Summary
В этой работе описывается оптимизированный протокол секвенирования доменов с меченным CpG-связывающим доменом (MBD) и вычислительный конвейер для идентификации дифференцированных метилированных CpG-богатых областей у пациентов с хронической лимфоцитарной лейкемией (CLL).
Abstract
Роль длинных некодирующих РНК (lncRNAs) в раке выходит на первый план из-за растущего интереса к пониманию их механистических функций при развитии рака и его прогрессировании. Несмотря на это, глобальная эпигенетическая регуляция lncRNAs и повторяющихся последовательностей в раке не была хорошо исследована, особенно при хронической лимфоцитарной лейкемии (CLL). В этом исследовании основное внимание уделяется уникальному подходу: взятие иммунопреципитации двухцепочечных метилированных фрагментов ДНК с использованием белков с метиловым связыванием (MBD) с последующим секвенированием следующего поколения (MBD-seq). В этом исследовании использовались образцы пациентов с ХЛЛ, принадлежащие двум прогностическим подгруппам (5 мутантных образцов ИГВХ + 5 безмолекулярных образцов IGVH). Анализ выявил 5800 гиперметилированных и 12 570 гипометилированных CLL-специфических дифференцированных метилированных генов (cllDMG) по сравнению с нормальными здоровыми контролями. Важно отметить, что эти результаты выявили несколько CLL-специфических, дифференцированных метилированных lncRNAs, reМелкие элементы и белок-кодирующие гены с потенциальной прогностической ценностью. В этой работе описывается подробный протокол для трубопровода MBD-seq и биоинформатики, разработанный для всестороннего анализа глобальных профилей метилирования в богатых CpG областях с использованием образцов пациентов CLL. Наконец, ген, кодирующий белок, и lncRNA были проверены с использованием пиросеквенирования, который является высоко количественным методом для анализа уровней метилирования CpG для дальнейшего подтверждения результатов протокола MBD-seq.
Introduction
Использование технологий последующего секвенирования для анализа глобальных профилей метилирования ДНК в последние годы пользуется все большей популярностью. Анализы метилирования в масштабе всего генома, включая методы на основе микрочипов и не микрочипов, были разработаны на основе следующего: бисульфитная конверсия геномной ДНК, чувствительность к метилированию рестрикционных ферментов и иммунопреципитация метилированной ДНК с использованием метил-CpG-специфических антител ,
Метилирование ДНК аберранта является одним из признаков лейкемии и лимфом, включая хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ). Ранее несколько групп, в том числе наши, характеризовали профили метилирования ДНК различных прогностических подгрупп CLL и нормальные здоровые B-клеточные контрольные группы с использованием бисульфитной конверсии геномной ДНК с последующими методами на основе микро-матрицы или секвенированием цельного генома 1 , 2 , 3 , <Sup class = "xref"> 4. Бисульфитная конверсия геномной ДНК приводит к дезаминированию немодифицированных цитозинов к урацилу, оставляя модифицированные метилированные цитозины в геноме. После преобразования статус метилирования ДНК может быть определен с помощью ПЦР-амплификации и секвенирования с использованием различных количественных или качественных методов, таких как бисульфитное секвенирование на основе микроячейки или цельного генома (WGBS). Хотя методы, основанные на использовании бисульфита, имеют много преимуществ и широко используются в разных типах рака для анализа уровней метилирования ДНК, есть несколько недостатков, связанных с этим методом. Секвенирование WGBS позволяет разрешать однобазовую пару с меньшим количеством ДНК и является наилучшим подходящим вариантом для анализа большого количества образцов. Однако этот метод не позволяет дифференцировать модификации между уровнями 5 мК и 5 hmC в геноме 5 , 6 . Кроме того, методы на основе микрочипов не предлагают полного cИзбыток генома.
В недавнем исследовании из нашей лаборатории 7 методы, основанные на иммунопреципитации, а не конверсия бисульфита, были использованы для идентификации высококонцентрированных, дифференцированных метилированных областей CpG в глобальном масштабе у пациентов с ХЛЛ и нормального здорового контроля. Секвенирование следующего поколения inmethyl-CpG-связывающего домена (MBD) (MBD-seq), обогащение двухцепочечной фрагментированной ДНК зависит от степени метилирования CpG. Этот способ может преодолеть недостатки метода конверсии бисульфита и может также обеспечить общий охват генотипированием CpG в геноме несмещенным и ПЦР-независимым образом. Кроме того, в отличие от методов микрочипов на основе конверсии на основе бисульфита, MBD-seq может использоваться для анализа статуса метилирования повторяющихся элементов, таких как длинные вкрапленные ядерные элементы (LINE), короткие вкрапленные ядерные элементы (SINE), длинные концевые повторы (LTRS) И т.д. Однако по сравнению с методами конверсии бисульфита,Для протокола MBD-seq требуется относительно большое количество входной ДНК. Кроме того, качество чтения последовательности и данные зависят от специфичности, сродства и качества используемых антител.
