Summary
עבודה זו מדגימה גישה חדשנית להעריך את התפשטות, הבחנה, ואת היכולת להרכיב פוטנציאל של תאי גזע אנדותל כלי הדם (VESCs) באמצעות השתלת כרית שומן החלב ואחריו הכנת רקמות הר שלם עבור תצפית מיקרוסקופית. א השושלת מעקב אחר אסטרטגיה לחקור את ההתנהגות של VESCs in vivo מוצג גם.
Abstract
תאי האנדותל (ECs) הם אבני הבניין הבסיסיות של הארכיטקטורה הווסקולארית ותווך את צמיחת כלי הדם ואת שיפוץ כדי להבטיח פיתוח כלי תקין הומיאוסטזיס. עם זאת, מחקרים על היררכיה השושלת האנדותל להישאר חמקמק בשל היעדר כלים כדי לקבל גישה, כמו גם להעריך באופן ישיר את ההתנהגות שלהם in vivo . כדי לענות על חסרון זה, מודל רקמות חדש ללמוד אנגיוגנזה באמצעות כרית שומן החלב פותחה. בלוטת החלב מתפתחת בעיקר בשלבים שלאחר הלידה, כולל גיל ההתבגרות וההריון, שבמהלכם התפשטות האפיתל החזקה מלווה בשיפוץ נרחב של כלי הדם. שומני שומן החלב לספק שטח, מטריקס, עשירים אנגיוגניים גירויים מן האפיתל החלב גדל. יתר על כן, רפידות שומן החלב ממוקמות מחוץ חלל הצפק, מה שהופך אותם אתר השתלת נגיש בקלות להערכת פוטנציאל angiogenic של תאים אקסוגניים. עבודה זו מתארת גם יעילותNt מעקב הגישה באמצעות עכברים כתב פלואורסצנטי במיוחד התווית האוכלוסייה ממוקדת של תאי גזע אנדותל כלי הדם (VESCs) ב vivo . שיטה זו מעקב השושלת, יחד עם רקמות שלאחר מכן מיקרוסקופ הר שלם, לאפשר הדמיה ישירה של תאים ממוקד הצאצאים שלהם, שדרכו יכולת התפוצה ניתן לכמת את המחויבות בידול יכול להיות מיפוי גורל. באמצעות שיטות אלה, אוכלוסייה של Bipotent חלבון C קולטן (Procr) להביע VESCs זוהו לאחרונה במערכות כלי הדם מרובים. Procr + VESCs, המביא הן ECs חדשים pericytes, לתרום באופן פעיל אנגיוגנזה במהלך פיתוח, הומאוסטזיס, תיקון פציעה. בסך הכל, כתב היד הזה מתאר השתלה חדשה כרית שומן החלב ב vivo השושלת מעקב טכניקות שניתן להשתמש בהם כדי להעריך את תכונות תאי גזע של VESCs.
Introduction
במהלך הפיתוח והומיאוסטזיס, צמיחת כלי הדם ושיפוצם נאמנים בהתאם לצמיחת איברים ולתיקונם. אנגיוגנזה מתאר את הדור של כלי דם חדשים מכלי הדם הקיימים, ונחשב לכוח מרכזי המתווך את השינויים הדינמיים הדינמיים. כל כלי דם הוא פנימי שורות עם שכבת תאי האנדותל (ECs), והם נראים הבסיס של הארכיטקטורה כלי השיט. במשך זמן רב, המנגנון שדרכו הבריכה EC מתחדשת במהלך ההומיאוסטזיס נותרה לא ברורה, והועלו טיעונים על השאלה אם מחזור כלי הדם הוא תוצאה של התפשטות הבשלות האירופית או תרומת הפעילות של תאי גזע ו / או אב. בשל היעדר ראיות פיזיולוגיות ישירות, הקיום והזהות הסלולרית של תאי גזע אנדותליים (VESCs) נותרו גם הם שנויים במחלוקת.
אחת הגישות הנפוצות ביותר לאימות התנהגות תאי גזע היא באמצעות הטרנספלאןTation של תאי גזע putative לתוך עכברים מקבלי. שיטה זו מודדת את פוטנציאל הגזע של תאי גזע מועמדים in vivo. ההשתלה יושמה לראשונה על המחקר של תאי גזע של מח עצם 1 , אשר תרמו להקמת המאפיינים ההיררכיים של המערכת ההמטופויטית 2 . בתחום האנדותל, מטריצת קרום במרתף ( למשל, matrigel) תקע מוכנס תת עורי מתחת לעור האגף כבר תקן assay angiogenesis vivo בשימוש כדי להתמודד עם יכולות היווצרות כלי שיט של ECs המושתלים. שיטות ניסיוניות מרובות, כולל היווצרות המושבה במערכות תרבות 3D השתלה, הציעו אבות פוטנציאליים EC / אוכלוסיות VESC 3 , 4 , 5 , 6 . עם זאת, מאז ECs מוטבע במטריצה בממברנה במרתף נפרדים יחסיתהרקמה שמסביב, זה אינו מספק את הסביבה נישה אופטימלי הנדרש כדי לחקור את הפוטנציאל angiogenic של תאים המושתלים. כתוצאה מכך, כלי שנוצרו בתוך תקע המטריצה הם בעיקר נימיות כמו והם ניתנים למדידה באופן פונקציונלי.
בלוטת החלב מתפתחת לאחר הלידה, עם הצמיחה החזקה ביותר המתרחשת במהלך ההתבגרות וההריון. בשלב הבגרותי, האפיתל החלב עובר התרחבות מהירה, כדי לתפוס את כל פנקס השומן החלב, מלווה שיפוץ יעיל של מבנים וסקולריים שמסביב. לפיכך, בלוטת החלב מציעה מודל מצוין לחקר אנגיוגנזה. הוא מספק מרחב, מטריקס ועשירים גירויים אנגיוגניים מן האפיתל החלב גדל ולכן הוא אתר השתלת אידיאלי להערכת פוטנציאל angiogenic של תאים אקסוגניים. בנוסף, פנקס שומן החלב מאפשר כלי אקסוגניים נוצרו להשתלב עם מערכת מחזור המארחת, ומאפשר f נוספתהערכה לא-פונקציונלית ומייצגת יתרון על פני השתלות תת-עורית.
