O до конечного объема 100 мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Вместо описанного выше метода прямого иммунопреципитации метод косвенного иммунопреципитации можно использовать, сначала комбинируя хроматин с антителами, а затем добавляя магнитные гранулы белка G.
  3. Инкубируйте образцы на концевом ротаторе в течение 4-12 часов при 4 ° C.

5. Элюирование

  1. Поместите трубки на магнитную подставку. После того, как магнитные бусины собраны на стороне трубки, осторожно удалите и выбросьте супернатант.
  2. Три раза промыть бусины 800 мкл промывочного буфера 1 (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 мМ EDTA, рН 8, 20 мМ Трис-HCl, pH 8 и 150 мМ NaCl); Смешивать, переворачивая трубку несколько раз. Поместите трубку на магнитную подставку aОсторожно удалите и выбросите бункер для стирки, как только магнитные бусины будут собраны сбоку от трубки.
  3. Один раз промыть бусины 800 мкл промывочного буфера 2 (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 мМ EDTA, рН 8, 20 мМ Tris-HCl, pH 8 и 500 мМ NaCl); Смешивать, переворачивая трубку несколько раз. Поместите трубку на магнитную подставку и аккуратно удалите и выбросите бункер для стирки, как только магнитные бусины наполнится сбоку от трубки.
  4. Ресуспендируют гранулы в 50 мкл буфера для элюирования (1% SDS и 100 мМ NaHCO 3 ) и инкубируют образцы на концевом ротаторе в течение 15 мин при комнатной температуре.
  5. Поместите трубки на магнитную подставку, и как только магнитные шарики собираются сбоку от трубки, перенесите супернатант в свежую трубку.
  6. Добавьте 6 мкл 5 М NaCl, чтобы свернуть сшивку и 2 мкл протеиназы К (0,5 мкг / мкл). После смешивания образцов инкубируйте образцы в течение 2 ч при 65 ° С.
  7. Для очистки ДНК выполните pheNol / хлороформ 12 (этап 3.5) и затем ресуспендируют осадок в 30 мкл dH 2 O.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Образцы могут быть непосредственно проанализированы на сайты связывания белка (раздел 5) или могут храниться при -20 ° C.

6. Анализ связующего сайта

  1. Проведите анализ для конкретных сайтов связывания в пределах известной последовательности нуклеиновой кислоты с использованием ПЦР или qRT-ПЦР. Для дизайна грунтовки следуйте обычным протоколам PCR или qRT-PCR. Конструируйте праймеры для синтеза ампликона 150-400 пар оснований, который мостирует интересующий сайт связывания белка ( рис. 1 ).
  2. Настройте ПЦР, используя четыре разных шаблона ДНК, чтобы обеспечить определенность: i) ДНК из ChIP, иммунопреципитированной интересующим антителом, ii) ДНК из ChIP, иммунопреципитированной неспецифическим IgG-антителом, iii) входная ДНК и iv) H 2 O в виде Отрицательный контроль для ПЦР, чтобы исключить загрязнение. В случае стимуляции пути, Выберите пятый шаблон, используя другой набор праймеров, специфичных для известного сайта связывания иммунопреципитированного белка.
    ПРИМЕЧАНИЕ. В случае анализа промотора лиганда c-KIT используют обычную ПЦР для демонстрации связывания SMAD, индуцированного TGF-β, в SBE в области промотора лиганда c-KIT. В качестве положительного контроля выполните ПЦР на ингибитор-активатор плазминогена-1 (PAI-1) в качестве известной мишени связывания с SMAD, индуцированного TGF-β.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Связывание лиганда TGF-β1 с его родственным рецепторным комплексом приводит к серинфосфорилированию транскрипционных факторов SMAD2 / 3, за которыми следует их связь с общим медиатором SMAD4. Комплекс SMAD транслоцируется в ядро. TGF-β может регулировать транскрипцию гена либо непосредственно через SMAD-связывание с SBE в регуляторных областях генов-мишеней, либо косвенно через SMAD-регулируемую экспрессию транскрипционных активаторов или репрессоров, которые впоследствии регулируют экспрессию интересующего гена 10 . Чтобы проверить, транскрипционно регулируется лиганд c-KIT лиганда SCF путем прямого индуцированного TGF-β1 связывания SMAD2 с его промотором, мы проанализировали промотор SCF, содержащий 2,4-kb, 5'-фланкирующую область гена SCF для SMAD2, 5'-AGAC-3 '(SBE) 13 , 14 . Мы определили 7 предполагаемых взлетов СБЭTream стартового кодона SCF ( рисунок 1A ). Для подтверждения TGF-β1-индуцированного связывания SMAD2 с промотором SCF был описан анализ ChIP, описанный здесь. Обработка TGF-β1 приводила к связыванию SMAD2 с промотором SCF в линиях рака печени человека, клетках HepG2 и Hep3B ( рисунок 1B ). В отсутствие стимуляции TGF-β1 не отмечалось связывания SMAD. В качестве положительного контроля активации SMAD, индуцированного TGF-β1, выполняли ChIP для PAI-1. Промотор PAI-1 является известной мишенью TGF-β / SMAD 13 . Для подтверждения специфичности иммунопреципитации SMAD2 использовали неспецифические IgG-антитела; Никакое связывание с SMAD2 с SBE отмечено после иммунопреципитации IgG.

