Summary
この研究は、顕微鏡観察のための全マウント組織調製に続く、乳房脂肪パッド移植による血管内皮幹細胞（VESC）の増殖、分化および血管形成能を評価するための新規アプローチを実証する。 インビボでのVESCの挙動を調べる系統的な追跡戦略も提示される。
Abstract
内皮細胞（EC）は、血管構造の基本的な構築ブロックであり、適切な血管発達およびホメオスタシスを確実にするための血管成長およびリモデリングを媒介する。しかしながら、内皮系統の階層に関する研究は、アクセスを獲得し、インビボでのその行動を直接評価するためのツールがないため、依然として分かり難い。この欠点に対処するために、乳房脂肪パッドを用いて血管新生を研究するための新しい組織モデルが開発されている。乳腺は主に、思春期および妊娠を含む出生後の段階で発症し、その間に堅牢な上皮増殖が広範囲の血管リモデリングを伴う。乳房脂肪パッドは、成長する乳房上皮からの空間、マトリックス、および豊富な血管形成刺激を提供する。さらに、乳房脂肪パッドは、腹膜腔の外側に位置し、外因性細胞の血管新生能を評価するための容易に接近可能な移植部位となる。この作品はまた、効率インビボで血管内皮幹細胞（VESC）の標的とされた集団を特異的に標識するために蛍光レポーターマウスを用いるntトレースアプローチ。この系譜追跡法は、その後の組織全面顕微鏡法と組み合わせて、標的細胞およびその子孫の直接的な可視化を可能にし、増殖能力を定量化し、分化のコミットメントを運命マッピングすることができる。これらの方法を用いて、VESCを発現する二重性プロテインCレセプター（Procr）の集団が最近、複数の血管系において同定されている。新たなECおよび周皮細胞の両方を生じるProcr + VESCは、発生、ホメオスタシス、および傷害修復の間に血管新生に積極的に寄与する。全体として、この原稿は、VESCsの幹細胞特性を評価するために使用することができる新しい乳房脂肪パッド移植およびインビボ系譜追跡技術を記載している。
Introduction
発生およびホメオスタシスの間、血管の成長およびリモデリングは、臓器の成長および修復に従って忠実に起こる。血管新生は、既存の血管からの新しい血管の発生を説明し、これらの動的な血管変化を媒介する主要な力とみなされる。各血管は内皮細胞（EC）の層で内張りされており、血管構造の基礎と思われる。長い間、恒常性の間にECプールが補充されるメカニズムは依然として不明であり、血管代謝回転が成熟EC増殖の結果であるか、または血管幹/前駆細胞活性の寄与であるかについて議論がなされた。直接の生理学的証拠の欠如のために、血管内皮幹細胞（VESC）の存在および細胞の同一性もまた議論の余地があった。
幹細胞の行動を確認するために使用される最も一般的なアプローチの1つは、移植計画推定上の幹細胞のレシピエントマウスへの導入。この方法は、 インビボで候補幹細胞の幹細胞の可能性を測定する。移植は、骨髄幹細胞1の研究に最初に適用され、これは造血系2の階層的特徴の確立に寄与した。内皮の分野では、側面皮膚の下に皮下に挿入された基底膜マトリックス（ 例えば、マトリゲル）プラグは、移植されたECの血管形成能力に対処するために使用される標準的なin vivo血管形成アッセイであった。 3D培養系及び移植におけるコロニー形成を含む、複数の実験方法は、潜在的なEC前駆/ VESC集団3、4、5、6を示唆しています。しかし、基底膜マトリックスに埋め込まれたECは、これは、移植された細胞の血管形成能を完全に探索するのに必要な最適なニッチ環境を提供しない。その結果、マトリックスプラグ内に形成された血管は、主に毛細管様であり、機能的に測定不可能である。
乳腺は出生後に発達し、最も堅牢な成長が思春期および妊娠中に起こる。思春期段階では、乳房上皮は急速に拡大し、周囲の血管構造の効率的なリモデリングを伴う乳房脂肪パッド全体を占有する。したがって、乳腺は、血管新生の研究のための優れたモデルを提供する。これは、成長する乳房上皮からの空間、マトリックス、および豊富な血管新生刺激を提供し、したがって、外因性細胞の血管新生能力を評価するための理想的な移植部位である。さらに、乳房脂肪パッドは、形成された外因性血管を宿主循環系と統合することを可能にし、さらなるf皮下移植に対する優位性を表す。
インビトロ培養および移植アッセイは、細胞集団の再生特性を調べるのに有効な方法であるが、そのようなアッセイは、細胞がそれらの天然生息地から取り除かれるにつれて可塑性を刺激することがあり、細胞が切断されると彼らの生理的環境7 。したがって、細胞運命の直接インビボ証拠を得ることは、内皮集団の行動の現在の理解を進めるための重要なアプローチである。
VESCの同定および身体系におけるそれらの特性の調査のためには、生理学的状況におけるインビボでの幹細胞の挙動を明らかにすることができるため、遺伝的運命マッピング（ すなわち、インビボ系譜の追跡）が不可欠であり、実際の幹細胞は、評価される。リネージュtraci候補VESCの長期持続（ すなわち、自己再生）および起源組織（ すなわち、分化能力）のための細胞型を産生するそれらの能力の直接的な証拠を提供する。