למרות מבחני culturing והשתלות במבחנה הם דרך יעילים כדי לחקור את מאפייני ההתחדשות של אוכלוסיית תא, ידוע כי מבחנים כזה עלולים לעורר פלסטיות כתאים נלקחים מן הגידול הטבעי שלהם, ושינויים עלולים להיגרם כאשר תאים מנותקים הסביבה הפיזיולוגית שלהם 7 . לכן, קבלת ראיות ישירות vivo גורל התא היא הגישה העיקרית לקידום ההבנה הנוכחית של ההתנהגות של אוכלוסיות האנדותל.
מיפוי גורל גנטי ( כלומר, ב vivo השושלת מעקב) הוא הכרחי לזיהוי של VESCs ו לחקירת תכונותיהם במערכת הגוף, כפי שהוא יכול לגלות התנהגות התא גזע vivo בהקשר הפיזיולוגי שלה, ואת הגזע בפועל יכול להיות מוֹעֳרָך. השושלתNg מספק ראיות ישירות להתמדה ארוכת הטווח ( כלומר, התחדשות עצמית) של VESCs המועמדים ויכולתם לייצר סוגי תאים עבור רקמת המוצא ( כלומר, כוח ההבחנה).
פרוטוקול זה מתאר רומן חזה רומן חדש השתלת טכניקה שיטת השושלת השורש כדי לבחון את יכולת ייצור כלי של VESCs. טכניקות אלה להתגבר על חסרונות של מבחני זמין כיום ולספק דרך חדשה כדי להעריך באופן אופטימלי את תכונות תאי גזע של VESCs. גישות אלה הם כלים יעילים שניתן להשתמש בהם כדי להעריך את ההתנהגות ואת כלי יצירת המאפיינים של אוכלוסיות האנדותל, כמו גם לקבוע שינוי פוטנציה תא כוח כלי הדם בתוך סביבה פתולוגית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
נהלים ניסיוניים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים ושימוש ועדת שנחאי המכון לביוכימיה וביולוגיה התא, האקדמיה הסינית למדעים תחת פרוטוקול מאושר SIBCB-NAF-15-002-S335-003.
1. בידוד של VESCs מן בלוטת החלב עכבר
- קציר בלוטת החלב ועיכול רקמות.
- השתמש 8 בן אקטין- GFP בוגרת כתבת בעכברים הכתב, עם משקולות טווח בין 20 ל 25 גרם, כמו תורמים רקמות.
הערה: תאים שמקורם התורם ניתן לעקוב בקלות על ידי ביטוי GFP. - הכן רקמות בסיס עיכול בינוני המורכב של 5% בסרום שור עוברית (FBS), 1% עט / סטרפט, ו 25 מ"מ HEPES ב RPMI1640. מסננים את התערובת באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר לעקר מראש לחמם אותו ל 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
- להקריב את העכברים בתא CO 2 . לנתח את הצמד הרביעי של בלוטות החלב משפיעה על ידי ביצוע הראשון עור אנכי אניNcision על קו האמצע התחתונה התחתונה באמצעות אזמל (או מספריים כירורגיים). בעדינות לקלף את העור בצד אחד כדי לחשוף את בלוטת החלב בשדיים באמצעות מלקחיים. השג את בלוטות החלב הרביעיות משני הצדדים וחתך אותן לחתיכות יפות בצלחת פטרי 6 ס"מ בעזרת מספריים.
- למדוד את המשקל הכולל של הרקמה טחון ומניחים אותו צינור 50 מ"ל.
הערה: ודא כי רקמה וכתוצאה מכך הוא קטן מ 1 מ"מ 3 בגודל עבור כל חתיכה. תשואה טיפוסית היא כ -5,000 VESCs לכל בעל חיים.
- למדוד את המשקל הכולל של הרקמה טחון ומניחים אותו צינור 50 מ"ל.
- הכן בינוני בסיס העיכול בצינור 50-מ"ל צנטריפוגה capped בנפח של 10 מ"ל לכל 1 גרם של רקמת בשר. הוסף collagenase סוג 3 בריכוז של 300 יחידות לכל 10 מ"ל של המדיום עיכול בסיס להוות למאגר העיכול. מערבבים באופן שווה ומוסיפים אותו לרקמה.
- אופקית במקום צינור 50 צנטריפוגה מ"ל על פלטפורמת נדנדה ולהגדיר את המהירות עד 100 סל"ד ואת הטמפרטורה ל 37 מעלות צלזיוס. לְהַתְסִיסרקמת החלב עבור 2 שעות. בדוק ידני לנער את הצינור כל 20 דקות כדי להבטיח עיכול תקין.
הערה: מטרת העיכול ברקמות לפני FACS היא להכין פתרון תא בודד מ רקמות מוצקות. לכן, עד סוף העיכול, התוכן צריך להיות פתרון עבה ללא חתיכות רקמות גלוי.
- השתמש 8 בן אקטין- GFP בוגרת כתבת בעכברים הכתב, עם משקולות טווח בין 20 ל 25 גרם, כמו תורמים רקמות.
- יחיד פתרון התא הכנה.
- לאחר העיכול, למעלה למעלה צינור 50 צנטריפוגות מ"ל עם מראש חימם, סטרילי PBS ולהפוך את הצינור לערבב באופן שווה. צנטריפוגה הצינור ב XG 200 במשך 5 דקות כדי להשיג גלולה התא.
- הסר את supernatant וסובב את החלק התחתון של הצינור כדי לשחרר את גלולה התא. הוסף ב 3 מ"ל של תאי דם אדומים lysing חיץ (ראה טבלה של חומרים) ו דגירה ברדס תרבות רקמה בטמפרטורת החדר (RT) במשך 5 דקות כדי לחסל את כדוריות הדם האדומות.