Для другой демонстрации технологии ChIP мы проанализировали 5'-фланкирующую область гена TGF-β-лиганда для STAT3 консенсусных связывающих мотивов 5 '-TT (N4) AA-3 'и 5'-TT (N5) AA-3' 15 . Мы идентифицировали два предполагаемых участка связывания STAT3 перед стартовым кодоном TGFB в положениях -4384 / -4373 (STB-1) и -5365 / -5357 (STB-2) ( рисунок 2A ). Для подтверждения TGF-β1-индуцированного связывания STAT3 с геном TGF-β-лиганда мы проводили анализы ChIP с использованием TGF-β1-обработанных клеток HepG2 и Hep3B. Обработка TGF-β1 приводила к связыванию STAT3 со вторым предполагаемым сайтом связывания STAT3 (STB-2) гена TGFB, но не с первым (STB-1) ( рисунок 2B ). В этом примере положительное связывание STAT3 с STB-2 служит внутренним положительным контролем. Подобно вышеуказанному эксперименту ChIP, связывание STAT3 с STB-2 не наблюдалось после иммунопреципитации с использованием IgG.

Рисунок 1
Рисунок 1 Ong>: TGF-β-индуцированное SMAD2 связывание с промоутером SCF. ( A ) Схематическое изображение промотора SCF с предполагаемыми SBE, показанными в виде ящиков (белые квадраты = AGAC) с их относительным положением к стартовому кодону. Расположение праймера ChIP показано ниже, с относительными положениями к стартовому кодону SCF и размеру продукта ПЦР. ( B ) ChIP для связывания SMAD2 с промотором SCF . Хроматин-белковые комплексы обработанных TGF-β1 и необработанных клеток HepG2 и Hep3B иммунопреципитировали антителом против SMAD2. ПЦР проводили с использованием SCF-специфических праймеров. Слева показаны результаты ПЦР с использованием входной ДНК. В середине результаты ПЦР после иммунопреципитации неспецифическим IgG показаны для подтверждения специфичности иммунопреципитации SMAD2. В нижней панели в качестве положительного контроля использовался ChIP для связывания SMAD2 с PAI-1 .Ge.jpg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

фигура 2
Рисунок 2 : TGF-β-индуцированное связывание STAT3 с геном TGF-β. ( A ) Схема гена TGF-β с предполагаемыми сайтами связывания STAT3, показанными как серые ящики с их относительным положением к стартовому кодону. Расположение праймеров ChIP показано с их относительными положениями к стартовому кодону TGF-β и указанным ниже размерам ПЦР. ( B ) ChIP для TGF-β1-индуцированного STAT3-связывания с геном TGF-β. Хроматин-белковые комплексы TGF-β1-обработанных и необработанных клеток HepG2 и Hep3B иммунопреципитировали антителом против STAT3. ПЦР проводили с использованием TGF-β-специфических праймеров. Слева показаны результаты ПЦР с использованием входной ДНК. В середине ПЦРРезультаты после иммунопреципитации неспецифическим IgG показаны для подтверждения специфичности иммунопреципитации STAT3. Верхняя панель показывает результаты ПЦР с использованием праймеров, специфичных для сайта связывания STAT3 1 (STB-1), а нижняя панель показывает результаты связывания STAT3 с сайтом 2 привязки STAT3 (STB-2). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом отчете мы демонстрируем индуцированное TGF-β1 связывание SMAD2 с SBE в промоторе лиганда c-KIT и индуцированное TGF-β-связывание STAT3 с его распознающей последовательностью в гене TGF-β1-лиганда. Мы демонстрируем индуцированное цитокином связывание обоих факторов транскрипции с использованием иммунопреципитации хроматина.

Хроматиновая иммунопреципитация является мощным инструментом для демонстрации прямого связывания белка, представляющего интерес для ДНК, для характеристики стимулов, которые индуцируют связывание белка с ДНК, и для характеристики последовательности ДНК, с которой связывается белок. Последняя информация может помочь в идентификации генов, регулируемых конкретным белком, представляющим интерес, и достигается с помощью стратегий ChIP-on-chip, ChIP-seq или клонирования 7 , 8 , 9 . Одним из основных преимуществ ChIP по сравнению с другими методами демонстрации связывания ДНК-белка, Такие как EMSA или DNAase I footprinting, заключается в том, что в технологии ChIP связывание фиксируется in vivo , а с другими - in vitro . Следовательно, ChIP обеспечивает понимание связывания ДНК-белка в клеточном контексте, тогда как другие методы представляют собой изолированную систему.

