Summary
Questo lavoro descrive un protocollo di sequenziamento del dominio di binding di metil-CpG (MBD) ottimizzato e una pipeline computazionale per identificare le regioni ricche di CpG riccamente differenziate in pazienti con leucemia linfocitaria cronica (CLL).
Abstract
Il ruolo di lunghi RNA non codificanti (lncRNA) nel cancro sta arrivando all'avanguardia a causa del crescente interesse per comprendere le loro funzioni meccaniche durante lo sviluppo e la progressione del cancro. Nonostante questo, la regolazione epigenetica globale dei lncRNA e delle sequenze ripetitive nei tumori non è stata ben studiata, in particolare nella leucemia linfocitaria cronica (CLL). Questo studio si concentra su un approccio unico: la cattura a base di immunoprecipitazione di frammenti di DNA a doppio filamento e metilato usando proteine del dominio di legame di metile (MBD), seguito da sequenziamento di nuova generazione (MBD-seq). In questo studio sono stati utilizzati campioni di pazienti CLL appartenenti a due sottogruppi prognostici (5 campioni mutati IGVH + 5 IGVH campioni non mutati). L'analisi ha rivelato 5.800 ipermetilati e 12.570 glicini differenzialmente metilati specifici CLL-ipometilati (cllDMGs) rispetto ai normali controlli sani. Importante, questi risultati hanno identificato diversi lncRNA specifici CLL, differenzialmente metilatiElementi petitive e geni che codificano la proteina con potenziale valore prognostico. Questo lavoro descrive un protocollo dettagliato per una pipeline MBD-seq e bioinformatica sviluppata per l'analisi completa dei profili di metilazione globale in regioni altamente ricche di CpG usando campioni di pazienti CLL. Infine, un gene codificante proteina e un lncRNA sono stati convalidati usando il pirosequencing, che è un metodo altamente quantitativo per analizzare i livelli di metilazione di CpG per corroborare ulteriormente i risultati del protocollo MBD-seq.
Introduction
L'utilizzo di tecniche di sequenziamento di nuova generazione per l'analisi dei profili di metilazione del DNA globale è diventato sempre più popolare negli ultimi anni. I metodi di metilazione a livello genomico, compresi metodi basati su microarray e non microarray, sono stati sviluppati in base a quanto segue: la conversione di bisulfite di DNA genomico, digestioni enzimatiche di restrizione sensibile alla metilazione e l'immunoprecipitazione del DNA metilato usando anticorpi specifici di metil CpG .
La metilazione aberrante del DNA è uno dei segni distintivi della leucemia e dei linfomi, inclusa la leucemia linfocitica chirurgica (CLL). In precedenza, diversi gruppi compresi i nostri caratterizzavano i profili di metilazione del DNA di diversi sottogruppi CLL e dei normali e sani controlli delle cellule B usando la conversione bisulfa del DNA genomico seguita da metodi basati su micro-array o sequenziamenti interi genomi 1 , 2 , 3 , <Sup class = "xref"> 4. La conversione di bisulfite del DNA genomico conduce alla deaminazione di citosine non modificate all'uracil, lasciando le citosine metilate modificate nel genoma. Una volta convertito, lo stato di metilazione del DNA può essere determinato mediante amplificazione e sequenza PCR utilizzando diversi metodi quantitativi o qualitativi, come il sequenziamento di bisulfite a base di micro-array o intero genoma (WGBS). Sebbene i metodi basati sulla conversione di bisolfito abbiano molti vantaggi e sono ampiamente usati in diversi tipi di cancro per analizzare i livelli di metilazione del DNA, ci sono alcuni inconvenienti associati a questa tecnica. Il sequenziamento di WGBS consente la risoluzione di una coppia di basi con quantità minori di DNA ed è l'opzione migliore per analizzare un gran numero di campioni. Tuttavia, questo metodo non riesce a differenziare le modifiche tra i livelli di 5 mC e 5 hmC nel genoma 5 , 6 . Inoltre, i metodi basati su microarray non offrono completa cSopravvivenza del genoma.
In un recente studio del nostro laboratorio 7 , sono stati utilizzati metodi basati su immunoprecipitazione, piuttosto che la conversione di bisulfite, per identificare regioni ricche di CpG ricche e differenziate su scala globale nei pazienti CLL e nei controlli normali sani. Il sequenziamento di prossima generazione (MBD-seq) del dominio di binding inmetil-CpG (MBD), l'arricchimento del DNA frammentato a doppio filamento dipende dal grado di metilazione di CpG. Questo metodo può superare gli inconvenienti del metodo di conversione di bisulfite e può anche fornire una copertura genomica della metilazione CpG in modo indipendente e indipendente dalla PCR. Inoltre, a differenza dei metodi di microarray basati su conversione a base di bisolfito, MBD-seq può essere utilizzato per analizzare lo stato di metilazione degli elementi ripetitivi, quali elementi nucleari interrati lunghi (LINEs), elementi nucleari interspersati corti (SINEs), ripetizioni terminali lunghe (LTRS) Ecc . Tuttavia, rispetto ai metodi di conversione di bisolfito,Un protocollo MBD-seq richiede una quantità relativamente elevata di DNA di input. Inoltre, la qualità dei sequenziamenti legge e i dati dipendono dalla specificità, affinità e qualità degli anticorpi utilizzati.
Lo studio corrente spiega un dettagliato protocollo MBD-seq per arricchire il DNA metilato per la sequenza di nuova generazione. Utilizza un kit di arricchimento di legame metilato commerciale (elencato nella tabella dei materiali ), nonché una pipeline computazionale per visualizzare e interpretare i dati di sequenziamento della metilazione per identificare le regioni iper- e ipometilate specifiche CLL rispetto ai controlli normali sani. Fondamentalmente, questo metodo utilizza la capacità dell'MBD dell'interazione con proteine umane MBD2 con CpG metilati per estrarre il DNA arricchito con CpG metilati, e questo è seguito dal sequenziamento ad alta percentuale di DNA metilato.
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Protocol
L'approvazione etica per la raccolta dei campioni CLL è dal 2007-05-21, con il seguente numero di registrazione: EPN Gbg dnr 239/07. Tutti i pazienti affetti da CLL sono stati diagnosticati in base ai criteri di revisione recenti 8 , ei campioni sono stati raccolti al momento della diagnosi. I pazienti dello studio sono stati inclusi in diversi reparti di ematologia nella parte occidentale della Svezia dopo che era stato ottenuto il consenso scritto. In questo studio sono stati selezionati solo i campioni di cellule mononucleari del sangue periferico CLL (PBMC) con una percentuale tumorale di cellule leucemiche ≥70%.
1. Preparativi
- Isolare i PBMC per le estrazioni del DNA da CLL e campioni di sangue normali e sani utilizzando un kit di isolamento commerciale (vedi tabella dei materiali ), secondo le istruzioni del produttore.
- Autoclave tubi da 1,5 ml. Sciogliere tutti i reagenti nel kit di legame metilato (vedere la tabella dei materiali )/ Li>
- Utilizzare acqua libera da DNase per preparare 10 mL di tampone di lavaggio a strato di 1x dal tampone di lavaggio a magazzino da 5x fornito dal kit per lavare le perle e diluire la proteina MBD fornita dal kit.
- Ottenere o preparare in anticipo i seguenti elementi: 3 M acetato di sodio, etanolo assoluto e 70% etanolo per la precipitazione del DNA ( Table Materials ).
2. Estrazione e Sonicazione del DNA genomico
- Utilizzare un kit di estrazione del DNA disponibile in commercio ( Table Materials ) per isolare il DNA genomico da pazienti e campioni normali PBMC secondo il protocollo del produttore. Quantificare il DNA genomico usando uno spettrofotometro a 260 nm.
NOTA: La capacità della colonna di estrazione del DNA è di 5-6 milioni di celle, massimo; Di conseguenza, è importante utilizzare più di una colonna per campioni con più di 5 milioni di celle. Eluire il DNA due volte in volumi uguali pari a 100 μl di 10 mM Tris EDTA (TE). La proteina MBD-biotina utilizzata nel metilIl kit miner per il sequenziamento di MBD non si lega al DNA a singolo filamento. Quindi, è molto importante mantenere il DNA eluito congelato oa 4 ° C per conservare la sua natura a doppio filamento. - Diluire 5 μg di DNA genomico da ogni campione fino a un totale di 200 μL utilizzando il tampone TE (pH 8), dando una concentrazione finale di 25 ng / μL.