- הוסף 10 מ"ל של PBS סטרילית להפוך את הצינור לערבב באופן שווה. צנטריפוגה התוכן רקמות ב 200 xg במשך 5 דקות דיסקארד supernatant. הוסף 3 מ"ל של מחומם מראש 0.05% טריפסין ולאחסן את הצינור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לעכל עוד את הרקמה הנותרת.
- הוסף ב 3 מ"ל של חימם מראש IMDM ולאחר מכן להוסיף 100 μL של DNase אני פתרון (0.25 מ"ג DNase אני מדולל 1 מ"ל של PBS). חנות הצינור על 37 מעלות צלזיוס כדי לשבור את החוטים DNA. לעבור את תערובת רקמות דרך מסננת 70 מיקרומטר התא כדי להשיג את הפתרון התא. שוטפים את מסננת פעמיים עם 2 מ"ל של PBS + 5% FBS לנטרל את העיכול האנזימטי.
- צנטריפוגה תערובת התא ב XG 200 במשך 5 דקות כדי גלולה התאים. מחק supernatant ו resuspend תא גלולה ב 1 מ"ל של PBS + 5% FBS עבור מכתים נוגדן.
- FACS המבוסס על FACS + בידוד VESC.
- נושא תערובת התא המתקבל רקמת החלב התורם מכתים נוגדן בעקבות פרוטוקולים שגרתית שפורסמו 8 .
הערה: נוגדנים הבאים שימשו: אנטי עכבר(FICC), FTCC, אנטי עכבר CD31 (PECAM1) -PECY7, אנטי עכבר CD105-APC (כולם בשימוש בריכוז של 1 מיקרוגרם / מ"ל), anti-mouse CD201 (Procr) -botin (בשימוש בריכוז של 2.5 מיקרוגרם / מ"ל), ו streptavidin-v450 (בשימוש בריכוז של 0.5 מיקרוגרם / מ"ל).- לאחר מכתים נוגדנים, למעלה את התאים עם PBS + 5% FBS ואז צנטריפוגה ב 200 גרם במשך 5 דקות. מחק supernatant ו resuspend התאים עם 1 מ"ל של PBS + 5% FBS. מסנן דרך מסננת תא 40 מיקרומטר. מקום על הקרח עד FACS מיון.
- המשך לבצע מיון מבוסס FACS כדי לבודד Procr + VESCs.
- לנתח את המדגם unstained וכל צבע אחד שליטה כדי לקבוע את המתח עבור כל צבע. חישוב הפרמטרים פיצוי כדי למנוע אוטומטי הקרינה או מכתים ברקע. הגדרת התבנית עבור gating נכונה ומיון עבור אוכלוסיות תאים הרצוי.
- כדי לקבוע את ההיררכיה של מיון FACS, תחילה לסלק פסולתכל האירועים ולאחר מכן להשליך הכפילים או אשכולות תא דבק ידי מפעילה עם רוחב. שער מחוץ לתאי שושלת דם ולאחר מכן להשתמש CD31 + ו CD105 + כדי להגדיר את אוכלוסיות האנדותל.
הערה: התאים + Procr בודדו מ- CD31 + CD105 + ECs בהשוואה לבקרת FMO. תרשים ניתוח FACS נציג מוצג באיור 1 . A VSC מבודד האוכלוסייה VESC צריך להיות מושעה IMDM + 50% FBS ומאוחסנים על הקרח עד עיבוד נוסף.
- נושא תערובת התא המתקבל רקמת החלב התורם מכתים נוגדן בעקבות פרוטוקולים שגרתית שפורסמו 8 .
2. ב VIVC VIVC VIVC VISC באמצעות לוח שומן החלב
- הכן ECs העיקרי להשתלה.
- למעלה- FACS תאים מיון עם 10 מ"ל של PBS + 5% FBS ואז צנטריפוגה ב XG 200 במשך 5 דקות ליישב את התאים למטה לתחתית.
- לשאוב את הנוזל בזהירות, לספור את מספר התא באמצעות hemocytometer, ו resuspend תא גלולה עם תערובת הממברנה במרתף במרתף (קונסיעוקץ של 50% במרתף בממברנה במרתף ו PBS עם 20% FBS, בתוספת 100 ng / mL rmVEGF ו 60 U / מ"ל הפרין) להגיע לריכוז עבודה של 15,000 תאים / 15 μL.
הערה: תערובת הממברנה במרתף צריך תמיד להיות מאוחסן על הקרח. - סדרתי לדלל את מיון תאים ממוינים ונספרו להגיע לריכוז קלט הנדרש מיקרוטייז 1.5 מ"ל, ולוודא כי נפח הזרקה הסופי לא יעלה על 15 μL בסך הכל. הוסף 0.1% Trypan כחול לכל צינור כדי להדמיה תוכן טוב יותר במהלך ההשתלה. פיפטה ביסודיות לערבב. אחסן את הצינורות על הקרח עד לשימוש.
הערה: ייצור ספינות מוצלח יכול להיות מושגת עם מינימום של 100 VESCs.
- השתלת ECS ראשוני כדי פנקס שומן החלב.
- לחטא את מכשירים כירורגי benchtop. אם באמצעות אותם מכשירים על בעלי חיים מרובים, sterilzer חרוז יכול לשמש לחיטוי.
- להרדים 3 בן שבוע BALB / c mic עירוםE באמצעות פרוטוקול ההרדמה המומלץ על ידי הווטרינר של המוסד שלך IACUC. הנח כל עכבר במצב שכיבה, עם הגב על שולחן הניתוח. לשתק את איבריה באמצעות סרט דבק.
- טובלים מטלית כותנה לתוך תמיסת חיטוי מבוסס יוד. נגב את אזור הבטן כולו של העכבר ביסודיות לעקר את פני העור לפני הניתוח.
- החזק ולהרים את העור הבטן של העכבר עם מלקחיים. השתמש באזמל כירורגי לבצע חתך אנכי קטן, 1 ס"מ. לעשות שני חתכים על 0.5 - 1 ס"מ אורך, כל לכיוון הרגל האחורית, כדי להשיג חתך הפוך, בצורת Y.