Однако анализ ChIP является сложным, включает в себя несколько шагов, которые могут влиять на результаты, и требует оптимизации и опыта. Одним из первых шагов, который имеет решающее значение для успешного ChIP, является этап сшивания (шаг 2.2). Ультрафиолетовое сшивание является необратимым и поэтому непригодным для ChIP. Формальдегидная сшивка предпочтительна, но концентрация формальдегида и время сшивания могут влиять на эффективность связывания хроматина и осаждения антигена. В общем, более низкие концентрации формальдегида (1% мас. / Об.) И более короткие времена сшивания (5-10 мин) являются предпочтительными, поскольку они улучшают эффективность сдвига. Однако формальдегид не эффективенПри белково-белковой сшивке и, следовательно, субоптимально для белков, которые непосредственно не связываются с ДНК 16 . Для таких случаев ChIP может быть осуществлен в двухэтапном подходе, в котором белково-белковое сшивание выполняется сначала с использованием сшивающих агентов, таких как диукцинимидилглутарат, с последующим сшиванием с помощью ДНК-белка 17, опосредованным формальдегидом.

Следующим критическим шагом является сдвиг хроматина. В нашем исследовании мы использовали ферментативную стрижку с использованием микрококковой нуклеазы. Ферментативная стрижка особенно полезна для несшитого нативного ChIP (N-ChIP), когда обработка ультразвуком нарушает связывание ДНК-белка. N-ChIP преимущественно используется для анализа гистонов и модификаторов гистонов 18 . Хотя микрококковая нуклеаза считается относительно неспецифической эндо-экзонуклеазой, было показано, что она вызывает специфичное для последовательности расщепление 19 . Это может привести к зависящему от последовательности смещению в полученном fraС избыточным представлением определенных локусов генов. Ультразвук создает фрагменты ДНК произвольного размера без смещения последовательности и, как правило, предпочтительнее для сшитого ChIP (X-ChIP). Однако условия ультразвука должны определяться эмпирически для каждой модели клеток или тканей и модели звукооператора, а полученные фрагменты ДНК обычно больше, чем при ферментативном сдвиге 16 . Кроме того, чрезмерная обработка или эмульгирование образца может привести к потере эпитопов антител из-за денатурации и деградации белка.

Шаг иммунопреципитации - еще один важный шаг, который может существенно повлиять на результаты ЧИП. Агарозные гранулы связывают ДНК неспецифически, и изменение количества добавленных гранул может влиять на удельное отношение сигнал-фон. Следовательно, важно сохранить суспензию агарозы «суспензию» хорошо взвешенной, когда она добавляется к образцам ДНК-белка. Что касается антитела, используемого для iMmunoprecipitation, в общем, следует использовать антитела класса CHIP, и в тех случаях, когда они недоступны, предпочтительными должны быть, по меньшей мере, антитела иммунопреципитации. Поскольку специфические эпитопы могут маскироваться во время сшивания, поликлональные антитела являются предпочтительными, поскольку они распознают несколько эпитопов. Количество добавленного антитела должно превышать фактор, который осаждается, и, следовательно, должен быть определен эмпирически для каждого фактора / антитела. Кроме того, поскольку кинетика достижения равновесия связывания антитела отличается для каждого антитела, оптимальные условия инкубации должны определяться для каждого антитела.

В экспериментальную установку могут и должны быть включены несколько элементов управления. В тех случаях, когда оценивают индукцию специфической реакции связывания с ДНК-белком, важно включить входной контроль ДНК, чтобы продемонстрировать равные количества ДНК-матрицы в конечном анализе ( т.е. ПЦР или qRT-ПЦР). Контроль антител необходим дляПодтверждают специфичность иммунопреципитации представляющего интерес белка. Обычно иммуноглобулины, совместимые с изотипами, хорошо подходят как отрицательные контрольные образцы, но также могут использоваться агарозные гранулы. Иногда для подтверждения функционального экспериментального потока ChIP используют позитивный контроль, и для этой цели часто используются антигистонные антитела. В экспериментах по стимуляции предпочтительным положительным контролем является иммунопреципитация представляющего интерес белка, с последующим анализом последовательности для известной области ДНК, с которой белки связываются при стимуляции. В наших репрезентативных результатах SBE в промоторе PAI-1 использовали в качестве известной мишени для индуцированного TGF-β1 связывания SMAD. В экспериментах без стимуляции связывания с белками для последующего анализа ДНК может быть использована последовательность ДНК, которая не является мишенью для представляющего интерес белка. Что касается анализа ДНК, важно включить реакцию без матричной ДНК, чтобы исключить загрязнение.