このプロトコルは、VESCの血管発生能力を観察するための新規の乳房脂肪パッド移植技術および系譜追跡方法を記載する。これらの技術は、現在利用可能なアッセイの欠点を克服し、VESCの幹細胞特性を最適に評価する新しい方法を提供する。これらのアプローチは、内皮集団の挙動および血管形成特性を評価し、病理学的環境内の血管細胞効力変化を決定するために使用できる効率的なツールである。
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Protocol
実験手順は、承認されたプロトコールSIBCB-NAF-15-002-S335-003の下で、上海生化学および細胞生物学研究所の中国科学アカデミーのアニマルケアおよび使用委員会によって承認された。
1.マウス乳腺からのVESCの単離
- 乳腺の収穫および組織消化。
- 組織ドナーとして、8週齢のアクチン-GFP成熟処女レポーターマウスを使用し、体重範囲は20〜25gです。
注：ドナーから由来する細胞は、GFP発現によって容易に追跡することができる。 - RPMI1640中の5％ウシ胎仔血清（FBS）、1％ペン/ストレプ、および25mM HEPESからなる組織消化基礎培地を調製する。この混合物を0.22μmのフィルターで濾過し、滅菌し、これを水浴中で37℃に予熱する。
- CO 2チャンバー内でマウスを犠牲にする。最初に垂直の皮膚を作ることによって、第4の鼠径乳腺の対を解剖する。メスを使用して下腹部の正中線（または外科用ハサミ）でncision。静かに片側に皮を剥がし、鉗子を使って鼠径乳腺を露出させます。両側から4番目の鼠径乳腺を得、はさみを用いて6cmのペトリ皿で細かく切る。
- 細かい組織の総重量を測定し、それを50 mLチューブに入れます。
注：得られた組織の切れ端が、各部分のサイズが1 mm 3未満であることを確認してください。典型的な収量は、1匹あたり約5,000のVESCである。
- 細かい組織の総重量を測定し、それを50 mLチューブに入れます。
- 50mLの蓋をした遠心分離管内の消化基礎培地を組織1g当たり10mLの容量で調製する。消化緩衝液を構成するために、消化ベース培地10mL当たり300単位の濃度でコラゲナーゼタイプ3を添加する。均等に混合し、それを組織ミンスに加える。
- 水平に50 mL遠心チューブをロッキングプラットフォームに置き、速度を100 rpmに、温度を37℃に設定します。かき混ぜる乳房組織を2時間インキュベートする。適切な消化を確実にするためにチューブを20分ごとに点検し、手で振る。
注：FACSに先立つ組織消化の目的は、固形細胞から単一細胞溶液を調製することです。したがって、消化の終わりまでに、内容物は目に見える組織片なしで濃厚な溶液でなければならない。
- 組織ドナーとして、8週齢のアクチン-GFP成熟処女レポーターマウスを使用し、体重範囲は20〜25gです。
- 単一細胞溶液調製。
- 消化後、予め加温した滅菌PBSを含む50mL遠心分離チューブを補充し、均一に混合するようにチューブを逆さにします。チューブを200×gで5分間遠心分離し、細胞ペレットを得る。
- 上清を除去し、チューブの底を軽くたたいて細胞ペレットを緩めます。 3 mLの赤血球溶解バッファー（材料表を参照）を加え、室温（RT）で組織培養フード内で5分間インキュベートして、赤血球を除去する。
- 10mLの滅菌PBSを加え、均等に混合するようにチューブを逆さにする。組織の内容物を200 xgで5分間遠心分離し、ディスク上清を回収する。あらかじめ加温した0.05％トリプシン3 mLを添加し、37℃で5分間保存して残りの組織をさらに消化する。
- 3mLの予熱したIMDMを添加し、次に100μLのDNaseI溶液（1mLのPBSに希釈した0.25mgのDNaseI）を加える。 37℃でチューブを保存してDNAフィラメントを分解する。組織混合物を70μmセルストレーナーに通して細胞溶液を得る。 2 mLのPBS + 5％FBSでストレーナーを2回すすぎ、酵素消化を中和します。
- 200×gで5分間細胞混合物を遠心分離して細胞をペレット化する。上清を捨て、抗体染色のために1mLのPBS + 5％FBSに細胞ペレットを再懸濁する。
- FACSベースのProcr + VESC分離
- 公開された慣用のプロトコール8次抗体染色にドナー乳房組織から得られた細胞混合物を供します。
注：以下の抗体を使用した：抗マウス抗マウスCD31（PECAM1）-PECY7、抗マウスCD105-APC（いずれも1μg/ mLの濃度で使用）、抗マウスCD201（Procr） - ビオチン（濃度2.5 μg/ mL）、およびストレプトアビジン-v450（0.5μg/ mLの濃度で使用）。- 抗体染色の後、PBS + 5％FBSで細胞を補充し、次いで200gで5分間遠心分離する。上清を捨て、1mLのPBS + 5％FBSで細胞を再懸濁する。 40μmセルストレーナで濾過します。 FACSソーティングまで氷上に置く。
- Procr + VESCを分離するためにFACSベースのソーティングを実行します。
- 染色されていないサンプルと各単色コントロールを分析して、各色の電圧を決定します。自己蛍光やバックグラウンド染色を避けるために、補正パラメータを計算します。目的の細胞集団の適切なゲーティングおよびソーティングのためのテンプレートを設定する。
- FACSソーティングの階層を確立するには、まず、全ての事象を検出し、次いで、幅を用いてトリガーすることにより、ダブレットまたは接着性細胞クラスターを廃棄する。細胞をゲートアウトし、CD31 +およびCD105 +を使用して内皮集団を定義する。
注：Procr +細胞は、FMO対照と比較してCD31 + CD105 + ECから単離された。代表的なFACS解析プロットを図1に示します 。 FACSで単離したVESC集団は、IMDM + 50％FBS中に懸濁させ、その後の処理まで氷上に保存しなければならない。
- 公開された慣用のプロトコール8次抗体染色にドナー乳房組織から得られた細胞混合物を供します。
2.乳房脂肪パッドを用いたインビボ VESC血管形成アッセイ
- 一次ECを移植用に準備する。
- 10mLのPBS + 5％FBSを含むFACSソート細胞を補充し、200xgで5分間遠心分離して、細胞を底に沈降させる。
- 液体を慎重に吸引し、血球計数器を用いて細胞数を数え、細胞ペレットを基底膜マトリックス混合物で再懸濁する（consi100ng / mL rmVEGFおよび60U / mLヘパリンを補充した50％基底膜マトリックスおよび20％FBSを含むPBSのスティング）を用いて15,000細胞/15μLの作業濃度に到達させた。
注：基底膜マトリックスの混合物は、常に氷上に保存する必要があります。 - 最終的な注入量が合計15μLを超えないように、1.5mLのマイクロチューブで必要な入力濃度に達するように、選別および計数した細胞を連続希釈する。移植中のより良い内容の視覚化のために、各チューブに0.1％トリパンブルーを加える。ピペットで徹底的に混合する。使用するまでチューブを氷上に保管します。
注：船舶の建設が成功するには、最低100 VESCを達成する必要があります。
- 一次ECを乳房脂肪パッドに移植する。
- 手術器具とベンチトップを消毒する。複数の動物で同じ器具を使用する場合は、ビーズ滅菌器を使用して消毒することができます。
- 3週齢のBALB / cヌードマイスを麻酔するあなたの施設の獣医師とIACUCによって推奨される麻酔プロトコルを使用してください。各マウスを仰臥位に置き、手術台に背中を置きます。粘着テープを使用して四肢を固定する。
- 綿棒をヨウ素ベースの消毒液に浸す。手術前に皮膚表面を滅菌するために、マウスの腹部全体を完全に拭きます。
- 鉗子でマウスの腹部の皮膚を持ち上げ、持ち上げます。外科用メスを使用して、1cmの垂直切開部を小さくします。後ろ向きにそれぞれ約0.5〜1cmの2つの切れ目を入れて、逆さまのY字型切開を達成します。
- 鉗子と綿棒を使用して、皮膚を腹部から静かに引き離し、鼠径乳腺を露出させるために皮膚を横にピン止めします。ステレオスコープの下にマウスを置き、倍率を2.0Xに設定します。乳房の脂肪パッドがはっきりと見えるように、フォーカスを調整してください。
- 27G 1/2 "ニードルを置く凍ってから冷やす。前もって基底膜マトリックス混合物を含む1mLシリンジを準備して、針取り付け領域内に捕捉された可能性のある気泡を除去する。 15μLの混合溶液をマイクロ遠心チューブのキャップにピペットで注入し、次に全量をプライミングしたシリンジに吸引します。
- 鼠径リンパ節の前に乳房脂肪パッドを細かいピンセットを用いて持ち、容易に注射できるようにわずかに持ち上げます。脂肪パッドに注射針の約1/4を静かに挿入します。
- 流しパッドからピンセットを離して、注射針を握って安定させます。液体が漏れないようにゆっくりと溶液を注入してください。針を引き抜くときに漏れを最小限に抑えるために、細胞混合物が凝固していることを確認するために数秒間保持する。
- 吸収可能な縫合糸で皮膚フラップを閉じる。サイズ5-0の非反応性モノフィラメント縫合糸を使用して皮膚フラップを縫合し、外科医のスタイルの結び目で創傷を閉じ、各結び目の近似ately 0.3 cm離れている。あるいは、創傷ステープルを用いて皮膚を閉じる。
- 回復のために操作したマウスを別のケージに入れる。麻酔したマウスが低体温に陥るのを防ぐために、ケージの上に加熱ランプを置きます。ケージの底に柔らかい紙と綿を置き、マウスを手術後に暖かく保ちます。
- すべての受診者が完全に目を覚ますまで注意深くマウスを観察する。次の数日間は、すべての動物に、または施設の獣医師の指示に従って、術後鎮痛剤を先制的に適用する。創傷感染が起こる場合、承認された動物プロトコールに従って抗生物質を適用する。外科用創傷が創傷ステープルで閉鎖されている場合、創傷が完全に閉鎖した手術の10日後に創傷クリップを除去する。
3.顕微鏡観察のための全身組織調製
- 組織収穫
- 移植後2〜4週間で、レシピエントBALB / cを麻酔するステップ2.2.2のように、体重20g当たり0.12mLの投与量で2.5％麻酔剤の腹腔内注射を用いて、ヌードマウスに投与した。