- השתמש מלקחיים ו צמר גפן כדי להפריד בעדינות את העור מן הבטן ואת סיכות העור לצדדים כדי לחשוף את בלוטות החלב משפיעה. מניחים את העכבר תחת stereoscope ולהגדיר את ההגדלה 2.0X. הקפד להתאים את המיקוד כך פנקס שומן החלב ניתן לראות בבירור ומופעל על.
- מניחים 27G 1/2 "אינפלE על קרח כדי מראש צמרמורת. ראש מזרק 1 מ"ל עם תערובת הממברנה במרתף במרתף מראש כדי להסיר בועות אוויר אפשרי לכודים באזור המחט מצרף. פיפטה 15 μL של פתרון מעורב על הכובע של הצינור microcentrifuge ולאחר מכן לשאוב את נפח כולו לתוך מזרק דרוך.
- החזק את פנקס השומן החלב מול הצומת הלימפה המפשעת, באמצעות פינצטה בסדר, ולהרים אותו קלות עבור הזרקת קל. הכנס על 1/4 של המחט מזרק בעדינות לתוך כרית שומן.
- שחרר את פינצטה מ בלוק תחביב לאחיז ולייצב את המחט מזרק. להזריק את הפתרון באיטיות כדי למנוע דליפת נוזלים. החזק במשך כמה שניות כדי לוודא תערובת התא הוא מוצק כדי למזער את הדליפה בעת משיכת המחט.
- סגור את דש העור עם התפרים absorbable. תפר את דש העור באמצעות גודל 5-0 non-reactive monufilament תפר ולסגור את הפצעים עם קשרים בסגנון המנתח, כל קירוב knotAtely 0.3 ס"מ זה מזה. לחלופין, סגור את העור עם סיכות הפצע.
- מקום עכברים פעלו בכלוב נפרד להתאוששות. מניחים מנורת חימום מעל הכלוב כדי למנוע את עכברים מורדמים סובל היפותרמיה. מניחים נייר רך וכותנה בחלק התחתון של הכלוב כדי לשמור על עכברים חמים שלאחר הניתוח.
- שימו לב לעכברים בזהירות עד שכל הנמענים ערים לחלוטין. במשך כמה ימים, יש ליישם משככי כאבים לאחר הניתוח מראש לכל בעלי החיים או על פי הוראות הרופא הוטרינר. החל אנטיביוטיקה על פי פרוטוקול חיה מאושרת אם הפצע מתרחש. אם הפצע כירורגי היה סגור עם סיכות פצע, להסיר את קליפים הפצע 10 ימים לאחר הניתוח, כאשר הפצע נסגר לחלוטין.
3. שלם הר רקמת הכנה עבור תצפית מיקרוסקופית
- קציר רקמות
- ב 2 - 4 שבועות לאחר ההשתלה, להרדים את הנמען BALB / cעכברים בעירום תוך הזרקת intra-פריטוני של סוכן הרדמה 2.5% במינון של 0.12 מ"ל לכל 20 גרם של bodyweight, כמו בשלב 2.2.2.
הערה: צמיחה של כלי שיט חיובי יכולה להיות מזוהה 2-4 שבועות לאחר השתלת תאים. - תווית מחזור מערכתית הנמען עם הזרקת וריד הזנב של צבע isolectin-647 במינון של 50 מיקרוגרם / 25 גרם של bodyweight, resuspended ב 50 μL של סטרילי PBS. אפשר מנוחה של 5 - 10 דקות. להקריב את העכברים באמצעות CO 2 .
- לנתח את האזור של רקמות החלב שבו התאים הוזרקו תחילה בעקבות שלב 2.2.4; להשתמש במספריים כירורגיים. באמצעות להב כירורגי, לקצוץ את הרקמה לתוך בערך 3 עד 4 מ"מ 3 קוביות בצלחת 6 ס"מ פטרי.
- ב 2 - 4 שבועות לאחר ההשתלה, להרדים את הנמען BALB / cעכברים בעירום תוך הזרקת intra-פריטוני של סוכן הרדמה 2.5% במינון של 0.12 מ"ל לכל 20 גרם של bodyweight, כמו בשלב 2.2.2.
- עיכול רקמות הכנה מכתים נוגדן.
- לעכל את חתיכות רקמות צינור צנטריפוגה 15 מ"ל מלא 10 מ"ל של מראש חימם בסיס בסיס העיכול (שלב 1.1.2) בתוספת קולגן 3(300 U לכל 10 מ"ל).
- מניחים את צינור צנטריפוגה 15 מ"ל אופקית על פלטפורמת נדנדה עם מהירות להגדיר 100 סל"ד והטמפרטורה מוגדר 37 מעלות צלזיוס למשך כ 1 שעות כדי לשחרר את מבנה הרקמה כדי להסיר רקמת אדיפוציטים מוגזמת.
הערה: אדיפוציטים נוטים לייצר אוטומטי פלואורסצנציה אשר עלולה לגרום רקע פלואורסצנטי רועש. בסוף העיכול, חתיכות רקמה צריך להיות מראה רך, מעונן. תקופת עיכול אופטימלי תלוי בגודל של רקמות קצוצות חתיכות ולכן צריך להיות מותאם בהתאם להשיג את התוצאות הטובות ביותר. מאז vasculature הרקמה כבר שכותרתו עם Isolectin פלואורסצנטי מתויג, כל ההליכים הבאים צריך להתבצע מוגן מפני האור. - לשטוף את חתיכות רקמות עם PBS ב RT במשך 10 דקות. תקן את הרקמה כולה הר ידי בזהירות הנחת חתיכות לתוך צלחת 6 פטרי ס"מ חצי מלא עם PFA 4% (pH 7.2 - 7.4) כדי לשמר את הקרינה. מניחים את צלחת פטריעל פלטפורמת נדנדה בעדינות להתסיס את הרקמה למשך 30 דקות ב RT.
הערה: PFA הוא מסרטן ויש לטפל בו בזהירות. - הסר את PFA הנותרים לשטוף את הרקמה הקבועה שלוש פעמים עם כל הר חיץ לשטוף (0.1% tween ב PBS), עם מרווח של 10 דקות בין כל לשטוף.