В настоящем исследовании объясняется подробный протокол MBD-seq для обогащения метилированной ДНК для секвенирования следующего поколения. Он использует коммерческий набор метилированного ДНК-связывающего обогащения ( указанный в Таблице материалов ), а также вычислительный трубопровод для визуализации и интерпретации данных секвенирования метилирования для определения специфичных к ХЛЛ гипер- и гипометилированных областей по сравнению с нормальным здоровым контролем. В принципе, этот метод использует способность MBD взаимодействия человеческого белка MBD2 с метилированными CpG для экстракции ДНК, обогащенной метилированными CpG, и за этим следует высокопроизводительное секвенирование метилированной ДНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этическое утверждение для сбора образцов ХЛЛ осуществляется с 2007-05-21, со следующим регистрационным номером: EPN Gbg dnr 239/07. Все пациенты с ХЛЛ были диагностированы в соответствии с недавно пересмотренными критериями 8 , и образцы были собраны во время диагностики. Пациенты в исследовании были включены из разных отделений гематологии в западной части Швеции после получения письменного согласия. В этом исследовании были отобраны только образцы мононуклеарных клеток CLL периферической крови (PBMC) с процентным содержанием опухолей лейкемических клеток ≥70%.
1. Препараты
- Выделите РВМС для экстракции ДНК из ХЛЛ и нормальных здоровых образцов периферической крови с использованием коммерческого изоляционного набора (см. Таблицу материалов ) в соответствии с инструкциями производителя.
- Автоклав 1,5 мл пробирки. Оттепель всех реагентов в наборе связывания с метилированной ДНК (см. Таблицу материалов ). </ Li>
- Используйте воду, не содержащую ДНКазы, для приготовления 10 мл 1-кратного буфера для промывки шариков из 5-кратного буфера для промывки буфером, поставляемого комплектом для промывки гранул и разбавления белка MBD, поставляемого комплектом.
- Получите или подготовьте следующие предметы заранее: 3 М ацетата натрия, абсолютного этанола и 70% этанола для осаждения ДНК ( Таблица материалов ).
2. Извлечение геномной ДНК и ультразвуковое исследование
- Используйте коммерчески доступный набор для извлечения ДНК ( Таблица материалов ) для выделения геномной ДНК у пациентов и обычных образцов РВМС в соответствии с протоколом изготовителя. Количественное определение геномной ДНК с использованием спектрофотометра при 260 нм.
ПРИМЕЧАНИЕ. Емкость экстракции ДНК составляет 5-6 миллионов клеток, максимальная; Следовательно, важно использовать более одного столбца для образцов с более чем 5 миллионами ячеек. Элюируйте ДНК дважды в равных объемах, составляя 100 мкл 10 мМ буфера Tris EDTA (TE). Белок MBD-биотин, используемый в метильномМайнер для секвенирования MBD не будет связываться с одноцепочечной ДНК. Таким образом, очень важно сохранить элюированную ДНК либо замороженной, либо при 4 ° C, чтобы сохранить ее двухцепочечную природу. - Развести 5 мкг геномной ДНК из каждого образца до 200 мкл, используя TE-буфер (pH 8), получая конечную концентрацию 25 нг / мкл.
- Выполняйте обработку ультразвуком в специально разработанных трубах с использованием ультразвукового аппарата ( Таблица материалов ) в течение 30 циклов (30 с и 30 с за каждый цикл, через каждые 5 циклов кратковременно откручивайте трубки, чтобы собрать образцы на дно).
ПРИМЕЧАНИЕ. Это приведет к фрагментированной ДНК в диапазоне от 150 до 300 п.о., что является оптимальным для этого протокола. - Проверьте диапазон обработки ультразвука для всех образцов перед тем, как перейти к следующему этапу секвенирования MBD, запустив 1 мкл фрагментированных образцов ДНК и лестницу с размером ДНК на коммерчески доступном, предварительно отлитом 2% агарозном геле с использованием оборудования для получения изображений с использованием электрофореза ДНК. Визуализировать tОн ДНК с использованием стандартного ультрафиолетового трансиллюминатора.
3. Подготовка бисера до связывания с белком MBD-биотина
- Ресуспендируют магнитные стрептавидиновые гранулы из пробирки, поставляемой комплектом, осторожно пипетируют вверх и вниз для получения гомогенной суспензии. Не встряхивайте бусинки или не дайте им высохнуть.
- Поместите 50 мкл шариков (для каждого 5 мкг фрагментированного образца ДНК) в отдельные, чистые и меченые пробирки объемом 1,5 мл. Добавьте 50 мкл 1x буфера для промывки бусинок, чтобы достичь конечного объема 100 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ. При использовании небольших полосок полимеразной цепной реакции (ПЦР) 0,5 мл для промывочных гранул используется около 150-200 мкл промывочного буфера на пробирку, как указано в протоколе набора. Однако в случае 1,5 мл пробирок добавьте по меньшей мере 250 мкл до 300 мкл промывочного буфера на пробирку для промывки борта. - Поместите трубки на магнитную подставку в течение одной минуты, чтобы все магнитные шарики могли концентрироваться на внутренней стенке трубкиПеред магнитом. Удалите жидкость, не касаясь бусинок, используя пипетку 200 мкл.
- Удалите трубки с магнитной подставки, добавьте 250 мкл 1x буфера для промывки бусинок и осторожно смешайте бусины с пипеткой.
- Повторите шаги 3.3 и 3.4 по крайней мере 4-5 раз для всех образцов и, наконец, повторно суспендируйте в 250 мкл 1-кратного буфера для промывки шариков. Держите их на льду.
4. Связывание белка MBD-биотина с промытыми шариками
- Добавить 35 мкл белка MBD (7 мкл для 1 мкг образца ДНК) для разделения пробирок и довести общий объем до 250 мкл с использованием 1-кратного буфера для промывки шариков.
- Добавить 250 мкл разбавленного белка MBD в 250 мкл промытых гранул и оставить их при сквозном вращении при комнатной температуре в течение 1 часа.
- После смешивания шариков и белка в течение 1 часа промывают биотин белка MBD, связанный с магнитными гранулами стрептавидина.
- Поместите трубки на магнитную подставку в течение 1 минуты и удалите tОн жидкий, не касаясь бусинок, используя пипетку. Добавьте 250 мкл 1-кратного буфера для промывки буфера и поместите трубки на вращающийся смеситель в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Повторите шаг 4.3.1 еще два раза и, наконец, повторно суспендируйте промытые гранулы MBD-биотина в 200 мкл 1-кратного буфера для промывки шариков, делая шарики готовыми для захвата метилированной ДНК.
ПРИМЕЧАНИЕ. Промывка 2-3 раза таким образом удаляет все фоновые несвязанные буферы MBD и улучшает эффективное связывание буферов, связанных с белком MBD, с фрагментированной геномной ДНК.
5. Связывание буферов MBD-биотина с фрагментированной геномной ДНК
- В чистую 1,5-миллилитровую трубку без ДНКазы добавьте 100 мкл 5-кратного буфера для промывки шариков и 180 мкл фрагментированной геномной ДНК (шаг 2.3). Довести конечный объем до 500 мкл, используя воду, свободную от ДНКазы.
- Добавьте 380 мкл воды, не содержащей ДНКазы, в оставшиеся 20 мкл фрагментированной геномной ДНК и заморозите их. Используйте эти образцы в качестве входного DNКонтролирует и осаждает их позже вместе с конечными элюированными образцами метилированной ДНК (см. Шаг 7.1).
- Поместите пробирки, содержащие промытые гранулы MBD-биотина (шаг 4.4), на магнитную подставку в течение 1 мин и удалите жидкость, не нарушая шарики. Добавить 500 мкл фрагментированной геномной ДНК, разведенной в буфере для промывки бусинок.
- Уплотните все трубки плотно с помощью парафиновой пленки и оставьте их на ночь при 4 ° C на сквозной стойке вращения со скоростью 8-10 об / мин.
ПРИМЕЧАНИЕ. Реакцию связывания ДНК и биотина с шариком можно проводить в течение 1 часа при комнатной температуре, но оставляя ее при 4 ° С в течение ночи, можно улучшить извлечение конечной метилированной ДНК.
6. Удаление несвязанной ДНК и элюирование метилированной ДНК из бусин
- После реакции связывания ДНК и MBD-шарика поместите трубки на магнитную стойку в течение 1 мин, чтобы сконцентрировать все шарики на внутренней стенке трубки.
- Удалите супернатантную жидкость с помощью пипетки, не касаясьБисер и сохранить эту несвязанную фракцию ДНК на льду.