- Effettuare la sonicazione in tubi appositamente progettati usando un sonicatore ( Table Materials ) per un totale di 30 cicli (30 secondi e 30 secondi per ogni ciclo; dopo ogni 5 cicli spingere brevemente i tubi per raccogliere i campioni verso il basso).
NOTA: Questo produrrà DNA frammentato compreso tra 150 bp e 300 bp, che è ottimale per questo protocollo. - Controllare l'intervallo di sonicazione per tutti i campioni prima di procedere alla fase successiva della sequenza MBD eseguendo 1 μL dei campioni frammentati del DNA e una scaletta di dimensione del DNA su un gel agarosico pre-castato 2% in commercio, utilizzando l'apparecchiatura di imaging di elettroforesi del DNA. Visualizzare tLui utilizzando un transilluminatore UV standard.
3. Preparazione del tallone prima della legatura con proteina MBD-biotina
- Resuspendere le perline magnetiche di streptavidina dalla provetta fornita dal kit, pipettando delicatamente su e giù per ottenere una sospensione omogenea. Non vorticare le perle o lasciarli asciugare.
- Posizionare 50 μl di branelli (per ogni 5 μg di campione DNA frammentato) in tubi separati, puliti e etichettati da 1,5 ml. Aggiungere 50 μl di tampone di lavaggio 1x per ottenere il volume finale di 100 μL.
NOTA: quando si utilizzano piccole strisce di reazione a catena di polimerasi da 0,5 mL per il lavaggio di perline, vengono utilizzati circa 150-200 μL di tampone di lavaggio per tubo, come indicato nel protocollo del kit. Tuttavia, nel caso di tubi da 1,5 ml, aggiungere almeno 250 μL a 300 μL di tampone di lavaggio per tubo per il lavaggio del tallone. - Posizionare i tubi su un supporto magnetico per un minuto per permettere a tutte le perline magnetiche di concentrarsi sulla parete interna del tuboDi fronte al magnete. Rimuovere il liquido senza toccare le perle usando una pipetta da 200 μl.
- Rimuovere i tubi dal basamento magnetico, aggiungere 250 μl di tampone di lavaggio 1x perle e mescolare delicatamente le perle con una pipetta.
- Ripetere i passaggi 3.3 e 3.4 almeno 4-5 volte per tutti i campioni e infine risospendere in 250 μl di tampone di lavaggio 1x bead. Tenerli in ghiaccio.
4. Legatura della proteina MBD-biotina ai branelli lavati
- Aggiungere 35 μL di proteine MBD (7 μL per 1 μg di campione di DNA) per separare i tubi e portare il volume totale fino a 250 μL usando un tampone di lavaggio a goccia.
- Aggiungere 250 μL di proteina MBD diluita a 250 μL di brani lavati e lasciarli in rotazione end-to-end a temperatura ambiente per 1 h.
- Dopo aver mescolato le perle e le proteine per 1 h, lavare la biotina proteica MBD legata a perline magnetiche di streptavidina.
- Posizionare i tubi sul supporto magnetico per 1 min e rimuovere il tuboLiquido senza toccare le perle usando una pipetta. Aggiungere 250 μl di tampone di lavaggio 1x bead e mettere i tubi su un miscelatore di rotazione per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Ripetere il passo 4.3.1 ancora due volte e infine riusare le branche MBD-biotina lavate in 200 μL di tampone di lavaggio 1x perle, rendendo le perle pronte per la cattura di metilato del DNA.
NOTA: il lavaggio 2-3 volte in questo modo rimuove tutte le sfere proteiche MBD non legate alla sfilata e migliora l'efficiente legame delle perline legate alla proteina MBD con DNA genomico frammentato.
5. Perline di MBD-biotina leganti con DNA genomico frammentato
- In un tubo pulito da 1,5 ml senza DNasi, aggiungere 100 μl di tampone di lavaggio 5x e 180 μL del DNA genomico frammentato (fase 2.3). Portare il volume finale a 500 μL usando acqua libera da DNase.
- Aggiungere 380 μL di acqua DNase-free al restante 20 μL del DNA genomico frammentato e bloccarli. Utilizzare questi campioni come input DNA controlli e li precipitano in seguito con i campioni DNA di metilato eluito finale (vedere punto 7.1).