- מכתים נוגדן רקמות שלם.
- לדלל את הנוגדן העיקרי במאגר מכתים נוגדן בצינור צנטריפוגות 2 מ"ל. דגירה הרקמה עם נוגדן העיקרי לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
הערה: עכברוש נגד CD31 (ריכוז: 10 מיקרוגרם / מ"ל) או עכברוש נגד VE-Cadherin (CD144 / Cdh5, ריכוז: 2.5 מיקרוגרם / מ"ל) שימשו נוגדנים ראשוניים. שניהם CD31 ו- VE-Cadherin הם פני השטח סמנים המשמשים לזהות האנדותל. 5x חיץ נוגדנים מוכן עם 500 מ"מ חומצה malic, pH 7.5; 750 מ"מ NaCl; ו 0.5% (v / v) tween להתמוסס PBS. רק להוסיף נפח מתאים בסרום (5%) בעת הכנת פתרון עבודה טרי 1x9 . - הסר את המאגר מכתים נוגדן לשטוף את רקמת הר כולו שלוש פעמים עם חיץ לשטוף, עם מרווח 10 דקות. דגירה הרקמה עם נוגדנים משני (ראה טבלה של חומרים ) בתוספת DAPI ב RT במשך 4 שעות על פלטפורמת נדנדה או לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
הערה: השתמש DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) בריכוז סופי של 5 מיקרוגרם / מ"ל לדמיין את הגרעינים. - לשטוף את רקמת הר כולו עם חיץ לשטוף 3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד. דגירה חתיכות רקמות גליצרול 80% או סוכרוז 80% לילה לייבש את הרקמה לשימור טוב יותר.
- מניחים את חתיכות רקמות בודדים על גבי שקופית זכוכית להסיר את חיץ יתר של התייבשות. מכסים את הרקמה עם המדיום הרכבה, במקום coverslip, בעדינות לסחוט את הרקמה כדי להגדיר אותו.
- ביצוע confocal התמונה הרכישה מיקרוסקופית. עבור כל בלוטות החלב הר, לרכוש תמונות באמצעות 40X עם NA = 1.3 שמן אובייקטיש. רכישת אריחי סריקה של Z- ערימות על רזולוציה סעיף אופטי של 1,024 x 1,024 ואת הפרדת שכבת של 1.0-1.2 מיקרומטר.
הערה: כדי ללכוד את האור הנכון פלואורסצנטי האור, מסנן קרן ספליטר צריך להיות מוגדר משולש dichroic (TD) 488/553/638, עם הגדרת רווח ב PMT רווח 600-800. מקורות עירור / פליטה הבאים יש להשתמש: mGFP, עם מקסימום עירור / פליטה של 488/509 ננומטר; MTomato עם מקסימום עירור / פליטה של 532/588 ננומטר; Alexa-647, עם מקסימום עירור / פליטה של 594/665; ו DAPI, עם עירור / פליטה מקסימום של 350/470.
- לדלל את הנוגדן העיקרי במאגר מכתים נוגדן בצינור צנטריפוגות 2 מ"ל. דגירה הרקמה עם נוגדן העיקרי לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
4. השושלת מעקב באמצעות מודל עכבר מהונדס גנטית
- זיהוי Procr + VESCs באמצעות מודל העכבר.
- השתמש Procry CreERT2-IRES-tdTomato / + (המכונה Procr CreERT2 ) לדפוק את זן העכבר.
הערה: במודל עכבר זה, קלטת CreERT2-IRES-tdTomato Procr 11 .- קרוס Procr עכברים Crebert2 עם mttomatomGFP Rosa26 (המכונה R26 mTmG ) זן כתב להתחקות אחר גורלו של Procr + אנדוגני ECs in vivo 11 . לזהות את כל מסומן אנדרוגני + ECs וצאצא שלהם באמצעות ביטוי GFP.
- ניהול תמיסת טמוקסיפן 11 (10 מ"ג טמוקסיפן מומס ב -1 מ"ל של שמן בוטנים + אתנול 10% להמציא פתרון מלאי של 10 מ"ג / מ"ל) intraperitoneally במינון של 4 מ"ג / 25 גרם bodyweight במהלך שלב ההתבגרות (5 שבועות הישן) כדי לעקוב אחר גורלם ההתפתחותי של Procr + ECs.
- ניתוח יעילות שיבוט שיבוט של תאים שכותרתו על ידי immunostaining הר כולו בעקבות שלבי הכנה המתוארים בשלב 3. השג רפידות שומן החלב מעכברים שטופלו הן לאחר קצר טווח (2 ימים) ותקופות זמן ממושכות (עד 10 חודשים). ראה איור 3 .
- השתמש Procry CreERT2-IRES-tdTomato / + (המכונה Procr CreERT2 ) לדפוק את זן העכבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
VESCs החלב בידוד:
כדי לבודד את האוכלוסייה האנדותל עבור assay ההשתלה כתוצאה, בוגרת (8 שבועות), בלוטות החלב הבתולה בתולה נקצרו כחומר התורם. תאים אנדותל בודדו באמצעות טכניקה מיון תא נוגדן מבוסס. חלקות נציג של ניתוח FACS של האוכלוסייה VESC ב 8 שבועות בן C57BL / 6 בלוטות החלב ECS מוצגים באיור 1 (איור מותאם יאו ואח ' 8 , ברשות).
השומן שומן פאד השתלה:
פנקס שומן החלב מספק אתר אידיאלי לחקר אנגיוגנזה. לאחר בידוד FACS מבוסס, Procr + ECs היו מעורבים עם 0.5% במרתף בממברנה במרתף 0.1% מחוון טריפן כחול היו אז transplanטד פנקס שומן ריק של מקבלי SCID בן 3 שבועות. במהלך גיל ההתבגרות, משטח השומן החלב יוצר סביבה אנגיוגנית, המקדמת את שיפוץ כלי הדם באמצעות יישור עם הרחבת אפיתל החלב. כתוצאה מכך, מושתלים Procr + ECs (GFP + ) שולבו כלי גדול של המארח ( איור 2 ב , חצים) וגם נוצרו משני ו שלישוני GFP + ענפי כלי ( איור 2 ב , ראשי חצים). למרות Procr + ECs מושתלים יכולים גם לייצר כלי assay תקע מטריצה (מוכנס מתחת לעור האגדי), כלי שנוצר רק להיראות נימי דמויי ( איור 2 א , דמות מותאמת מן Yu et al 8 , ברשות).