- Добавьте 200 мкл 1x буфера для промывки шариков в гранулы и поместите трубки на вращающуюся подставку в течение 3 минут при комнатной температуре. Поместите трубки на магнитную подставку и удалите жидкость. Повторите промывку еще два раза, чтобы удалить остаточную несвязанную ДНК.
- После окончательной промывки добавьте 200 мкл буфера для элюирования с высокой солью (2000 мМ NaCl), предоставленного в комплекте для элюирования ДНК.
- Поместите трубки на вращающуюся подставку в течение 15 минут при комнатной температуре. Поместите их на магнитную подставку в течение 1 минуты и используйте пипетку, чтобы тщательно перенести супернатант на новую, чистую 1,5-мл пробирку.
- Добавьте 200 мкл буфера элюирования с высокой солью и повторите элюирование, повернув трубки при комнатной температуре в течение 15 мин. Добавьте второй элюент в ту же самую трубу, содержащую 200 мкл первого элюата.
ПРИМЕЧАНИЕ. Окончательные 400 мкл общей элюированной ДНК теперь готовы к осаждению этанолом для извлечения очищенногоДНК, подходящая для секвенирования следующего поколения.
7. Осаждение этанола и обогащение метилированной ДНК
- Добавьте 1 мкл гликогена (20 мкг / мкл, включенный в комплект); 40 мкл 3 М ацетата натрия, рН 5,2; И 800 мкл ледяного абсолютного этанола до 400 мкл элюированной ДНК, а также 400 мкл образцов входной ДНК, приготовленных на этапе 5.2.
- Хорошо перемешайте пробирки путем встряхивания и инкубируйте их при -80 ° C в течение ночи.
- Центрифугируйте пробирки при 12000 xg (максимальная скорость) и 4 ° C. Сбросьте супернатант осторожно, не нарушая осадок, добавьте 500 мкл 70% этанола и прокрутите пробирки.
- Центрифугируйте снова с максимальной скоростью в течение 15 минут при 4 ° C и удалите супернатант осторожно, используя пипетку. Центрифугируйте трубки на максимальной скорости в течение 1 мин при комнатной температуре и полностью удалите остаточный этанол с помощью наконечника пипетки.
- Высушить на воздухе гранулу в течение 5 мин при комнатной температуреrature. Добавьте 10 мкл воды без ДНКазы в ДНК-таблетку. Перейдем к количественной оценке метилированной ДНК (этап 7.6), последовательности MBD (этап 7.7) и анализу (разделы 8 и 9).
- Количественное определение конечных извлеченных образцов метилированной ДНК с использованием коммерчески доступного комплекта флуорометрического количественного определения (см. Таблицу материалов ) в соответствии с инструкциями производителя.
- Примечание. Используя этот протокол, из каждого образца извлекали 30-50 нг конечной ДНК. Образцы ДНК готовы отправить на сухой лед для последующей сборки библиотеки и высокопроизводительной последовательности MBD
- Выполните построение библиотеки ДНК и высокопроизводительное MBD-секвенирование с использованием коммерческой платформы ( Таблица материалов ), как описано в ссылке 9 .
ПРИМЕЧАНИЕ. Для первоначального контроля качества конечной метилированной ДНК выполните библиотечные препараты с использованием парного конца 50 п.о. для всех образцов. Обработать необработанные данные для контроля качества после секвенирования,Разработанной на этапе 8.1, и далее обрабатывают его с использованием подходов биоинформатики и статистических методов, как описано ниже (шаги 8.2-9.6).
8. Метод анализа биоинформатики 1: Определение ассоциированных с ХЛЛ дифференциально метилированных областей (cllDMR)
- Очистите полученные 49-бит чтения (формат FASTQ) для адаптеров с использованием доступных инструментов контроля качества, таких как Trimmomatic 10 или Cutadapt. Перепроверьте качество обрезанных чтений с помощью инструментария FastQC:
Java -jar trimmomatic.jar SE SAMPLE_uncleaned.fastq SAMPLE.fastq ILLUMINACLIP: adapters.fasta: 2: 30: 10 - Совместите очищенные файлы FASTQ с кратковременным считывателем генома Bowtie против эталонного генома 11 . Задайте параметры, как показано ниже:
- Разрешить до двух несоответствий (параметр Bowtie: -v 2).
- Ограничьте отчетность шестью лучшими выравниваниями на чтение (параметр Боути: -m 6) для управленияДля чтения с несколькими картами.
Bowtie -v 2 -a -m 6 HG19_INDEX -S SAMPLE.fastq> SAMPLE.sam
ПРИМЕЧАНИЕ. Преобразование SAM-файлов, сгенерированных для отдельных образцов, после выравнивания в BAM с использованием SAMtools.
Просмотр samtools -bS -o SAMPLE.bam SAMPLE.sam
- Используйте модельный анализ пикового звонка ChIP-Seq (MACS) на выровненных образцах (BAM) для прогнозирования обогащенных / метилированных областей из подгрупп 12 CLL.
ПРИМЕЧАНИЕ. Сравнение I: используйте образец ввода в качестве контрольной группы, а также образцы пациентов с нормальным и CLL в качестве групп лечения. Этот шаг должен собрать все отрицательные пики (пики, обогащенные Input / background). Сравнение II: Используйте группу образцов «Нормальная» в качестве группы контроля и группу образцов пациентов с ХЛЛ в качестве группы лечения. Полученные положительные пики являются гиперметилированными областями ХЛЛ, а отрицательные пики представляют собой гипометилированные области ХЛЛ над нормальными или дифференцированными метилированными областями (ПМР).
macs14 -t SAMPLE_TREATMENT.bam -c SAMPLE_CONTROL.bam --format BAM -g hs - Удалите сравнительные фоновые пики из дифференцированных метилированных областей (DMR) с использованием BEDtools 13 .
Bedtools subtract -a <CLL_enriched_regions> -b <Input_enriched_regions> - Прогнозируйте процент повторяющихся элементов (SINE-Alu, LINE и т. Д.), Обогащенных DMR.
- Используйте fastacmd для извлечения последовательности FASTA из DMR по хромосомным координатам из эталонного генома HG19.
Fastacmd -d HG19_genome.fa -s Chromosome -L Start, End -l 50000> DMRs.fasta - Используйте инструмент командной строки RepeatMasker для прогнозирования процента повторяющихся элементов, присутствующих в последовательности FASTA DMR.
RepeatMasker -gc -gccalc -s -species human -html DMRs.fasta
- Используйте fastacmd для извлечения последовательности FASTA из DMR по хромосомным координатам из эталонного генома HG19.
- Аннотировать предсказанные DMR с помощью Homer «annotatePeaks.pl» с доступным Ensembl [PMC4919035] oR Gencode [PMID 22955987] аннотации транскрипта (кодирующие белок и некодирующие транскрипты).
AnnotatePeaks.pl DMRs.bed <GENOME> -gtf <Ensembl или Gencode GTF>
ПРИМЕЧАНИЕ. Это дает информацию о распределении пиков по разным гениальным регионам ( т. Е. Промотору, экзону, интрону, 3 'UTR и 5' UTR) и межгенным регионам. Транскрипты или гены, связанные с DMR, называются дифференцированными метилированными генами (DMG). - Используйте инструмент обогащения с обновленной или текущей функциональной базой данных, чтобы найти функции, обогащенные CLL DMG (только белок-кодирующие гены) 14 .
ПРИМЕЧАНИЕ. Кластеризация генных наборов на основе функциональной аннотации (GeneSCF) 14 представляет собой инструмент для функционального анализа обогащения, основанный на реальном времени, который использует обновленную KEGG и Gene Ontology в качестве справочной базы данных.
9. Метод биоинформатики. Метод 2. Определение ассоциированного с ХЛЛ значительного разломаЭтерифицированные Метилированные области (cll sigDMR)
- Выполните шаги 8.1-8.5 из метода I (раздел 8) и используйте анализ дифференциального обогащения на основе чтения, используя доступные инструменты, как это было описано в шагах 9.2-9.6, чтобы добавить еще один уровень статистики в конвейер анализа.
- Определите количество считываний, сопоставленных с отдельными пиками или DMR в образцах пациентов Normal и CLL, используя «featureCounts» из пакета «Subread» 15 .
Subread / bin / featureCounts -Q 30 -F SAF -a DMRs.SAF -o DMRs_counts.table SAMPLE_TREATMENT.bam SAMPLE_CONTROL.bam
ПРИМЕЧАНИЕ. Может быть введен фильтр качества отображения, чтобы избежать количественного определения недостоверных чтений ( например, -Q 30). Для этого шага подготовьте файлы SAF для полученных DMR. Для получения дополнительной информации о формате файла SAF, пожалуйста, используйте эту ссылку http://bioinf.wehi.edu.au/featureCounts/. - Используйте таблицу отсчета чтения RAW, содержащую количество чтений для отдельных пиков в Normal иD групп образцов пациентов CLL в edgeR в качестве входного сигнала 16 .