- Posizionare i tubi contenenti branelli MBD-biotina lavati (punto 4.4) su un supporto magnetico per 1 min e rimuovere il liquido senza disturbare le perle. Aggiungere 500 μl di DNA genomico frammentato diluito nel tampone di lavaggio del bead.
- Sigillare tutti i tubi strettamente con pellicola paraffina e lasciarli durante la notte a 4 ° C su un banco di rotazione end-to-end a 8-10 giri / min.
NOTA: La reazione di legame del DNA e della biotina può essere fatta per 1 ora a temperatura ambiente, ma lasciandola a 4 ° C per una notte può migliorare il recupero del DNA finale metilato.
6. Rimuovere il DNA non legato e eluire il DNA metilato dai branelli
- Dopo la reazione di legame di DNA e MBD, posizionare i tubi sulla cremagliera magnetica per 1 min per concentrare tutte le perle sulla parete interna del tubo.
- Rimuovere il liquido supernatante con una pipetta senza toccareLe perline e salvare questa frazione campione di DNA non legata su ghiaccio.
- Aggiungere 200 μL di tampone di lavaggio 1x perlato alle perle e posizionare i tubi sul supporto rotativo per 3 min a temperatura ambiente. Posizionare i tubi sul supporto magnetico e rimuovere il liquido. Ripetere il lavaggio altre due volte per rimuovere il DNA residuo non legato.
- Dopo il lavaggio finale, aggiungere 200 μl di tampone di eluizione ad alto sale (2.000 mM NaCl), fornito nel kit per eluire il DNA.
- Mettere i tubi sul supporto rotante per 15 minuti a temperatura ambiente. Posizionarli sul supporto magnetico per 1 min e utilizzare una pipetta per trasferire accuratamente il surnatante su un nuovo tubo da 1,5 ml pulito.
- Aggiungere 200 μl di tampone di eluizione ad alto sale e ripetere l'eluizione ruotando i tubi a temperatura ambiente per 15 min. Aggiungere il secondo eluire allo stesso tubo contenente 200 μl del primo eluito.
NOTA: Il finale di 400 μL di DNA totale eluito è ora pronto per la precipitazione di etanolo per estrarre il purificatoDNA adatto per sequenziamento di nuova generazione.
7. Precipitazione di etanolo e arricchimento del DNA metilato
- Aggiungere 1 μl di glicogeno (20 μg / μL incluso nel kit); 40 μl di 3 M acetato di sodio, pH 5,2; E 800 μl di etanolo assoluto ghiaccio freddo a 400 μL di DNA eluito e anche ai 400 μL di campioni di DNA di ingresso preparati nella fase 5.2.
- Mescolare bene i tubi vorticando e incubarli a -80 ° C per tutta la notte.
- Centrifugare i tubi a 12.000 xg (velocità massima) e 4 ° C. Scartare con attenzione il surnatante, senza disturbare il pellet, aggiungere 500 μl di etanolo al 70% e vortexare i tubi.
- Centrifugare nuovamente alla velocità massima per 15 minuti a 4 ° C e rimuovere il surnatante utilizzando attentamente una pipetta. Centrifugare i tubi alla velocità massima per 1 min a temperatura ambiente e rimuovere completamente l'etanolo residuo utilizzando una punta pipetta.
- Asciugare il pellet per 5 minuti a temperatura ambienteratura. Aggiungere 10 μl di acqua DNase-free al pellet DNA. Procedere alla quantificazione del DNA metilato (fase 7.6), alla sequenza MBD (fase 7.7) e all'analisi (sezioni 8 e 9).
- Quantificare i campioni DNS recuperati definitivi utilizzando un kit di quantitazione fluorometrico disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali ), secondo le istruzioni del produttore.
- Nota: Utilizzando questo protocollo, 30-50 ng di DNA finale è stato recuperato da ogni campione. I campioni di DNA sono pronti per essere inviati su ghiaccio secco per la costruzione di librerie a valle e la sequenza MBD ad alta capacità
- Eseguire la sequenza di MBD della libreria DNA e la produzione di elevata produttività utilizzando una piattaforma commerciale ( Table Materials ), come descritto nel riferimento 9 .
NOTA: Per il controllo di qualità iniziale del DNA finale metilato, eseguire le preparazioni per la libreria utilizzando il sequenziamento a coppia di 50 bp per tutti i campioni. Processare i dati grezzi per il controllo di qualità post-sequenziale, aS elaborata nel punto 8.1 e poi elaborarlo utilizzando approcci bioinformatici e metodi statistici, come descritto di seguito (passaggi 8.2-9.6).
8. Analisi della bioinformatica Metodo 1: Identificazione delle regioni differenzialmente metilizzate associate a CLL (cllDMRs)
- Pulire i lettori ottenuti da 49 bp (formato FASTQ) per gli adattatori utilizzando strumenti di controllo qualità disponibili, come Trimmomatic 10 o Cutadapt. Verificare la qualità delle letture tagliate utilizzando il toolkit FastQC:
Java -jar trimmomatic.jar SE SAMPLE_uncleaned.fastq SAMPLE.fastq ILLUMINACLIP: adapters.fasta: 2: 30: 10 - Allineare i file FASTQ puliti con l'allineatore di genitali di breve scatto Bowtie contro un genoma di riferimento 11 . Specificare i parametri come segue:
- Permettono fino a due disallineamenti (parametro Bowtie: -v 2).
- Limitare la segnalazione ai sei miglior allineamenti per lettura (parametro Bowtie: -m 6) da controllarePer le letture multi-mapping.
Bowtie -v 2 -a -m 6 HG19_INDEX -S SAMPLE.fastq> SAMPLE.sam
NOTA: Convertire i file SAM generati per i singoli campioni dopo l'allineamento in BAM utilizzando SAMtools.
Samtools vista -bS -o SAMPLE.bam SAMPLE.sam
- Utilizzare l'analisi basata sul modello del chiamante di picco ChIP-Seq (MACS) sui campioni allineati (BAM) per prevedere regioni arricchite / metilate dai sottogruppi CLL 12 .
NOTA: confronto I: utilizzare il campione di input come gruppo di controllo e i campioni dei pazienti Normal e CLL come gruppi di trattamento. Questo passo consiste nel raccogliere tutti i picchi negativi (picchi arricchiti in Input / Background). Confronto II: Utilizzare il gruppo di campionamento normale come gruppo di controllo e il gruppo di campioni di pazienti CLL come gruppo di trattamento. I picchi positivi ottenuti sono le regioni ipermetilate CLL ei picchi negativi sono le regioni ipometilate CLL sulle regioni normali o differenzialmente metilate (DMR).
macs14 -t SAMPLE_TREATMENT.bam -c SAMPLE_CONTROL.bam --format BAM -g hs - Rimuovere i picchi di fondo Comparison I dalle regioni differenzialmente metilate (DMR) utilizzando BEDtools 13 .
I bedtools sottrarranno -a <CLL_enriched_regions> -b <Input_enriched_regions> - Predicare la percentuale di elementi ripetuti (SINE-Alu, LINE, ecc. ) Arricchiti in DMR.
- Utilizzare fastacmd per estrarre la sequenza FASTA di DMR dalle coordinate cromosomiche del genoma di riferimento HG19.
Fastacmd -d HG19_genome.fa -s Cromosoma -L inizio, fine -l 50000> DMRs.fasta - Utilizzare lo strumento di riga di comando RepeatMasker per predire la percentuale di elementi di ripetizione presenti nella sequenza FASTA di DMR.
RepeatMasker -gc -gccalc -s -species umano -html DMRs.fasta
- Utilizzare fastacmd per estrarre la sequenza FASTA di DMR dalle coordinate cromosomiche del genoma di riferimento HG19.
- Annotare i DMR previsti utilizzando Homer "annotatePeaks.pl" con l'ensemble disponibile [PMC4919035] oR Gencode [PMID 22955987] annotazione trascrizione (codici di codifica e non trascodifica).
AnnotatePeaks.pl DMRs.bed <GENOME> -gtf <Ensembl o Gencode GTF>
NOTA: fornisce informazioni sulla distribuzione di picchi su diverse regioni geniche ( es. Promoter, esone, intron, 3 'UTR e 5' UTR) e regioni intergene. I trascritti oi geni associati a DMR sono chiamati geni differenzialmente metilati (DMG). - Utilizzare lo strumento di arricchimento con il database funzionale aggiornato o attuale per trovare funzioni arricchite da DML CLL (solo i geni che codificano la proteina) 14 .
NOTA: Il cluster di set di geni basato su Annotazione funzionale (GeneSCF) 14 è uno strumento basato su tempo reale per l'analisi funzionale dell'arricchimento che utilizza aggiornato KEGG e Gene Ontology come database di riferimento.
9. Analisi del metodo di bioinformatica 2: Identificazione di CLL-Associated Significativamente DiffRegioni eritimate di metilazione (cll sigDMR)
- Seguire i passaggi 8.1-8.5 dal metodo I (sezione 8) e utilizzare l'analisi di arricchimento differenziale basata su lettura utilizzando gli strumenti disponibili, come elaborato nei punti da 9.2 a 9.6, per aggiungere un altro livello di statistiche alla pipeline di analisi.
- Quantificare il numero di letture mappate a picchi o DMR individuali nei campioni di pazienti di Normal e CLL usando "featureCounts" dal pacchetto "Subread" 15 .
Sottile / bin / featureCounts -Q 30 -F SAF -a DMRs.SAF -o DMRs_counts.table SAMPLE_TREATMENT.bam SAMPLE_CONTROL.bam
NOTA: È possibile introdurre un filtro di qualità di mappatura per evitare di quantificare le letture di cattiva qualità ( ad esempio, -Q 30). Per questo passo, preparare i file SAF per i DMR ottenuti. Per ulteriori informazioni sul formato di file SAF, utilizzare questo link http://bioinf.wehi.edu.au/featureCounts/. - Utilizzare una tabella di lettura RAW contenente il numero di letture per i picchi individuali in Normal anD CLL gruppi di pazienti CLR in edgeR come ingresso 16 .
NOTA: confronta i gruppi di campioni del paziente normale rispetto al CLL per trovare sigDMRs. Per un'analisi differenziale di arricchimento, seguire la guida di edgeR per istruzioni dettagliate dettagliate (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf). - Filtrare i sigDMR utilizzando la falsa risoluzione di scoperta (FDR) e la modifica di log-fold previsti da edgeR 16 .
- Annotare i sigDMR predefiniti utilizzando Homer "annotatePeaks.pl" con l'annotazione di trascrizione disponibile di Ensembl o Gencode (codici di codifica e non trascodifica).
AnnotatePeaks.pl sigDMRs.bed HG19_genome.fa -gtf <Ensembl o Gencode GTF> -CpG
NOTA: fornisce informazioni sulla distribuzione di picchi su diverse regioni geniche ( es. Promoter, esone, intron, 3 'UTR e 5' UTR) e regioni intergene. Trascrizioni o geni associati a siGDMRs sono chiamati sigDMGs. - Utilizzare uno strumento di arricchimento con il database funzionale aggiornato o attuale per trovare funzioni arricchite da CLL sigDMGs (solo i geni codificanti proteine) 14 .
NOTA: GeneSCF, uno degli strumenti in tempo reale per l'analisi funzionale di arricchimento, utilizza KEGG e Gene Ontology come database di riferimento.
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Representative Results
MBD-seq è stato recentemente eseguito su pazienti affetti da CLL e controlli abbinati, normali e sani per identificare geni differenziali iper- e ipometilati specifici CLL 7 . La pipeline sperimentale e bioinformatica utilizzata per analizzare i dati generati da CLL e campioni sani normali sono mostrati in Figura 1A e 1B . Queste analisi identificarono diverse regioni differenzialmente metilate specifiche CLL (cllDMRs), che erano significativamente iper / ipometilati da campioni IGHV mutati e IGHV-mutati mutati rispetto ai campioni di controllo, con un valore p <0.00001. La Figura 2A mostra tutti i cllDMR ottenuti sia dai confronti normale di B e dai normali PMBC. Tutti i cllDMRs sono stati mappati a diverse classi di geni che codificano e non codificano, come mostrato nella Figura 2B . Importante, in questa analisi, i confronti sono stati perforMed indipendentemente tra i campioni dei pazienti CLL, con due diversi controlli normali, cellule B e PMBC ordinate. È interessante notare che l'analisi ha determinato una grande sovrapposizione di geni comuni CLL-differenzialmente metilati (cllDMGs, 851 ipermetilati e 2.061 ipometilati) rispetto al normale controllo delle cellule B e ai campioni di controllo PBMC normali ( Figura 2C ), suggerendo che questi cllDMGs possano essere Possibili geni di firma CLL con ruoli significativi nella patogenesi della malattia. Per rafforzare i dati analizzati , sono stati convalidati diversi siti CpG localizzati in un gene codificante di proteine ipermetilati SKOR1 e un lcnRNA non codificato lungo l'ipometilato, AC012065.7 , come descritto nelle pubblicazioni precedenti 7 , 17 , 18 ( Figura 3A E B ). La figura 4 mostra il DNA tagliatoDopo il protocollo di sonicazione. Il DNA frammentato varia da 150 a 300 bp, rendendolo ideale per scopi di sequenziamento.