פונקציונליות של כלי שיוצרו על ידי Procr + VESCs:
כדי לבדוק אם ה- GFP + vEssels ב pads שומן החלב הם חלק של כלי הדם תפקודי הדם, isolectin היה מנוהל על ידי הזרקת תוך ורידי לפני הקציר. כלי GFP + היו isolectin +, המציין כי כלי שנוצר הם מאירים ומחובר עם כלי הדם המארח ( איור 2 ב , דמות מותאמת מן יו ואח ' 8 , ברשות).
השושלת VESC השושלת מעקב באמצעות Creret2 Procr ; Rosa26 mTmG דגם עכבר:
Procr CreERT2 ; עכברים Rosa26 mTmG שימשו גורל מעקב של Procr + VESCs in vivo ( איור 3 א ). כדי לחקור כיצד Procr + VESCs לתרום אנגיוגנזה חזקים ושיפוץ כלי הדם במהלך התפתחות בלוטת החלב, Procr CreERT2 ; Rosa26 mTmG היו מנוהליםד עם טמוקסיפן כדי לגרום ביטוי GFP ב + אנקוטל Procr האוכלוסייה. השומן של שומן החלב של תרופה פרוקר CreERT2 ; עכברים Rosa26 mTmG נקצרו הן לטווח קצר (2 ימים לאחר הזרקת, איור 3 ב ) ו לטווח ארוך (עד 10 חודשים שלאחר ההזרקה, איור 3C -F, דמות מותאם יאו ואח ' 8 , ברשות). ההכנה כולה הר בוצע כדי לדמיין את תוצאות מעקב. זהות האנדותל כלי הדם יכול להיות מאומת על ידי מכתים עם סמן פני השטח האנדותל VE-Cadherin (Cdh5, איור 3B , תמונה מימין).
איור 1: ניתוח של VESCs בלוטת החלב עכבר. ניתוח FACS של הביטוי Procr ב C שבועות 7 שבועות C57BL / 6 בלוטות החלב ECS. 8 בן שבוע v Irgin C67BL / 6 עכברים נקבה שימשו אוסף בלוטת החלב. לאחר דגימות תאים הוכנו, מדגם unstained וכל צבע אחד שליטה נותחו כדי לקבוע את המתח עבור כל צבע. הפרמטרים פיצוי חושבו כדי למנוע הקרינה אוטומטי או רקע מכתים. תבנית הוקמה עבור gating ראוי למיין עבור אוכלוסיות תאים הרצוי. כדי לקבוע את ההיררכיה של מיון FACS, פסולת מכל האירועים בוטלה ולאחר מכן זוגות או אשכולות תא דבק הושלכו. תאי השושלת היו נשלטים החוצה, ו CD31 ו CD105 שימשו כדי להגדיר את אוכלוסיות האנדותל. Procr + תאים היו מבודדים CD31 + CD105 + ECs לעומת בקרת FMO. נתון זה שונה מ- Yu et al. 8 , באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
.within-page = "1"> 
איור 2 איור: VESC החלב שומן Pad השתלת Assay. ( א ) כלי שנוצר מ Procr + ECs בתוך תקע מטריצת קרום במרתף מוכנס מתחת לעור האגף. ( ב ) תמונה confocal של כרית שומן החלב הנמען, המציין את האינטגרציה ואת התרומה של Procr + ECs המושתלים (GFP +) לארח כלי הדם החלב. ECs היו counterstained עם CD31. ( ג ) הזרקה תוך ורידי בעכברים המקבלים עם isolectin הראה כי תולעים יצרו כלי המאירים. סולם בר, 50 מיקרומטר. תמונות נרכשו באמצעות 40X NA 1.3 המטרה שמן. סריקות אריחים של Z- ערימות נרכשו על רזולוציה קטע אופטי של 1,024 x 1,024, וכל שכבה היה 1.0 - 1.2 מיקרומטר בנפרד. כדי ללכוד את האות הנכון הקרינה אור, מסנן קרן ספליטר נקבע TD 488/553/638, עם gAin הגדרת ב PMT רווח 600 - 800. מקורות עירור / פליטה הבאים שימשו: mGFP, עם מקסימום עירור / פליטה של 488/509 ננומטר; MTomato, עם מקסימום עירור / פליטה של 532/588 ננומטר; Alexa-647, עם מקסימום עירור / פליטה של 594/665; ו DAPI, עם עירור / פליטה מקסימום של 350/470. נתון זה שונה מ- Yu et al. 8 , באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: מעקב השושלת של פרוקר + ECs ממחיש את תרומתם הרחבת EC המשובצת במהלך הפיתוח. ( א ) איור של השושלת מעקב אחר האסטרטגיה באמצעות Procry Creert2 ; קו רוזה 26 mTmG (פאנל שמאלי). נִסיוֹנִיההתקנה בשימוש לטווח קצר (2 ימים) ו לטווח ארוך (7 ימים עד 10 חודשים), כפי שצוין (הפאנל הימני). ( BF ) הדמיה שלם confocal הר של vasculature החלב לאחר אורכים שונים של תקופות מעקב, המציין את המיקום הראשוני של Procr + ECs ותרומתם vasculature החלב בשלבי מעקב שונים. סולם בר = 50 מיקרומטר. נתון זה שונה מ- Yu et al. 8 , באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מבחני אנגיוגנזה מייצגים גישה ניסויית טובה לדינמיקה של כלי הדם. עכבר הרשתית של הרשתית, המתפתח לאחר הלידה, הוכח כמודל אטרקטיבי ללימוד אנגיוגנזה 12 . למרות היותו נגיש יחסית, מניפולציה בפועל בתוך המיטה הרשתית הרשתית היא די קשה. עד כה, המתואר הכי טוב ב השתלת vivo כבר assay תקע, אשר מקיף תאים בתוך המסה מטריצה הממברנה במרתף השתלים ניתוחית / הזרקת תת עורית באזור האגף של העכבר הנמען. זה assay angiogenesis יעיל בבדיקת פוטנציאל regenerative ויכולת יצירת כלי של תאים מוטבע. עם זאת, מאז המיקום של תקע מטריקס מושתל יוצר סביבה מבודדת יחסית עבור התאים בתוך, זה לא מספק נישה פיזיולוגית אופטימלית. לאחרונה, מודל חדש של אנגיוגנזה ריאות פותח גם על ידי החלת תיקון פיברין על הסורפההאתר של ריאות העכבר 13 . עם זאת, מניפולציות פוזה עוד סיכון, כי טכניקה זו פועלת באופן פולשני בתוך חלל החזה העכבר, ובכך להקשות על שימוש בהגדרת assay כללית יותר.