ПРИМЕЧАНИЕ. Сравните обычные группы образцов пациентов с CLL, чтобы найти sigDMR. Для анализа дифференциального обогащения следуйте руководству от edgeR для подробных пошаговых инструкций (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf). - Отфильтруйте sigDMR с использованием скорости ложного обнаружения (FDR) и изменения логарифмической шкалы, предсказанной edgeR 16 .
- Аннотируйте предсказанные sigDMR с использованием Homer «annotatePeaks.pl» с доступной аннотацией ансамбля Ensembl или Gencode (кодирующие белок и некодирующие транскрипты).
AnnotatePeaks.pl sigDMRs.bed HG19_genome.fa -gtf <Ensembl или Gencode GTF> -CpG
ПРИМЕЧАНИЕ. Это дает информацию о распределении пиков по разным гениальным регионам ( т. Е. Промотору, экзону, интрону, 3 'UTR и 5' UTR) и межгенным регионам. Транскрипты или гены, связанные с siGDMR называются sigDMG. - Используйте инструмент обогащения с обновленной или текущей функциональной базой данных, чтобы найти функции, обогащенные CLL sigDMG (только белок-кодирующие гены) 14 .
ПРИМЕЧАНИЕ. GeneSCF, один из инструментов реального времени для анализа функционального обогащения, использует KEGG и Gene Ontology в качестве справочных баз данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MBD-seq недавно был проведен на пациентах с ХЛЛ и соответствовал нормальным здоровым элементам управления, чтобы идентифицировать дифференцированные ХЛЛ дифференциально гипер- и гипометилированные гены. Экспериментальный и биоинформационный трубопровод, используемый для анализа данных, полученных из CLL и нормальных здоровых образцов, показан на рисунках 1A и 1B . Эти анализы выявили несколько специфически дифференцированных CLL-специфичных областей (cllDMR), которые были значительно гипер / гипометилированы из IGHV-мутированных и IGHV-немутированных образцов по сравнению с контрольными образцами с p-значением <0,00001. На рисунке 2A показаны все cllDMR, полученные как из нормального B-ячейки, так и для нормального сравнения PMBC. Все cllDMR были сопоставлены с различными классами белок-кодирующих и некодирующих генов, как показано на рисунке 2B . Важно отметить, что в этом анализе сравнения былиНезависимо друг от друга между образцами пациентов с ХЛЛ, с двумя различными нормальными элементами управления, сортированными В-клетками и ПМБК. Интересно, что анализ привел к большому перекрытию общих CLL-специфически дифференцированных метилированных генов (cllDMG, 851 гиперметилированных и 2061 гипометилированных) по сравнению с обычными контрольными элементами B-клеток и нормальными контрольными образцами PBMC ( рисунок 2C ), что указывает на то, что эти cllDMG могут быть Возможные гены подписи CLL со значительными ролями в патогенезе болезни. Для усиления анализируемых данных были проверены несколько сайтов CpG, расположенных в одном гиперметилированном белковом кодирующем гене, SKOR1 и одна гипометилированная длинная некодирующая lncRNA, AC012065.7 , с использованием метода пиросеквенирования, как описано в ранних публикациях 7 , 17 , 18 ( фиг. 3A И B ). На рисунке 4 показана разрушенная ДНКПосле протокола обработки ультразвуком. Фрагментированная ДНК составляет от 150 до 300 пар оснований, что делает ее идеальной для секвенирования.