注：陽性の血管成長は、細胞移植の2〜4週間後に検出することができます。 - 50μg/ 25gの体重の用量でisolectin-647色素の尾静脈注射でレシピエント全身循環を標識し、50μLの滅菌PBSに再懸濁する。 5〜10分の休憩を取る。 CO 2を用いてマウスを犠牲にする。
- ステップ2.2.4の後に細胞が最初に注入された乳房組織の領域を解剖する。外科用ハサミを使用する。手術用ブレードを使用して、組織を6cmのペトリ皿で約3〜4mm 3立方体にチョップします。
- 移植後2〜4週間で、レシピエントBALB / cを麻酔するステップ2.2.2のように、体重20g当たり0.12mLの投与量で2.5％麻酔剤の腹腔内注射を用いて、ヌードマウスに投与した。
- 組織消化および抗体染色のための調製。
- コラゲナーゼIIIを補充した予め加温した消化基礎培地（ステップ1.1.2）10mLを満たした15mLの遠心チューブに組織片を消化する（10mLあたり300U）。
- 速度を100rpmに設定し、温度を37℃に約1時間設定したロッキングプラットフォーム上に15mL遠心チューブを水平に置き、組織構造を緩め、過剰な脂肪細胞組織を除去する。
注：脂肪細胞は自己蛍光を生成する傾向があり、その結果、ノイズの多い蛍光バックグラウンドが生じる可能性があります。消化の終わりまでに、組織片は柔らかく曇った外観を有するべきである。最適な消化期間は、切断された組織片のサイズに依存し、従って、最良の結果を得るために調整されるべきである。組織の脈管構造はすでに蛍光標識Isolectinで標識されているため、以下の手順はすべて光から保護する必要があります。 - RTで10分間PBSで組織片を洗浄する。蛍光を保存するために、4cmのPFA（pH 7.2-7.4）を半分にした6cmのペトリ皿に慎重にピースを置くことによって、全マウント組織を固定する。ペトリ皿を置くロッキングプラットフォーム上に置き、RTで30分間組織を静かに攪拌する。
注：PFAは発癌性物質であり、注意して取り扱う必要があります。 - 残りのPFAを除去し、全洗浄緩衝液（PBS中0.1％トゥイーン）で3回、各洗浄の間に10分間の間隔を置いて固定組織を3回洗浄する。
- 全マウント組織抗体染色。
- 抗体染色バッファー中の一次抗体を2 mL遠心チューブで希釈する。一次抗体と組織を4℃で一晩インキュベートする。
注：一次抗体としてラット抗CD31（濃度10μg/ mL）またはラット抗VE-カドヘリン（CD144 / Cdh5;濃度2.5μg/ mL）を用いた。 CD31およびVE-カドヘリンの両方は、内皮細胞を認識するために使用される細胞表面マーカーである。 5x抗体染色緩衝液を500mMマレイン酸（pH7.5）で調製する。 750mM NaCl;および0.5％（v / v）トゥイーンをPBSに溶解する。新鮮な1x作業溶液を調製する場合にのみ、適切な血清容量（5％）を加える9 。 - 抗体染色バッファーを取り除き、10分間隔で洗浄バッファーで全マウント組織を3回洗浄する。組織を二次抗体（ 材料表を参照）に加えて、DAPIと室温で4時間、4℃で振とうするか、または4℃で一晩インキュベートする。
注：5μg/ mLの最終濃度でDAPI（4 '、6-diamidino-2-phenylindole）を使用して核を可視化します。 - 洗浄緩衝液で全マウント組織を3回、それぞれ10分間洗浄する。より良い保存のために組織を脱水するために、80％グリセロールまたは80％スクロース中の組織片を一晩インキュベートする。
- 個々の組織片をガラススライド上に置き、過剰な脱水緩衝液を除去する。組織をマウント媒体で覆い、カバースリップを置き、穏やかに組織を絞ってセットします。
- 共焦点顕微鏡画像取得を行う。全身乳腺の場合、NA = 1.3の油性対象物で40倍の画像を取得するve。 1,024×1,024の光学セクション解像度と1.0〜1.2μmのレイヤー分離で、Zスタックのタイルスキャンを取得します。
注：正しい蛍光信号を捕捉するには、フィルタービームスプリッターを3倍ダイクロイック（TD）488/553/638に設定し、ゲイン設定をPMTゲイン600-800に設定する必要があります。以下の励起/放射源を使用すべきである：mGFP、488 / 509nmの励起/発光最大値;励起/発光極大が532 / 588nmのmTomato; Alexa-647、励起/放出極大は594/665; DAPI、励起/発光極大は350/470である。
- 抗体染色バッファー中の一次抗体を2 mL遠心チューブで希釈する。一次抗体と組織を4℃で一晩インキュベートする。
遺伝的に改変されたマウスモデルを用いた系譜の追跡
- マウスモデルを使用してProcr + VESCを検出します。
- Procr CreERT2-IRES-tdTomato / + （ Procr CreERT2と呼ばれる）ノックインマウス系統を使用する。
注：このマウスモデルでは、 CreERT2-IRES-tdTomatoカセット- Rosa26 mTtomatomGFP （ R26 mTmGと呼ばれる）レポーター株を用いて、内因性Procr + ECのin vivoでの運命を追跡するためのProERT CreERT2マウス11 。 GFP発現を用いて、全ての標識された内因性Procr + ECおよびそれらの子孫を同定する。
- 糖尿病の段階（5週間）中に体重25mgの体重で腹腔内に腹腔内にタモキシフェン溶液11 （10mg / mLのピーナッツ油+ 10％エタノールに溶解したタモキシフェン10mgを腹腔内に貯蔵） Procr + ECの発達的な運命を追跡するためのものです。
- ステップ3で概説した調製ステップに従って、全マウント免疫染色により標識細胞のクローン形成効率を分析する。短期（2日）および延長された期間（10ヶ月まで）。 図3を参照してください。
- Procr CreERT2-IRES-tdTomato / + （ Procr CreERT2と呼ばれる）ノックインマウス系統を使用する。
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Representative Results
乳腺VESC単離：
その結果の移植アッセイのための内皮集団を単離するために、成熟（8週齢）の未処理マウス乳腺をドナー材料として採取した。内皮細胞は、抗体に基づく細胞選別技術を用いて単離された。 8週齢のC57BL / 6乳腺ECにおけるVESC集団のFACS分析の代表的プロットを図1に示す（図8は 、Yu ら 8 ）。
乳腺脂肪移植：
乳房脂肪パッドは、血管新生の研究に理想的な部位を提供する。 FACSに基づく単離の後、Procr + ECを0.5％基底膜マトリックスおよび0.1％トリパンブルー指示薬と混合し、次にトランスプランした3週齢のSCID受診者の空腹の脂肪パッドに貼付した。思春期に、乳房脂肪パッドは血管形成環境を作り出し、哺乳類の上皮の拡張と整列して脈管構造のリモデリングを促進する。その結果、移植されたProcr + EC（GFP + ）は宿主の大血管（ 図2B 、矢印）に組み込まれ、また二次および三次GFP +血管枝（ 図2B 、矢頭）を形成した。移植されたProcr + ECはマトリクスプラグアッセイ（腹部皮膚の下に挿入される）で血管を生成することもできるが、形成された血管は毛細管様にしか見えない（ 図2A ; Yu らの許可を得て図8 ）。
Procr + VESCによって形成された血管の機能性：
GFP + v乳房脂肪パッドのエッセルは機能的循環脈管構造の一部であり、収穫前にイソレクチンを静脈内注射によって投与した。 GFP +血管はisolectin +であり、形成された血管が発光し、宿主脈管構造と接続されていることを示している（ 図2B ; Yu ら 8 ）。
Procr CreERT2を使用した乳房 VESC系譜の追跡; Rosa26 mTmGマウスモデル：
Procr CreERT2 ; Rosa26mTmGマウスを、in vivoでProcr + VESCsの運命追跡に使用した（ 図3A ）。 Procr + VESCsがどのようにして乳腺の思春期発達中の堅牢な血管新生および血管リモデリングに寄与するかを調べるために、 Procr CreERT2 ; Rosa26mTmGを投与したdをタモキシフェンと接触させて、Procr +内皮集団におけるGFP発現を誘導する。薬物処理されたProcr CreERT2の乳房脂肪パッド; Rosa26 mTmGマウスを短期間（注射後2日; 図3B ）および長期間（注射後10ヶ月まで、 図3C -F; Yu らの許可を得て許可された図8 ）の両方で採取した。トレーシングの結果を視覚化するために全マウント準備を行った。血管内皮の同一性は、内皮表面マーカーVE-カドヘリン（Cdh5; 図3B 、右の画像）で染色することによって確認することができる。
図1：マウス乳腺におけるVESCの分析。 8週齢のC57BL / 6乳腺ECにおけるProcr発現のFACS分析。 8週齢のvイージンC67BL / 6雌マウスを乳腺採取に用いた。細胞サンプルを調製した後、無染色サンプルおよび各単色対照を分析して、各色の電圧を決定した。自動蛍光またはバックグラウンド染色を避けるために、補償パラメータを計算した。ゲーティングを適切に行い、所望の細胞集団を選別するためのテンプレートを確立した。 FACSソーティングの階層を確立するために、すべての事象からの破片を除去し、次にダブレットまたは接着性の細胞クラスターを廃棄した。リネージュ細胞をゲートアウトし、CD31およびCD105を用いて内皮集団を画定した。 Procr +細胞は、FMO対照と比較してCD31 + CD105 + ECから単離された。この図は、Yu et al。 8 、許可を得て。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2：VESC乳腺脂肪移植アッセイ。 （ A ）基底膜マトリクスプラグ内のProcr + ECから形成された血管で、側面の皮膚の下に皮下挿入されている。 （ B ）移植哺乳動物脈管構造への移植されたProcr + EC（GFP +）の統合および寄与を示す、受領乳腺脂肪パッドの共焦点画像。 ECをCD31で対比染色した。 （ C ）レシピエントマウスにイソレクチンを静脈内注射すると、その外胚が発光した血管を形成することが示された。スケールバー、50μm。 40倍のNA 1.3油の対物レンズを用いて画像を取得した。 Zスタックのタイル走査は、1024×1024の光学セクション解像度で得られ、各層は1.0〜1.2μm離れていた。正しい蛍光光信号を捕捉するために、フィルタービームスプリッターをTD 488/553/638に設定し、gPMTゲイン600〜800で設定した。以下の励起/発光源を使用した：mGFP、励起/発光極大は488/509nm; mTomato、励起/発光極大は532 / 588nm; Alexa-647、励起/放出極大は594/665; DAPI、励起/発光極大は350/470である。この図は、Yu et al。 8 、許可を得て。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：Procr + ECの系統追跡は、開発中のECクローン拡張への貢献を示す。 （ A ） Procr CreERT2を用いた系譜追跡戦略の図 。 Rosa26 mTmG系統（左パネル）。実験的（2日）および長期（7日〜10ヶ月）に使用された設定（右パネル）。 （ BF ）標識されたProcr + ECの初期位置および種々の追跡段階での乳房血管系へのそれらの寄与を示す、異なる長さの追跡期間後の哺乳動物脈管構造のホールマウント共焦点画像化。スケールバー=50μm。この図は、Yu et al。 8 、許可を得て。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
血管新生アッセイは、血管動態を研究するための良好な実験的アプローチである。出生後に発症するマウス網膜血管系は、血管新生を研究する魅力的なモデルであることが証明されている12 。それが比較的接近可能であるにもかかわらず、網膜血管床内の実際の操作はむしろ困難である。これまでのところ、最もよく記述されているインビボ移植は、基底膜マトリックス塊の内部に細胞を封入し、外科的にインプラント/レシピエントマウスの側面領域に皮下注射するプラグアッセイであった。この血管形成アッセイは、埋め込み細胞の再生能および血管形成能を試験するのに有効である。しかし、植え込まれたマトリックスプラグの位置は、細胞内の比較的孤立した環境を作り出すため、最適な生理学的ニッチを提供しない。最近、サーファにフィブリンパッチを適用することにより、新しい肺血管新生モデルも開発されているマウス肺の13部位。しかし、この技術はマウスの胸腔の中で侵襲的に働くため、より一般化されたアッセイ設定で使用することが困難になるため、操作はさらに別のリスクをもたらす。
本明細書に記載の血管新生アッセイでは、小容積の細胞混合物が、乳腺の脂肪パッドの内部に移植され、これは、思春期に空間、マトリックスおよび豊富な血管形成刺激を提供する。これにより、生成された血管が再構築する宿主脈管構造に適合して統合され、さらなる機能評価が可能になり、皮下プラグアッセイよりも有利であることが示される。また、乳房脂肪パッドは、腹膜腔外に位置し、非常にアクセス可能な部位になっている。乳房脂肪パッド上での操作は、レシピエント動物に限られた苦痛をもたらし、網膜および肺ベースのアッセイに関わる侵襲的外科的処置を回避する。
血液血管系ウィット臓器はしばしば組織の成分の間に絡み合って血管カバレッジを最大にし、血液酸素および物質移動の供給を最適化することができる。そのため、組織の従来の切片化は、その血管の管状構造をしばしば横切る。血管特性の分析は、血管を保存してそのまま残すことができるときに最もよく行われる。組織の全マウント準備は、血管構造の全体を大部分保存することができる。この方法は、器官内の血管の真正な空間分布の観察だけでなく、他の組織成分との関係も可能にする。
幹細胞含有組織のホメオスタシスは、細胞集団の発生と消失とのバランスをとることによって維持される。特定の居住する臓器内の幹細胞はしばしば保護され、幹細胞のニッチと呼ばれる周囲の組織環境と密接に接触する。したがって、stu成体幹細胞組織を分析するダイは、好ましくは、インタクトな生理学的状況で実施されるべきである。移植アッセイは、細胞の潜在能力を評価する手段を提供することができ、系統追跡技術は、ネイティブ生息地内の真の細胞運命の探査を可能にする。近年、 in vivo系譜の追跡は、幹性の実験的評価のための強力な技術となっている。この戦略は、組織残留幹細胞および腸10、14、毛包15、胃16、および膵臓17を含む複数の組織におけるそれらの子孫を同定するために使用されてきました。系譜追跡法は、主に幹細胞の遺伝的マーキングに依存し、規定された集団において開始される。したがって、実際の幹細胞が、標識された細胞内のより小さな亜集団に見出される可能性を排除することは困難である。したがって、トレースされたクローンの細胞原点を正確にマッピングし、経時的なトレース効率を定量的に測定することが不可欠です。このようにして、標識された集団の自己再生能力を理解することができる。
記載された血管新生アッセイは、特定の研究目的のために改変することができる：それは、関心のある内皮集団の血管発生能力を試験するためだけでなく、局所血管再構築に対する血管新生因子の効果を評価するためにも使用できる。しかし、乳児腺は、異なる発達段階（ 例えば、思春期、発情周期、および妊娠）の間に動的な形態学的変化を受けるので、結果解釈中のホルモンレベルの変動などの全身変化の影響を考慮する必要がある。このアッセイの重要なステップには、原発性内皮細胞単離が含まれる。移植のために生存細胞を最適に得るために、FACS単離のための手順はb穏やかに行った。細胞ペレットの緩みや吊り下げなど、細胞調製中の過酷な取り扱いを避けるために注意が必要です。別の重要なステップは、脂肪混合物への細胞混合物の注入である。脂肪パッドの注入中に、脂肪混合物が脂肪パッド内に正確に沈着することを確認することが重要である。針の挿入が深すぎる/浅い場合、または全体の容量が推奨用量を超えている場合、これは難しいことがあります。
このプロトコルは、内皮幹細胞集団の同定を助ける一連の実験方法を提供する。これらの技術を介して、移植を介して幹細胞の特性を評価すること、および生体内の生理学的プロセス下でのそれらの挙動を追跡および観察することが可能であった。これらのアプローチは、腫瘍環境における内皮集団の研究およびそれらの細胞効力の変化を含む、複数の分野に適用できる効率的なツールである。私特に、脂肪パッドの移植および全身の準備は、血管生物学の異なる側面を調査するための将来の努力を助けることができる、再現可能かつ強力な方法である。
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Disclosures
著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。
Acknowledgments
この研究は、中国国立科学財団（31530045および31371500、YAZ、31401245からQCY）、中国科学技術省（2014CB964800）、中国科学アカデミー（XDB19000000からYAZ）、および中国細胞生物学会（QCYへの早期キャリアフェローシップ）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(EDTA) (1x) | Gibco (Life Technologies) | 25300-062 | 0.05% Trypsin |
| 0.22 µm Filter Unit | Merck Millipore Ltd. | SLGP033RB | 0.22 µm Filter |
| 2-Methylbutanol-2, ReagentPlus | Sigma-Aldrich | 24, 048-6 | Tert Amyl Alcohol |
| 222, Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25g | 222, Tribromethanol |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) | Invitrogen | D1306 | DAPI |
| 70 µm Cell Strainer | BD FAL | 352350 | 70 µm Cell Strainer |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 188105 | Glass slides |
| Anti-mouse CD105 APC | eBioscience | 17-1051-82, clone MJ7/18 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| Anti-mouse CD201 Biotin | eBioscience | 13-2012-82 | for FACS analusis use at 2.5 µg/mL |
| Anti-mouse CD31 PE-Cyanine 7 | eBioscience | 25-0311-82, clone 390 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| BD FACSJazz Cell Sorter | BD Biosciences | 655489 | FACS |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 100190332 | BSA |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Centrifuge |
| Collagenase type 3 | Worthington-Biochem | #LS004183 | Collagenase III |
| Confocal microscopy | Leica | sp8 | Confocal |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D2463-5VL | Dnase I |
| Donkey anti-Rat Cy3 | Jackson ImmunResearch | 712-165-150 | Secondary antibody, use at 0.5 µg/mL |
| Dumont Forceps | WPI | 500342 | Froceps |
| Dumont Forceps - Micro-Blunted Tips | FST | 11253-20 | Forceps |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | FBS |
| FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119 | BioLegend | 78022 | Blood lineage cocktail for FACS analysis, use at 25 µL per test |
| Glycerol | Sigma | G6279 | Glycerol |
| Iscov's Modified Dulbecco's Medium | Gibco (Life Technologies) | 12440-053 | IMDM |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora 647 | Invitrogen | Z32450 | Isolectin-647 |
| Matrigel Matrix (growth factor reduced) | BD | 356231 | Matrigel |
| Mouse strain (Actin-GFP) | Jax Laboratories | 3773 | Actin-GFP |
| Mouse strain (C57BL/6) | SLAC | C57BL/6 | C57BL/6 |
| Mouse strain (BALB/c nude) | SLAC | BALB/c nude | Nude mice |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | PFA |
| Penicilin Streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 5140-122 | Pen/Strep |
| Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1x | Gibco (Life Technologies) | c20012500BT | PBS |
| PRIM1640 | Gibco (Life Technologies) | c11875500CP | PRIM1640 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | Mounting Medium |
| Rat anti CD144 | BD Biosciences | 550548 | for whole-mount analysis, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy for endothelial tight junction, use at 2.5 µg/mL |
| Rat anti CD31-biotin | BD Biosciences | 553371 | for whole-mount analusis, anti-CD31/PECAM1 antibody for endothelial surface adhesion molecule, use at 10 µg/mL |
| Red Cell Lysis Buffer | Sigma | R7767-100ML | Red blood cell lysing buffer |
| Straight/Sharp-Blunt/10cm | FST | 14028-10 | Fine Scissors |
| Streptavidin eFluor 450 | eBioscience | 48-4317-82 | for FACS analysis use at 0.5 µg/mL |
| Tamoxifen | Sigma | 101551374 | TAM |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | TritonX |
| Wax Coated Braided Silk (Size 5-0 USP (1 Metric), 18 inches (45 cm) BLACK on C-1 Needle) | COVIDIEN | S1173 | Suture |
| Sterile Disposable Scaplels | Swann Morton | #10 | Scalpel |
| Betadine | Yifeng Medical | 20160101 | Antiseptic solution |
References
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