ב assay אנגיוגנזה המתואר כאן, נפח קטן של תערובת התא מושתל בתוך כרית שומן של בלוטת החלב, המספק שטח, מטריקס, ואת גירויים אנגיוגניים עשירים במהלך ההתבגרות. זה מאפשר את כלי שנוצר כדי לציית ולשלב לתוך vodculature שיפוץ המארח, המאפשר הערכה תפקודית נוספת, כמו גם מייצג יתרון על פני assay plug תת עורי. כמו כן, פנקס שומן החלב נמצא מחוץ לחלל הצפק, מה שהופך אותו לאתר נגיש מאוד. מבצע על כרית שומן החלב מציג מצוקה מוגבלת החיה הנמען, הימנעות הליכים כירורגיים פולשניים המעורבים מבחני הרשתית ואת הריאות מבוסס.
דם wasculature שנינותHin איבר לעתים קרובות intertwines בין רכיבי רקמות על מנת למקסם את כלי הדם כיסוי כך מתן חמצן בדם חומר העברת יכול להיות מותאם. מסיבה זו, חתך קונבנציונלי של הרקמה לעתים קרובות מיירט את המבנה הצינורי של כלי שלה. ניתוח על מאפייני כלי הדם מתבצע בצורה הטובה ביותר כאשר כלי יכול להישמר ולהישאר ללא שינוי. הכנת הר שלם של רקמה יכולה במידה רבה לשמר את מכלול הארכיטקטורה של כלי הדם בתוך. שיטה זו מאפשרת לא רק את התצפית של חלוקה אותנטית מרחבית של כלי הדם בתוך איבר, אלא גם את הקשר עם מרכיבי רקמה אחרים.
ההומיאוסטזיס של רקמה המכילה תאי גזע מתקיים על ידי איזון הדור ואובדן מסת המסה. תאי גזע בתוך האיבר מיושב ספציפיים מוגנים לעתים קרובות במגע קרוב עם הסביבה הרקמה שמסביב, המכונה נישה תא גזע. לכן, סטומת לנתח את רקמות תאי גזע בוגרים עדיף להתבצע בהקשר פיזיולוגי שלם. מבחני השתלה יכול לספק אמצעי להערכת פוטנציאל התא, בעוד טכניקה השושלת- tracing מאפשר לחקור את גורל התא האמיתי בתוך בית הגידול המקומי. בשנים האחרונות, ב vivo השושלת tracing הפך טכניקה חזקה להערכה ניסיונית של תכונות גזע. אסטרטגיה זו שימשה לזיהוי תאי גזע של שאריות הרקמה וצאצאיהם במספר רקמות, כולל המעי 10 , 14 , זקיקי השיער 15 , הבטן 16 והלבלב 17 . שיטת מעקב השושלת נשענת במידה רבה על סימון גנטי של תאי גזע, והיא מיושמת באוכלוסיות מוגדרות. לכן, קשה להוציא מכלל אפשרות את האפשרות שגזעיות בפועל נמצאת בתת-שכבות קטנה עוד יותר בתוך התאים המסומנים. לכן יש צורך למפות את התא של המקור של שיבוטים מעוקרים בדייקנות וכדי למדוד כמותית את היעילות מעקב לאורך זמן. בדרך זו ניתן לתפוס את יכולת ההתחדשות העצמית של האוכלוסייה המסומנת.
Assay angiogenesis המתואר יכול להיות שונה למטרות מחקר ספציפי: זה יכול לשמש לא רק כדי לבחון את יכולת ייצור כלי קיבולת של אוכלוסיות האנדותל של עניין, אלא גם כדי להעריך את ההשפעה של גורמים angiogenic על שיפוץ כלי מקומי. עם זאת, מאז בלוטת החלב עוברת שינויים מורפולוגיים דינמיים במהלך שלבי התפתחות שונים ( למשל, גיל ההתבגרות, מחזורי אטרוס, הריון) יש לקחת בחשבון את ההשפעה של שינויים מערכתיים, כגון תנודות ברמה ההורמונלית, במהלך פרשנות התוצאה. השלבים הקריטיים assay זה כוללים בידוד תא האנדותל העיקרי. כדי להשיג אופטימלי תאים קיימא להשתלה, נהלים בידוד FACS צריך bE ביצע בעדינות. זהירות יש לנקוט כדי למנוע טיפול קשה במהלך ההכנות התא, כגון תא גלולה התרופפות והשעייה. צעד קריטי נוסף הוא הזרקת תערובת התא לתוך פאט שומן. במהלך הזרקת כרית שומן, חשוב לוודא כי תערובת התא מופקד דווקא בתוך משטח שומן. זה יכול להיות מסובך אם הכניסה מחט עמוק מדי / רדודה או אם הנפח הכולל עולה על המינון המומלץ.
פרוטוקול זה מספק סדרה של שיטות ניסיוניות אשר סייעו בזיהוי של אוכלוסיית תאי הגזע האנדותל. באמצעות טכניקות אלה, ניתן היה להעריך תכונות תאי גזע באמצעות השתלה, כמו גם לעקוב ולבחון את התנהגותם תחת תהליכים פיזיולוגיים in vivo . גישות אלה הם כלים יעילים שניתן ליישם על דיסציפלינות מרובות, כולל מחקרים על אוכלוסיות האנדותל בסביבות גידול של שינויים בעוצמת התא שלהם. אניבפרט, השתלת כרית שומן ההכנה כולה הר הם שיטות לשחזור עוצמה שיכולים לסייע במאמצים עתידיים לחקור היבטים שונים של ביולוגיה של כלי הדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31530045 ו- 31371500 ל- YAZ, 31401245 ל- QCY), משרד המדע והטכנולוגיה של סין (2014CB964800), האקדמיה הסינית למדעים (XDB19000000 ל- YAZ) והסינים חברה לביולוגיה של התא (מלגות מוקדמות לקריירה).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(EDTA) (1x) | Gibco (Life Technologies) | 25300-062 | 0.05% Trypsin |
| 0.22 µm Filter Unit | Merck Millipore Ltd. | SLGP033RB | 0.22 µm Filter |
| 2-Methylbutanol-2, ReagentPlus | Sigma-Aldrich | 24, 048-6 | Tert Amyl Alcohol |
| 222, Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25g | 222, Tribromethanol |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) | Invitrogen | D1306 | DAPI |
| 70 µm Cell Strainer | BD FAL | 352350 | 70 µm Cell Strainer |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 188105 | Glass slides |
| Anti-mouse CD105 APC | eBioscience | 17-1051-82, clone MJ7/18 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| Anti-mouse CD201 Biotin | eBioscience | 13-2012-82 | for FACS analusis use at 2.5 µg/mL |
| Anti-mouse CD31 PE-Cyanine 7 | eBioscience | 25-0311-82, clone 390 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| BD FACSJazz Cell Sorter | BD Biosciences | 655489 | FACS |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 100190332 | BSA |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Centrifuge |
| Collagenase type 3 | Worthington-Biochem | #LS004183 | Collagenase III |
| Confocal microscopy | Leica | sp8 | Confocal |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D2463-5VL | Dnase I |
| Donkey anti-Rat Cy3 | Jackson ImmunResearch | 712-165-150 | Secondary antibody, use at 0.5 µg/mL |
| Dumont Forceps | WPI | 500342 | Froceps |
| Dumont Forceps - Micro-Blunted Tips | FST | 11253-20 | Forceps |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | FBS |
| FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119 | BioLegend | 78022 | Blood lineage cocktail for FACS analysis, use at 25 µL per test |
| Glycerol | Sigma | G6279 | Glycerol |
| Iscov's Modified Dulbecco's Medium | Gibco (Life Technologies) | 12440-053 | IMDM |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora 647 | Invitrogen | Z32450 | Isolectin-647 |
| Matrigel Matrix (growth factor reduced) | BD | 356231 | Matrigel |
| Mouse strain (Actin-GFP) | Jax Laboratories | 3773 | Actin-GFP |
| Mouse strain (C57BL/6) | SLAC | C57BL/6 | C57BL/6 |
| Mouse strain (BALB/c nude) | SLAC | BALB/c nude | Nude mice |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | PFA |
| Penicilin Streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 5140-122 | Pen/Strep |
| Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1x | Gibco (Life Technologies) | c20012500BT | PBS |
| PRIM1640 | Gibco (Life Technologies) | c11875500CP | PRIM1640 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | Mounting Medium |
| Rat anti CD144 | BD Biosciences | 550548 | for whole-mount analysis, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy for endothelial tight junction, use at 2.5 µg/mL |
| Rat anti CD31-biotin | BD Biosciences | 553371 | for whole-mount analusis, anti-CD31/PECAM1 antibody for endothelial surface adhesion molecule, use at 10 µg/mL |
| Red Cell Lysis Buffer | Sigma | R7767-100ML | Red blood cell lysing buffer |
| Straight/Sharp-Blunt/10cm | FST | 14028-10 | Fine Scissors |
| Streptavidin eFluor 450 | eBioscience | 48-4317-82 | for FACS analysis use at 0.5 µg/mL |
| Tamoxifen | Sigma | 101551374 | TAM |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | TritonX |
| Wax Coated Braided Silk (Size 5-0 USP (1 Metric), 18 inches (45 cm) BLACK on C-1 Needle) | COVIDIEN | S1173 | Suture |
| Sterile Disposable Scaplels | Swann Morton | #10 | Scalpel |
| Betadine | Yifeng Medical | 20160101 | Antiseptic solution |
References
- Thomas, E. D., Lochte, H. L., Lu, W. C., Ferrebee, J. W. Intravenous infusion of bone marrow in patients receiving radiation and chemotherapy. N Engl J Med. 257 (11), 491-496 (1957).
- Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).
- Bompais, H., et al. Human endothelial cells derived from circulating progenitors display specific functional properties compared with mature vessel wall endothelial cells. Blood. 103 (7), 2577-2584 (2004).
- Fang, S., Wei, J., Pentinmikko, N., Leinonen, H., Salven, P. Generation of functional blood vessels from a single c-kit+ adult vascular endothelial stem cell. PLoS Biol. 10 (10), e1001407 (2012).
- Naito, H., Kidoya, H., Sakimoto, S., Wakabayashi, T., Takakura, N. Identification and characterization of a resident vascular stem/progenitor cell population in preexisting blood vessels. EMBO J. 31 (4), 842-855 (2012).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Snippert, H. J., Clevers, H.
- Yu, Q. C., Song, W., Wang, D., Zeng, Y. A. Identification of blood vascular endothelial stem cells by the expression of protein C receptor. Cell Res. 26 (10), 1079-1098 (2016).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506, 322-327 (2014).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Wang, D. S., et al. Identification of multipotent mammary stemcells by protein C receptor expression. Nature. 517, 81-U201 (2015).
- Stahl, A., et al. The Mouse Retina as an Angiogenesis Model. Invest Ophth Vis Sci. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Mammoto, T., Mammoto, A. Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis. J. Vis. Exp. (94), e52012 (2014).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17 (6), 849-860 (2009).