Рисунок 1: Обзор рабочего потока, используемого в этом исследовании. Эта цифра, полученная из нашей недавней публикации 7 , показывает схему общего анализа, используемого для идентификации дифференцированных метилированных областей (DMR) в образцах пациентов с хронической лимфоцитарной лейкемией (CLL). ( A ) Экспериментальная конструкция обогащения метилированной ДНК на основе MBD. ( B ) Контур анализа биоинформатики, используемый для идентификации специфически дифференцированных метилированных областей CLL (cllDMR). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Гиперметилированные и гиполиметилированные cllDMRs и cllDMG образцов пациентов с ХЛЛ по сравнению с нормальными, здоровыми, сортированными В-клетками. ( A ) Все хронические лимфоцитарные лейкозы (ХЛЛ) -связанные дифференцированные метилированные области со значительными p-значениями (<0,00001), полученные путем сравнения мутантных IGHV и -унтутированных образцов CLL с обычными сортированными В-клетками (верхняя панель) и обычными образцами PBMC (Нижняя панель). Обогащения, показанные в тепловой карте, находились в пределах ± 3-kb окна из дифференциально-метилированной области (DMR). ( Б ) диаграмма Венна, показывающая перекрытие специфических к CLL дифференцированных метилированных генов (cllDMG, гиперметилированных и гипометилированных) между IGHV-мутированными и IGHV-немутированными группами. Круговая диаграмма представляет процент генов, относящихся к разной классификации, таких как кодирование белков, Длинная некодирующая РНК (lncRNA), псевдоген, антисмысловая и другие некодирующие РНК. ( В ) диаграмма Венна, показывающая перекрытие общих дифференцированных метилированных генов (IGHV-мутированных и IGHV-немотализованных прогностических групп) между сравнениями В-клеток и РВМС. На левой панели диаграммы Венна показано перекрытие гиперметилизированных генов и правая панель для гипометилированных генов. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Валидация статуса метилирования ДНК для отдельных сайтов CpG на выбранных сильно дифференцированных метилированных генах-мишенях. Данные о подрыве для количественной оценки процента метилирования ДНК для двух выбранных генов с использованием независимой хронической лимфоцитыIc лейкемия (CLL), содержащая 54 образца и 6 нормальных, здоровых, сопоставимых по возрасту образцов В-клеток. ( A ) Ячейки представляют процент уровней метилирования для 3 отдельных сайтов CpG гиперметилированного гена SKOR1 с использованием пиросеквенирования. ( B ) Коробка показывает степень метилирования для 5 отдельных сайтов CpG гипометилированного гена AC012065.7 с использованием пиросеквенирования. Коробки показывают межквартильный диапазон (25-75%), а внутренняя горизонтальная линия указывает медианное значение. Усы представляют собой минимальные и максимальные значения. Р-значение, соответствующее степени дифференцированного метилирования образцов ХЛЛ над нормальными В-клетками, показано в ящиках для каждого отдельного сайта CpG. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MBD-seq является экономически эффективным методом иммунопреципитации, который может быть использован для изучения образцов метилирования с полным охватом генома. И MeDIP seq (метилированная ДНК-иммунопреципитация с последующим секвенированием), и MBD-seq приводят к обогащению обогащенной CpG-метилированной ДНК. Однако MBD-seq демонстрирует большее сродство к связыванию с богатыми CpG-областями по сравнению с MeDIP seq 19 . Используя набор для обогащения метиловым связыванием, можно фракционировать ДНК в высококонцентрированные CpG- и низко-CpG-области, элюируя ДНК с помощью высокосолевых и низкосолевых буферов соответственно. В этом исследовании было проведено только однократное элюирование для захвата высокообогащенных CpG-богатых областей, покрывающих большую часть островов CpG.
MBD-seq может быть мощной альтернативой WGBS, которая обычно используется в исследованиях CLL и других лейкозов. Несмотря на то, что MBD-seq требует относительно более высокого количества входной ДНК по сравнению с бисульфитомОснованные на конверсиях, он позволяет исследовать глобальные изменения метилирования, которые являются специфическими только для модификаций 5 мК, без какого-либо смещения амплификации ПЦР, созданного после преобразования. Таким образом, MBD-seq является идеальным методом для решения проблемы cllDMG, которые могут быть потенциальными генами сигнатур CLL на основе эпигенетики с прогностическим значением.
Важнейшими факторами для выполнения этого метода являются качество и диапазон обработки ультразвука фрагментированной ДНК, использованной до реакции связывания. Все образцы показали более короткие интервалы фрагментов, между 150 и 300 п.о. ( рисунок 4 ), что привело к результатам качественного секвенирования, причем около 25-33 миллионов уникальных чтений для каждого сопоставления образцов в геноме после фильтрации и очистки данных.
Наконец, метилирующий статус гипер- и гипометилированных cllDMGs был проверен для нескольких генов с использованием метода пиросеквенирования в независимой когорте образцов. Этот метод дает представлениеВ зависимости от соотношения C-to-T в отдельных CpG-сайтах в зависимости от количества С и Т, введенного во время расширения последовательности. Гиперметилированные cllDMG показали высокие проценты метилирования в образцах ХЛЛ по сравнению с нормальными образцами. Аналогично, гипометилированные cllDMG показали противоположное. Данные Pyrosequencing для двух cllDMG показаны на рисунке 3 .