ChIP - превосходная методика, позволяющая непосредственно продемонстрировать связывание белка, представляющего интерес для гена. Однако это не функциональное исследование. В тех случаях, когда считается, что интересующий белок играет регуляторную роль, необходимо также выполнять функциональные анализы, такие как анализы на основе репортерного гена ( например, люцифераза). В этих протоколах интересующий ген клонируют в регуляторном положении репортерного гена. Индукция представляющего интерес гена приводит к экспрессии репортерного гена, если он имеет регуляторную функцию. Для дальнейшего подтверждения регуляторной роли конкретного белка, представляющего интерес, могут быть сгенерированы или сбитые с ног клетки, в которых ДНК-связывающий белок генетически замалчивается. В качестве дополнительного контроля сайт связывания белка в регуляторном гене может быть мутирован для предотвращения связывания представляющего интерес белка. В любом из двух последних экспериментальных конструкций стимуляция клеток не приведет к экспрессии маркера gена.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Университетом Техаса MD Cancer Center в Андерсоне, Хьюстон, штат Техас (стартовые фонды, BB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HepG2 cells ATCC HB-8065
Hep3B cells ATCC HB-8064
TGF-β1 R&D Systems 101-B1 Used at a concentration of 10 ng/mL
Anti-SMAD2 antibody Cell Signalling Technology 5339 Amount used/IP: 3 µg
Anti-STAT3 antibody Cell Signalling Technology 4904 Amount used/IP: 3 µg
ChIP-IT Protein G Magnetic Beads Active Motif 53033
Protease Inhibitor Cocktail Active Motif 37490
Micrococcal Nuclease Cell Signalling Technology 10011
PCR forward primer: PAI-1 Sequence: 5’-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3’
PCR reverse primer: PAI-1 Sequence: 5’-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3’
PCR forward primer: SCF Sequence: 5’-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3’ 
PCR reverse primer: SCF Sequence: 5’-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3’
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-1) Sequence: 5’-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3’ 
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-1) Sequence: 5’-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3’ 
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-2) Sequence: 5’-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3’    
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-2) Sequence: 5’-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3’  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions. Methods Enzymol. 130, 132-181 (1986).
  2. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).
  3. Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).
  4. Gilmour, D. S. Lis J.T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 5 (8), 2009-2018 (1985).
  5. Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).
  6. Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J., Tissenbaum, H. A. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans. Nat Protoc. 3 (4), 698-709 (2008).
  7. Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters. Mol Cell Biol. 21 (20), 6820-6832 (2001).
  8. Weinmann, A. S., Farnham, P. J. Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation. Methods. 26 (1), 37-47 (2002).
  9. Weinmann, A. S., Yan, P. S., Oberley, M. J., Huang, T. H., Farnham, P. J. Isolating human transcription factor targets by coupling chromatin immunoprecipitation and CpG island microarray analysis. GenesDev. 16 (2), 235-244 (2002).
  10. Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Dev. 19 (23), 2783-2810 (2005).
  11. Rojas, A., et al. A Positive TGF-beta/c-KIT Feedback Loop Drives Tumor Progression in Advanced Primary Liver Cancer. Neoplasia. 18 (6), 371-386 (2016).
  12. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of nucleic acids by extraction with phenol:chloroform. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  13. Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17 (11), 3091-3100 (1998).
  14. Shi, Y., et al. Crystal structure of a Smad MH1 domain bound to DNA: insights on DNA binding in TGF-beta signaling. Cell. 94 (5), 585-594 (1998).
  15. Seidel, H. M., et al. Spacing of palindromic half sites as a determinant of selective STAT (signal transducers and activators of transcription) DNA binding and transcriptional activity. Proc Natl Acad Sci USA. 92 (7), 3041-3045 (1995).
  16. Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nat Protoc. 1 (1), 179-185 (2006).
  17. Tian, B., Yang, J., Brasier, A. R. Two-step cross-linking for analysis of protein-chromatin interactions. Methods Mol Biol. 809, 105-120 (2012).
  18. O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
  19. Horz, W., Altenburger, W. Sequence specific cleavage of DNA by micrococcal nuclease. Nucleic Acids Res. 9 (12), 2643-2658 (1981).
  20. Chung, H. R., et al. The effect of micrococcal nuclease digestion on nucleosome positioning data. PLoS One. 5 (12), 15754 (2010).

Tags

Генетика выпуск 124 иммунопреципитация хроматина регуляция генов промотор фактор транскрипции лиганд c-KIT TGF-β SMAD
Анализ промотора c-KIT-лиганда с использованием иммунопреципитации хроматина
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, P., Rojas, A., Blechacz, B.… More

Zhang, P., Rojas, A., Blechacz, B. Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (124), e55689, doi:10.3791/55689 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter