Summary
Эта работа демонстрирует новый подход к оценке пролиферации, дифференцировки и сосудообразующего потенциала сосудистых эндотелиальных стволовых клеток (VESC) посредством трансплантации молочной жировой ткани с последующим тщательным приготовлением тканей для микроскопического наблюдения. Также представлена стратегия трассировки линий для исследования поведения VESC in vivo .
Abstract
Эндотелиальные клетки (EC) являются фундаментальными строительными блоками сосудистой архитектуры и опосредуют рост сосудов и ремоделирование для обеспечения надлежащего развития сосудов и гомеостаза. Однако исследования по иерархии линий эндотелия остаются неуловимыми из-за отсутствия инструментов для получения доступа, а также для непосредственной оценки их поведения in vivo . Чтобы устранить этот недостаток, была разработана новая модель ткани для изучения ангиогенеза с использованием молочной жировой прокладки. Молочная железа развивается в основном на постнатальных стадиях, включая половое созревание и беременность, во время которых ростовая пролиферация эпителия сопровождается обширным сосудистым ремоделированием. Маммовые жировые подушки обеспечивают пространство, матрицу и богатые ангиогенные стимулы от растущего эпителия молочной железы. Кроме того, прокладки молочных жиров расположены за пределами брюшной полости, что делает их доступным для трансплантации местом для оценки ангиогенного потенциала экзогенных клеток. Эта работа также описывает эффективностьNt с использованием флуоресцентных репортерных мышей для специфической маркировки целевой популяции сосудистых эндотелиальных стволовых клеток (VESC) in vivo . Этот метод отслеживания линии, в сочетании с последующей микроскопией всего тела, позволяет непосредственно визуализировать целевые клетки и их потомков, через которые можно количественно определить способность распространения, а обязательства по дифференциации могут быть сопоставлены судьбой. Используя эти методы, популяция бипотентного рецептора белка С (Procr), экспрессирующего VESC, недавно была идентифицирована в нескольких сосудистых системах. Procr + VESC, приводящие к появлению как новых EC, так и перицитов, активно способствуют ангиогенезу во время развития, гомеостаза и ремонта повреждений. В целом, эта рукопись описывает новую трансплантацию молочной жировой ткани и методы трассировки линии in vivo , которые могут быть использованы для оценки свойств стволовых клеток VESC.
Introduction
Во время развития и гомеостаза сосудистый рост и ремоделирование добросовестно происходят в соответствии с ростом и восстановлением органов. Ангиогенез описывает генерацию новых сосудов из ранее существовавших кровеносных сосудов и считается основной силой, опосредующей эти динамические сосудистые изменения. Каждый кровеносный сосуд внутренне облицован слоем эндотелиальных клеток (EC), и они, по-видимому, являются основой архитектуры судна. Долгое время механизм, по которому ЕС-бассейн пополнялся во время гомеостаза, оставался неясным, и были высказаны аргументы в пользу того, является ли сосудистый оборот результатом зрелой пролиферации ЕС или является вкладом в деятельность сосудистых стволовых клеток / клеток-предшественников. Из-за отсутствия прямых физиологических доказательств существование и клеточная идентичность сосудистых эндотелиальных стволовых клеток (VESC) также оставались спорными.
Одним из наиболее распространенных подходов, используемых для проверки поведения стволовых клеток, является транспланВ отношении предполагаемых стволовых клеток к мышам-реципиентам. Этот метод измеряет потенциал стельности потенциальных стволовых клеток in vivo. Трансплантация была впервые применена к изучению стволовых клеток 1 костного мозга, что способствовало установлению иерархических характеристик гемопоэтической системы 2 . В эндотелиальном поле матрица подвальной мембраны ( например, матригеля), вставленная подкожно под боковую оболочку, была стандартным анализом ангиогенеза in vivo, используемым для решения возможностей формирования сосудов трансплантированных EC. Несколько экспериментальных методов, включая образование колоний в системах 3D-культуры и трансплантации, предложили потенциальные популяции предшественников EC / VESC 3 , 4 , 5 , 6 . Однако, поскольку ИС, встроенные в матрицу фундаментальной мембраны, относительно независимы отОкружающая ткань, это не обеспечивает оптимальную нишевую среду, необходимую для полного изучения ангиогенного потенциала трансплантированных клеток. В результате сосуды, образованные внутри матричной пробки, преимущественно капиллярны и функционально неизмеримы.
Молочная железа развивается постнатально, причем наиболее устойчивый рост происходит во время полового созревания и беременности. На пубертатной стадии эпителий молочной железы подвергается быстрому расширению, занимая всю молочную жировую подушку, сопровождаемую эффективным ремоделированием окружающих сосудистых структур. Таким образом, молочная железа является отличной моделью для изучения ангиогенеза. Он обеспечивает пространственные, матричные и богатые ангиогенные стимулы от растущего эпителия молочной железы и поэтому является идеальным местом прививки для оценки ангиогенного потенциала экзогенных клеток. Кроме того, подушка для молочной железы позволяет сформированным экзогенным сосудам интегрироваться с системой циркуляции хозяина, что позволяет далее fА также представляет собой преимущество перед подкожной трансплантацией.
Хотя анализы культивирования и трансплантации in vitro являются таким же эффективным способом исследования регенерирующих свойств популяции клеток, известно, что такие анализы могут стимулировать пластичность, поскольку клетки отбираются из их родных мест обитания, и изменения могут быть вызваны, когда клетки отсоединены от Их физиологическое окружение 7 . Поэтому получение прямых in vivo доказательств клеточной судьбы является ключевым подходом к продвижению современного понимания поведения популяций эндотелия.
Генетическая картинка судьбы ( т. Е. Трассировка линии in vivo ) необходима для идентификации VESC и для исследования их свойств в системе организма, поскольку она может выявлять поведение стволовых клеток in vivo в его физиологическом контексте, а фактическая стебельность может быть оценены. Lineage traciNg дает прямые доказательства долговременной стойкости ( т.е. самообновления) кандидатов VESC и их способности производить типы клеток для ткани происхождения ( т. Е. Дифференцировочную активность).
В этом протоколе описывается новая методика трансплантации молочной жировой ткани и метод трассировки линии, чтобы наблюдать способность сосудов VESC. Эти методы преодолевают недостатки имеющихся в настоящее время анализов и обеспечивают новый способ оптимальной оценки свойств стволовых клеток VESC. Эти подходы являются эффективными инструментами, которые могут быть использованы для оценки поведения и сосудообразующих свойств популяций эндотелия, а также для определения изменения потенции сосудистых клеток в патологической среде.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Экспериментальные процедуры были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Шанхайского института биохимии и клеточной биологии Китайской академии наук по утвержденному протоколу SIBCB-NAF-15-002-S335-003.
1. Выделение VESC из мышей Mammary Gland
- Сбор молочной железы и переваривание тканей.
- Используйте 8-недельные пожилые мышечные репортерные мыши Actin-GFP с массой от 20 до 25 г в качестве доноров тканей.
Примечание. Клетки, полученные от донора, можно легко отслеживать с помощью выражения GFP. - Подготовьте основную среду для переваривания ткани, состоящую из 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% пера / стрелы и 25 мМ HEPES в RPMI1640. Отфильтруйте смесь через фильтр 0,22 мкм для стерилизации и предварительно нагрейте ее до 37 ° C на водяной бане.
- Жертвуйте мышей в камере CO 2 . Вырезать четвертую пару паховых молочных желез, сначала сделав вертикальную кожу iNcision на нижней средней части живота с помощью скальпеля (или хирургических ножниц). Аккуратно очистите кожу в одной стороне, чтобы открыть паховую молочную железу с помощью щипцов. Получите четвертую паховую молочную железу с обеих сторон и разрежьте их на мелкие кусочки в чашке Петри 6 см с помощью ножниц.
- Измерьте общий вес измельченной ткани и поместите ее в трубку объемом 50 мл.
Примечание. Удостоверьтесь, что итоговый тканевый фарш меньше 1 мм 3 для каждой детали. Типичный выход составляет приблизительно 5000 VESC на животное.
- Измерьте общий вес измельченной ткани и поместите ее в трубку объемом 50 мл.
- Подготовьте среду для обработки пищеварения в колпачке с центрифугой на 50 мл в объеме 10 мл на 1 г тонкой ткани. Добавить коллагеназу типа 3 в концентрации 300 единиц на 10 мл среды пищеварения, чтобы образовать буфер для пищеварения. Смешайте равномерно и добавьте его в тканевый фарш.
- Горизонтально поместите 50 мл центрифужную пробирку на платформу для качания и установите скорость до 100 об / мин и температуру до 37 ° C. агитироватьМолочной железы в течение 2 часов. Проверяйте и вручную встряхивайте трубку каждые 20 минут, чтобы обеспечить надлежащее пищеварение.
Примечание. Целью переваривания тканей перед FACS является приготовление одноцелевого раствора из твердой ткани. Поэтому к концу пищеварения содержимое должно быть толстым раствором без видимых частей ткани.
- Используйте 8-недельные пожилые мышечные репортерные мыши Actin-GFP с массой от 20 до 25 г в качестве доноров тканей.
- Подготовка одноклеточных растворов.
- После переваривания долейте 50 мл центрифужную пробирку с предварительно разогретым стерильным PBS и инвертируйте трубку для равномерного смешивания. Центрифугируйте пробирку при 200 × g в течение 5 мин, чтобы получить клеточный осадок.
- Удалите супернатант и пролистайте нижнюю часть трубки, чтобы ослабить клеточный осадок. Добавить в 3 мл буфера для лизинга эритроцитов (см. Таблицу материалов) и инкубировать в капюшонах для тканевой культуры при комнатной температуре (RT) в течение 5 мин для удаления красных кровяных клеток.
- Добавить 10 мл стерильного PBS и инвертировать трубку для равномерного смешивания. Центрифугируйте содержимое ткани 200 мкг в течение 5 мин и дискаИ супернатант. Добавьте в 3 мл предварительно нагретого 0,05% трипсина и храните пробирку при 37 ° С в течение 5 мин для дальнейшей переваривания оставшейся ткани.
- Добавить в 3 мл предварительно нагретого IMDM и затем добавить 100 мкл раствора ДНКазы I (0,25 мг ДНКазы I, разведенного в 1 мл PBS). Храните трубку при 37 ° C, чтобы разбить ДНК-нити. Пропустите смесь тканей через сетчатый фильтр размером 70 мкм, чтобы получить раствор клетки. Промойте фильтр дважды с помощью 2 мл PBS + 5% FBS, чтобы нейтрализовать ферментативное расщепление.
- Центрифугируйте смесь клеток при 200 мкг в течение 5 мин, чтобы осадить клетки. Удалите супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок в 1 мл PBS + 5% FBS для окрашивания антител.
- Изоляция Procr + VESC на основе FACS.
- Задайте клеточную смесь, полученную из донорной ткани молочной железы, на окрашивание антителом после опубликованных стандартных протоколов 8 .
Примечание: Использовались следующие антитела: антимышинаЛиния крови - FITC, антимышиный CD31 (PECAM1) -PECY7, антимышиный CD105-APC (все используют в концентрации 1 мкг / мл), антимышиный CD201 (Procr) -биотин (используемый в концентрации 2,5 Мкг / мл) и стрептавидин-v450 (используется в концентрации 0,5 мкг / мл).- После окрашивания антителами пополняют клетки PBS + 5% FBS, а затем центрифугируют при 200 г в течение 5 мин. Удалите супернатант и повторно суспендируйте клетки с 1 мл PBS + 5% FBS. Фильтруют через 40-мкм клеточный фильтр. Место на льду до сортировки FACS.
- Продолжайте выполнять сортировку на основе FACS для изоляции Procr + VESC.
- Проанализируйте необработанный образец и каждое одноцветное управление, чтобы определить напряжение для каждого цвета. Вычислите параметры компенсации, чтобы избежать автоматической флуоресценции или фонового окрашивания. Настройте шаблон для правильного стробирования и сортировки для нужных групп клеток.
- Чтобы установить иерархию сортировки FACS, сначала устраните мусор изВсе события, а затем выбросить дублеты или клеточные кластеры путем запуска с шириной. Выводят линии кровотока, а затем используйте CD31 + и CD105 + для определения популяций эндотелия.
Примечание: клетки Procr + были выделены из CD31 + CD105 + EC по сравнению с контролем FMO. Примерный график анализа FACS показан на рисунке 1 . Выделенная FACS популяция VESC должна быть приостановлена в IMDM + 50% FBS и храниться на льду до дальнейшей обработки.
- Задайте клеточную смесь, полученную из донорной ткани молочной железы, на окрашивание антителом после опубликованных стандартных протоколов 8 .
2. В Vivo VESC судно Формирование Пробирного Использование Pad Молочная жира
- Подготовьте первичные EC для трансплантации.
- Пополнение клеток, отсортированных по FACS, с помощью 10 мл PBS + 5% FBS, а затем центрифугируют при 200 × g в течение 5 минут, чтобы осадить клетки до дна.
- Аспирируйте жидкость осторожно, подсчитайте количество клеток, используя гемоцитометр, и повторно суспендируйте клеточный осадок с помощью смеси мембран матрицы основания (consiSting из 50% мембранной матрицы основания и PBS с 20% FBS, дополненной 100 нг / мл rmVEGF и 60 U / мл гепарина) для достижения рабочей концентрации 15000 клеток / 15 мкл.
Примечание: Смесь мембранной мембраны основания всегда должна храниться на льду. - Серийно разбавлять отсортированные и подсчитанные клетки, чтобы достичь требуемых входных концентраций в 1,5-миллилитровую микротрубу, убедившись, что конечные объемы впрыска не превышают 15 мкл. Добавьте 0,1% трипанового синего в каждую пробирку для лучшей визуализации содержимого во время трансплантации. Пипетку тщательно перемешать. Храните трубки на льду до использования.
Примечание. Успешное создание судна может быть достигнуто с использованием не менее 100 VESC.
- Пересаживают первичные ECs на молочную жироуловитель.
- Дезинфицируйте хирургические инструменты и столешницу. При использовании одних и тех же инструментов у нескольких животных для дезинфекции можно использовать стерилизатор борта.
- Анестезируйте трехнедельный микрофон BALB / c nudeE, используя протокол анестезии, рекомендованный ветеринаром вашего учреждения и IACUC. Положите каждую мышь в положение лежа на спине, спиной на рабочем столе. Иммобилизовать свои конечности с помощью липкой ленты.
- Окуните ватный тампон в раствор антисептика на основе йода. Протрите всю область живота мыши, чтобы стерилизовать поверхность кожи до операции.
- Держите и поднимите живот кожи мыши с помощью щипцов. Используйте хирургический скальпель, чтобы сделать небольшой вертикальный разрез на 1 см. Сделайте два разреза длиной около 0,5-1 см, каждый по направлению к задней ноге, чтобы достичь перевернутого Y-образного разреза.
- Используйте щипцы и ватный тампон, чтобы аккуратно отделить кожу от живота и прикрепить кожу к боку, чтобы открыть паховые молочные железы. Поместите мышь под стереоскоп и установите увеличение в 2.0X. Удостоверьтесь, что вы отрегулировали фокус так, чтобы прокладка молочной железы хорошо видна и оперирована.
- Поместите 27G 1/2 "needlЕ на льду до предварительного охлаждения. Предварительно пропустите 1-мл шприц с матричной матрицей на основе основания, чтобы удалить возможные пузырьки воздуха, захваченные в области прикрепления иглы. Внесите 15 мкл смешанного раствора на колпачок микроцентрифужной трубки и затем аспирируйте весь объем в загрунтованный шприц.
- Держите молочную жировую подушечку перед паховым лимфатическим узлом, используя тонкие пинцеты, и слегка поднимите его для легкой инъекции. Вставьте примерно 1/4 иглы шприца осторожно в жироуловитель.
- Отпустите пинцет с подушки причуды, чтобы захватить и стабилизировать иглу шприца. Медленно вводить раствор, чтобы предотвратить утечку жидкости. Удерживайте в течение нескольких секунд, чтобы убедиться, что смесь клеток затвердевает, чтобы свести к минимуму утечку при вытягивании иглы.
- Закройте лоскут кожи абсорбируемыми швами. Нанесите шпатлевку на кожу с использованием непрореагировавшего монофиламентного шва размером 5-0 и закройте раны узлами хирурга, каждый узел аппроксимируетНа расстоянии 0,3 см друг от друга. Альтернативно, закройте кожу раневыми скобами.
- Поместите обработанных мышей в отдельную клетку для восстановления. Поместите нагревательную лампу над клеткой, чтобы предотвратить обезболивание мышей от гипотермии. Поместите мягкую бумагу и хлопок в нижней части клетки, чтобы держать мышей теплой после операции.
- Наблюдайте за мышами тщательно, пока все получатели не будут полностью бодрствовать. В течение следующих нескольких дней применяйте послеоперационные анальгетики до всех животных или по указанию ветеринарного врача. Применяют антибиотики в соответствии с утвержденным протоколом животных, если происходит раневая инфекция. Если хирургическая рана была закрыта раневыми скобами, удалите зажимы для раны через 10 дней после операции, когда рана полностью закрыта.
3. Подготовка цельной ткани для микроскопического наблюдения
- Тканевый сбор
- Через 2 - 4 недели после имплантации обезболивают получателя BALB / cГолых мышей с внутрибрюшинной инъекцией 2,5% обезболивающего средства в дозе 0,12 мл на 20 г веса тела, как на этапе 2.2.2.
Примечание. Положительный рост сосудов можно обнаружить через 2-4 недели после трансплантации клеток. - Обозначьте системную циркуляцию реципиента с инъекцией хвостовой вены красителя изоэктин-647 в дозе 50 мкг / 25 г массы тела, ресуспендированной в 50 мкл стерильного PBS. Разрешить период отдыха 5 - 10 мин. Пожертвуйте мышам, используя CO 2 .
- Вырезать область молочной железы, где клетки были первоначально введены после операции 2.2.4; Используйте хирургические ножницы. Используя хирургическое лезвие, нарежьте ткань примерно 3 - 4 мм 3 кубиками в чашке Петри 6 см.
- Через 2 - 4 недели после имплантации обезболивают получателя BALB / cГолых мышей с внутрибрюшинной инъекцией 2,5% обезболивающего средства в дозе 0,12 мл на 20 г веса тела, как на этапе 2.2.2.
- Переваривание тканей и подготовка к окрашиванию антител.
- Дайте кусочки ткани в 15 мл центрифужную пробирку, заполненную 10 мл предварительно нагретой основной основы пищеварения (этап 1.1.2), дополненной коллагеназой III(300 ед. На 10 мл).
- Поместите 15 мл центрифужную трубку горизонтально на платформу для качания со скоростью, установленной на 100 об / мин, и температуру, установленную на 37 ° C в течение приблизительно 1 часа, ослабьте структуру ткани и удалите излишнюю ткань адипоцитов.
Примечание. Адипоциты, как правило, производят автофлуоресценцию, что может привести к возникновению шумного флуоресцентного фона. К концу пищеварения кусочки ткани должны иметь мягкий, облачный вид. Оптимальный период вываривания зависит от размера измельченных кусочков ткани и поэтому должен быть соответствующим образом скорректирован для получения наилучших результатов. Поскольку тканевая сосудистая сеть уже была помечена флуоресцентно-меченым изоценом, все следующие процедуры должны быть защищены от света. - Промойте кусочки ткани PBS при комнатной температуре в течение 10 мин. Закрепите ткань целиком, аккуратно поместив кусочки в 6-сантиметровую чашку Петри, наполовину заполненную 4% PFA (pH 7,2 - 7,4), чтобы сохранить флуоресценцию. Поместите чашку ПетриНа качающейся платформе и осторожно перемешивать ткань в течение 30 мин при комнатной температуре.
Примечание: PFA является канцерогеном, и его следует обрабатывать с осторожностью. - Удалите оставшуюся PFA и промойте фиксированную ткань три раза буфером для промывки целиком (0,1% твин в PBS) с интервалом в 10 минут между каждой промывкой.
- Цельное окрашивание тканевых антител.
- Разбавьте первичное антитело в буфере для окрашивания антител в 2 мл центрифужной пробирке. Инкубируйте ткань с первичным антителом в течение ночи при 4 ° C.
Примечание: в качестве первичных антител использовали анти-CD31 крысы (концентрация: 10 мкг / мл) или крысиный анти-VE-кадерин (CD144 / Cdh5, концентрация: 2,5 мкг / мл). Оба CD31 и VE-Cadherin являются маркерами поверхности клеток, которые используются для распознавания эндотелия. 5х-окрашивающий буфер антител готовят с 500 мМ малеиновой кислотой, pH 7,5; 750 мМ NaCl; И 0,5% (об. / Об.), Т. Е. Растворяют в PBS. Добавляйте только соответствующий объем сыворотки (5%) при приготовлении нового 1x рабочего раствора9 . - Удалите бутон для окрашивания антител и три раза промывайте всю ткань с помощью промывочного буфера с интервалом в 10 минут. Инкубируйте ткань с помощью вторичного антитела (см. Таблицу материалов ) плюс DAPI при комнатной температуре в течение 4 часов на качающейся платформе или в течение ночи при 4 ° C.
Примечание. Используйте DAPI (4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол) с конечной концентрацией 5 мкг / мл для визуализации ядер. - Промывайте всю ткань с промывочным буфером 3 раза по 10 минут каждый. Инкубируйте кусочки ткани в 80% глицерина или 80% сахарозы в течение ночи, чтобы обезводить ткань для лучшего сохранения.
- Поместите отдельные кусочки ткани на стеклянный предмет и удалите излишний буфер дегидратации. Накройте ткань установочной средой, поместите покровное и аккуратно сожмите ткань, чтобы установить ее.
- Выполнение конфокального микроскопического изображения. Для молочных желез общего назначения, приобретайте изображения с использованием 40X с NA = 1,3 масляными предметамиве. Приобретайте сканирование фрагментов Z-стеков при разрешении оптической секции 1024 x 1024 и разделение слоев 1,0-2,2 мкм.
Примечание. Чтобы зафиксировать правильный флуоресцентный световой сигнал, разделитель светового потока фильтра должен быть установлен в тройной дихроичный (TD) 488/553/638 с настройкой усиления в PMT Gain 600-800. Должны использоваться следующие источники возбуждения / излучения: mGFP с максимумами возбуждения / излучения 488/509 нм; MTomato с максимумами возбуждения / излучения 532/588 нм; Alexa-647, с максимумами возбуждения / излучения 594/665; И DAPI, с максимумами возбуждения / излучения 350/470.
- Разбавьте первичное антитело в буфере для окрашивания антител в 2 мл центрифужной пробирке. Инкубируйте ткань с первичным антителом в течение ночи при 4 ° C.
4. Трассировка линии с использованием генетически модифицированной модели мыши
- Обнаружение Procr + VESC с использованием мыши.
- Используйте штамм Procr CreerT2-IRES-tdTomato / + (называемый Procr CreerT2 ).
Примечание. В этой модели мыши, кассета CreERT2-IRES-tdTomato Procr 11 .- Мыши Cross Procr CreERT2 с репортерским штаммом Rosa26 mTtomatomGFP (называемым R26 mTmG ) для отслеживания судьбы эндогенных Procr + EC in vivo 11 . Определите все помеченные эндогенные Procr + EC и их потомство с использованием выражения GFP.
- Администрирование раствора тамоксифена 11 (10 мг тамоксифена, растворенного в 1 мл арахисового масла + 10% этанола для приготовления исходного раствора 10 мг / мл) внутрибрюшинно в дозе 4 мг / 25 г массы тела во время пубертатной стадии (5 недель Старый), чтобы отслеживать судьбу развития Procr + EC.
- Проанализируйте эффективность клонирования меченых клеток путем иммунного окрашивания целиком в соответствии с этапами подготовки, описанными на этапе 3. Получите прокладки молочных жиров от обработанных мышей как после кратковременного (2 дня) и продолжительные периоды времени (до 10 месяцев). См. Рисунок 3 .
- Используйте штамм Procr CreerT2-IRES-tdTomato / + (называемый Procr CreerT2 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Изоляция молочных желез VESC:
Чтобы выделить популяцию эндотелия для последующего трансплантационного анализа, зрелые (8-недельные) молочные железы первичной мыши были собраны в качестве донорского материала. Эндотелиальные клетки выделяли с использованием методики сортировки клеток на основе антител. Репрезентативные участки анализа FACS популяции VESC у 8-недельных EC-лимфоцитов C57BL / 6 показаны на рисунке 1 (рисунок, адаптированный из Yu et al., 8 , с разрешения).
Трансплантация жировой ткани молочной железы:
Прокладка молочных желез - идеальный сайт для изучения ангиогенеза. После выделения на основе FACS Procr + EC смешивали с 0,5% мембранной мембраной основания и 0,1% индикатором трипанового синего и затем транспланНа пустую жировую площадку трехнедельных получателей SCID. В период полового созревания молочная жировая подушка создает ангиогенную среду, способствуя ремоделированию сосудистой сети в соответствии с расширением эпителия молочной железы. В результате трансплантированные Procr + ECs (GFP + ) были включены в крупные сосуды хозяина ( рис. 2В , стрелки), а также образовали вторичные и третичные ветви сосудов GFP + ( рис. 2В , наконечники стрел). Хотя трансплантированные Procr + EC могут также генерировать сосуды в анализе матричной пробки (вставлены под боковую оболочку), сформированные сосуды появляются только капиллярно ( см. Рисунок 2A , рисунок, адаптированный из Yu et al., 8 , с разрешения).
Функциональность судов, созданных Procr + VESC:
Чтобы выяснить, работает ли GFP + vЭсселы в молочных жировых подушках являются частью функциональной циркуляционной сосудистой сети, изоэктин вводили внутривенной инъекцией до сбора урожая. Судами GFP + были изоэлектин +, что указывает на то, что сформированные сосуды освещаются и связаны с сосудистой сеткой хозяина ( рисунок 2B , рисунок, адаптированный из Yu et al., 8 , с разрешения).
Трассировка трассировки молочных желез VESC с использованием Procr CreerT2 ; Rosa26 mTmG Мышь Модель:
Procr CreERT2 ; Мышей Rosa26 mTmG использовали для отслеживания судьбы Procr + VESCs in vivo ( рисунок 3A ). Чтобы исследовать, как Procr + VESC способствуют устойчивому ангиогенезу и сосудистому ремоделированию во время полового развития молочной железы Procr CreerT2 ; Rosa26 mTmG назначалиD с тамоксифеном для индуцирования экспрессии GFP в популяции Procr + эндотелия. Прокладки молочных жиров обработанных лекарственными средствами Procr CreerT2 ; Мышей Rosa26 mTmG собирали как краткосрочные (2 дня после инъекции, рис. 3B ), так и долгосрочные (до 10 месяцев после инъекции, рисунок 3C -F, рисунок, адаптированный из Yu et al., 8 , с разрешения). Подготовка цели была проведена для визуализации результатов трассировки. Идентификация сосудистого эндотелия может быть подтверждена окрашиванием маркером эндотелиальной поверхности VE-Cadherin (Cdh5; Рисунок 3B , правое изображение).
Рисунок 1: Анализ VESC в мышечной молочной железе. Анализ FACS экспрессии Procr у 8-недельных C57BL / 6 молочных желез EC. 8-недельный vДля сбора молочных желез использовались самцы irgin C67BL / 6. После подготовки образцов клеток анализировали необработанный образец и каждый одноцветный контроль для определения напряжения для каждого цвета. Параметры компенсации рассчитывались так, чтобы избежать флуоресценции или фонового окрашивания. Был создан шаблон для правильного стробирования и сортировки для желаемых популяций клеток. Чтобы установить иерархию сортировки FACS, удалены остатки всех событий, а затем удалены дублеты или клеточные клеточные кластеры. Линейные клетки были закрыты, и CD31 и CD105 использовали для определения популяций эндотелия. Procr + клетки были выделены из CD31 + CD105 + EC по сравнению с контролем FMO. Эта цифра была изменена с Yu et al. 8 , с разрешения. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Анализ трансплантации молочной железы VESC. ( A ) Судно, образованное из Procr + EC в подвальной мембране, подкожно под крышкой. ( B ) Конфокальное изображение жировой прокладки молочной железы реципиента, указывающее на интеграцию и вклад трансплантированных Procr + ECs (GFP +) для размещения сосудистой сети молочной железы. EC были противопоставлены CD31. ( C ) Внутривенная инъекция у реципиентных мышей с изоэктином показала, что выросты образовали освещаемые сосуды. Шкала шкалы, 50 мкм. Изображения были получены с использованием 40X NA 1.3 масляного объекта. Плиточные сканы Z-стеков были получены при разрешении оптического сечения 1024 × 1024, а каждый слой был от 1,0 до 1,2 мкм. Чтобы зафиксировать правильный световой сигнал флуоресценции, разделитель луча фильтра был установлен на TD 488/553/638, а gAin при PMT Gain 600 - 800. Использовались следующие источники возбуждения / испускания: mGFP с максимумами возбуждения / излучения 488/509 нм; MTomato, с максимумами возбуждения / излучения 532/588 нм; Alexa-647, с максимумами возбуждения / излучения 594/665; И DAPI, с максимумами возбуждения / излучения 350/470. Эта цифра была изменена с Yu et al. 8 , с разрешения. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Трассировка линии Procr + EC демонстрирует их вклад в расширение Клонала ЕС во время разработки. ( A ) Иллюстрация стратегии трассировки линии с использованием Procr CreERT2 ; Линия Rosa26 mTmG (Левая панель). экспериментальныйНастройки, используемые в краткосрочной (2 дня) и долгосрочной (от 7 дней до 10 месяцев), как указано (правая панель). ( BF ) Конфокальная визуализация сосудистой сети грудной клетки во всем мире после различных периодов трассировки, указывающая начальное местоположение меченых Procr + EC и их вклад в сосудистую сеть молочной железы на разных этапах трассировки. Шкала шкалы = 50 мкм. Эта цифра была изменена с Yu et al. 8 , с разрешения. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анализ ангиогенеза представляет собой хороший экспериментальный подход к изучению сосудистой динамики. Мышь сетчатки сетчатки, которая развивается постнатально, оказалась привлекательной моделью для изучения ангиогенеза 12 . Несмотря на то, что он относительно доступен, фактические манипуляции в сосудистом ложе сетчатки довольно сложны. До настоящего времени наиболее оптимальной трансплантацией in vivo был анализ пробки, который охватывает клетки внутри массы матрицы подвальной мембраны и хирургически имплантирует / вводит подкожно во фланговой области мыши-реципиента. Этот анализ ангиогенеза эффективен при тестировании регенеративного потенциала и способности сосуществования встроенных клеток. Однако, поскольку расположение имплантированной матричной пробки создает сравнительно изолированную среду для клеток внутри, она не обеспечивает оптимальную физиологическую нишу. Недавно была разработана новая модель ангиогенеза легкого, применяя фибриновый патч на surfaСайт легкого мыши 13 . Тем не менее, манипуляции представляют еще один риск, потому что эта техника работает инвазивно внутри полости грудной клетки мыши, поэтому затрудняет ее использование в более обобщенном анализе.
В описанном здесь анализе ангиогенеза небольшой объем клеточной смеси трансплантируется внутри жировой прокладки молочной железы, что обеспечивает пространство, матрицу и богатые ангиогенные стимулы во время полового созревания. Это позволяет сгенерированным сосудам соответствовать и интегрироваться в ремоделирование сосудистой сети организма, обеспечивая дополнительную функциональную оценку, а также представляя преимущество перед анализом подкожных проб. Кроме того, молочная жировая подушка расположена по периметру брюшной полости, что делает ее очень доступной. Операция на молочной клетке молочной железы приводит к ограниченному бедствию животному-реципиенту, избегая инвазивных хирургических процедур, связанных с анализом сетчатки и легких.
Кровь сосудистой системыHin орган часто переплетается между тканевыми компонентами, чтобы максимизировать сосудистое покрытие, чтобы можно было обеспечить оптимизацию кислорода и кислорода в крови. По этой причине обычное разделение ткани часто перехватывает трубчатую структуру его сосудов. Анализ на сосудистые свойства лучше всего проводить, когда сосуды можно сохранять и оставаться неповрежденными. Цельная подготовка ткани может в значительной степени сохранить целостность сосудистой архитектуры внутри. Этот метод позволяет не только наблюдать достоверное пространственное распределение кровеносного сосуда внутри органа, но также и отношение к другим тканевым компонентам.
Гомеостаз ткани, содержащей стволовые клетки, поддерживается балансировкой генерации и потерей клеточной массы. Стволовые клетки в конкретном населяющем органе часто защищаются и находятся в тесном контакте с окружающей тканевой средой, называемой нитью стволовых клеток. Следовательно, stuАнализы тканей взрослых стволовых клеток предпочтительно должны проводиться в интактном физиологическом контексте. Анализы трансплантации могут служить средством оценки клеточного потенциала, в то время как техника трассировки линии позволяет исследовать истинную клеточную судьбу в пределах естественной среды обитания. В последние годы трассировка линий in vivo стала мощным методом экспериментальной оценки свойств стеблей. Эта стратегия была использована для идентификации стволовых клеток тканей и их потомков в нескольких тканях, включая кишечник 10 , 14 , волосяные фолликулы 15 , желудок 16 и поджелудочную железу 17 . Метод трассировки линии в основном основан на генетической маркировке стволовых клеток и инициируется в определенных популяциях. Поэтому трудно исключить возможность того, что фактическая стебель обнаруживается в еще меньшей субпопуляции в меченых клетках, Поэтому крайне важно точно отображать клетку происхождения прослеживаемых клонов и количественно измерять эффективность трассировки с течением времени. Таким образом, способность самообновления помеченного населения может быть воспринята.
Описанный анализ ангиогенеза может быть модифицирован для конкретных целей исследования: его можно использовать не только для проверки способности генерации сосудов популяций эндотелия, но и для оценки влияния ангиогенных факторов на локализованное ремоделирование сосудов. Однако, поскольку молочная железа подвержена динамическим морфологическим изменениям на разных стадиях развития ( например, половым созреванием, циклам эструса и беременности), следует учитывать влияние системных изменений, таких как колебания гормонального уровня, во время интерпретации результатов. Критические этапы в этом анализе включают выделение первичных эндотелиальных клеток. Для оптимального получения жизнеспособных клеток для трансплантации процедуры изоляции FACS должны быть bЕ осторожно. Следует проявлять осторожность, чтобы избежать жесткой обработки во время подготовки клеток, таких как отщепление клеток и суспендирование. Другим важным шагом является инъекция клеточной смеси в жир пот. Во время инъекции жировой прокладки важно убедиться, что смесь клеток точно осаждается внутри жировой прокладки. Это может быть сложно, если вставка иглы слишком глубокая / мелкая или общий объем превышает рекомендуемую дозировку.
Этот протокол обеспечивает ряд экспериментальных методов, которые помогли идентифицировать популяцию эндотелиальных стволовых клеток. С помощью этих методов можно было оценить свойства стволовых клеток путем трансплантации, а также отслеживать и наблюдать их поведение в физиологических процессах in vivo . Эти подходы являются эффективными инструментами, которые могут быть применены к нескольким дисциплинам, включая исследования популяций эндотелия в опухолевых средах и изменения их клеточной активности. яВ частности, трансплантация жировой прокладки и подготовка всего растения являются воспроизводимыми и мощными методами, которые могут помочь в будущих усилиях по изучению различных аспектов сосудистой биологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным научным фондом Китая (31530045 и 31371500 до ЯЗ, 31401245 - QCY), Министерством науки и технологий Китая (2014CB964800), Китайской академией наук (XDB19000000 до ЯЗ) и китайской Общество клеточной биологии (Ранняя карьера для QCY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(EDTA) (1x) | Gibco (Life Technologies) | 25300-062 | 0.05% Trypsin |
| 0.22 µm Filter Unit | Merck Millipore Ltd. | SLGP033RB | 0.22 µm Filter |
| 2-Methylbutanol-2, ReagentPlus | Sigma-Aldrich | 24, 048-6 | Tert Amyl Alcohol |
| 222, Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25g | 222, Tribromethanol |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) | Invitrogen | D1306 | DAPI |
| 70 µm Cell Strainer | BD FAL | 352350 | 70 µm Cell Strainer |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 188105 | Glass slides |
| Anti-mouse CD105 APC | eBioscience | 17-1051-82, clone MJ7/18 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| Anti-mouse CD201 Biotin | eBioscience | 13-2012-82 | for FACS analusis use at 2.5 µg/mL |
| Anti-mouse CD31 PE-Cyanine 7 | eBioscience | 25-0311-82, clone 390 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| BD FACSJazz Cell Sorter | BD Biosciences | 655489 | FACS |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 100190332 | BSA |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Centrifuge |
| Collagenase type 3 | Worthington-Biochem | #LS004183 | Collagenase III |
| Confocal microscopy | Leica | sp8 | Confocal |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D2463-5VL | Dnase I |
| Donkey anti-Rat Cy3 | Jackson ImmunResearch | 712-165-150 | Secondary antibody, use at 0.5 µg/mL |
| Dumont Forceps | WPI | 500342 | Froceps |
| Dumont Forceps - Micro-Blunted Tips | FST | 11253-20 | Forceps |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | FBS |
| FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119 | BioLegend | 78022 | Blood lineage cocktail for FACS analysis, use at 25 µL per test |
| Glycerol | Sigma | G6279 | Glycerol |
| Iscov's Modified Dulbecco's Medium | Gibco (Life Technologies) | 12440-053 | IMDM |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora 647 | Invitrogen | Z32450 | Isolectin-647 |
| Matrigel Matrix (growth factor reduced) | BD | 356231 | Matrigel |
| Mouse strain (Actin-GFP) | Jax Laboratories | 3773 | Actin-GFP |
| Mouse strain (C57BL/6) | SLAC | C57BL/6 | C57BL/6 |
| Mouse strain (BALB/c nude) | SLAC | BALB/c nude | Nude mice |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | PFA |
| Penicilin Streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 5140-122 | Pen/Strep |
| Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1x | Gibco (Life Technologies) | c20012500BT | PBS |
| PRIM1640 | Gibco (Life Technologies) | c11875500CP | PRIM1640 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | Mounting Medium |
| Rat anti CD144 | BD Biosciences | 550548 | for whole-mount analysis, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy for endothelial tight junction, use at 2.5 µg/mL |
| Rat anti CD31-biotin | BD Biosciences | 553371 | for whole-mount analusis, anti-CD31/PECAM1 antibody for endothelial surface adhesion molecule, use at 10 µg/mL |
| Red Cell Lysis Buffer | Sigma | R7767-100ML | Red blood cell lysing buffer |
| Straight/Sharp-Blunt/10cm | FST | 14028-10 | Fine Scissors |
| Streptavidin eFluor 450 | eBioscience | 48-4317-82 | for FACS analysis use at 0.5 µg/mL |
| Tamoxifen | Sigma | 101551374 | TAM |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | TritonX |
| Wax Coated Braided Silk (Size 5-0 USP (1 Metric), 18 inches (45 cm) BLACK on C-1 Needle) | COVIDIEN | S1173 | Suture |
| Sterile Disposable Scaplels | Swann Morton | #10 | Scalpel |
| Betadine | Yifeng Medical | 20160101 | Antiseptic solution |
References
- Thomas, E. D., Lochte, H. L., Lu, W. C., Ferrebee, J. W. Intravenous infusion of bone marrow in patients receiving radiation and chemotherapy. N Engl J Med. 257 (11), 491-496 (1957).
- Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).
- Bompais, H., et al. Human endothelial cells derived from circulating progenitors display specific functional properties compared with mature vessel wall endothelial cells. Blood. 103 (7), 2577-2584 (2004).
- Fang, S., Wei, J., Pentinmikko, N., Leinonen, H., Salven, P. Generation of functional blood vessels from a single c-kit+ adult vascular endothelial stem cell. PLoS Biol. 10 (10), e1001407 (2012).
- Naito, H., Kidoya, H., Sakimoto, S., Wakabayashi, T., Takakura, N. Identification and characterization of a resident vascular stem/progenitor cell population in preexisting blood vessels. EMBO J. 31 (4), 842-855 (2012).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Snippert, H. J., Clevers, H.
- Yu, Q. C., Song, W., Wang, D., Zeng, Y. A. Identification of blood vascular endothelial stem cells by the expression of protein C receptor. Cell Res. 26 (10), 1079-1098 (2016).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506, 322-327 (2014).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Wang, D. S., et al. Identification of multipotent mammary stemcells by protein C receptor expression. Nature. 517, 81-U201 (2015).
- Stahl, A., et al. The Mouse Retina as an Angiogenesis Model. Invest Ophth Vis Sci. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Mammoto, T., Mammoto, A. Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis. J. Vis. Exp. (94), e52012 (2014).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17 (6), 849-860 (2009).