Figura 1: Panoramica del flusso di lavoro utilizzato in questo studio. Questa figura, ottenuta dalla nostra recente pubblicazione 7 , mostra la progettazione dell'analisi globale utilizzata per identificare le regioni differenzialmente metilate (DMR) nei campioni dei pazienti della leucemia linfocitaria cronica (CLL). ( A ) Progettazione sperimentale dell'arricchimento MBD di DNA metilato. B ) La pipeline di analisi bioinformatica utilizzata per identificare le regioni differenzialmente metilate specifiche CLL (cllDMRs). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: I cllDMR e cllDMG ipermetilati e ipometilati dei campioni di pazienti CLL rispetto a normali, sani e ordinati B cellule 7 . ( A ) Tutte le regioni differenzialmente metilate associate a leucemia linfocitica cronica (CLL) con significativi valori p (<0,00001) ottenuti dal confronto dei campioni CLL mutati e-mutati IGHV a normali cellule B ordinate (pannello superiore) e campioni PBMC normali (Pannello inferiore). Gli arricchimenti mostrati nel diagramma di calore erano all'interno di una finestra di ± 3 kb da regione differenzialmente metilata (DMR). ( B ) Diagramma Venn che mostra la sovrapposizione di geni differenzialmente metilati specifici CLL (cllDMGs, ipermetilati e ipometilati) tra gruppi IGHV mutati e IGHV-mutati. Il grafico a torta rappresenta la percentuale di geni appartenenti a una classificazione diversa, come la codifica delle proteine, Lunghi non codificanti RNA (lncRNA), pseudogeni, antisenso e altri RNA non codificanti. ( C ) Diagramma Venn che mostra la sovrapposizione di geni differenzialmente metilati (gruppi IGHV mutati e prognostici non mutati IGHV) tra confronti di cellule B e PBMC. Il pannello sinistro del diagramma Venn mostra la sovrapposizione dei geni ipermetilati e il pannello destro per i geni ipometilati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Validazione dello stato di metilazione del DNA per i singoli siti CpG sui geni target target metilamente differenziati. Dati piroscensivi per la quantificazione della percentuale di metilazione del DNA per due geni selezionati utilizzando un linfocitico cronico indipendente(CLL) contenente 54 campioni e 6 campioni di cellule B normali, sani e adatti all'età. ( A ) I boxplots rappresentano la percentuale di livelli di metilazione per 3 singoli siti CpG del gene SKOR1 hypermethylated utilizzando pyrosequencing. ( B ) Il boxplot mostra il grado di metilazione per 5 singoli siti CpG di ipometilato AC012065.7 gene utilizzando pyrosequencing. Le caselle indicano l'interquartile (25-75%), mentre la linea orizzontale interna indica il valore mediano. I baffi rappresentano i valori minimi e massimi. Il valore p corrispondente al grado di metilazione differenziale dei campioni CLL rispetto alle normali cellule B è mostrato nei boxplots per ogni singolo sito CpG. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
MBD-seq è una tecnica basata su costo-efficacia basata sull'immunoprecipitazione che può essere utilizzata per studiare i modelli di metilazione con copertura completa a livello genomico. Sia MeDIP seq (immunoprecipitazione metilata DNA seguita da sequenziamento) e MBD-seq provocano l'arricchimento di DNA metilato ricco di CpG. Tuttavia, MBD-seq mostra maggiore affinità verso l'adesione a regioni ricche di CpG molto elevate rispetto a MeDIP seq 19 . Utilizzando un kit di arricchimento di metile, si può frazionare il DNA in regioni ricche di CpG e di bassa CpG, eluendo il DNA con risparmio di bufere ad alto sale e basso contenuto di sale. In questa ricerca, è stata eseguita solo un'eluzione di una singola frazione per catturare regioni ricche di arricchimenti ricchi di CpG che coprono gran parte delle isole CpG.