По сравнению с методами на основе массивов этот метод позволяет более широко исследовать последовательности по всему геному, включая ранее аннотированные области, охватывающие регионы, кодирующие белок, и не аннотированные последовательности, охватывающие повторяющиеся элементы и lncRNAs. Таким образом, этот подход у пациентов с ХЛЛ выявил несколько новых cllDMG, охватывающих lncRNAs и повторяющиеся элементы. Поскольку эти исследования ранее не проводились в образцах пациентов с ХЛЛ, это исследование служит ценным ресурсом для идентификации дифференцированных метилированных областей, связанных с ХЛЛ, вРазные прогностические подгруппы. Эти cllDMG будут служить в качестве новых биомаркеров и мишеней для эпигенетической лекарственной терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Шведским исследовательским советом, Шведским онкологическим обществом, Фондом Кнут и Алисой Валленбергом (KAW) и FoU VästraGötalandsregionen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dneasy Blood and tissue kit | Qaigen | 69504 | |
| Lymphoprep solution | A X I S-S H I E L D | 1114544 | |
| Nano drop 2000 | Thermo Fischersceintific | ||
| TE buffer pH 8 | Sigma aldrich | 93283 | |
| Bioruptor standard sonication device | Diagenode | UCD-200 | |
| TPX bioruptor tubes 1.5 mL | Diagenode | C30010010-300 | |
| 3 M Sodium acetate | Diagenode | C03030002 | |
| E-gel iBase safe imager combo kit | Thermo Fischersceintific | G6465EU | |
| E-gel 2% Agarose gels | Thermo Fischersceintific | G441002 | |
| Methylminer Methylated DNA enrichment kit | Thermo Fischersceintific | ME10025 | |
| Labquake Tube Shaker/Rotators | Thermo Fischersceintific | 415110 | |
| Dynal MPC-S | Thermo Fischersceintific | A13346 | |
| Vortex mixer | VWR | 12620-848 | |
| Absolute Ethanol | Any company | ||
| 70% Ethanool | Any company | ||
| DNAse free water | Milli Q | ||
| DNA precipitant (3M sodium acetate) | Diagenode | C03030002 | |
| Safe seal 1.5 mL eppendorf tubes | Eppendorf | 4036-3204 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fischersceintific | Q32851 | |
| Qubit 0.5 mL tubes | Thermo Fischersceintific | Q32856 | |
| Qubit | Thermo Fischersceintific | Q32866 | |
| Illumina Hiseq2000 Platform | Illumina | ||
| Water Bath | Grant | ||
| Heat block | grant | ||
| Tube rotater | Labquake |
References
- Kanduri, M., et al. Differential genome-wide array-based methylation profiles in prognostic subsets of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 115 (2), 296-305 (2010).
- Cahill, N., et al. 450K-array analysis of chronic lymphocytic leukemia cells reveals global DNA methylation to be relatively stable over time and similar in resting and proliferative compartments. Leukemia. 27 (1), 150-158 (2013).
- Kanduri, M., et al. Distinct transcriptional control in major immunogenetic subsets of chronic lymphocytic leukemia exhibiting subset-biased global DNA methylation profiles. Epigenetics. 7 (12), 1435-1442 (2012).
- Kulis, M., et al. Epigenomic analysis detects widespread gene-body DNA hypomethylation in chronic lymphocytic leukemia. Nat Genet. 44 (11), 1236-1242 (2012).
- Booth, M. J., et al. Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution. Science. 336 (6083), 934-937 (2012).
- Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149 (6), 1368-1380 (2012).
- Subhash, S., Andersson, P. O., Kosalai, S. T., Kanduri, C., Kanduri, M. Global DNA methylation profiling reveals new insights into epigenetically deregulated protein coding and long noncoding RNAs in CLL. Clin Epigenetics. 8, 106 (2016).
- Hallek, M., et al. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute-Working Group 1996 guidelines. Blood. 111 (12), 5446-5456 (2008).
- De Meyer, T., et al. Quality evaluation of methyl binding domain based kits for enrichment DNA-methylation sequencing. PLoS One. 8 (3), e59068 (2013).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Subhash, S., Kanduri, C. GeneSCF: a real-time based functional enrichment tool with support for multiple organisms. BMC Bioinformatics. 17 (1), 365 (2016).
- Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Martinelli, S., et al. ANGPT2 promoter methylation is strongly associated with gene expression and prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Epigenetics. 8 (7), 720-729 (2013).
- Kopparapu, P. K., et al. Epigenetic silencing of miR-26A1 in chronic lymphocytic leukemia and mantle cell lymphoma: Impact on EZH2 expression. Epigenetics. 11 (5), 335-343 (2016).
- Robinson, M. D., et al. Evaluation of affinity-based genome-wide DNA methylation data: effects of CpG density, amplification bias, and copy number variation. Genome Res. 20 (12), 1719-1729 (2010).