MBD-seq può essere una potente alternativa al WGBS, che è comunemente usato in CLL e in altre ricerche sulle leucemie. Anche se MBD-seq richiede una quantità relativamente più elevata di DNA in ingresso rispetto al bisolfitoMetodi basati sulla conversione, consente di studiare i cambiamenti della metilazione globale che sono specifici solo per le modifiche di 5 mC, senza alcuna polarizzazione di amplificazione PCR creata dopo la conversione. Quindi, MBD-seq è un metodo ideale per affrontare cllDMGs, che potrebbero essere potenziali geni di firma CLL a base epigenetica con un valore prognostico.
I fattori cruciali per l'esecuzione di questo metodo sono la gamma di qualità e di sonicazione del DNA frammentato utilizzato prima della reazione di legame. Tutti i campioni mostravano una gamma di frammenti più brevi, tra 150 e 300 bp ( Figura 4 ), con risultati di sequenziamento di buona qualità, con circa 25-33 milioni di letture uniche per ogni mappatura del campione al genoma dopo il filtraggio e la pulizia dei dati.
Infine, lo stato di metilazione dei cllDMG iper- e ipometilati è stato convalidato per pochi geni usando un metodo di pyrosequencing in una coorte campione indipendente. Questo metodo dà il percezioneDella mediazione del DNA, a seconda del rapporto tra C e T nei singoli siti CpG sulla base della quantità di C e T incorporata durante l'estensione della sequenza. I cllDMG ipermetilati hanno mostrato elevate percentuali di metilazione nei campioni CLL rispetto ai campioni normali. Allo stesso modo, i cllDMG ipometilati hanno mostrato il contrario. I dati pirocedenti per due cllDMGs sono mostrati in Figura 3 .
Rispetto ai metodi basati su array, questo metodo consente di esaminare più ampiamente le sequenze del genoma, incluse le regioni precedentemente annotate che riguardano regioni di codifica delle proteine e sequenze non annotate che attraversano elementi ripetitivi e lncRNA. Così, questo approccio sui pazienti CLL ha individuato diversi cllDMG nuovi che attraversano lncRNA e elementi ripetitivi. Poiché queste indagini non sono state eseguite precedentemente nei campioni dei pazienti CLL, questo studio serve come una risorsa preziosa per identificare le regioni metilate differenziali associate a CLL inDiversi sottogruppi prognostici. Questi cllDMG serviranno come nuovi biomarcatori e target per la terapia epigenetica con farmaci.
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Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dal Consiglio di ricerca svedese, dalla Società cancro svedese, dalla fondazione Knut e Alice Wallenberg (KAW) e da FoU VästraGötalandsregionen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dneasy Blood and tissue kit | Qaigen | 69504 | |
| Lymphoprep solution | A X I S-S H I E L D | 1114544 | |
| Nano drop 2000 | Thermo Fischersceintific | ||
| TE buffer pH 8 | Sigma aldrich | 93283 | |
| Bioruptor standard sonication device | Diagenode | UCD-200 | |
| TPX bioruptor tubes 1.5 mL | Diagenode | C30010010-300 | |
| 3 M Sodium acetate | Diagenode | C03030002 | |
| E-gel iBase safe imager combo kit | Thermo Fischersceintific | G6465EU | |
| E-gel 2% Agarose gels | Thermo Fischersceintific | G441002 | |
| Methylminer Methylated DNA enrichment kit | Thermo Fischersceintific | ME10025 | |
| Labquake Tube Shaker/Rotators | Thermo Fischersceintific | 415110 | |
| Dynal MPC-S | Thermo Fischersceintific | A13346 | |
| Vortex mixer | VWR | 12620-848 | |
| Absolute Ethanol | Any company | ||
| 70% Ethanool | Any company | ||
| DNAse free water | Milli Q | ||
| DNA precipitant (3M sodium acetate) | Diagenode | C03030002 | |
| Safe seal 1.5 mL eppendorf tubes | Eppendorf | 4036-3204 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fischersceintific | Q32851 | |
| Qubit 0.5 mL tubes | Thermo Fischersceintific | Q32856 | |
| Qubit | Thermo Fischersceintific | Q32866 | |
| Illumina Hiseq2000 Platform | Illumina | ||
| Water Bath | Grant | ||
| Heat block | grant | ||
| Tube rotater | Labquake |
References
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